10
INTRODUÇÃO GERAL
Os basidiomicetos Pleurotus ostreatus e Lentinula edodes são fungos
lignocelulósicos com capacidade de degradar diversos materiais, devido à produção
de enzimas extracelulares, principalmente enzimas lignolíticas como a lacase
(BALDRIAN et al., 2005; GIANFREDA et al., 1999; LECHNER; PAPINUTTI, 2006;
POPPE, 2005; SILVA et al., 2005). Esta enzima atua em materiais lignocelulósicos,
permitindo a utilização de subprodutos da agroindústria, ricos em lignina e celulose,
para o cultivo de cogumelos. Sendo assim, o cultivo de cogumelos é uma forma de
agregar valor a resíduos que seriam descartados e produzir biomassa de interesse
terapêutico e nutricional (EIRA, 2003; ISHIKAWA et al., 2001; SHARMA; MADAN,
1993; SOUZA-PACCOLA et al., 2004; WASSER; WEIS, 1999).
Alguns biocompostos de interesse terapêutico ou nutricional produzidos por
estes fungos podem ser extraídos diretamente do micélio, não necessitando a
formação de basidiocarpo, reduzindo assim o tempo e os custos de produção. Outro
processo que utiliza o micélio é a produção de inoculantes para produtores de
cogumelos (EIRA, 2003; HWANG et al; 2005; MATA et al., 2001; SANCHEZ, 2004;
SHU et al., 2006). Dessa forma o desenvolvimento de substratos para o crescimento
micelial de fungos é uma alternativa para acelerar o processo de obtenção de
biocompostos.
A manutenção adequada do micélio destes fungos é necessária para a
preservação de suas características biológicas. A criopreservação é uma das
técnicas mais utilizadas na preservação de fungos, podendo utilizar temperaturas de
-70 ºC a -196 ºC (PUTZKE; PUTZKE, 1998). A utilização de temperaturas mais
elevadas, como de -20ºC neste processo o torna mais acessível (HUBÁLEK, 2003;
MATA; PEREZ-MÉRLO, 2003; MATA; SALMONES, 2005; PUTZKE; PUTZKE,
1998),
Sendo assim, no artigo 1 foi realizado crescimento micelial de Pleurotus sp e
no artigo 2 o crescimento micelial Lentinula edodes, em diferentes subprodutos da
agroindústria, caracterizados físico-quimicamente. Primeiramente o micélio foi
crescido em meios de cultivo em placa de Petri e posteriormente, baseado nos
melhores meios de cultivo em placas de Petri, o fungo foi cultivado em substratos de
cultivo com diferentes granulometrias em tubos de borosilicato. Em ambos os casos
11
mantiveram-se fixa a relação carbono-nitrogênio (C/N). Após estas etapas foi
realizada a determinação da atividade da enzima lacase nos substratos com maior
crescimento micelial em tubos de borosilicato, e adicionado indutores de produção
da enzima de acordo com planejamento fatorial fracionário.
Nos artigos 3 e 4 realizou-se a criopreservação de Pleurotus ostreatus e
Lentinula edodes, respectivamente. Para a preservação das linhagens foi realizado
primeiramente um teste de inibição do crescimento micelial por diferentes
concentrações de crioprotetores. Em seguida, selecionou-se a porcentagem de
crioprotetor que causou menor porcentagem de inibição e cresceram-se os fungos
em diferentes grãos ou cilindro de meio batata-dextrose-ágar. Assim, o fungo foi
criopreservado em diferentes substratos e com adição de diversos crioprotetores nas
temperaturas de -20 ºC ou -70 ºC. A recuperação do fungo foi feita após um ano de
congelamento, em meio de cultivo batata-dextrose-ágar.
12
2. FATORES FÍSICO-QUÍMICOS PRESENTES NO SUBSTRATO DE CULTIVO DE
Pleurotus sp.
2.1. INTRODUÇÃO
A produção anual de resíduos da agricultura é estimada em 500 milhões de
toneladas, sendo parte utilizada para alimentação animal e outra grande parte
acumulada no ambiente (POPPE, 2005; RAJARATHNAM; BANO, 1987). O Brasil é
um dos maiores produtores mundiais de soja (Glycine max), mandioca (Manihot
esculenta) e milho (Zea mays). Grande parte da produção nacional é proveniente do
estado do Paraná, sendo o Estado também produtor de arroz (Oryza sativa) e trigo
(Triticum aestivum) (PARANÁ, 2007). O processamento destes vegetais gera
resíduos em função do processo tecnológico adotado, podendo os subprodutos
serem constituídos de fibras, farelos, bagaços, cascas e outros materiais
lignocelulósicos com potencial para o crescimento diversos microrganismos
(CEREDA, 2001; HOSENEY, 1991).
Os cogumelos comestíveis são uma alternativa de melhor utilização destes
subprodutos, através do processo de bioconversão, auxiliando na diminuição do
acúmulo destes resíduos e gerando biomassa de interesse comercial (POPPE,
2005; SILVA et al., 2005). Os fungos do gênero Pleurotus possuem capacidade de
colonizar uma variedade de substratos quando comparado a outros fungos (POPPE,
2005), exigindo uma menor complexidade das técnicas de cultivo quando
comparado com fungos do gênero Agaricus (SILVA et al., 2007). Este fato se deve
principalmente pela produção de grande quantidade de enzimas extracelulares
lignocelulóticas como xilanases, celulases e lacases (BALDRIAN et al., 2005). A
lacase é a principal enzima envolvida na degradação de lignina do sistema lignolítico
de fungos (GIANFREDA et al., 1999), sendo sua atividade fortemente influenciada
pela linhagem, composição do substrato e condições de cultivo do fungo
(ELISASHIVILI, 2008; HOU et al., 2004; STAJIC et al., 2006). As propriedades
físicas do substrato de cultivo incluindo natureza cristalina, área de superfície,
porosidade e principalmente tamanho da partícula são essenciais para a atividade
enzimática (PANDEY, 2003). Existe uma diversidade de resíduos lignocelulósicos
13
regionais que apresentam estas características e que podem ser utilizados como
substrato.
Devido à sua capacidade de degradar compostos fenólicos, a lacase pode ser
aplicada em diversas áreas da indústria, como branqueamento e aumento da
resistência do papel e tratamento de efluentes (WIDSTEN; KANDELBAUER, 2008).
Sendo assim é importante o aumento da habilidade dos basidiomicetos produzirem
lacase para aplicações industriais (HOU et al., 2004). O aumento na produção de
lacase por Pleurotus ostreatus pode ocorrer com a adição de indutores (ARORA;
GILL, 2001; BALDRIAN, 2003; BALDRIAN et al., 2005; BALDRIAN; GABRIEL,
2002).
Além da habilidade de crescer em grande variedade de resíduos, o gênero
Pleurotus possui alto valor nutricional (SHARMA; MADAN, 1993) e capacidade de
produzir biocompostos antitumorais (WASSER; WEIS, 1999) e hipocolesterolêmicos
(HOSSAIN et al., 2003). Os diferentes biocompostos produzidos por cogumelos
podem ser extraídos diretamente do micélio do fungo (HWANG et al., 2005; SHU et
al., 2006), não necessitando o desenvolvimento do corpo de frutificação. Isto
diminuiria o custo do processo, pois envolve um menor número de mão de obra e de
etapas de cultivo. Portanto, a análise do crescimento micelial, bem como a
otimização deste processo é fundamental para a produção de princípios ativos
terapêuticos em escala industrial.
Outro processo que utiliza a produção de biomassa micelial é a indústria de
produção de inoculantes (spawn). Inoculantes são propágulos viáveis do fungo,
geralmente em veículo sólido, utilizados para colonizar o substrato de produção
(EIRA, 2003). Segundo Herrera (2001), cerca de 80% dos produtores de cogumelos
não produz substrato de cultivo próprio, encarecendo o produto final aos
consumidores. Portanto, a busca de matérias-primas alternativas regionais poderia
abrir perspectivas de preparo de inóculo e de substrato próprios, evitando os custos
de transporte de outras regiões (DIAS et al., 2003).
Buscando a melhor utilização dos resíduos regionais agrícolas o objetivo
deste trabalho foi avaliar a composição físico-química para a produção de biomassa
e de lacase de diferentes formulações de substratos a partir de subprodutos da
agroindústria para o gênero Pleurotus.
14
2.2 MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi realizado no Laboratório de Biologia Molecular da
Universidade Paranaense - Campus sede de Umuarama, Paraná, Brasil. Foram
utilizadas quatro linhagens do gênero Pleurotus: Pleurotus ostreatus (U6/8),
Pleurotus ostreatus (U6/9), Pleurotus florida (U6/10), Pleurotus ostreatus (U2/11),
provenientes da micoteca da Universidade Estadual de Londrina - UEL. O fungo foi
cultivado em meio batata-dextrose-ágar (BDA) (39 g/L) a 25 ºC em estufa sem
circulação de ar. Após a recuperação do vigor de crescimento, foram selecionadas
como inóculo placas com ramificação homogênea, sem setoriamento.
2.2.1 Crescimento do fungo em placas de Petri
As matérias-primas utilizadas para compor os meios de cultivo foram: fibra de
soja (FS), farelo de trigo (FT), farelo de arroz (FA), grãos de milho (GM), sabugo de
milho (SM), fibra de mandioca (FM) e serragem de eucalipto (SE). A FM foi obtida a
partir de tubérculos, provenientes do horto medicinal da Universidade Paranaense,
descascados, lavados e triturados com água em liquidificador. A massa obtida foi
transferida para um filtro de pano e lavada com água corrente. A FM resultante foi
seca em estufa com circulação de ar a 45 ºC por dez horas. A FS (Fibrarich FN –
17/01/2001) foi fornecida moída e desidratada pela empresa Solae do Brasil. Os
demais subprodutos foram obtidos de cooperativas da região. Todas as matérias-
primas, desidratadas, foram moídas em liquidificador e peneiradas a fim de obter
granulometria menor que 355 µm, e em seguida armazenadas em freezer a -20 ºC.
As matérias-primas foram analisadas quanto o seu teor de nitrogênio
determinado pelo método de Kjeldahl, umidade em estufa a 105 ºC até massa
constante, cinzas em mufla a 550 ºC. Em seguida foram calculados os diferentes
meios de cultivo para obter-se relação C/N de 30 (WU et al., 2004). A relação C/N foi
calculada, conforme Griensven (1988), considerando que 50% da matéria orgânica é
composta por carbono (conteúdo de massa seca total menos cinzas, multiplicado
por 0,5). O meio de cultivo foi preparado com 15 g/L de ágar e 30 g/L de diferentes
misturas de matéria-prima (Tabela 1) e então autoclavado a 121 ºC por 20 min.
Quando necessário o pH do meio foi ajustado para 6,0 com NaOH ou HCl
15
previamente esterilizados por filtração (filtro de 0,22 µm), em seguida os meios
foram vertidos em placas de Petri (90 mm).
Para a inoculação dos meios de cultivo foi retirado um cilindro de cinco
milímetros de diâmetro da área periférica de crescimento do micélio e disposto no
centro da placa de Petri contendo meio de cultivo, tomando-se o cuidado para que o
micélio do cilindro ficasse em contato direto com o meio de cultivo. As placas
inoculadas foram dispostas ao acaso para crescimento em estufa a 25 ºC no escuro
por 6 dias.
O crescimento foi acompanhado pela medida do diâmetro do micélio através
de paquímetro em quatro pontos diferentes das placas de Petri, sendo estes valores
utilizados para a determinação da média de crescimento fúngico de cada meio de
cultivo. A densidade micelial e possíveis degenerações do crescimento foram
registradas através de fotografia digital ao final do experimento.
Todos os tratamentos tiveram quatro réplicas. A média e o desvio padrão do
crescimento do micélio foram calculados e as diferenças determinadas pela análise
de variância e teste de Tukey (p<0,05).
2.2.2 Crescimento em tubos de borosilicato
Os melhores meios de cultivo e a melhor linhagem do crescimento em placas
de Petri foram selecionadas para esta etapa experimental. Foi efetuada uma
estratificação granulométrica das matérias-primas componentes do substrato de
cultivo em quatro faixas principais, sendo determinado então, dois níveis de
granulometria. Cada diferente faixa foi analisada quanto à quantidade de nitrogênio,
carbono, cinzas e umidade conforme descrito no item 2.1. A formulação dos
substratos foi calculada para manter a relação C/N de 30 (WU et al., 2004) e todos
os tratamentos tiveram quatro réplicas.
Depois de misturados os componentes do substrato em Erlenmeyers e
autoclavados com excesso de água ultra pura a 121 ºC por 10 min retirou-se o
excesso de água e adicionou-se carbonato de cálcio (CaCO3) para ajustar o pH para
6,0. Os substratos foram acondicionados nos tubos de borosilicato (de 300 mm por
30 mm) com densidade de 0,70 g/cm3 e após 24 h da primeira autoclavagem foram
novamente autoclavados a 121 ºC por 40 min.
16
Em seguida inoculou-se os tubos com cilindros miceliais de 30 mm de
diâmetro da área periférica da colônia crescida em meio BDA, de forma a cobrir toda
superfície de uma das extremidades do tubo, foram então armazenandos em estufa
a 25 ºC, com cerca de 70% de umidade, no escuro.
O crescimento micelial do fungo foi medido com paquímetro através de quatro
medidas ao longo de cada tubo, sendo estes valores utilizados para a determinação
da média de crescimento do fungo e desvio padrão. A densidade micelial e possíveis
degenerações do crescimento foram registradas através de fotografia digital ao final
do experimento. Os dados obtidos foram analisados e as diferenças determinadas
pela análise de variância e teste de Tukey (p<0,05).
2.2.3 Determinação da atividade da lacase
Com base nos resultados obtidos do crescimento em tubos de borosilicato,
escolheu-se os dois melhores substratos de cultivo e realizou-se um planejamento
fatorial fracionário. A linhagem U6/8 de Pleurotus ostreatus cresceu nos substratos
acondicionados em tubos Falcon. A estes substratos foram adicionados água ultra
pura em excesso e então autoclavados a 121 ºC por 10 min. Após o resfriamento foi
removido o excesso de água, adicionado carbonato de cálcio (CaCO3) para ajustar o
pH para 6,0 e adicionada soluções de metais para indução da atividade da lacase
(Tabela 1). As soluções de metais foram utilizadas nas seguintes concentrações:
CuSO4 (2mM), ZnSO4 (1mM), Cd(NO3)2 (2mM), MnSO4 (1mM) e Fe(SO4) (1mM)
(BALDRIAN; GABRIEL, 2002; GALHAUP et al., 2002; ROBINSON et al., 2001). Em
seguida os tubos foram autoclavados a 121 ºC por 40 min, inoculados com o fungo e
mantidos a 25 ºC por oito dias.
Para a determinação da atividade da lacase foi obtido um extrato bruto (1:4) g
do meio colonizado em tampão acetato de sódio (10 mM, pH 4,2), mantido em
banho de gelo por 1 h com agitação de 30 segundos em vórtex, a cada 15 min. A
mistura foi centrifugada a 9,5 g a 4 °C, por 2 min, sendo o sobrenadante considerado
o extrato bruto.
A atividade de lacase foi medida pela redução da absorvância de uma mistura
contendo 400 µL do extrato bruto, 1400 µL de água, 900 µL de tampão acetato de
sódio 0,1 M (pH 5,0) e 300 µL de 1 mM de ABTS (C18H18N4O6S4.2H3N). A reação
17
ocorreu a 30 °C por 10 min. Após este período, a reação foi paralisada com a adição
de 100 µL de ácido tricloroacético (5%). Foi então adicionado 8,5 mL de água ultra
pura e realizada a leitura da absorvância a 420 nm. Uma unidade de atividade
enzimática (U) foi definida como 1 µmolar de ABTS oxidado por minuto. Para
calcular a atividade enzimática, o coeficiente de absorção de 3,6 104 M-1cm-1 foi
utilizado.
A fim de quantificar a porcentagem de lignina e celulose presente nos
substratos, realizou-se análise de fibras de detergente neutro (FDN) e fibras de
detergente ácido (FDA). Sendo que FDN representam as fibras insolúveis em
detergente neutro (lignina, celulose e hemicelulose), enquanto FDA representa a
porcentagem de lignina e celulose, fibras insolúveis em detergente ácido (SILVA;
QUEIROZ, 2002).
Tabela 1. Níveis das variáveis indutores metálicos na produção de lacase estudadas no planejamento fatorial fracionário 26-2 (I-III). A sexta variável foi o substrato de crescimento definido pelo teste de crescimento em tubos de borosilicato (item 2.2).
Variáveis Níveis (ppm) -1 +1
Cu 0,000 1,103 Zn 0,000 0,588 Fe 0,000 1,324 Cd 0,000 0,368 Mn 0,000 0,882
18
2.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
2.3.1 Crescimento micelial em placas de Petri
Na Tabela 2 é apresentada a análise físico-química das matérias-primas para
o crescimento do fungo em placas de Petri. Observou-se, quanto ao teor de
nitrogênio, que as matérias-primas ficaram divididas em dois grupos. Um grupo de
maior quantidade de nitrogênio composto por FS, FT, FA e GM e outro grupo de
menor quantidade de nitrogênio, composto pelo SM, FM e SE.
Tabela 2. Análise físico-química das matérias-primas para meio de cultivo em placas de Petri (%), em base seca. Matéria-prima
Nitrogênio Carbono* Cinzas Umidade
FS 4,330 44,100 3,83 7,99 FT 2,600 42,310 5,04 10,34 FA 1,760 38,380 12,22 11,03 GM 1,620 43,830 1,15 11,18 SM 0,530 42,850 2,23 12,07 FM 0,090 44,990 0,39 9,64 SE 0,040 33,020 0,12 33,76
Legenda: FS = fibra de soja, FT = farelo de trigo, FA = farelo de arroz, GM = milho, SM = sabugo de milho, FM = fibra de mandioca, SE = serragem de eucalipto. *Carbono calculado segundo Griensven (1988).
Usualmente matérias-primas com maiores concentrações de nitrogênio são
adicionadas a matérias-primas volumosas e com menores concentrações de
nitrogênio. A fim de obter relação C/N de 30 (WU et al., 2004) os meios de cultivo
foram formulados independentes deste aspecto (Tabela 3). O controle (CT) (Tabela
3) possui relação C/N de 28 não sendo alterada para 30 como os demais
tratamentos para não modificar a porcentagem de matéria-prima usualmente
utilizada.
19
Tabela 3. Composição dos meios de cultivo (M1 a M12 e controle (CT)) em g e porcentagem do meio, em base seca.
Na figura 1 é apresentada a média do crescimento micelial em placas de Petri
das diferentes linhagens de Pleurotus, demonstrando sua capacidade em utilizar
uma diversidade de substratos, com rápido crescimento micelial, confirmando o
relato de Poppe (2005) sobre a capacidade do fungo de utilizar diversos resíduos
agrícolas. Houve crescimento similar, em geral com baixo desvio padrão, entre as
linhagens nos diferentes meios de cultivo, ressaltando a semelhança na capacidade
de degradação de linhagens para um mesmo gênero (Figura 1). Maiores variações
ocorreram com os meios de cultura M2 e M7, onde a linhagem 10-6 (dados não
apresentados) apresentou menor crescimento em relação às demais, o que se deve
MATÉRIA-PRIMA EM g (%)
FS FT FA GM SM FM SE Total
M1 9,6 (32) - - - - - 20,4 (68) 30,0 (100)
M2 - 16,2 (54) - - - - 13,8 (46) 30,0 (100)
M3 - - 22,2 (74) - - - 7,8 (26) 30,0 (100)
M4 - - - 27,0 (90) - - 3,0 (10) 30,0 (100)
M5 7,2 (24) - - - 22,8 (76) - - 30,0 (100)
M6 - 12,9 (43) - - 17,1 (57) - - 30,0 (100)
M7 - - 19,5 (65) - 10,5 (35) - - 30,0 (100)
M8 - - - 25,5 (85) 4,5 (15) - - 30,0 (100)
M9 9,9 (33) - - - - 20,1 (67) - 30,0 (100)
M10 - 16,2 (54) - - - 13,8 (46) - 30,0 (100)
M11 - - 22,2 (74) - - 7,8 (26) - 30,0 (100)
M12 - - - 27,0 (90) - 3,0 (10) - 30,0 (100)
CT - - 6,0 (20) - 24,0 (80) - - 30,0 (100)
Legenda: FS = fibra de soja, FT = farelo de trigo, FA = farelo de arroz, GM = grãos de milho, SM = sabugo de milho, FM = fibra de mandioca, SE = serragem de eucalipto.
20
provavelmente a uma variação da linhagem que não está apta a degradar estes dois
meios de cultivo.
Os meios de cultivo com maior crescimento micelial foram M5, M6, M9 e M10
(Figura 1, Tabela 1). Os meios M9 e M10 são compostos por alta porcentagem de
fibra de mandioca, que possui porosidade permitindo um melhor acesso enzimático
do fungo e maior absorção de nutrientes, o que é também observado na fibra de
soja com maior porosidade e capacidade ainda maior de absorção de água que a
fibra de mandioca (LINDE; MACHADO, 2001). Já o farelo de trigo, que é o principal
subproduto da moagem do trigo, diferentemente das fibras, é constituído de uma
mistura heterogênea de fragmentos da camada hialina-aleurona dos grãos, sendo
fonte de minerais, vitaminas e outros nutrientes de valor biológico (DI LENA et al.,
1997). A FS e o FT são adequados para o crescimento micelial de Pleurotus, no
entanto quando adicionado SE à mistura não apresentam o mesmo desempenho
(Figura 1), isto se deve provavelmente a algum composto tóxico presente na SE.
Os meios de cultivo M5 e M6 contêm porcentagens maiores de sabugo de
milho, um material poroso que absorve grande quantidade de água e permite o
acesso enzimático do fungo a nutrientes (RODRIGUEZ et al., 1998), sendo
usualmente utilizado como material volumoso em substratos para cultivo de fungos
(EIRA et al., 2005; GABRIEL, 2005). Segundo Neiva-Junior et al. (2007) o SM tem
uma porcentagem de lignina e celulose de 16,04 e 28,99% respectivamente, o que
propicia o cultivo de fungos com alta capacidade lignocelulótica. Menores
concentrações de SM (M7 e M8) e de FM (M11 e M12) apresentaram crescimento
micelial inferior a concentrações elevadas destas matérias-primas (Figura 1).
Crescimento intermediário foi observado em meios de cultivo com FA ou GM,
(Figura 1). O FA é o subproduto mais importante do arroz, sendo constituído pelo
gérmem e pela camada de aleurona, rico em fibras, minerais e proteínas
(ALENCAR; ALVARENGA, 1991). Embora seja muito utilizado na suplementação de
substratos para cultivo de fungos (RAJARATHNAM; BANO, 1987; SINGH, 2000),
observou-se crescimento inferior ao CT nos meios de cultivo com adição de farelo
de arroz.
21
Figura 1. Crescimento médio do gênero Pleurotus (média das linhagens U6/8, U6/9, U6/10 e U2/11) após seis dias de crescimento em diferentes meios de cultivo. Colunas seguidas da mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).
Os substratos com serragem de eucalipto apresentaram menor crescimento
micelial (Figura 1). De acordo com Eira e Montini (1997), a serragem possui uma
composição nutricional pobre, tornando-se indispensável sua correção com aditivos.
Na Figura 1 observa-se que o aumento na concentração de SE diminui a produção
de biomassa pelo fungo, sendo que o melhor resultado para a SE ocorreu quando
misturada a 90% de milho (M4), resultado que se deve provavelmente a alta
concentração de amido encapsulado na matriz protéica no endosperma de milho,
fonte rica de carbono e nitrogênio (ECKHOFF; PAULSEN, 1996). Segundo Figura 1,
maiores concentrações de GM proporcionaram maior crescimento micelial. A análise
visual da densidade do micélio (dados não apresentados) mostrou vigor semelhante
entre as diferentes linhagens nos diversos meios de cultivo, com exceção do M1,
que possui maior porcentagem de SE e apresentou densidade micelial inferior aos
demais, evidenciando a escassez de nutrientes neste meio de cultivo.
2.3.2 Crescimento em tubos de borosilicato
Para a formulação dos substratos em tubos de borosilicato foi realizada uma
estratificação granulométrica das matérias-primas com tamisador. Na faixa 1 (F1) o
tamanho das partículas foram de 1,7 a 5 mm, faixa 2 (F2) de 0,8 a 1,7 mm, faixa 3
0
10
20
30
40
50
60
70
80
M1 M2 M3 M11 M7 M4 CT M8 M12 M6 M5 M9 M10
Meios de cultivo
Diâ
met
ro d
e cr
esci
men
to d
o m
icél
io (
mm
).
gf
ef e e cde cd ca aababb
22
(F3) de 0,3 a 0,8 mm e faixa 4 (F4) menor que 0,3 mm. Foram determinados dois
níveis de granulometria. No primeiro nível (G1) usou-se a faixa F1 para a matéria-
prima com menor quantidade de nitrogênio e F2 a F4 para a matéria-prima com
maior quantidade de nitrogênio. No segundo nível (G2) usou-se a faixa F2 a F4 para
ambas as matérias-primas do substrato. Na G2 as matérias-primas foram
adicionadas de forma proporcional para cada faixa, assim como no G1 para as
faixas F2 a F4.
Realizou-se então, uma análise físico-química das diferentes faixas de
granulometria para cada matéria-prima, conforme Tabela 4, mantendo-se a relação
C/N em 30 e a densidade média de 0,69 ± 0,08 g/cm3. Os controles (Tabela 5)
possuem relação C/N de 53 (CTG1) e 33 (CTG2) não sendo alteradas para não
modificar a porcentagem de matéria-prima usualmente utilizada.
Pode se observar variação da quantidade de compostos de uma mesma
matéria-prima dependendo do tamanho das partículas (Tabela 4). Isto esta
relacionado à moagem dos subprodutos, onde é esperado que os minerais, por
normalmente encontrarem-se na forma de sais de fácil quebra, concentrem-se nas
frações de menor granulometria (FENNEMA, 2000) alterando assim as frações
orgânicas e inorgânicas dos substratos de cultivo. A fração orgânica é responsável
pelo fornecimento de carbono e nitrogênio, enquanto que a fração inorgânica exerce
importante papel na disponibilização de micronutrientes normalmente envolvidos no
funcionamento dos sistemas de transporte celular e das reações enzimáticas
(BELITZ; GROSCH, 1997; FENNEMA, 2000; LEHNINGER et al., 1995). Desta
forma, o conhecimento da composição química das frações granulométricas do
substrato de cultivo é importante para a compreensão do crescimento do fungo em
diferentes substratos.
Tabela 4. Análise físico-química das matérias-primas utilizadas para o crescimento em tubos de borosilicato em porcentagem (base seca).
Resultado de análise (%) MP G Nitrogênio Carbono* Cinzas Umidade
F1 0,453 44,712 1,766 8,810 F2 0,817 44,270 2,301 9,160 F3 1,038 44,250 2,130 9,370
SM
F4 1,229 43,006 4,318 9,670 F2 5,520 43,497 3,736 9,270 FS F3 4,590 43,826 3,668 8,680
23
F4 4,834 43,616 3,959 8,810 F2 1,959 42,711 5,229 9,350 F3 2,508 41,762 7,696 8,780 FA F4 2,667 39,455 12,040 9,050 F2 3,575 41,935 5,421 10,710 F3 3,820 42,038 4,794 11,130 FT F4 3,299 42,514 3,142 11,830
Legenda: MP = matéria-prima, G = granulometria, FS = fibra de soja, FT = farelo de trigo, FA = farelo de arroz, SM = sabugo de milho, F1 a F4 = faixa de granulometria. *Carbono calculado segundo Griensven (1988).
Tabela 5. Composição dos substratos (M5G1 a M7G2 e controles (CTG1 e CTG2)) em g e porcentagem do substrato, em base seca.
SUBSTRATO EM g (%) MP G
M5G1 M5G2 M6G1 M6G2 M7G1 M7G2 CTG1 CTG2
F1 29,0 (74,0)
- 23,6 (60,0)
- 16,7 (43,0)
- 32,0 (80,0)
-
F2 - 10,6 (27,0)
- 9,1 (23,3)
- 6,5 (17,3)
- 10,1 (26,7)
F3 - 10,6
(27,0) - 9,1
(23,3) - 6,5
(17,3) - 10,1
(26,7)
SM
F4 - 10,6
(27,0) - 9,1
(23,3) - 6,5
(17,3) - 10,1
(26,7)
F2 3,4
(8,6) 2,5
(6,3) - - - - - -
F3 3,4
(8,6) 2,5
(6,3) - - - - - - FS
F4 3,4
(8,6) 2,5
(6,3) - - - - - -
F2 - - - - 7,5
(19,0) 6,6
(16,0) 2,4
(6,6) 3,0
(6,6)
F3 - - - - 7,5
(19,0) 6,6
(16,0) 2,4
(6,6) 3,0
(6,6) FA
F4 - - - - 7,5
(19,0) 6,6
(16,0) 2,4
(6,6) 3,0
(6,6)
F2 - - 5,2
(13,3) 3,9
(10,0) - - - -
F3 - - 5,2
(13,3) 3,9
(10,0) - - - - FT
F4 - - 5,2
(13,3) 3,9
(10,0) - - - -
Legenda: MP = matéria-prima, G = granulometria, SM = sabugo de milho, FS = fibra de soja, FT = farelo de trigo, FA = farelo de arroz, F1 a F4 = faixa de granulometria.
24
Os meios de cultivo utilizados para crescimento micelial em placas de Petri
que continham FM ou GM não foram utilizados para a fase experimental de
crescimento do fungo em tubos de borosilicato (Tabela 2). Ambas as matérias-
primas, são ricas em amido, que por sua vez, gelatinizam em temperaturas acima de
52 ºC, para FM, e 62 ºC para GM (BELITZ; GROSCH, 1997). Devido à
autoclavagem do substrato haveria a formação do gel, provavelmente limitando a
passagem de oxigênio ao longo do tubo e inviabilizando o crescimento do micélio.
Desta forma, algumas matérias-primas nutricionalmente adequadas para o
crescimento micelial em placas de Petri, não tem o mesmo resultado, em maior
escala, principalmente no sistema axênico de produção, em que calor é utilizado
para esterilizar o substrato. Entretanto especula-se que em pequenas quantidades,
desde que este complexo seja capaz de ser degradado pelo fungo, pode ser fonte
de reserva de água e nutrientes para produção em longo prazo. Isto pode ser
verificado na Figura 2, onde o substrato M7G2 apresentou o menor crescimento
micelial, devido alta concentração de FA, que sofreu gelatinização durante a
autoclavagem, inviabilizando o crescimento micelial. Entretanto o substrato M7G1,
que possui a mesma formulação, exceto a granulometria, não apresentou
gelatinização visível do FA. Este fator físico do substrato proporcionou um
crescimento micelial no M7G1 cerca de 10 vezes maior que no M7G2. Neste caso a
maior granulometria do substrato proporcionou uma maior aeração evitando o
bloqueio físico do micélio.
Observou-se que a G1 proporcionou maior crescimento micelial para todos os
substratos, com exceção do M5G1 e M5G2, em que a menor granulometria
apresentou melhores resultados (Figura 2). A maior granulometria proporciona uma
maior aeração do meio e permite ao micélio crescer em superfície mais rapidamente
na maioria dos meios. Entretanto para o substrato M5G1 e M5G2, a menor
granulometria não implicou em limitação da aeração permitindo, portanto, um melhor
aproveitamento do substrato devido a maior área específica do meio.
O FA que não foi eficiente nas placas de Petri apresentou resultado
semelhante nos tubos de borosilicato, exceto no CTG1. Nos substratos M7G1 e
M7G2 foi utilizado uma maior quantidade de FA (Tabela 5), isto sugere que houve
gelatinização alterando a matéria-prima de forma a dificultar a sua metabolização e,
portanto, a menor velocidade de crescimento do micélio verificado claramente no
25
substrato M7G2. No CTG2 a menor granulometria do SM dificultou o maior
crescimento do fungo de forma similar a maioria dos tratamentos com esta
granulometria. Já o CTG1 apesar de nutricionalmente ser menos eficiente,
apresentou condições melhores de aeração o que permitiu o maior crescimento do
fungo. Portanto os fatores nutricionais e de aeração tem importância na decisão do
tipo de formulação utilizada e merece atenção por parte dos produtores.
Figura 2. Crescimento micelial da linhagem U6/8 de Pleurotus ostreatus durante 49 dias em tubos de borosilicato. Colunas seguidas da mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).
A cinética de crescimento micelial (Figura 2) mostra um crescimento uniforme
entre os tratamentos ao longo do tempo, com taxas de crescimento semelhantes,
exceto do M7G2. Para M5G2, M6G1 e CTG1 a velocidade média de crescimento do
micélio foi de 6,1 mm/dia, para M5G1 foi de 4,9 mm/dia e para M6G2, M7G1, e
CTG2 foi de 3,7 mm/dia. Na Figura 2 observa-se que ao longo do tempo, houve uma
diminuição do crescimento do micélio do dia 27 ao dia 35, provavelmente devido à
diminuição na demanda de oxigênio na parte interna do tubo, retornando a
velocidade de crescimento conforme o micélio se aproxima da extremidade do tubo.
Isto é verificado no crescimento de inóculo (spawn) em que ocorre a diminuição da
velocidade de crescimento do micélio após a metade do frasco ou saco. Dessa
forma, a criação de bolsões de ar nestes recipientes pode permitir a manutenção da
velocidade de crescimento do micélio diminuindo o tempo de colonização do
substrato e evitando o surgimento de contaminantes oportunistas.
0
50
100
150
200
250
300
5 9 14 19 23 27 30 35 40 44 49Tempo (Dias)
Méd
ia d
o cr
esci
men
to m
icel
ial (
mm
). M5G1
M5G2
M6G1
M6G2
M7G1
M7G2
CTG1
CTG2
a
b
c
d
26
A densidade micelial foi semelhante entre os substratos no tubo de
borosilicato, confirmando os resultados de densidade micelial encontrados em
placas de Petri.
2.3.3 Determinação da atividade da lacase
Na Figura 3 são apresentados os efeitos das variáveis na passagem do nível
inferior (-1) para o nível superior (+1) sobre a resposta da atividade da lacase. A
variável que mais influenciou a produção da lacase foi o substrato, sendo que os
indutores avaliados exerceram menor efeito na atividade enzimática (Figura 3).
Observa-se que a produção de lacase aumenta quando utilizado o substrato M5G2 e
diminui quando utilizado o substrato CTG1. Isto se deve provavelmente ao tamanho
da partícula de SM, que sendo menor em M5G2 apresenta maior área de contato
para ação da enzima, permitindo o acesso do fungo aos nutrientes.
Figura 3. Efeito em U/g (base seca) das variáveis na passagem do nível inferior (-1) para o nível superior (+1) sobre a resposta da atividade da lacase para a linhagem U6/8 de Pleurotus ostreatus. *Indicativo de diferença significativa pela análise de variância (p<0,05).
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
Fe
Cu
Zn
Mn
Cd
Substrato
Var
iáve
is
Efeito (U/g meio seco)
*
*
*
*
*
27
Pandey (2003) cita o tamanho da partícula como propriedade física essencial
para a atividade enzimática, outros pontos importantes destacados pelo autor são
natureza cristalina, porosidade e área de superfície do substrato. Membrillo et al.
(2008) observaram que a razão geométrica e o tamanho das fibras do bagaço da
cana-de-açúcar influenciam fortemente o perfil da atividade enzimática do gênero
Pleurotus. Isso se deve provavelmente, ao perfil da lacase que possui massa
molecular alta, não conseguindo penetrar fundo nos tecidos, agindo na lignina
presente na superfície das partículas do substrato (WIDSTEN, KANDELBAUER,
2008).
Uma maior concentração de lignina no substrato aumenta a atividade da
lacase (NILADEVI; PREMA, 2008), no entanto, observamos que a disponibilidade da
lignina é fundamental. Na tabela 6 é apresentada a composição química do
substrato, observa-se que a porcentagem de minerais é semelhante nos dois
substratos, enquanto o conteúdo protéico é o dobro em M5G2, isto se deve a
granulometria, pois em partículas menores concentra-se compostos cristalinos como
as proteínas, que podem facilmente sofrer quebra mecânica. Já em frações mais
grossas concentram-se fibras de maior elasticidade, como lignina e celulose
(BELITZ; GROSCH, 1997; FELLOWS, 2006; FENNEMA, 2000). Em relação às
fibras, observa-se que uma maior quantidade de lignocelulose está presente no
CTG1 (Tabela 6). Considerando que no SM cerca de 35% da lignocelulose é lignina
(NEIVA-JUNIOR et al., 2007), seria esperado que este substrato de cultivo induzisse
uma maior atividade da lacase. Contudo isto não foi verificado (Figura 3), indicando
que a área de contato entre o substrato e a enzima possui maior efeito para sua
maior produção.
Tabela 6. Conteúdo de cinzas, proteínas, fibras de detergente neutro (FDN) e fibras de detergente ácido (FDA) nos substratos de cultivo para determinação da atividade da lacase na linhagem U6/8 de Pleurotus ostreatus. Valores expressos em porcentagem de base seca.
Substrato Cinzas Proteína FDN FDA
M5G2 2,81 10,55 70,29 30,84
CTG1 2,86 5,19 77,49 49,92
28
Em relação aos indutores avaliados observou-se, com exceção do metal Fe,
que todos os outros apresentaram efeito significativo no aumento da produção de
lacase (Figura 3). Baldrian et al. (2005) verificaram um aumento na degradação de
lignocelulose por Pleurotus ostreatus na presença de Cu, Mn e Zn. Cu e Mn
participam diretamente do processo de degradação da lignina, o primeiro atua como
cofator para o centro catalítico da lacase e o Mn participa diretamente do ciclo da
peroxidase Mn-dependente, outra enzima envolvida na degradação da lignina
(BALDRIAN, 2003; PALMIERI, et al. 2000). O Cd também é citado como indutor do
aumento da atividade da lacase em Pleurotus ostreatus em concentrações de 1 a 5
mM (BALDRIAN; GABRIEL, 2002). Segundo Singhal e Rathore (2001) o Zn é
necessário para o funcionamento do sistema enzimático lignolítico, atuando na
mineralização e solubilização da lignina. Sendo assim a adição de indutores
metálicos contribui de forma significativa para o aumento da produção de lacase por
Pleurotus ostreatus (U6/9).
29
2.4 CONCLUSÃO
Em função da metodologia adotada e das condições experimentais concluiu-
se que o gênero Pleurotus é capaz de degradar uma ampla variedade de substratos,
sendo as matérias-primas mais adequadas ao crescimento micelial em placas de
Petri a fibra de mandioca, sabugo de milho, fibra de soja e farelo de trigo. Já a
serragem não foi adequada nas condições avaliadas, demonstrando a influência da
composição química do meio de cultivo no crescimento micelial. Diferentes
granulometrias afetam a composição física e nutricional do substrato de cultivo e
interferem no crescimento do fungo. Tamanho de partículas diferentes, de uma
mesma matéria-prima, tem relação C/N distintas. O maior diâmetro da partícula do
substrato proporciona maior crescimento micelial devido à maior aeração do
substrato. As matérias-primas que gelatinizam após autoclavagem (121 ºC) não são
adequadas ao crescimento micelial axênico de fungos quando em quantidades
iguais ou superiores a 48% do substrato. O aumento da atividade da lacase esta
relacionado diretamente a maior quantidade de lignina disponível pela maior área de
contato das partículas (menores) do substrato.
AGRADECIMENTOS
À Universidade Paranaense, CNPq e Fundação Araucária pelo apoio financeiro e
pela bolsa de estudos concedida.
30
2.5. REFERÊNCIAS
ALENCAR, M.L.C. B. B.; ALVARENGA, M. G. Farelo de arroz: composição química e seu potencial como alimento. Arquivos de Biologia e Tecnologia, Porto Alegre, v. 34, n. 1, p. 95-108, 1991.
ARORA, D. S.; GILL, P. K. Effects of various media and supplements on lacase production by some white rot fungi. Bioresource Technology, Amsterdam, v. 77, p. 89-91, 2001.
BALDRIAN, P. Interactions of heavymetals with white-rot fungi. Enzyme and Microbial Technology, Amsterdam, v. 32, p. 78-91, 2003.
BALDRIAN, P.; GABRIEL, J. Copper and cadmium increase activity in Pleurotus ostreatus. FEMS Microbiology, Amsterdam, v. 206, p. 69-74, 2002.
BALDRIAN, P.; VALASKOVÁ, V.; MERHAUTOVÁ, V.; GABRIEL, J. Degradation of lignocellulose by Pleurotus ostreatus in the presence of copper, manganese, lead and zinc. Research in Microbiology, Amsterdam, v. 156, p. 670-676, 2005.
BELITZ, H. D.; GROSCH, W. Química de los alimentos. Zaragoza: Acribia, 1997. 1087 p.
CEREDA, M. P. Valorização de subprodutos como forma de reduzir custos de produção. In: Culturas de tuberosas amiláceas latino americanas: Manejo, uso e tratamento de subprodutos da industrialização da mandioca. São Paulo: Fundação Cargill, 2001, 320p.
DIAS, E. S.; KOSHIKUMO, E. M. S.; SCHWAN, R. E. F.; SILVA, R. Cultivo do cogumelo Pleurotus sajor-caju em diferentes resíduos agrícolas. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 27, n. 6, p. 1363-1369, 2003.
DI LENA, G.; PATRONI, E.; QUAGLIA, G. B. Improving the nutritional value of wheat bran by a white rot fungus. International Journal of food science and technology, Oxford, v. 32, p. 513-519, 1997.
ECKHOFF, S. R.; PAULSEN, M. R. Maize. In: HENRY, R. J. KETTLEWELL, P. S. Cereal grain quality. London: Chapmam & Hall, 1996.
EIRA, A. F. Cultivo do cogumelo medicinal Agaricus blazei (Murrill) ss. Heinemann ou Agaricus brasiliensis (Wasser et al.). Viçosa: Aprenda fácil, 2003.
31
EIRA, F. C.; MEIRELLES, W. F., PACCOLA-MEIRELLES, L. D. Shiitake production on corncob substrates. Revista Brasileira de Milho e Sorgo, Sete Lagoas, v. 4, n. 2, p. 141-148, 2005.
EIRA, A. F.; MONTINI, R. M. C. Manual de cultivo do shiitake (Lentinula edodes (Berk.) Pegler). Botucatu: FEPAF, 1997. 38p.
ELISASHVILI, V.; PENNINCKX, M.; KACHLISHVILI, E.; TSIKLAURI, N.; METREVELI, E.; KHARZIANI, T.; KVESITADZE, G. Lentinus edodes and Pleurotus species lignocellulolytic enzymes activity in submerged and solid-state fermentation of lignocellulosic wastes of different composition. Bioresource Technology, Amsterdam, v. 99, p. 457-462, 2008.
FELLOWS, P. J. Tecnologia do Processamento de Alimentos: princípios e prática. 2ed. Porto Alegre: Artmed, 2006. 602p.
FENNEMA, O. R. Química de los alimentos. Zaragoza: Acríbia, 1993. 1051p.
GABRIEL, V. Cereal straw and corncobs. In: Shiitake cultivation. Korea: Mushworld, 2005. p. 86-90.
GALHAUP, C,; GOLLER, S.; PETERBAUER, C. K.; STRAUSS, J.; HALTRICH, D. Characterization of the major lacase isoenzyme from Trametes pubescens and regulation of its synthesis by metal ions. Microbiology, Londres, v. 148, p. 2159-2169, 2002.
GIANFREDA, L.; XU, F.; BOLLAG, J. M. Laccases: a useful group of oxidoreductive enzymes. Biorremediation Journal, Boca Raton, v. 3, n. 1, p. 1-26, 1999.
GRIENSVEN, L. J. L. D. The cultivation of mushrooms. Horst: Mushroom Experimental Station. 1988. 515p.
HERRERA, O. M. Produção, economicidade e parâmetros energéticos do cogumelo Agaricus blazei: um enfoque na cadeia produtiva. Botucatu, 2001. Originalmente apresentada como dissertação de doutorado, Departamento de Defesa Fitossanitária, Faculdade de Ciências Agronômicas, Unesp, 2001.
HOSENEY, R. C. Princípios de ciencia y tecnologia de los cereales. Zaragoza: Acribia, 1991. 320p.
32
HOSSAIN, S., HASHIMOTO, M., CHOUDHURY, E., ALAM, N., HUSSAIN, S., HASAN, M., CHOUDHURY, S. & MAHMUD, I. Dietary mushroom (Pleurotus ostreatus) ameliorates atherogenic lipid in hypercholesterolaemic rats. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, Oxford, v. 30, p. 470, 2003.
HOU, H.; ZHOU, J.; WANG, J.; DU, C.; YAN, B. Enhancement of laccase production by Pleurotus ostreatus and its use for the decolorization of anthraquinone dye. Process Biochemistry, Amsterdam, v. 39, p. 1415-1419, 2004.
HWANG, H. J.; KIM, S. W.; LIM, J. M.; JOO, J. H.; KIM, H. O.; KIM, H. M.; YUN, J. W. Hypoglycemic effect of crude exopolysaccharides produced by a medicinal mushroom Phellinus baumii in strptozotocin-induced diabetic rats. Life Sciences, Oxford v. 76, p. 3069-3080, 2005.
LEHNINGER, A. L.; NELSON, D. L.; COX, M. M. Princípios de Bioquímica. 2ed. São Paulo: Sarvier, 1995, 803p.
LINDE, G. A., MACHADO, R. P. Fibra de soja: benefícios a saúde e aplicações. Food Ingredients, v. 11, n. 3, 2001.
MEMBRILLO, I.; SÁNCHEZ, C.; MENESES, M.; FAVELA, E.; LOERA, O. Effect of substrate particle size and additional nitrogen source on production of lignocellulolytic enzymes by Pleurotus ostreatus strains. Bioresource Technology, Amsterdam, v. 99, n. 16, p. 7842-7847, 2008.
NEIVA-JUNIOR, A. P.; SILVA-FILHO, J. C.; TIESENHAUSEN, I. M. E. V. V.; ROCHA, G. P.; CAPELLE, E. R.; COUTO-FILHO, C. C. C. Efeito de diferentes aditivos obre os teores de proteína bruta, extrato etéreo e digestibilidade da silagem de maracujá. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 31, n. 3, p.871-875, 2007.
NILADEVI, K. N.; PREMA, P. Effect of inducers and process parameters on laccase prodution by Stretomyces psammoticus and its application in dye decolourization, Bioresource Technology, Amsterdam, v. 99, p. 4583-4589, 2008.
PALMIERI, G.; GIARDINA, P.; BIANCO, C.; FONTANELLA, B.; SANNIA, G. Copper induction of lacase isoenzymes in the ligninolytic fungus Pleurotus ostreatus. Applied and Enviromental Microbiology, Washington, v. 66, p. 920-924, 2000.
PANDEY, A. Solid–state fermentation. Biochemical Engineering Journal, Amsterdam, v. 13, p. 81-84, 2003.
33
PARANÁ. Secretaria da Agricultura e do Abastecimento do Paraná. Relatório da safra 2006/2007. Disponível em: <http://www.pr.gov.br/seab/deral/Relat%f3rio%20da%20Safra_JAN_07.pdf> Acesso em 21/02/2007.
POPPE, J. Substrate. In: Shiitake cultivation. Korea: Mushworld, 2005. p. 75-85.
RAJARATHNAM, S.; BANO, Z. Pleurotus Mushrooms. Parte I A. Morfology, life cycle, taxonomy, breeding and cultivation. CRC Critical Reviews in Food Science and Nutrition, Boca Raton, v. 26, n. 2, p.157-223, 1987.
ROBINSON, T.; CHANDRAN, B.; NIGAM, P. Studies on the production of enzymes by white-rot fungi for the decolourisation of textil dyes. Enzyme and Microbial Technology, Amsterdam, v. 29, p. 575-579, 2001.
RODRIGUEZ, S.; SANTORO, R.; CAMESELLE, C., SANROMÁN, A. Effect of different parts of the corn cob employed as a carrier on lignolytic activity in solid state cultures by P. chrysosporium. Bioprocess Engineering, Amsterdam, v. 18, p.251-255, 1998.
SÁNCHEZ, C. Modern aspects of mushroom culture technology. Applied Microbiology and Biotechnology, Berlim, v. 64, p. 756-762, 2004.
SHARMA, S., MADAN, M. Microbial protein from leguminous and non-leguminous substrates. Acta Biotechnologica, Berlim v. 13, p. 131-139, 1993.
SHU, C.; XU, C., LIN, E. Production, purification and partial characterization of a novel endo-b-1,3-glucanase from Agaricus brasiliensis. Process Biochemistry, Barking, v. 41, p. 1229-1233, 2006.
SILVA, E. G.; DIAS, E. S.; SIQUEIRA, F. G.; SCHWAN, R. F. Análise química de corpos de frutificação de Pleurotus sajor-caju cultivado em diferentes concentrações de nitrogênio. Ciência e Tecnologia de Alimentos, Campinas, v. 27, n. 1, p. 72-76, 2007.
SILVA, E. M.; MACHUCA, A.; MILAGRES, A. M. F. Effect os cereal brans on Lentinula edodes growth and enzyme activies during cultivation on forestry waste. Letters in Applied Microbiology, v. 40, p. 283-288, 2005.
SILVA, D. J.; QUEIROZ, A. C. Análise de alimentos: métodos químicos e biológicos. Viçosa: UFV, 2002. 235p.
34
SINGHAL, V.; RATHORE, V. S. Effects of Zn2+ and Cu2+ on growth, lignin degradation and ligninolytic enzymes in Phanerochaete chrysosporium. World Journal Microbiology and Biotechnology, Oxford, v. 17, p. 2235-2240, 2001.
SINGH, M. P. Biodegradation of lignocelulosic waste through cultivation of Pleurotus sajor-caju. Mushroom Science, Sidney, v. 15, p. 517-521, 2000.
STAJIC, M.; PERSKY, L.; FRIESEM, D. HADAR, Y.; WASSER, S. P.; NEVO, E.; VUKOJEVIC, J. Effect of different carbon and nitrogen sources on lacase and peroxidases production by selected Pleurotus species. Enzyme and Microbial Technology, Amsterdam, v. 38, p. 65-73, 2006.
WASSER, S. P.; WEIS, A. L. Medicinal properties of substances occurring in higher Basidiomycetes mushrooms: current perspectives. International Journal of Medicinal Mushrooms, v. 1, p. 31-62, 1999.
WIDSTEN, A.; KANDELBAUER, A. Laccase applications in the forest products industry: a review. Enzyme and Microbial Technology, Amsterdam, v. 42, p. 293-307, 2008.
WU, J. Z.; CHEUNG, P. C. K.; WONG, K. H.; HUANG, N. I. Studies on submerged fermentation of Pleurotus tuber-regium (Fr.) Singer. Part 2: effect of carbon-to-nitrogen ratio of culture medium on the content and composition of the mycelial dietary fibre. Food Chemistry, Barking, v. 85, n. 1, p. 101-105, 2004.
35
3. FATORES FÍSICO-QUÍMICOS PRESENTES NO SUBSTRATO PARA O
CULTIVO DE Lentinula edodes
3.1 INTRODUÇÃO
A produção anual de resíduos da agricultura é estimada em 500 milhões de
toneladas sendo que enquanto uma parte é utilizada para alimentação animal, outra
grande parte é acumulada no ambiente (POPPE, 2005; RAJARATHNAM; BANO,
1987). O Brasil é um dos maiores produtores mundiais de soja (Glycine max),
mandioca (Manihot esculenta) e milho (Zea mays). Grande parte da produção
nacional é proveniente do estado do Paraná, sendo o Estado também produtor de
arroz (Oryza sativa) e trigo (Triticum aestivum) (PARANÁ, 2007). O processamento
dos vegetais gera resíduos em função do processo tecnológico adotado, podendo os
subprodutos serem constituídos de fibras, farelos, bagaços, cascas e outros
materiais lignocelulósicos com potencial para o crescimento de microrganismos
(CEREDA, 2001; HOSENEY, 1991).
Os cogumelos comestíveis são uma alternativa de melhor utilização destes
subprodutos, através do processo de bioconversão, auxiliando na diminuição de
resíduos e gerando biomassa de interesse comercial (POPPE, 2005; SILVA et al.,
2005). O fungo Lentinula edodes possui enzimas extracelulares lignocelulóticas
capazes de degradar eficientemente materiais lignocelulósicos (LECHNER;
PAPINUTTI, 2006). A lacase é a principal enzima envolvida na degradação de
lignina do sistema lignolítico de fungos (GIANFREDA et al., 1999), sendo sua
atividade fortemente influenciada pela linhagem, composição do substrato e
condições de cultivo do fungo (ELISASHIVILI, 2008; HOU et al., 2004; STAJIC et al.,
2006). As propriedades físicas do substrato de cultivo incluindo natureza cristalina e
amorfa, área acessível, área de superfície, porosidade e principalmente tamanho da
partícula são essenciais para a atividade enzimática (PANDEY, 2003). Existe uma
diversidade de resíduos lignocelulósicos regionais que apresentam estas
características e que podem ser utilizados como substrato.
36
Devido à sua capacidade de degradar compostos fenólicos, a lacase pode ser
aplicada em diversas áreas da indústria, como branqueamento e aumento da
resistência do papel e tratamento de efluentes (WIDSTEN; KANDELBAUER, 2008).
Sendo assim é importante o aumento da habilidade dos basidiomicetos produzirem
lacase para aplicações industriais (HOU et al., 2004). O aumento na produção de
lacase por Pleurotus ostreatus pode ocorrer com a adição de indutores (ARORA;
GILL, 2001; BALDRIAN, 2003; BALDRIAN et al., 2005; BALDRIAN; GABRIEL,
2002).
O interesse da comunidade científica internacional pelos cogumelos tem
aumentado devido às propriedades medicinais (EIRA, 2003). O cogumelo Lentinula
edodes, conhecido como shiitake, exibe propriedades antimicrobianas (ISHIKAWA et
al., 2001), antitumorais (SUZUKI et al., 1994), antimutagênicas (SOUZA-PACCOLA
et al., 2004); antivirais (SAZAKI et al., 2001; SUZUKI et al., 1990) e
hipocolesterolêmicas (SAZAKI et al., 2001). Os diferentes biocompostos produzidos
por cogumelos podem ser extraídos diretamente do micélio do fungo (HWANG et al.,
2005; SHU et al., 2006), não necessitando o desenvolvimento do corpo de
frutificação, o que diminui o custo do processo, pois envolve um menor número de
mão de obra e etapas de produção. Desta forma, a análise do crescimento micelial e
a otimização deste processo é fundamental para a produção de princípios ativos
terapêuticos em escala industrial.
Outro processo que utiliza a produção de biomassa micelial é a indústria de
produção de inoculantes (spawn). Inoculantes são propágulos viáveis do fungo,
geralmente em veículo sólido, utilizados para colonizar o substrato de produção
(EIRA, 2003). Segundo Herrera (2001), cerca de 80% dos produtores de cogumelos
não produz substrato de cultivo próprio, encarecendo o produto final aos
consumidores. Portanto, a busca de matérias-primas alternativas regionais poderia
abrir perspectivas de preparo de inóculo e de substrato próprios, evitando os custos
de transporte de outras regiões (DIAS et al., 2003).
Buscando substratos mais adequados a produção micelial e potencial
produção de cogumelos o objetivo deste trabalho foi avaliar a composição físico-
química de diferentes formulações de substratos para o crescimento micelial a partir
de subprodutos da agroindústria para o fungo Lentinula edodes.
37
3.2 MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi realizado no Laboratório de Biologia Molecular da
Universidade Paranaense - Campus sede, Umuarama, Paraná, Brasil. Foram
utilizadas as linhagens U6/1, U6/11 e U6/12 de Lentinula edodes provenientes da
micoteca da Universidade Estadual de Londrina - UEL. O fungo foi cultivado em
meio batata-dextrose-ágar (BDA) (39 g/L) a 25 ºC em estufa sem circulação de ar.
Após a recuperação do vigor de crescimento, foram selecionadas como inóculo
placas com crescimento radial, ramificação homogênea e sem setoriamento.
3.2.1 Crescimento em placas de Petri
As matérias-primas utilizadas para compor os meios de cultivo foram: fibra de
soja (FS), farelo de trigo (FT), farelo de arroz (FA), grãos de milho (GM), sabugo de
milho (SM), fibra de mandioca (FM) e serragem de eucalipto (SE). A FM foi obtida a
partir de tubérculos, provenientes do horto medicinal da Universidade Paranaense,
descascados, lavados e triturados com água em liquidificador. A massa obtida foi
transferida para um filtro de pano e lavada com água corrente, em seguida foi seca
em estufa com circulação de ar a 45 ºC por dez horas. A FS (Fibrarich FN –
17/01/2001) foi fornecida pela empresa Solae do Brasil. Os demais subprodutos
foram obtidos de cooperativas da região. Todas as matérias-primas desidratadas
foram moídas em liquidificador e peneiradas a fim de obter granulometria menor que
355µm, e armazenadas em freezer a -20 ºC.
As matérias-primas foram analisadas quanto o seu teor de nitrogênio
determinado pelo método de Kjeldahl, umidade em estufa a 105 ºC até massa
constante e cinzas em mufla a 550 ºC. A partir destes resultados, os diferentes
meios de cultivo foram calculados a fim de obter-se relação C/N de 25 (OEI, 1996). A
relação C/N foi calculada conforme Griensven (1988), considerando que 50% da
matéria orgânica é composta por carbono (conteúdo de massa seca total menos
cinzas, multiplicado por 0,5). O meio de cultivo foi preparado com ágar (15g/L) e
30g/L de diferentes misturas de matéria-prima e então autoclavado a 121 ºC por 20
min. Quando necessário o pH do meio foi ajustado para 6,0 com NaOH ou HCl
38
previamente esterilizados por filtração (filtro de 0,22 µm), em seguida os meios
foram vertidos em placas de Petri de 90 mm.
Para a inoculação dos meios de cultivo foi retirado um cilindro de cinco
milímetros de diâmetro da área periférica de crescimento do micélio e disposto no
centro da placa de Petri contendo meio de cultivo, tomando-se o cuidado para que o
micélio do cilindro ficasse em contato direto com o meio de cultivo. As placas
inoculadas foram dispostas para crescimento em estufa a 25 ºC no escuro por 10
dias.
O crescimento foi acompanhado pela medida do diâmetro micelial através de
paquímetro em quatro pontos diferentes das placas de Petri, sendo estes valores
utilizados para a determinação da média de crescimento de cada meio de cultivo. A
densidade micelial e possíveis degenerações do crescimento foram registradas
através de fotografia digital ao final do experimento.
Todos os tratamentos tiveram quatro réplicas. A média e o desvio padrão do
crescimento do micélio foram calculados e as diferenças determinadas pela análise
de variância e teste de Tukey (p<0,05).
3.2.2 Crescimento em tubos de borosilicato
Os melhores meios de cultivo e a melhor linhagem do crescimento em placas
de Petri foram selecionadas para esta etapa experimental. Foi efetuada uma
estratificação granulométrica das matérias-primas componentes do substrato de
cultivo em quatro faixas principais, sendo determinado então, dois níveis de
granulometria. Cada diferente faixa foi analisada quanto à quantidade de nitrogênio,
carbono, cinzas e umidade conforme descrito no item 2.1. A formulação dos
substratos foi calculada para manter a relação C/N de 25 (OEI, 1996) e todos os
tratamentos tiveram quatro réplicas.
Depois de misturados os componentes do substrato em Erlenmeyers e
autoclavados com excesso de água ultra pura a 121 ºC por 10 min retirou-se o
excesso de água e adicionou-se carbonato de cálcio (CaCO3) para ajustar o pH para
6,0. Os substratos foram acondicionados nos tubos de borosilicato (de 300 mm por
30 mm) com densidade média de 0,70 g/cm3 e após 24 h da primeira autoclavagem
foram novamente autoclavados a 121 ºC por 40 min.
39
Em seguida inoculou-se os tubos com cilindros miceliais de 30 mm de
diâmetro, da área periférica da colônia crescida em meio BDA, de forma a cobrir
toda superfície de uma das extremidades do tubo e foram armazenados em estufa a
25 ºC, com 70% de umidade, no escuro.
O crescimento micelial do fungo foi medido com paquímetro através de quatro
medidas ao longo de cada tubo, sendo estes valores utilizados para a determinação
da média de crescimento do fungo e desvio padrão. A densidade micelial e possíveis
degenerações do crescimento foram registradas através de fotografia digital ao final
do experimento. Os dados obtidos foram analisados e as diferenças determinadas
pela análise de variância e teste de Tukey (p<0,05).
3.2.3 Determinação da atividade da lacase
Com base nos resultados obtidos do crescimento em tubos de borosilicato,
escolheram-se os dois melhores substratos de cultivo e realizou-se um planejamento
fatorial fracionário. A linhagem U6/12 de Lentinula edodes cresceu no substrato
acondicionado em tubos Falcon. A estes substratos foram adicionados água ultra
pura em excesso e então autoclavados a 121 ºC por 10 min. Após o resfriamento foi
removido o excesso de água, adicionado carbonato de cálcio CaCO3 para ajustar o
pH para 6,0 e adicionada soluções de metais para indução da atividade da lacase
(Tabela 3). As soluções de metais foram utilizadas nas concentrações de CuSO4
(2mM), ZnSO4 (1mM), Cd(NO3)2 (2mM), MnSO4 (1mM) e Fe(SO4) (1mM)
(BALDRIAN; GABRIEL, 2002; GALHAUP et al., 2002; ROBINSON et al., 2001). Em
seguida os tubos foram autoclavados a 121 ºC por 40 min, inoculados com o fungo e
mantidos a 25 ºC por quinze dias.
Para a determinação da atividade da lacase foi obtido um extrato bruto (1:4) g
do meio colonizado em tampão acetato de sódio (10 mM, pH 4,2), mantido em
banho de gelo por 1 h com agitação de 30 segundos em vórtex, a cada 15 min. A
mistura foi centrifugada a 9,5 g, a 4 °C, por 2 min, sendo o sobrenadante
considerado o extrato bruto.
A atividade de lacase foi medida pela redução da absorvância de uma mistura
contendo 400 µL do extrato bruto, 1400 µL de água, 900 µL de tampão acetato de
sódio 0,1 M (pH 5,0) e 300 µL de 1 mM de ABTS (C18H18N4O6S4.2H3N). A reação
40
ocorreu a 30 °C por 10 min. Após este período, a reação foi paralisada com a adição
de 100 µL de ácido tricloroacético (5%). Foi então adicionado 8,5 mL de água ultra
pura e realizada a leitura da absorvância a 420 nm. Uma unidade de atividade
enzimática (U) foi definida como 1 µmolar de ABTS oxidado por minuto. Para
calcular a atividade enzimática, o coeficiente de absorção de 3,6 104 M-1cm-1 foi
utilizado.
A fim de quantificar a porcentagem de lignina e celulose presente nos
substratos, realizou-se análise de fibras de detergente neutro (FDN) e fibras de
detergente ácido (FDA). Sendo que FDN representam as fibras insolúveis em
detergente neutro (lignina, celulose e hemicelulose), enquanto FDA representa a
porcentagem de lignina e celulose, fibras insolúveis em detergente ácido (SILVA;
QUEIROZ, 2002).
Tabela 1. Níveis das variáveis indutores metálicos na produção de lacase estudadas no planejamento fatorial fracionário 26-2 (I-III). A sexta variável foi o substrato de crescimento definido pelo teste de crescimento em tubos de borosilicato (item 2.2).
Variáveis Níveis (ppm) -1 +1
Cu 0,000 1,103 Zn 0,000 0,588 Fe 0,000 1,324 Cd 0,000 0,368 Mn 0,000 0,882
41
3.3 RESULTADOS
3.3.1 Crescimento em placas de Petri
Na Tabela 2 é apresentada a análise físico-química das matérias-primas para
o crescimento do fungo em placas de Petri. Observou-se, quanto ao teor de
nitrogênio, que as matérias-primas ficaram divididas em dois grupos. Um grupo de
maior quantidade de nitrogênio composto por FS, FT, FA e GM e outro grupo de
menor quantidade de nitrogênio, composto pelo SM, FM e SE.
Tabela 2. Análise físico-química das matérias-primas para meio de cultivo em placas de Petri (%), em base seca. Matéria-prima
Nitrogênio Carbono* Cinzas Umidade
FS 4,330 44,100 3,83 7,99 FT 2,600 42,310 5,04 10,34 FA 1,760 38,380 12,22 11,03 GM 1,620 43,830 1,15 11,18 SM 0,530 42,850 2,23 12,07 FM 0,090 44,990 0,39 9,64 SE 0,040 33,020 0,12 33,76
Legenda: FS= fibra de soja, FT= farelo de trigo, FA= farelo de arroz, GM= grão de milho, SM= sabugo de milho, FM= fibra de mandioca, SE= serragem de eucalipto. *Carbono calculado segundo Griensven (1988).
Usualmente matérias-primas com maiores concentrações de nitrogênio são
adicionadas a matérias-primas volumosas e com menores concentrações de
nitrogênio. A fim de obter relação C/N de 25 (OEI, 1996) os meios de cultivo foram
formulados independentes deste aspecto. O controle (CT) (Tabela 3) possui relação
C/N de 111 não sendo alterada para não modificar a porcentagem de matéria-prima
usualmente utilizada.
42
Na figura 1 é apresentada a média do crescimento micelial em placas de Petri
das diferentes linhagens de Lentinula edodes. Houve crescimento similar entre as
linhagens estudadas nos diferentes meios de cultivo, ressaltando a semelhança na
capacidade de degradação dos diversos meios pelas linhagens de um mesmo
gênero. Maiores variações ocorreram com os meios de cultura M1, M2 e M3, onde a
linhagem U6/12 (dados não apresentados) apresentou menor crescimento em
relação às demais, o que se deve provavelmente a uma variação da linhagem que
não está apta a degradar estes meios de cultivo.
Tabela 3. Composição dos meios de cultivo (M1 a M12 e controle (CT)) em g e porcentagem do meio, em base seca.
MATÉRIA-PRIMA EM g (%)
FS FT FA GM SM FM SE Total
M1 11,7 (39) - - - - - 18,3 (61) 30,0 (100)
M2 - 19,5 (65) - - - - 10,5 (35) 30,0 (100)
M3 - - 26,4 (88) - - - 3,6 (12) 30,0 (100)
M4 9,3 (31) - - - 20,7 (69) - - 30,0 (100)
M5 - 17,1 (57) - - 12,9 (43) - - 30,0 (100)
M6 - - 25,2 (84) - 4,8 (16) - - 30,0 (100)
M7 1,5 (5) - - 28,5 (95) - - - 30,0 (100)
M8 - 3,9 (13) - 26,1 (87) - - - 30,0 (100)
M9 - 11,1 (37) 18,9 (63) - - 30,0 (100)
M10 12,0 (40) - - - - 18,0 (60) - 30,0 (100)
M11 - 19,8 (66) - - - 10,2 (34) - 30,0 (100)
M12 - - 26,4 (88) - - 3,6 (12) - 30,0 (100)
CT - - 3,0 (10) - - - 27,0 (90) 30,0 (100)
Legenda: FS= fibra de soja, FT= farelo de trigo, FA= farelo de arroz, GM= grãos de milho, SM: sabugo de milho, FM: fibra de mandioca, SE: serragem de eucalipto.
43
Os meios de cultivo com maior crescimento micelial foram M5, M8 e M11
(Figura 1). Ambos são compostos por FT que é o principal subproduto da moagem
do trigo, constituído de uma mistura heterogênea de fragmentos da camada hialina-
aleurona dos grãos, sendo uma excelente fonte de minerais, vitaminas e outros
nutrientes de valor biológico (DI LENA et al., 1997). Entretanto observou-se que a
adição de SE ao meio resultou em crescimento abaixo das outras misturas com FT
(Figura 1). De acordo com Eira e Montini (1997), a serragem possui uma
composição nutricional pobre, tornando-se indispensável sua correção com aditivos.
Os substratos com serragem de eucalipto apresentaram menor crescimento micelial
(Figura 1), exceto o CT, apresentando crescimento ligeiramente superior.
Figura 1. Crescimento do fungo Lentinula edodes (média das linhagens U6/1, U6/11 e U6/12) após dez dias de crescimento em diferentes meios de cultivo. Colunas seguidas da mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).
A FM e a FS apesar de possuírem uma porosidade que permite alta
capacidade de absorção de água e melhor acesso do fungo aos nutrientes (LINDE;
MACHADO, 2001), apresentaram resultados intermediários. Exceto no M11, onde
houve maior crescimento micelial quando adicionado FT a FM. Crescimento
intermediário também foi observado em meios de cultivo com FA, GM e SM, (Figura
1). O FA é o subproduto mais importante do arroz, sendo constituído pelo gérmem e
pela camada de aleurona, rico em fibras, minerais e proteínas (ALENCAR;
ALVARENGA, 1991). Embora seja muito utilizado na suplementação de substratos
para cultivo de fungos (RAJARATHNAM; BANO, 1987; SINGH, 2000), observou-se
0
10
20
30
40
50
60
70
80
M2 M3 M1 M10 M4 CT M12 M6 M9 M7 M5 M8 M11
Meios de cultivo
Diâ
met
ro d
e cr
esci
men
to d
o m
icél
io (
mm
).
f
e
ee
dd cd cd
bc bc abc ab a
44
crescimento medianos nos meios de cultivo com adição de farelo de arroz. O SM é
um material poroso que absorve grande quantidade de água permitindo acesso
enzimático do fungo aos nutrientes (RODRIGUEZ et al., 1998), sendo usualmente
utilizado como material volumoso em substratos para cultivo de fungos (GABRIEL,
2005). Segundo Neiva-Junior (2007) o SM tem uma porcentagem de lignina e
celulose de 16,04 e 28,99% respectivamente, sendo fonte de lignocelulose para
crescimento de microrganismos. Já o GM possui alta concentração de amido
encapsulado na matriz protéica do seu endosperma, fonte rica de carbono e
nitrogênio (ECKHOFF; PAULSEN, 1996).
A análise visual da densidade do micélio (dados não apresentados) mostrou
vigor semelhante entre as diferentes linhagens nos diversos meios de cultivo,
evidenciando um adequado provimento de nutrientes para o fungo.
3.3.2 Crescimento em tubos de borosilicato
Para a formulação dos substratos em tubos de borosilicato foi realizada uma
estratificação granulométrica das matérias-primas com tamisador. Na faixa 1 (F1) o
tamanho das partículas foram de 1,7 a 5 mm, faixa 2 (F2) de 0,8 a 1,7 mm, faixa 3
(F3) de 0,3 a 0,8 mm e faixa 4 (F4) menor que 0,3 mm. Foram determinados dois
níveis de granulometria. No primeiro nível (G1) usou-se a faixa F1 para a matéria-
prima com menor quantidade de nitrogênio e F2 a F4 para a matéria-prima com
maior quantidade de nitrogênio. No segundo nível (G2) usou-se a faixa F2 a F4 para
ambas as matérias-primas do substrato. Na G2 as matérias-primas foram
adicionadas de forma proporcional para cada faixa, assim como no G1 para as
faixas F2 a F4.
Realizou-se então, uma análise físico-química das diferentes faixas de
granulometria para cada matéria-prima, conforme Tabela 4, mantendo-se a relação
C/N em 25 e a densidade média de 0,77 ± 0,09 g/cm3. O controle (Tabela 5)
possuem relação C/N de 124 não sendo alteradas para não modificar a
porcentagem de matéria-prima usualmente utilizada.
Pode se observar variação da quantidade de compostos dentro da mesma
matéria-prima dependendo do tamanho das partículas. Isto esta relacionado à
moagem dos subprodutos, onde é esperado que os minerais, por normalmente
45
encontrarem-se na forma de sais de fácil quebra, concentrem-se nas frações de
menor granulometria (FENNEMA, 2000) alterando assim as frações orgânicas e
inorgânicas dos substratos de cultivo. A fração orgânica é responsável pelo
fornecimento de carbono e nitrogênio, enquanto que a fração inorgânica exerce
importante papel na disponibilização de micronutrientes normalmente envolvidos no
funcionamento dos sistemas de transporte celular e das reações enzimáticas
(BELITZ; GROSCH, 1997; FENNEMA, 2000, LEHNINGER et al., 1995). Desta
forma, o conhecimento da composição química das frações granulométricas do
substrato de cultivo é importante para a compreensão do crescimento do fungo em
diferentes substratos.
Tabela 4. Análise físico-química das matérias-primas utilizadas para o crescimento em tubos de borosilicato em porcentagem (base seca).
Resultado de análise (%) MP G Nitrogênio Carbono* Cinzas Umidade
F1 0,453 44,712 1,766 8,810 F2 0,817 44,270 2,301 9,160 F3 1,038 44,250 2,130 9,370
SM
F4 1,229 43,006 4,318 9,670 F1 1,401 43,618 1,243 11,520 F2 0,308 43,661 1,927 10,750 F3 1,634 41,871 5,828 10,430
GM
F4 1,420 39,706 10,698 9,890 F2 0,032 32,511 0,138 34,840 F3 0,059 32,438 0,123 35,000 SE F4 0,028 34,136 0,277 31,450 F2 5,520 43,497 3,736 9,270 F3 4,590 43,826 3,668 8,680 FS F4 4,834 43,616 3,959 8,810 F2 1,959 42,711 5,229 9,350 F3 2,508 41,762 7,696 8,780 FA F4 2,667 39,455 12,040 9,050 F2 3,575 41,935 5,421 10,710 F3 3,820 42,038 4,794 11,130 FT F4 3,299 42,514 3,142 11,830
Legenda: MP = matéria-prima, G = granulometria, SM = sabugo de milho, GM=grão de milho, SE= serragem de eucalipto, FS = fibra de soja, FT = farelo de trigo, FA = farelo de arroz, F1 a F4 = faixa de granulometria. *Carbono calculado segundo Griensven (1988).
Tabela 5. Composição dos substratos (M4G1 a M8G2 e controle (CTG2)) em g e porcentagem do substrato, em base seca.
46
SUBSTRATO EM g (%) MP G
M4G1 M4G2 M5G1 M5G2 M6G1 M6G2 M8G1 M8G2 CTG2
F1 27,0 (68,0)
- 19,7 (50,0)
- 11,6 (30,0)
- - - -
F2 - 9,7 (24,7)
- 7,5 (19)
- 4,6 (11,6)
- - -
F3 - 9,7
(24,7) - 7,5 (19) -
4,6 (11,6) - - -
SM
F4 - 9,7
(24,7) - 7,5 (19) -
4,6 (11,6) - - -
F1 - - - - - - 28,0
(71,0) - -
F2 - - - - - - - 12
(30) -
F3 - - - - - - - 12
(30) - GM
F4 - - - - - - - 12
(30) -
F2 - - - - - - - - 12
(30)
F3 - - - - - - - - 12
(30) SE
F4 - - - - - - - - 12
(30)
F2 4,1
(10,6)
3,4 (8,6) - - - - - - -
F3 4,1
(10,6)
3,4 (8,6) - - - - - - - FS
F4 4,1
(10,6)
3,4 (8,6) - - - - - - -
F2 - - - - 9,2
(23,3) 8,5
(21,7) - - 1,1
(3,3)
F3 - - 9,2
(23,3) 8,5
(21,7) - - 1,1
(3,3) FA
F4 - - 9,2
(23,3) 8,5
(21,7) - - 1,1
(3,3)
F2 - - 6,5
(16,6) 5,6
(14,3) - 3,8
(9,6) 1,1
(3,3)
F3 - - 6,5
(16,6) 5,6
(14,3) - 3,8
(9,6) 1,1
(3,3) FT
F4 - - 6,5
(16,6) 5,6
(14,3) - 3,8
(9,6) 1,1
(3,3)
47
Os meios de cultivo utilizados para crescimento micelial em placas de Petri
que continham FM não foram utilizados para a fase experimental de crescimento do
fungo em tubos de borosilicato (Tabela 1). Esta matéria-prima é rica em amido, que
por sua vez, gelatiniza em temperaturas acima de 52 ºC. Devido à autoclavagem do
substrato haveria a formação deste complexo, provavelmente limitando a passagem
de oxigênio ao longo do tubo e inviabilizando o crescimento do micélio. Desta forma,
algumas matérias-primas nutricionalmente adequadas para o crescimento micelial
em placas de Petri, não tem o mesmo resultado, em maior escala, principalmente no
sistema axênico de produção, em que calor é utilizado para esterilizar o substrato.
Entretanto especula-se que em pequenas quantidades, desde que este complexo
seja capaz de ser degradado pelo fungo, pode ser fonte de reserva de água e
nutrientes para produção em longo prazo. Isto pode ser verificado na Figura 2, onde
o substrato M6G2 apresentou o menor crescimento micelial, devido alta
concentração de FA, que sofreu gelatinização durante a autoclavagem,
inviabilizando o crescimento micelial. Entretanto o substrato M6G1, que possui a
mesma formulação, exceto a granulometria, não apresentou gelatinização visível do
FA. Este fator físico do substrato proporcionou um crescimento micelial no M6G1
cerca de três vezes maior que no M6G2. Neste caso a maior granulometria do
substrato proporcionou uma maior aeração evitando o bloqueio físico do micélio.
Embora seja observado na Figura 2 que o M8G2 foi um dos melhores
substratos de cultivo, este dado não será considerado, pois após a autoclavagem
ocorreu gelatinização, passando o substrato a ocupar menor volume e se
distanciando da parede do tubo de borosilicato. Isto permitiu que o micélio crescesse
em superfície, não penetrando o substrato e consequentemente não degradando
seus componentes. Devido à gelatinização observada, o fungo possivelmente não
conseguiria penetrar no substrato, obtendo então, resultados de crescimento inferior
ao M8G1. De acordo com a Figura 1, o M8 é nutricionalmente adequado, mas
fisicamente seu crescimento poderia ser inferior em tubos de borosilicato por causa
da gelatinização.
Observou-se que a G1 proporcionou maior crescimento micelial no substrato
M5 e M6 quando comparada a G2 (Figura 2). A maior granulometria proporcionou
uma maior aeração do meio, permitindo ao micélio crescer mais rapidamente.
Entretanto para os substratos M4G1 e M4G2, a menor granulometria não implicou
48
em limitação da aeração permitindo um melhor aproveitamento do substrato devido
a maior área específica do meio, uma boa aeração do M4G2 se deve provavelmente
à alta porcentagem de SM (Tabela 2), que mesmo na G2 proporcionou uma boa
porosidade ao substrato. O M4 e M5 possuem alta porcentagem de SM, no entanto
o substrato M5G1com maior porcentagem de FT foi o que apresentou resultado
destacado, possivelmente devido à rica composição química do FT e à maior
granulometria quando comparado a M5G1 (Figura 2). Portanto os fatores
nutricionais e de aeração tem importância na decisão do tipo de formulação utilizada
e merece mais experimentos.
Figura 2. Crescimento micelial de Lentinula edodes aos 49 dias em tubos de borosilicato. Colunas seguidas da mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey (p<0,05). G1 = granulometria do substrato maior; G2 = granulometria do substrato menor.
O CTG2 apresentou o melhor resultado de crescimento micelial (Figura 2). O
cogumelo L. edodes é comumente cultivado em toras de madeira sendo que no
Brasil, opta-se pelo eucalipto, uma madeira de custo acessível encontrada em quase
todas as regiões, a fim de baratear a produção (EIRA et al., 2005; EIRA; MONTINI,
1997). A tora de madeira possui uma alta relação C/N, acima de 200 (EIRA;
MONTINI, 1997), bem como o CTG2, onde a relação C/N é de 124, enquanto os
demais substratos de cultivo possuem relação C/N de 25 (OEI, 1996). O principal
material utilizado no cultivo axênico de L. edodes é a serragem com adição de
0
50
100
150
200
M6 G2 M8 G1 M6 G1 M4 G1 M5 G2 M4 G2 M5 G1 M8 G2 CT G2
Substratos
Cre
scim
en
to m
icel
ail
(mm
)
abab b
b
b
c
d e
G1
G2
a
49
outros subprodutos como farelo de trigo, farelo de arroz, farelo de soja, entre outros
(EIRA; MINHONI, 1997; SILVA et al., 2005).
A densidade micelial foi semelhante entre os substratos no tubo de
borosilicato, confirmando os resultados de densidade micelial encontrados em
placas de Petri e evidenciando sua qualidade nutricional para o crescimento micelial
de Lentinula edodes.
3.3.3 Determinação da atividade da lacase
Na Figura 3 são apresentados os efeitos das variáveis na passagem do nível
inferior (-1) para o nível superior (+1) sobre a resposta da atividade da lacase.
A variável que mais influenciou a produção da lacase foi o Fe (Figura 3).
Observa-se que a produção de lacase aumenta em aproximadamente 5 unidades
enzimáticas quando utilizado o Fe como indutor. No entanto há poucos relatos na
literatura sobre a utilização do Fe como indutor da atividade da lacase. Giardina et
al. (1999), relatam que uma das isoenzimas (POXAw) da lacase produzida por P.
ostreatus possui um átomo de Fe em sua estrutura, sendo assim o Fe possuiria
papel importante na produção desta isoenzima. Também observou-se aumento na
produção de lacase quando adicionado Mn (Figura 3), este metal participa
diretamente da degradação de lignina, atuando no ciclo da peroxidase Mn-
dependente (BALDRIAN, 2003, PALMIERI, et al., 2000). Já o Cu, o Cd e o Zn
apresentaram efeito negativo na produção de lacase, sendo que o Cu não
apresentou efeito significativo. Singhal e Rathore (2001) relatam que baixas
concentrações de Zn e Cu são necessárias ao desenvolvimento do sistema
lignolítico de fungos, mas altas concentrações causam inibição. O mesmo foi
observado por Baldrian et al. (1996) com o a adição de Cd em Phanerochaete
chrysosporium. Dessa forma possivelmente a adição destes indutores foi em
concentração maior que a capacidade do fungo em utilizá-la, causando efeito
negativo na atividade da lacase.
50
Figura 3. Efeito em U/g (base seca) das variáveis na passagem do nível inferior (-1) para o nível superior (+1) sobre a resposta atividade da lacase para o fungo Lentinula edodes. * indicativo de diferença significativa pela análise de variância (p<0,05).
Em relação ao substrato de cultivo, observa-se que a atividade da lacase
aumenta com o uso do meio CTG2 e diminui quando utilizado o substrato M8G2
(Figura 3). Ambos os substratos possuem a granulometria mais fina, apresentando
maior área de contato para ação da enzima e permitindo o acesso do fungo aos
nutrientes. Pandey (2003) cita o tamanho da partícula como propriedade física
essencial para a atividade enzimática, outros pontos importantes destacados pelo
autor são natureza cristalina, porosidade e área de superfície do substrato. Membrilo
et al. (2008) observaram que a razão geométrica e o tamanho das fibras do bagaço
da cana-de-açúcar influenciam fortemente o perfil da atividade enzimática do gênero
de Pleurotus. Isso se deve provavelmente, ao perfil da lacase que possui massa
molecular alta, não conseguindo penetrar fundo nos tecidos, agindo na lignina
presente na superfície das partículas do substrato (WIDSTEN, KANDELBAUER,
2008).
Em relação ao substrato observa-se que a utilização do CTG2 aumenta a
atividade da lacase enquanto o uso do M8G2 diminui a atividade da enzima (Figura
4). Isto se deve à concentração de lignina no substrato de cultivo, sendo que em
-7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6
Zn
Substrato
Cd
Cu
Mn
FeV
ariá
veis
Efeito (U/g meio seco)
*
*
*
*
*
51
CTG2 a concentração é muito maior do que em M8G2 (Tabela 6). Segundo Niladevi
e Prema (2008), maiores concentrações de lignina no substrato aumentam
consideravelmente a atividade da lacase.
Tabela 6. Conteúdo de cinzas, proteínas, fibras de detergente neutro (FDN) e fibras de detergente ácido (FDA) nos substratos de cultivo para determinação da atividade da lacase pelo fungo Lentinula edodes. Valores expressos em % base seca.
Substrato FDN FDA
M8G2 30,99 1,03
CTG2 89,01 76,51
52
3.4 CONCLUSÃO
Em função da metodologia adotada e das condições experimentais concluiu-
se que o basidiomiceto Lentinula edodes é capaz de degradar uma ampla variedade
de substratos, sendo as matérias-primas mais adequadas ao crescimento micelial
em placas de Petri a fibra de mandioca, sabugo de milho, grãos de milho e farelo de
trigo. Diferentes granulometrias afetam a composição física e nutricional do
substrato de cultivo e que interferem no crescimento do fungo. Tamanho de
partículas diferentes, de uma mesma matéria-prima, têm relação C/N distintas. O
maior diâmetro da partícula do substrato proporciona maior crescimento micelial
devido à maior aeração do substrato. As matérias-primas que gelatinizam após
autoclavagem (121 ºC) não são adequadas ao crescimento micelial axênico de
fungos quando em quantidades iguais ou superiores a 65% do substrato. O aumento
da atividade da lacase é influenciado pela concentração de lignina do substrato e
pela adição de indutores metálicos.
AGRADECIMENTOS
À Universidade Paranaense, CNPq e Fundação Araucária pelo apoio financeiro e
pela bolsa de estudos concedida.
53
3.5 REFERÊNCIAS
ALENCAR, M.L.C. B. B.; ALVARENGA, M. G. Farelo de arroz: composição química e seu potencial como alimento. Arquivos de Biologia e Tecnologia, Porto Alegre, v. 34, n. 1, p. 95-108, 1991.
ARORA, D. S.; GILL, P. K. Effects of various media and supplements on lacase production by some white rot fungi. Bioresource Technology, Amsterdam, v. 77, p. 89-91, 2001.
BALDRIAN, P. Interactions of heavymetals with white-rot fungi. Enzyme and Microbial Technology, Amsterdam, v. 32, p. 78-91, 2003.
BALDRIAN, P.; GABRIEL, J. Copper and cadmium increase activity in Pleurotus ostreatus. FEMS Microbiology, Amsterdam, v. 206, p. 69-74, 2002.
BALDRIAN, P.; GABRIEL, J.; NERUD, F. Effect of cadmium on the lignolytic activity of Stereum harsutum and Phanerochaete chrysosporium. Folia Microbiologica, v. 41, p. 363-367, 1996.
BALDRIAN, P.; VALASKOVÁ, V.; MERHAUTOVÁ, V.; GABRIEL, J. Degradation of lignocellulose by Pleurotus ostreatus in the presence of copper, manganese, lead and zinc. Research in Microbiology, Amsterdam, v. 156, p. 670-676, 2005.
BELITZ, H. D.; GROSCH, W. Química de los alimentos. Zaragoza: Acribia, 1997. 1087 p.
CEREDA, M. P. Valorização de subprodutos como forma de reduzir custos de produção. In: Culturas de tuberosas amiláceas latino americanas: Manejo, uso e tratamento de subprodutos da industrialização da mandioca. São Paulo: Fundação Cargill, 2001, 320p.
DIAS, E. S.; KOSHIKUMO, E. M. S.; SCHWAN, R. E. F.; SILVA, R. Cultivo do cogumelo Pleurotus sajor-caju em diferentes resíduos agrícolas. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 27, n. 6, p. 1363-1369, 2003.
DI LENA, G.; PATRONI, E.; QUAGLIA, G. B. Improving the nutritional value of wheat bran by a white rot fungus. International Journal of food science and technology, Oxford, v. 32, p. 513-519, 1997.
ECKHOFF, S. R.; PAULSEN, M. R. Maize. In: HENRY, R. J. KETTLEWELL, P. S. Cereal grain quality. London: Chapmam & Hall, 1996.
54
EIRA, A. F. Cultivo do cogumelo medicinal Agaricus blazei (Murrill) ss. Heinemann ou Agaricus brasiliensis (Wasser et al.). Viçosa: Aprenda fácil, 2003.
EIRA, F. C.; MEIRELLES, W. F., PACCOLA-MEIRELLES, L. D. Shiitake production on corncob substrates. Revista Brasileira de Milho e Sorgo, Sete Lagoas, v. 4, n. 2, p. 141-148, 2005.
EIRA, A. F.; MONTINI, R. M. C. Manual de cultivo do shiitake (Lentinula edodes (Berk.) Pegler). Botucatu: FEPAF, 1997. 38p.
ELISASHVILI, V.; PENNINCKX, M.; KACHLISHVILI, E.; TSIKLAURI, N.; METREVELI, E.; KHARZIANI, T.; KVESITADZE, G. Lentinus edodes and Pleurotus species lignocellulolytic enzymes activity in submerged and solid-state fermentation of lignocellulosic wastes of different composition. Bioresource Technology, Amsterdam, v. 99, p. 457-462, 2008.
FELLOWS, P. J. Tecnologia do Processamento de Alimentos: princípios e prática. 2ed. Porto Alegre: Artmed, 2006. 602p.
FENNEMA, O. R. Química de los alimentos. Zaragoza: Acríbia, 1993. 1051p.
GABRIEL, V. Cereal straw and corncobs. In: Shiitake cultivation. Korea: Mushworld, 2005. p. 86-90.
GALHAUP, C,; GOLLER, S.; PETERBAUER, C. K.; STRAUSS, J.; HALTRICH, D. Characterization of the major lacase isoenzyme from Trametes pubescens and regulation of its synthesis by metal ions. Microbiology, Londres, v. 148, p. 2159-2169, 2002.
GIANFREDA, L.; XU, F.; BOLLAG, J. M. Laccases: a useful group of oxidoreductive enzymes. Biorremediation Journal, Boca Raton, v. 3, n. 1, p. 1-26, 1999.
GIARDINA, P.; PALMIERI, G.; SCALONI, A.; FONTANELLA, B.; FARACO, V.; CENNAMO, G.; SANNIA, G. Protein and gene structure of a blue lacase from Pleurotus ostreatus. Biochemical Journal, Londres, v. 341, p. 655-663, 1999.
GRIENSVEN, L. J. L. D. The cultivation of mushrooms. Horst: Mushroom Experimental Station. 1988. 515p.
55
HERRERA, O. M. Produção, economicidade e parâmetros energéticos do cogumelo Agaricus blazei: um enfoque na cadeia produtiva. Botucatu, 2001. Originalmente apresentada como dissertação de doutorado, Departamento de Defesa Fitossanitária, Faculdade de Ciências Agronômicas, Unesp, 2001.
HOSENEY, R. C. Princípios de ciencia y tecnologia de los cereales. Zaragoza: Acribia, 1991. 320p.
HOU, H.; ZHOU, J.; WANG, J.; DU, C.; YAN, B. Enhancement of laccase production by Pleurotus ostreatus and its use for the decolorization of anthraquinone dye. Process Biochemistry, Amsterdam, v. 39, p. 1415-1419, 2004.
HWANG, H. J.; KIM, S. W.; LIM, J. M.; JOO, J. H.; KIM, H. O.; KIM, H. M.; YUN, J. W. Hypoglycemic effect of crude exopolysaccharides produced by a medicinal mushroom Phellinus baumii in strptozotocin-induced diabetic rats. Life Sciences, Oxford v. 76, p. 3069-3080, 2005.
ISHIKAWA, N. K., KASUYA, M. C. M., VANETTI, M. C. D.Antibacterial activity of Lentinula edodes grown in liquid medium. Brazilian Journal of Microbiology, São Paulo, v. 32, p. 206-210, 2001.
LECHNER, B. E.; PAPINUTTI, V. L. Production of lignocellulosic enzymes during growth and fruiting of the edible fungus Lentinus tigrinus on wheat straw. Process Biochemistry, Amsterdam, v. 41, p. 594-598, 2006.
LEHNINGER, A. L.; NELSON, D. L.; COX, M. M. Princípios de Bioquímica. 2ed. São Paulo: Sarvier, 1995, 803p.
LINDE, G. A., MACHADO, R. P. Fibra de soja: benefícios a saúde e aplicações. Food Ingredients, v. 11, n. 3, 2001.
MEMBRILLO, I.; SÁNCHEZ, C.; MENESES, M.; FAVELA, E.; LOERA, O. Effect of substrate particle size and additional nitrogen source on production of lignocellulolytic enzymes by Pleurotus ostreatus strains. Bioresource Technology, Amsterdam, v. 99, n. 16, p. 7842-7847, 2008.
NEIVA-JUNIOR, A. P.; SILVA-FILHO, J. C.; TIESENHAUSEN, I. M. E. V. V.; ROCHA, G. P.; CAPELLE, E. R.; COUTO-FILHO, C. C. C. Efeito de diferentes aditivos obre os teores de proteína bruta, extrato etéreo e digestibilidade da silagem de maracujá. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 31, n. 3, p.871-875, 2007.
56
NILADEVI, K. N.; PREMA, P. Effect of inducers and process parameters on laccase prodution by Stretomyces psammoticus and its application in dye decolourization, Bioresource Technology, Amsterdam, v. 99, p. 4583-4589, 2008.
OEI, P. Mushroom cultivation. Tool: Leiden, 1996. 274p.
PALMIERI, G.; GIARDINA, P.; BIANCO, C.; FONTANELLA, B.; SANNIA, G. Copper induction of lacase isoenzymes in the ligninolytic fungus Pleurotus ostreatus. Applied and Enviromental Microbiology, Washington, v. 66, p. 920-924, 2000.
PANDEY, A. Solid–state fermentation. Biochemical Engineering Journal, Amsterdam, v. 13, p. 81-84, 2003.
PARANÁ. Secretaria da Agricultura e do Abastecimento do Paraná. Relatório da safra 2006/2007. Disponível em: <http://www.pr.gov.br/seab/deral/Relat%f3rio%20da%20Safra_JAN_07.pdf> Acesso em 21/02/2007.
POPPE, J. Substrate. In: Shiitake cultivation. Korea: Mushworld, 2005. p. 75-85.
RAJARATHNAM, S.; BANO, Z. Pleurotus Mushrooms. Parte I A. Morfology, life cycle, taxonomy, breeding and cultivation. CRC Critical Reviews in Food Science and Nutrition, Boca Raton, v. 26, n. 2, p.157-223, 1987.
ROBINSON, T.; CHANDRAN, B.; NIGAM, P. Studies on the production of enzymes by white-rot fungi for the decolourisation of textil dyes. Enzyme and Microbial Technology, Amsterdam, v. 29, p. 575-579, 2001.
RODRIGUEZ, S.; SANTORO, R.; CAMESELLE, C., SANROMÁN, A. Effect of different parts of the corn cob employed as a carrier on lignolytic activity in solid state cultures by P. chrysosporium. Bioprocess Engineering, Amsterdam, v. 18, p.251-255, 1998.
SAZAKI, S. H.; LINHARES, R. E. C.; NOZAWA, C. M.; MONTALVÁN, R.; PACCOLA-MEIRELLES, L. D. Strains of Lentinula edodes supress growth of phytopathogenic fungi and inhibit alagoas serotype of vesicular stomatitis vírus. Brazilian Journal of Microbiology, São Paulo, v. 32, p. 52-55, 2001.
SHU, C.; XU, C., LIN, E. Production, purification and partial characterization of a novel endo-b-1,3-glucanase from Agaricus brasiliensis. Process Biochemistry, Barking, v. 41, p. 1229-1233, 2006.
57
SILVA, E. M.; MACHUCA, A.; MILAGRES, A. M. F. Effect os cereal brans on Lentinula edodes growth and enzyme activies during cultivation on forestry waste. Letters in Applied Microbiology, v. 40, p. 283-288, 2005.
SILVA, D. J.; QUEIROZ, A. C. Análise de alimentos: métodos químicos e biológicos. Viçosa: UFV, 2002. 235p.
SINGHAL, V.; RATHORE, V. S. Effects of Zn2+ and Cu2+ on growth, lignin degradation and ligninolytic enzymes in Phanerochaete chrysosporium. World Journal Microbiology and Biotechnology, Oxford, v. 17, p. 2235-2240, 2001.
SINGH, M. P. Biodegradation of lignocelulosic waste through cultivation of Pleurotus sajor-caju. Mushroom Science, Sidney, v. 15, p. 517-521, 2000.
SOUZA-PACCOLA, E. A.; BOMFETI, C. A.; FÁVARO, L. C. L.; FONSECA, I. C. B.; PACCOLA-MEIRELLES, L. D. Antimutagenic action of Lentinula edodes and Agaricus blazei on Aspergillus nidulans conidia. Brazilian Journal of Microbiology, São Paulo, v. 35, p. 311-315. 2004.
STAJIC, M.; PERSKY, L.; FRIESEM, D. HADAR, Y.; WASSER, S. P.; NEVO, E.; VUKOJEVIC, J. Effect of different carbon and nitrogen sources on lacase and peroxidases production by selected Pleurotus species. Enzyme and Microbial Technology, Amsterdam, v. 38, p. 65-73, 2006.
SUZUKI, H.; ILYAMA, K.; YOSHIDA, O.; YAMAZAKI, S.; YAMAMOTO, N.; TODA, S. Structural characterization of the immunoactive and antiviral water-solubilized lignin in na extract of the culture medium of Lentinus edodes mycelia (LEM). Agricultural and Biological Chemistry, Tóquio, v. 54, n. 2, p. 479-487, 1990. SUZUKI, M.; IWASHIRO, M.; TAKATSUKI, F.; KURIBAYASHI, K.; HAMURO, J. Reconstitution of antitumor effects of lentinan in nude mice: roles of delayes-types hypersensitivy reaction triggred by CD4-positive T cell clone in the infiltration of effector cells into tumor. Journal Cancer Research., v. 85, p. 409-417, 1994.
WIDSTEN, A.; KANDELBAUER, A. Laccase applications in the forest products industry: a review. Enzyme and Microbial Technology, Amsterdam, v. 42, p. 293-307, 2008.
58
4. USO DE GRÃOS PARA CRIOPRESERVAÇÃOA -20 ºC E A -70 ºC DE Pleurotus
ostreatus.
4.1 INTRODUÇÃO
Fungos do gênero Pleurotus são Basidiomicetos de interesse comercial
devido a seu sabor refinado (SHARMA; MADAN, 1993) e capacidade de produzir
biocompostos antitumorais (WASSER; WEIS, 1999) e hipocolesterolêmicos
(HOSSAIN et al., 2003). O cultivo deste fungo vem crescendo devido principalmente
à menor complexidade das técnicas de cultivo quando comparado com fungos do
gênero Agaricus (SILVA et al., 2007).
Para o cultivo de cogumelos é necessária a manutenção adequada do inóculo
de forma a preservar suas características biológicas. A repicagem micelial tem sido a
técnica mais utilizada na preservação e manutenção desta espécie, porém isto
implica em contaminações acidentais e degenerações de crescimento (HOMOLKA
et al., 2001), com perda das características desejáveis de produção ou da linhagem.
Uma forma de superar estes obstáculos é a utilização de técnicas de
criopreservação para a manutenção de linhagens fúngicas.
A criopreservação é uma opção utilizada para a manutenção de coleções de
fungos em bancos de germoplasma. As temperaturas utilizadas nestes processos
são de -70 oC a -196 oC (PUTZKE; PUTZKE, 1998), o que exige equipamentos
caros, limitam seu uso para fins comerciais e de pesquisa. Assim o uso de
temperaturas mais elevadas e técnicas simples seriam adequados para viabilizar a
manutenção de linhagens fúngicas. A criopreservação a -20 oC tem sido pouco
explorada e pode trazer um novo enfoque para a manutenção de linhagens. Esta
técnica utiliza equipamentos mais baratos e de fácil aquisição, o que torna o
processo de criopreservação acessível. Entretanto esta temperatura ocasiona danos
celulares que inviabilizam a recuperação da viabilidade do fungo após congelamento
(THOMAS; SMITH, 1994). Para diminuir os efeitos deletérios da criopreservação a -
20 oC em Basidiomicetos são sugeridos agentes crioprotetores (HUBÁLEK, 2003). O
uso desses agentes evita a formação de cristais de gelo durante o congelamento,
reduzindo danos celulares e aumentando as chances de posterior recuperação do
59
micélio (MATA; PEREZ-MÉRLO, 2003). Contudo o substrato de crescimento do
fungo é um fator que também afeta a capacidade de recuperação do fungo à
criopreservação, podendo atuar como crioprotetor (MATA; SALMONES, 2005). A
associação de substrato de cultivo e agente crioprotetor poderia viabilizar a
criopreservação a -20 oC. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar
substratos associados a agentes crioprotetores na criopreservação a -20 ºC e a -70
ºC de Pleurotus ostreatus, visando desenvolver técnicas de criopreservação mais
simples, eficientes e com equipamentos de menor custo.
60
4.2 MATERIAIS E MÉTODOS
Os experimentos foram realizados no Laboratório de Biologia Molecular da
Universidade Paranaense - Unipar Campus sede, Umuarama, Paraná, Brasil, com a
linhagem U6/8 do Pleurotus ostreatus provenientes da micoteca da Universidade
Estadual de Londrina - UEL. Para o crescimento do inóculo utilizou-se meio de
cultura batata-dextrose-ágar (BDA) Merck® (39 g/L) autoclavado a 121 ºC por 20
min. O crescimento do fungo foi realizado a 25 ºC ± 1 ºC, sem iluminação por 15
dias. Selecionou-se como inóculo, micélio uniforme e sem setoriamento da
extremidade do crescimento radial.
4.2.1 Inibição do crescimento micelial
Para a determinação da inibição do crescimento do micélio (ICM) foram
adicionadas diferentes concentrações de cada agente crioprotetor em meio BDA,
conforme Tabela 1. Todos os crioprotetores foram esterilizados a 121 ºC por 20 min,
com exceção do dimetilsulfóxido (DMSO) que foi esterilizado por filtração (filtro com
poro de 0,22 µm). Em cada meio de cultura foi inoculado um cilindro de 5 mm de
diâmetro contendo o micélio do fungo e mantido a 25 ºC ± 1 ºC, na ausência de luz,
por 6 dias. O diâmetro micelial do fungo foi medido em mm e a média foi calculada
por quatro medidas de diâmetro. A maior concentração do agente crioprotetor, com
índice de ICM inferior a 25%, foi escolhida para a etapa de criopreservação.
4.2.2 Meio de cultivo para a criopreservação do fungo
O micélio foi crescido em meio BDA, grãos de aveia (Avena strigosa Schreb
cv. IAPAR 61) com casca (GA), grãos de trigo (Triticum aestivum) (GT), grãos de
arroz (Oryza sativa L.) (GA) tipo integral e grãos de painço (Setaria italica L.) (GP).
Aproximadamente 200 g de cada grão foi imerso em excesso de água ultra pura e
cozido a 90 ºC por 45 min. O excesso de água foi removido e os grãos foram
acondicionados em erlenmeyers e autoclavados a 121 ºC por 20 min. Em seguida os
erlenmeyers receberam cinco cilindros de inóculo de forma asséptica e foram
mantidos a 25 ºC ± 1 ºC no escuro, até completa colonização do fungo.
61
4.2.3 Criopreservação
Para o experimento de criopreservação foram utilizadas ampolas plásticas,
conforme descrito por Challen e Elliot (1986). As ampolas com uma das
extremidades termoseladas bem como as soluções aquosas dos crioprotetores
foram autoclavados a 121 ºC por 20 minutos em frascos separados, sendo que a
solução de DMSO foi filtrada para esterilização (filtro de 0,22 µm). Cada ampola
recebeu 800 µl de solução crioprotetora e em seguida foram adicionados cinco
cilindros de BDA ou cinco grãos contendo micélio crescido. As ampolas foram
fechadas por termoselagem e congeladas a -20 ºC ou a -70 ºC, a partir da
temperatura do ambiente (cerca de 23 ºC). Foram realizadas três repetições para
cada tratamento. Todas as etapas foram feitas em câmara de fluxo laminar.
4.2.4 Recuperação do fungo criopreservado
Após 30 dias e um ano de congelamento as ampolas foram descongeladas
por submersão em água a 30 ºC por 15 min (HERRERA et al., 1998). Em seguida as
ampolas foram lavadas com álcool 70% e álcool 96%. Uma das extremidades do
tubo foi cortada e a solução crioprotetora foi separada dos cilindros e dos grãos. Os
cilindros de BDA e os grãos foram transferidos para meio de cultivo BDA e mantidos
a 25 ºC ± 1 ºC por no máximo de 30 dias.
Considerou-se recuperado o fungo que apresentou média de recuperação de
crescimento maior ou igual a 75% e coeficiente de variação menor que 15%. A
média de crescimento das repetições e o coeficiente de variação foram calculados
para cada tratamento.
62
4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Na Tabela 1 é apresentado os ICM do fungo na presença de diferentes
concentrações de agentes crioprotetores em meio BDA. Pode-se observar que o
aumento da concentração do crioprotetor no meio de cultivo causou inibição do
crescimento do micélio, sendo necessário utilizar menores quantidades das relatadas
na literatura durante a criopreservação. Segundo Hubálek (2003) as concentrações
utilizadas para a crioproteção de microrganismos em geral são para GO entre 2% e
55% (média de 10%), DMSO entre 1% e 32% (média de 10%), GI entre 1% e 18%
(média de 4%), SA entre 1% e 68% (média de 10%), EM entre 0,5 e 20% (média de
2,5%) e PEG entre 5 a 45% (média de 10%). Como cada microrganismo apresenta
características únicas, mesmo quando da mesma espécie, optou-se por utilizar a
menor quantidade de crioprotetor e que apresentasse o menor distúrbio no
crescimento do micélio. Desta forma, selecionou-se a concentração do crioprotetor
para GO, DMSO, GI, SA, EM e PEG de 5,0%, 1,0%, 4,0%, 10,0%, 5,5% e 6,0%,
respectivamente, para as etapas de criopreservação.
Tabela 1. Diâmetro médio do crescimento micelial de Pleurotus ostreatus em meio de cultivo batata-dextrose-ágar (BDA) com diferentes concentrações de agentes crioprotetores.
Crioprotetor Código (%) Crescimento
micelial
(mm)
Inibição do crescimento do
micélio (%)
5,0 37,7 0
10,0 12,5 67 Glicerol GO
30,0 0,0 100
1,0 62,6 0
2,5 20,2 68 Dimetilsulfóxido DMSO
5,0 0,0 100
2,0 75,5 0
4,0 60,4 20 Glicose GI
10,0 23,4 69
63
5,0 72,3 0
10,0 58,9 18 Sacarose SA
30,0 0,0 100
4,0 67,1 0
5,5 51,8 23 Extrato de malte EM
13,0 19,3 71
3,0 64,4 0
6,0 53,5 17 Polietilenoglicol-
6000 PEG
10,0 19,1 70
Nas Tabelas 2 e 3 são apresentados os resultados de recuperação do
crescimento micelial do fungo após criopreservação por 30 dias a -20 oC e a -70 oC,
respectivamente. O BDA apresentou os piores resultados, havendo recuperação do
fungo somente em GO a -20 ºC e GO, DMSO e SA a -70ºC. Nas Tabelas 4 e 5 são
apresentados os resultados de recuperação do crescimento micelial do fungo após
criopreservação por um ano a -20 oC e a -70 oC, respectivamente. Semelhante ao que
ocorreu na criopreservação por 30 dias, o BDA apresentou a menor porcentagem de
recuperação quando utilizado qualquer crioprotetor -20 ºC e a -70 ºC. Somente houve
recuperação do fungo em cilindros de BDA quando associado ao crioprotetor DMSO.
Os cilindros de BDA são amplamente utilizados como suporte do micélio de
basidiomicetos para criopreservação (CHVOSTOVÁ, et al.; 1995; MATA et al., 1994),
no entanto muitos protocolos de congelamento utilizam nitrogênio líquido para a
criopreservação, o que provavelmente viabiliza o uso de cilindros de BDA, mas
encarece o processo.
Após a criopreservação por 30 dias todos os grãos apresentaram recuperação
do crescimento fúngico, exceto o GAR associado ao PEG quando congelado a -20 ºC
(Tabela 2 e 3). Para a criopreservação por um ano, o GTR apresentou o melhor
resultado a -20 ºC, com recuperação total do crescimento micelial para todos os
crioprotetores testados. Já GAV apresentou recuperação apenas quando utilizou-se a
SA como crioprotetor, e GAR e GPA não apresentaram recuperação do crescimento
micelial a -20 ºC, embora o GPA com SA tenha apresentado um bom resultado, dentro
dos parâmetros determinados não foi considerado recuperado (Tabela 4). No entanto
64
na criopreservação a -70 °C todos os grãos apresentaram 100% de recuperação
(Tabela 5). A maior eficiência esperada na criopreservação a -70 oC está relacionada à
maior velocidade de congelamento, que causa menores danos à célula devido a menor
desidratação e rompimento das membranas (DUMONT et al., 2004; FELLOWS, 2006).
O uso de temperatura mais elevada para a manutenção de linhagens
fúngicas, como a de -20 oC, considerada temperatura comercial de congelamento,
não é usual, segundo Putzke e Putzke (1998), por ocasionar danos celulares,
resultando em baixa taxa de sobrevivência do fungo. No entanto nossos resultados
demonstraram que a criopreservação por 30 dias a -20 ºC se torna viável com o uso
de grãos como substrato, permitindo alta taxa de sobrevivência do fungo (Tabela 2).
Isto se deve provavelmente a nutrientes presentes nos grãos que protegeriam o
fungo contra as baixas temperaturas (HOSENEY, 1991). Para a criopreservação por
um ano, o uso de GTR na conservação do fungo a -20 oC, permitiu alta taxa de
sobrevivência do fungo, à semelhança do que ocorreu na criopreservação a -70 oC
(Tabela 4 e 5). Isto sugere que o efeito crioprotetor do substrato GTR pode estar
relacionado à presença de alta concentração de amido e nutrientes termo-
resistentes no trigo e a uma rede de capilares (HOSENEY, 1991) que protegeriam
as hifas do fungo contra a baixa temperatura. Sendo assim, aspectos físicos e a
composição química do grão afetam a porcentagem de recuperação de Pleurotus
ostreatus. O amido possui alta capacidade de ligar água do substrato durante a
gelatinização (BELITZ; GROSCH, 1997; FENNEMA, 1993), o que reduz o tamanho
dos cristais de gelo, aproximando as temperaturas de congelamento intra e
extracelular, reduzindo a desidratação celular (DUMONT et al., 2004; FELLOWS,
2006). No entanto GAV, GAR e GPA que apresentaram recuperação a -20 ºC após
30 dias de congelamento não apresentaram os mesmos resultados após um ano de
criopreservação, sendo que somente o GAV associado à SA foi recuperado (Tabela
2 e 4). Sendo assim o tempo de congelamento do fungo e seu substrato de
crescimento deve ser levado em consideração quando for utilizada a temperatura de
-20 ºC. A criopreservação de linhagens de Lentinula em grãos de sorgo (Sorghum
vulgare) com glicerol a 10% como crioprotetor já foi relatado por Mata e Salmones
(2005) em nitrogênio líquido, no entanto não foram encontrados relatos em
temperatura comercial de -20 oC para Basidiomicetos. Este aspecto permitiria reduzir
o custo de equipamentos e a manutenção de coleções de cultura de Basidiomicetos.
65
Tabela 2. Porcentagem de recuperação e coeficiente de variação (CV) Pleurotus ostreatus crescido em ágar-batata-dextrose, grão de aveia, trigo, arroz ou painço e criopreservado por 30 dias a -20 ºC.
Crioprotetor BDA (CV) GAV (CV) GTR (CV) GAR (CV) GPA (CV)
GO (5%) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0)
DMSO (1%) 13,3 (173,2) 100,0 (0,0) 93,3 (12,3) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0)
GI (4%) 0,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0)
SA (10%) 51,6 (86,7) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0)
EM (5,5%) 0,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0)
PEG (6%) 0,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 78,3 (25,7) 100,0 (0,0)
BDA: batata-dextrose-ágar; GAV: grão de aveia, CTR: grão de trigo, GAR: grão de arroz; CPA (grão de painço)
Tabela 3. Porcentagem de recuperação e coeficiente de variação (CV) Pleurotus ostreatus crescido em ágar-batata-dextrose, grão de aveia, trigo, arroz ou painço e criopreservado por 30 dias a -70 ºC.
Crioprotetor BDA (CV) GAV (CV) GTR (CV) GAR (CV) GPA (CV)
GO (5%) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0)
DMSO (1%) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0)
GI (4%) 33,3 (69,2) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0)
SA (10%) 93,3 (12,3) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0)
EM (5,5%) 75,5 (28,3) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0)
PEG (6%) 33,3 (173,2) 93,3 (12,3) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0)
BDA: batata-dextrose-ágar; GAV: grão de aveia, CTR: grão de trigo, GAR: grão de arroz; CPA (grão de painço)
66
Tabela 4. Porcentagem de recuperação e coeficiente de variação (CV) Pleurotus ostreatus crescido em ágar-batata-dextrose, grão de aveia, trigo, arroz ou painço e criopreservado por um ano a -20 ºC.
Crioprotetor BDA (CV) GAV (CV) GTR (CV) GAR (CV) GPA (CV)
GO (5%) 0,0 (0,0) 33,3 (124,8) 100,0 (0,0) 12,5 (141,4) 0,0 (0,0)
DMSO (1%) 0,0 (0,0) 53,3 (86,6) 100,0 (0,0) 30,0 (141,4) 60,0 (88,1)
GI (4%) 0,0 (0,0) 70,0 (20,2) 100,0 (0,0) 83,3 (61,1) 40,0 (76,0)
SA (10%) 0,0 (0,0) 80,0 (0,0) 100,0 (0,0) 66,6 (62,4) 91,6 (15,7)
EM (5,5%) 0,0 (0,0) 73,3 (31,4) 100,0 (0,0) 25,0 (173,2) 83,0 (17,3)
PEG (6%) 0,0 (0,0) 60,0 (94,2) 100,0 (0,0) 40,0 (86,2) 51,6 (86,7)
BDA: batata-dextrose-ágar; GAV: grão de aveia, CTR: grão de trigo, GAR: grão de arroz; CPA (grão de painço)
Tabela 5. Porcentagem de recuperação e coeficiente de variação (CV) de Pleurotus ostreatus crescido em ágar-batata-dextrose, grão de aveia, trigo, arroz ou painço e criopreservado por um ano a -70 ºC.
Crioprotetor BDA (CV) GAV (CV) GTR (CV) GAR (CV) GPA (CV)
GO (5%) 56,1 (37,6) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0)
DMSO (1%) 93,3 (12,3) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0)
GI (4%) 17,1 (94,3) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0)
SA (10%) 83,3 (34,6) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0)
EM (5,5%) 23,3 (107,8) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0)
PEG (6%) 0,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0)
BDA: batata-dextrose-ágar; GAV: grão de aveia, CTR: grão de trigo, GAR: grão de arroz; CPA (grão de painço).
Para a criopreservação por 30 dias, observa-se que o PEG não foi eficiente
quando associado ao GAR a -20ºC, sendo que os demais crioprotetores associados a
67
grãos proporcionaram recuperação do fungo (Tabela 2 e 3). Supõe-se que este
resultado positivo seja referente à composição físico-química dos grãos, e não somente
à ação dos crioprotetores. A recuperação do BDA se mostra mais dependente do
crioprotetor, sendo que somente houve recuperação quando utilizado GO a -20 ºC e GO
e DMSO a -70 ºC (Tabela 2 e 3), provavelmente pela falta de estruturas físicas e
químicas mais complexas ausentes nos cilindros de BDA. Comparando a ação dos
crioprotetores para a criopreservação por um ano, pode-se verificar que a -20 ºC o
efeito protetor é baixo em todos os substratos, exceto para GTR onde todos os
crioprotetores foram eficientes, destaca-se também a ação crioprotetora da SA em GAV
(Tabela 4). No entanto, supõe-se que o ótimo resultado apresentado pelo GTR seja
referente à sua composição nutricional, e não somente à ação das substâncias
crioprotetoras adicionadas. Na temperatura de -70 ºC, destaca-se a ação do DMSO em
BDA, onde o crioprotetor viabilizou a recuperação do fungo, capacidade que nenhum
outro crioprotetor demonstrou em BDA nas duas temperaturas avaliadas (Tabela 4 e 5).
O DMSO, assim como o GO, tem a capacidade de penetrar a parede celular e
membrana plasmática, tornando-as mais elásticas, o que permite a acomodação
molecular durante a expansão de volume no congelamento. Além disso, possui a
capacidade de ligar a água no interior da célula, o que previne a desidratação
excessiva, reduz a toxicidade pelo excesso de sais e previne a formação de grandes
cristais de gelo (DUMONT et al., 2004; HUBÁLEK, 2003). Já os crioprotetores GI e SA
são compostos de carboidratos com alta capacidade de ligar água, que penetram na
parede celular, mas não penetram na membrana plasmática, formando uma barreira
contra o crescimento do gelo, protegendo a membrana plasmática mecanicamente
(HUBÁLEK, 2003; SANTOS, 2001; ZHANG et al., 1996). EM e PEG são crioprotetores
que não penetram na parede celular, adsorvem a superfície das células formando uma
camada viscosa e causando efluxo parcial da água na célula, inibindo o crescimento
dos cristais de gelo e aumentando a viscosidade da solução (HUBÁLEK, 2003).
Entretanto após 30 dias de congelamento somente o GO apresentou recuperação a -20
ºC e o GO e o DMSO apresentaram recuperação a -70 ºC (Tabela 2 e 3). Para um ano
GI, EM e PEG não apresentaram capacidade protetora a -20 ºC, apenas a SA
proporcionou recuperação micelial quando associada ao GAV (Tabela 4). Já a -70 ºC
apresentaram recuperação total quando associados ao GAV, GTR, GAR e GPA (Tabela
5).
68
Embora reconhecida a importância de aditivos crioprotetores, o substrato de
crescimento micelial parece influenciar de forma que o tipo de crioprotetor e a
temperatura de criopreservação sejam indiferentes (Tabela 4 e 5). Isto sugere que o
crioprotetor não seja necessário para criopreservar em diversas temperaturas,
principalmente a -20 oC.
O grãos e os cilindros de BDA além do efeito positivo na recuperação do
crescimento micelial, permitiram a manutenção do vigor de crescimento do fungo a -
20 oC e a -70 oC (dados não apresentados), sugerindo que houve a preservação das
estruturas celulares, mesmo a -20 oC. Estes resultados permitem uma nova
abordagem para os processos de manutenção de linhagens, viabilizando a
criopreservação comercial do gênero Pleurotus. Outros estudos devem ser ainda
desenvolvidos para a determinação de condições de criopreservação comercial para
outros Basidiomicetos de interesse, sendo que estes resultados são promissores
para estimular a produção de cogumelos comestíveis no Brasil.
69
4.4 CONCLUSÕES
Em função da metodologia adotada e das condições experimentais conclui-se
que o substrato de crescimento do micélio influencia diretamente na sobrevivência
do fungo criopreservado a -20 oC e a -70 oC, sendo os grãos mais eficientes que
batata-dextrose-ágar na criopreservação do fungo.
O uso de grãos de aveia, grãos de trigo, grãos de arroz e grãos de painço
viabiliza a criopreservação de Pleurotus ostreatus por 30 dias, em temperaturas
comercias de -20 ºC.
O uso de grãos de trigo associado a agentes crioprotetores viabiliza a
criopreservação de Pleurotus ostreatus por um ano, em temperaturas comerciais de
-20 oC, mantendo o vigor de crescimento do fungo
AGRADECIMENTOS
À Universidade Paranaense, CNPq e Fundação Araucária pelo apoio financeiro e
pela bolsa de estudos concedida.
70
4.5 REFERÊNCIAS
BELITZ, H. D.; GROSCH, W. Química de los alimentos. Zaragoza: Acribia, 1997. 1087 p.
CHALLEN, M.; ELLIOTT, T. J. Polypropylene straw ampoules for the storage of microorganisms in liquid nitrogen. Journal of Microbiological Methods, Amsterdam, v. 5, p.11-23, 1986.
CHVOSTOVÁ, V.; NERUD, F.; HOMOLKA, L. Viablity of wood-inhabiting basidiomycetes following cryogenic preservation. Folia Microbiologica, New York, v. 40, n.2, p. 193-197, 1995.
DUMONT, F.; MARECHAL, P. A.; GERVAIS, P. Cell size and water permeability as determining factors for cell viability after freezing at different cooling rates. Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 70, n.1, p. 268-272, 2004.
FELLOWS, P. J. Tecnologia do processamento de alimentos: princípios e práticas. Porto Alegre: Artmed, 2006. 602p.
FENNEMA, O. R. Química de los alimentos. Zaragoza: Acríbia, 1993. 1051p.
HERRERA, I. L.; MATA, G.; HERNÁNDEZ, R. G. Evaluation of the viability of Pleutorus spp. strains after liquid nitrogen cryopreservation. Revista de Microbiologia, São Paulo, v. 29, n. 3, 1998.
HOMOLKA, L.; LISÁ, L.; EIHLEROVÁ, I.; NERUD, F. Cryopreservation of basidiomycete strains using perlite. Journal of Microbiological Methods, Amsterdam, v. 47, p. 307-313, 2001.
HOSENEY, R. C. Principios de ciencia y tecnología de los cereales. Zaragoza: Acribia, 1991. 321p.
HOSSAIN, S.; HASHIMOTO, M.; CHOUDHURY, E.; ALAM, N.; HUSSAIN, S.; HASAN, M.; CHOUDHURY, S.; MAHMUD, I. Dietary mushroom (Pleurotus ostreatus) ameliorates atherogenic lipid in hypercholesterolaemic rats. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, New York, v. 30, p. 470, 2003.
HUBÁLEK, Z. Protectants used in the cryopreservation of microorganisms. Cryobiology, New York, v. 46, p. 205-229, 2003.
71
MATA, G.; PÉREZ-MERLO, R. Spawn viability in edible mushrooms after freezing in liquid nitrogen without a cryoprotectant. Cryobiology, New York, v. 47, p. 14-20, 2003.
MATA, G.; SALMONES, D. Preservation of shiitake spawn stocks by cryogenic storage. In: Shiitake cultivation. Korea: Mushworld, 2005. p. 42-45.
MATA. G.; SALMONES, D.; PÉREZ, P.; GUZMÁN, G. Behavior of some strains of the genus Pleurotus after different procedures for freezing in liquid nitrogen, Revista de Microbiologia, São Paulo, v. 25, n. 3, p. 197-200, 1994.
PUTZKE, J; PUTZKE, M. T. L. Os reinos dos fungos. Santa Cruz do Sul: EDUNISC, 1998. 606p.
SANTOS, I. R. I. Criopreservação de germoplasma vegetal – a alternativa para conservação a longo prazo. Biotecnologia, Ciência e Desenvolvimento, Brasília, n. 20, p. 60-65, 2001.
SHARMA, S., MADAN, M. Microbial protein from leguminous and non-leguminous substrates. Acta Biotechnologica, Berlim, v. 13, p.131-139, 1993.
SILVA, E. G.; DIAS, E. S.; SIQUEIRA, F. G.; SCHWAN, R. F. Análise química de corpos de frutificação de Pleurotus sajor-caju cultivado em diferentes concentrações de nitrogênio. Ciência e Tecnologia de Alimentos, Campinas, v. 27, n. 1, p. 72-76, 2007.
THOMAS, V.; SMITH, D. Cryogenic light microscopy and the development of long-term cryopreservation techniques for fungi. Outlook on Agriculture, New York, v. 23, n. 3, p. 163-167, 1994.
WASSER, S. P.; WEIS, A. L. Medicinal properties of substances occurring in higher Basidiomycetes mushrooms: current perspectives. International Journal of Medicinal Mushrooms, New York, v. 1, p. 31-62, 1999.
ZHANG, Y. H.; ZHONG, J. J.; YU, J. T. Enhancement of ginseng saponin production in suspension cultures of Panax notoginseng: manipulation of sucrose. Journal of Biotechnology, Amsterdam, v. 51, p. 49-56, 1996.
72
5. USO DE GRÃOS PARA CRIOPRESERVAÇÃOA -20 ºC E A -70 ºC DE Lentinula
edodes.
5.1 INTRODUÇÃO
O cogumelo Lentinula edodes, conhecido como shiitake possui propriedades
antimicrobianas (ISHIKAWA et al., 2001), antitumorais (SUZUKI et al., 1994),
antimutagênicas (SOUZA-PACCOLA et al., 2004), antivirais (SAZAKI et al., 2001;
SUZUKI et al., 1990), e hipocolesterolêmica (SAZAKI et al., 2001). Esta ampla
produção de compostos de interesse terapêutico associado a alto valor nutricional
torna o Lentinula edodes um cogumelo de grande interesse pela comunidade
científica internacional (EIRA; MONTINI, 1997).
Para o cultivo de cogumelos é necessária a manutenção adequada do inóculo
de forma a preservar suas características biológicas. A repicagem micelial tem sido a
técnica mais utilizada na preservação e manutenção desta espécie, porém isto
implica em contaminações acidentais e degenerações de crescimento (HOMOLKA
et al., 2001), com perda das características desejáveis de produção ou da linhagem.
Uma forma de superar estes obstáculos é a utilização de técnicas de
criopreservação para a manutenção de linhagens fúngicas.
A criopreservação é uma opção utilizada para a manutenção de coleções de
fungos em bancos de germoplasma. As temperaturas utilizadas nestes processos
são de -70 oC a -196 oC (PUTZKE; PUTZKE, 1998), o que exige equipamentos
caros, limitam seu uso para fins comerciais e de pesquisa. Assim o uso de
temperaturas mais elevadas e técnicas simples seriam adequados para viabilizar a
manutenção de linhagens fúngicas. A criopreservação a -20 oC tem sido pouco
explorada e pode trazer um novo enfoque para a manutenção de linhagens. Esta
técnica utiliza equipamentos mais baratos e de fácil aquisição, o que torna o
processo de criopreservação acessível. Entretanto esta temperatura ocasiona danos
celulares que inviabilizam a recuperação da viabilidade do fungo após congelamento
(THOMAS; SMITH, 1994). Para diminuir os efeitos deletérios da criopreservação a -
20 oC em Basidiomicetos são sugeridos agentes crioprotetores (HUBÁLEK, 2003). O
uso desses agentes evita a formação de cristais de gelo durante o congelamento,
73
reduzindo danos celulares e aumentando as chances de posterior recuperação do
micélio (MATA; PEREZ-MÉRLO, 2003). Contudo o substrato de crescimento do
fungo é um fator que afeta também a capacidade de recuperação do fungo à
criopreservação, podendo atuar como crioprotetor (MATA; SALMONES, 2005). A
associação de substrato de cultivo e agente crioprotetor poderia viabilizar a
criopreservação a -20 oC. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar
substratos associados a agentes crioprotetores na criopreservação a -20 ºC e a -70
ºC de Lentinula edodes visando desenvolver técnicas de criopreservação mais
simples, eficientes e com equipamentos de menor custo.
74
5.2 MATERIAIS E MÉTODOS
Os experimentos foram realizados no Laboratório de Biologia Molecular da
Universidade Paranaense - Unipar Campus sede, Umuarama, Paraná, Brasil, com o
fungo Lentinula edodes, linhagem U6/12, provenientes da micoteca da Universidade
Estadual de Londrina - UEL. Para o crescimento do inóculo utilizou-se meio de
cultura batata-dextrose-ágar (BDA) Merck® (39 g/L) autoclavado a 121 ºC por 20
min. O crescimento do fungo foi realizado a 25 ºC ± 1 ºC, sem iluminação por 15
dias. Selecionou-se como inóculo, micélio uniforme e sem setoriamento da
extremidade do crescimento radial.
5.2.1 Inibição do crescimento micelial
Para a determinação da inibição do crescimento do micélio (ICM) foram
adicionadas diferentes concentrações de cada agente crioprotetor em meio BDA,
conforme Tabela 1. Todos os crioprotetores foram esterilizados a 121 ºC por 20 min,
com exceção do dimetilsulfóxido (DMSO) que foi esterilizado por filtração (filtro com
poro de 0,22 µm). Em cada meio de cultura foi inoculado um cilindro de 5 mm de
diâmetro contendo o micélio do fungo e mantido a 25 ºC ± 1 ºC, na ausência de luz,
por 6 dias. O diâmetro micelial do fungo foi medido em mm e a média foi calculada
por quatro medidas de diâmetro. A maior concentração do agente crioprotetor, com
índice de ICM inferior a 25%, foi escolhida para a etapa de criopreservação.
5.2.2 Meio de cultivo para a criopreservação do fungo
O micélio foi crescido em meio BDA, grãos de aveia (Avena strigosa Schreb
cv. IAPAR 61) com casca (GA), grãos de trigo (Triticum aestivum) (GT), grãos de
arroz (Oryza sativa L.) (GA) tipo integral e grãos de painço (Setaria italica L.) (GP).
Aproximadamente 200 g de cada grão foi imerso em excesso de água ultra pura e
cozido a 90 ºC por 45 min. O excesso de água foi removido e os grãos foram
acondicionados em erlenmeyers e autoclavados a 121 ºC por 20 min. Em seguida os
75
erlenmeyers receberam cinco cilindros de inóculo de forma asséptica e foram
mantidos a 25 ºC ± 1 ºC no escuro, até completa colonização do fungo.
5.2.3 Criopreservação
Para o experimento de criopreservação foram utilizadas ampolas plásticas,
conforme descrito por Challen e Elliot (1986). As ampolas com uma das
extremidades termoseladas bem como as soluções aquosas dos crioprotetores
foram autoclavados a 121 ºC por 20 minutos em frascos separados, sendo que a
solução de DMSO foi filtrada para esterilização (filtro de 0,22 µm). Cada ampola
recebeu 800 µl de solução crioprotetora e em seguida foram adicionados cinco
cilindros de BDA ou cinco grãos contendo micélio crescido. As ampolas foram
fechadas por termoselagem e congeladas a -20 ºC ou a -70 ºC, a partir da
temperatura do ambiente (cerca de 23 ºC). Foram realizadas três repetições para
cada tratamento. Todas as etapas foram feitas em câmara de fluxo laminar.
5.2.4 Recuperação do fungo criopreservado
Após um ano de congelamento as ampolas foram descongeladas por
submersão em água a 30 ºC por 15 min (HERRERA et al., 1998). Em seguida as
ampolas foram lavadas com álcool 70% e álcool 96%. Uma das extremidades do
tubo foi cortada e a solução crioprotetora foi separada dos cilindros e dos grãos. Os
cilindros de BDA e os grãos foram transferidos para meio de cultivo BDA e mantidos
a 25 ºC ± 1 ºC por no máximo de 30 dias.
Considerou-se recuperado o fungo que apresentou média de recuperação de
crescimento maior ou igual a 75% e coeficiente de variação menor que 15%. A
média de crescimento das repetições e o coeficiente de variação foram calculados
para cada tratamento.
76
5.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Na Tabela 1 é apresentado os ICM do fungo na presença de diferentes
concentrações de agentes crioprotetores em meio BDA. Pode-se observar que o
aumento da concentração do crioprotetor no meio de cultivo causou inibição do
crescimento do micélio, exceto para a SA de 5,0 para 10,0%, sendo necessário
utilizar menores quantidades das relatadas na literatura durante a criopreservação.
Segundo Hubálek (2003) as concentrações utilizadas para a crioproteção de
microrganismos em geral são para GO entre 2% e 55% (média de 10%), DMSO
entre 1% e 32% (média de 10%), GI entre 1% e 18% (média de 4%), SA entre 1% e
68% (média de 10%), EM entre 0,5 e 20% (média de 2,5%) e PEG entre 5 a 45%
(média de 10%). Como cada microrganismo apresenta características únicas, mesmo
quando da mesma espécie, optou-se por utilizar a menor quantidade de crioprotetor
e que apresentasse o menor distúrbio no crescimento do micélio. Desta forma,
selecionou-se a concentração do crioprotetor para GO, DMSO, GI, SA, EM e PEG de
10,0%, 1,0%, 4,0%, 10,0%, 4,0% e 6,0%, respectivamente, para as etapas de
criopreservação.
Tabela 1. Diâmetro médio do crescimento micelial de Lentinula edodes, após 15 dias em meio de cultivo batata-dextrose-ágar (BDA) com diferentes concentrações de agentes crioprotetores.
Crioprotetor Código (%) Crescimento
micelial
(mm)
Inibição do crescimento
do micélio (%)
5,0 75,1 0
10,0 69,3 8 Glicerol GO
30,0 0,0 100
1,0 43,3 0
2,5 0,0 100 Dimetilsulfóxido DMSO
5,0 0,0 100
2,0 40,4 0
4,0 39,0 3 Glicose GI
10,0 25,7 36
Sacarose SA 5,0 46,2 11
77
10,0 52,2 0
30,0 23,8 54
4,0 41,6 0
5,5 37,8 9 Extrato de malte EM
13,0 25,7 38
3,0 47,8 0
6,0 42,7 10,7 Polietilenoglicol-
6000 PEG
10,0 22,0 54,0
Nas Tabelas 2 e 3 são apresentados os resultados de recuperação do
crescimento micelial do fungo após criopreservação a -20 oC e a -70 oC,
respectivamente. Todos os grãos e o cilindro de BDA não apresentaram recuperação
após a criopreservação a -20ºC. O uso de temperatura mais elevada para a
manutenção de linhagens fúngicas, como a de -20oC, considerada temperatura
comercial de congelamento, não é usual, segundo Putzke e Putzke (1998), por
ocasionar danos celulares, resultando em baixa taxa de sobrevivência do fungo (Tabela
2).
No entanto na criopreservação a -70°C todos os grãos e os cilindros de BDA
apresentaram 100% de recuperação, exceto o GAV, GPA e BDA associados ao PEG
(Tabela 3). A maior eficiência esperada na criopreservação a -70oC está relacionada à
maior velocidade de congelamento, que causa menores danos à célula devido a menor
desidratação e rompimento das membranas (DUMONT et al., 2004; FELLOWS, 2006).
O efeito crioprotetor dos grãos pode estar relacionado à presença de alta
concentração de nutrientes termo-resistentes, como vitaminas e minerais, e a uma
rede de capilares que grãos como o trigo e aveia possuem e que permitem uma
maior penetração das hifas do fungo, protegendo contra a baixa temperatura
(BELITZ; GROSCH, 1997; FENNEMA, 1993; HOSENEY, 1991). Os grãos também
possuem amido, com capacidade ligar a água durante a gelatinização, o que reduz o
tamanho dos cristais de gelo, aproximando as temperaturas de congelamento intra e
extracelular, reduzindo a desidratação celular (DUMONT et al., 2004; FELLOWS,
2006). A criopreservação de linhagens de Lentinula em grãos de sorgo (Sorghum
vulgare) com glicerol a 10% como crioprotetor já foi relatado por Mata e Salmones
78
(2005) em nitrogênio líquido, no entanto não foram encontrados relatos em
temperatura comercial de -20oC para Basidiomicetos.
Na temperatura de -70ºC destaca-se o resultado obtido pelos cilindros de BDA,
com recuperação total com todos os crioprotetores, exceto o PEG (Tabela 3). Os
cilindros de BDA são amplamente utilizados como suporte do micélio de basidiomicetos
para criopreservação (CHVOSTOVÁ, et al.; 1995; MATA et al., 1994), no entanto muitos
protocolos de congelamento utilizam nitrogênio líquido para a criopreservação. A -70 ºC
há influencia do substrato na recuperação do grão, o PEG associado a GTR e GAR
proporcionou recuperação do crescimento micelial, mas quando associado a BDA, GAV
e GPA inviabilizou a recuperação do fungo, provavelmente devido a composição
química e física dos grãos (Tabela 3).
Os crioprotetores avaliados mostraram-se adequados à criopreservação de
Lentinula edodes a -70 ºC, com exceção do PEG associado aos GAV, GPA e BDA. O
DMSO, assim como o GO, tem a capacidade de penetrar a parede celular e membrana
plasmática, tornando-as mais elásticas, o que permite a acomodação molecular durante
a expansão de volume no congelamento. Além disso, possui a capacidade de ligar a
água no interior da célula, o que previne a desidratação excessiva, reduz a toxicidade
pelo excesso de sais e previne a formação de grandes cristais de gelo (DUMONT et al.,
2004; HUBÁLEK, 2003;). Já os crioprotetores GI e SA são compostos de carboidratos
com alta capacidade de ligar água, que penetram na parede celular mas não penetram
na membrana plasmática, formando uma barreira contra o crescimento do gelo,
protegendo a membrana plasmática mecanicamente (HUBÁLEK, 2003; SANTOS, 2001;
ZHANG et al., 1996). EM e PEG são crioprotetores que não penetram na parede
celular, adsorvem a superfície das células formando uma camada viscosa e causando
efluxo parcial da água na célula, inibindo o crescimento dos cristais de gelo e
aumentando a viscosidade da solução (HUBÁLEK, 2003). Contudo PEG não
apresentou capacidade protetora a -70 ºC, ao contrário dos demais crioprotetores
(Tabela 3).
79
Tabela 2. Porcentagem de recuperação e coeficiente de variação (CV) de Lentinula edodes crescido em ágar-batata-dextrose, grão de aveia, trigo, arroz ou painço e criopreservado por um ano a -20 ºC.
Crioprotetor BDA (CV) GAV (CV) GTR (CV) GAR (CV) GPA (CV)
GO (10%) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0)
DMSO (1%) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0)
GI (4%) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 6,6 (173,2)
SA (10%) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0)
EM (4%) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0)
PEG (6%) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0)
BDA: batata-dextrose-ágar; GAV: grão de aveia, CTR: grão de trigo, GAR: grão de arroz; CPA (grão de painço).
Tabela 3. Porcentagem de recuperação e coeficiente de variação de Lentinula edodes crescido em ágar-batata-dextrose, grão de aveia, trigo, arroz ou painço e criopreservado por um ano a -70 ºC.
Crioprotetor BDA (CV) GAV (CV) GTR (CV) GAR (CV) GPA (CV)
GO (10%) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0)
DMSO (1%) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 93,3 (12,3)
GI (4%) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0)
SA (10%) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0)
EM (4%) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0) 100,0 (0,0)
PEG (6%) 0,0 (0,0) 65,0 (13,3) 100,0 (0,0) 80,0 (0,0) 46,6 (107,8)
BDA: batata-dextrose-ágar; GAV: grão de aveia, CTR: grão de trigo, GAR: grão de arroz; CPA (grão de painço).
O grãos e os cilindros de BDA, além do efeito positivo na recuperação do
crescimento micelial, permitiram a manutenção do vigor de crescimento do fungo a -
70oC (dados não apresentados), sugerindo que houve a preservação das estruturas
celulares, independente do substrato de crescimento do fungo.
80
5.4 CONCLUSÕES
Em função da metodologia adotada e das condições experimentais concluiu-
se que a criopreservação da linhagem U6/12 de Lentinula edodes por um ano não é
viável na temperatura de -20 ºC.
O uso de aditivos protetores associado a grãos ou cilindros de batata-
dextrose-ágar viabiliza a criopreservação de Lentinula edodes a -70 ºC.
AGRADECIMENTOS
À Universidade Paranaense, CNPq e Fundação Araucária pelo apoio financeiro e
pela bolsa de estudos concedida.
81
5.5 REFERÊNCIAS
BELITZ, H. D.; GROSCH, W. Química de los alimentos. Zaragoza: Acribia, 1997. 1087 p.
CHALLEN, M.; ELLIOTT, T. J. Polypropylene straw ampoules for the storage of microorganisms in liquid nitrogen. Journal of Microbiological Methods, Amsterdam, v. 5, p.11-23, 1986.
CHVOSTOVÁ, V.; NERUD, F.; HOMOLKA, L. Viablity of wood-inhabiting basidiomycetes following cryogenic preservation. Folia Microbiologica, New York, v. 40, n.2, p. 193-197, 1995.
DUMONT, F.; MARECHAL, P. A.; GERVAIS, P. Cell size and water permeability as determining factors for cell viability after freezing at different cooling rates. Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 70, n.1, p. 268-272, 2004.
EIRA, A. F.; MONTINI, R. M. C. M. Manual de Cultivo do shiitake (Lentinula edodes (Berk.) Pegler). Botucatu, FEPAF, 1997. 38p.
FELLOWS, P. J. Tecnologia do processamento de alimentos: princípios e práticas. Porto Alegre: Artmed, 2006. 602p.
FENNEMA, O. R. Química de los alimentos. Zaragoza: Acríbia, 1993. 1051p.
HERRERA, I. L.; MATA, G.; HERNÁNDEZ, R. G. Evaluation of the viability of Pleutorus spp. strains after liquid nitrogen cryopreservation, Revista de Microbiologia, São Paulo, v. 29, n. 3, 1998.
HOMOLKA, L.; LISÁ, L.; EIHLEROVÁ, I.; NERUD, F. Cryopreservation of basidiomycete strains using perlite. Journal of Microbiological Methods, Amsterdam, v. 47, p. 307-313, 2001.
HOSENEY, R. C. Principios de ciencia y tecnología de los cereales. Zaragoza: Acribia, 1991. 321p.
HUBÁLEK, Z. Protectants used in the cryopreservation of microorganisms. Cryobiology, New York, v. 46, p. 205-229, 2003.
82
ISHIKAWA, N. K., KASUYA, M. C. M., VANETTI, M. C. D.Antibacterial activity of Lentinula edodes grown in liquid medium. Brazilian Journal of Microbiology, São Paulo, v. 32, p. 206-210, 2001.
LECHNER, B. E.; PAPINUTTI, V. L. Production of lignocellulosic enzymes during growth and fruiting of the edible fungus Lentinus tigrinus on wheat straw. Process Biochemistry, Amsterdam, v. 41, p. 594-598, 2006.
MATA, G.; PÉREZ-MERLO, R. Spawn viability in edible mushrooms after freezing in liquid nitrogen without a cryoprotectant. Cryobiology, New York, v. 47, p. 14-20, 2003.
MATA, G.; SALMONES, D. Preservation of shiitake spawn stocks by cryogenic storage. In: Shiitake cultivation. Korea: Mushworld, 2005. p. 42-45.
MATA. G.; SALMONES, D.; PÉREZ, P.; GUZMÁN, G. Behavior of some strains of the genus Pleurotus alter different procedures for freezing in liquid nitrogen, Revista de Microbiologia, São Paulo, v. 25, n. 3, p. 197-200, 1994.
PUTZKE, J; PUTZKE, M. T. L. Os reinos dos fungos. Santa Cruz do Sul: EDUNISC, 1998. 606p.
SANTOS, I. R. I. Criopreservação de germoplasma vegetal – a alternativa para conservação a longo prazo. Biotecnologia, Ciência e Desenvolvimento, Brasília, n. 20, p. 60-65, 2001.
SAZAKI, S. H.; LINHARES, R. E. C.; NOZAWA, C. M.; MONTALVÁN, R.; PACCOLA-MEIRELLES, L. D. Strains of Lentinula edodes supress growth of phytopathogenic fungi and inhibit alagoas serotype of vesicular stomatitis vírus. Brazilian Journal of Microbiology, São Paulo, v. 32, p. 52-55, 2001.
SOUZA-PACCOLA, E. A.; BOMFETI, C. A.; FÁVARO, L. C. L.; FONSECA, I. C. B.; PACCOLA-MEIRELLES, L. D. Antimutagenic action of Lentinula edodes and Agaricus blazei on Aspergillus nidulans conidia. Brazilian Journal of Microbiology, São Paulo, v. 35, p. 311-315. 2004.
SUZUKI, H.; ILYAMA, K.; YOSHIDA, O.; YAMAZAKI, S.; YAMAMOTO, N.; TODA, S. Structural characterization of the immunoactive and antiviral water-solubilized lignin in na extract of the culture medium of Lentinus edodes mycelia (LEM). Agricultural and Biological Chemistry, Tóquio, v. 54, n. 2, p. 479-487, 1990.
83
SUZUKI, M.; IWASHIRO, M.; TAKATSUKI, F.; KURIBAYASHI, K.; HAMURO, J. Reconstitution of antitumor effects of lentinan in nude mice: roles of delayes-types hypersensitivy reaction triggred by CD4-positive T cell clone in the infiltration of effector cells into tumor. Journal Cancer Research, v. 85, p. 409-417, 1994.
THOMAS, V.; SMITH, D. Cryogenic light microscopy and the development of long-term cryopreservation techniques for fungi. Outlook on Agriculture, New York, v. 23, n. 3, p. 163-167, 1994.
ZHANG, Y. H.; ZHONG, J. J.; YU, J. T. Enhancement of ginseng saponin production in suspension cultures of Panax notoginseng: manipulation of sucrose. Journal of Biotechnology, Amsterdam, v. 51, p. 49-56, 1996.
84
CONCLUSÕES GERAIS
Os fungos Pleurotus sp e Lentinula edodes são capazes de degradar diversos
resíduos da agroindústria, sendo que o crescimento micelial é influenciado pelas
características físicas e químicas das matérias-primas.
A produção de lacase é influenciada pelas características físico-químicas do
substrato de cultivo, sendo que a granulometria das matérias-primas componentes
do substrato é fundamental para o acesso enzimático do fungo aos nutrientes.
Grãos associados à crioprotetores viabilizam a criopreservação de Pleurotus
ostreatus por 30 dias e um ano à -20 ºC, mas não viabilizam a criopreservação de
Lentinula edodes nas mesmas condições.
A criopreservação de Pleurotus ostreatus e Lentinula edodes a -70 ºC é
eficiente com a associação de cilindros de ágar-batata-dextrose e crioprotetores ou
com a grãos e crioprotetores.
85
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BALDRIAN, P. Interactions of heavymetals with white-rot fungi. Enzyme and Microbial Technology, Amsterdam, v. 32, p. 78-91, 2003.
EIRA, A. F. Cultivo do cogumelo medicinal Agaricus blazei (Murrill) ss. Heinemann ou Agaricus brasiliensis (Wasser et al.). Viçosa: Aprenda fácil, 2003.
GIANFREDA, L.; XU, F.; BOLLAG, J. M. Laccases: a useful group of oxidoreductive enzymes. Biorremediation Journal, Boca Raton, v. 3, n. 1, p. 1-26, 1999.
HUBÁLEK, Z. Protectants used in the cryopreservation of microorganisms. Cryobiology, New York, v. 46, p. 205-229, 2003.
HWANG, H. J.; KIM, S. W.; LIM, J. M.; JOO, J. H.; KIM, H. O.; KIM, H. M.; YUN, J. W. Hypoglycemic effect of crude exopolysaccharides produced by a medicinal mushroom Phellinus baumii in strptozotocin-induced diabetic rats. Life Sciences, Oxford v. 76, p. 3069-3080, 2005.
ISHIKAWA, N. K., KASUYA, M. C. M., VANETTI, M. C. D.Antibacterial activity of Lentinula edodes grown in liquid medium. Brazilian Journal of Microbiology, São Paulo, v. 32, p. 206-210, 2001.
LECHNER, B. E.; PAPINUTTI, V. L. Production of lignocellulosic enzymes during growth and fruiting of the edible fungus Lentinus tigrinus on wheat straw. Process Biochemistry, Amsterdam v. 41, p. 594-598, 2006.
MATA, G.; DELPECH, P.; SAVOIE, J. M. Selection of strains of Lentinula edodes and Lentinula boryana adapted for efficient growth on wheat straw. Revista Iberoamericana de Micologia, Bilbao, v. 18, p. 118-122, 2001.
MATA, G.; PÉREZ-MERLO, R. Spawn viability in edible mushrooms after freezing in liquid nitrogen without a cryoprotectant. Cryobiology, New York, v. 47, p. 14-20, 2003.
MATA, G.; SALMONES, D. Preservation of shiitake spawn stocks by cryogenic storage. In: Shiitake cultivation. Korea: Mushworld, 2005. p. 42-45.