Postêpy Dermatologii i Alergologii XX; 2003/2 73 Adres do korespodencji: dr med. Mariola Pawlaczyk, Katedra i Klinika Dermatologii AM, ul. Przybyszewskiego 49, 60-355 Poznañ, e-mail: [email protected]Zastosowanie badań immunohistochemicznych i technik biologii molekularnej w diagnostyce ziarniniaka grzybiastego The use of immunohistochemistry and molecular biology techniques in the diagnosis of mycosis fungoides MARIOLA PAWLACZYK 1 , ELŻBIETA PORĘBA 2 , VIOLETTA FILAS 3 , TAMARA BANASIAK 3 , LUCYNA KRAMER 4 , JAN BRĘBOROWICZ 3 , ANNA GOŹDZICKA-JÓZEFIAK 2 1 Katedra i Klinika Dermatologii AM im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu, kierownik Katedry i Kliniki prof. dr hab. med. Wojciech Silny; 2 Zakład Wirusologii Molekularnej Instytutu Biotechnologii UAM, kierownik Zakładu prof. dr hab. Anna Goździcka-Józefiak; 3 Katedra Onkologii AM im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu, kierownik Katedry prof. dr hab. med. Jan Bręborowicz; 4 Katedra i Zakład Informatyki i Statystyki AM im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu, kierownik Katedry i Zakładu prof. dr hab. Jerzy Moczko Abstract Mycosis fungoides (MF) is the most common primary cutaneous T-cell lymphoma which may be difficult to dia- gnose at the early stage. The aim of the study was to evalu- ate the usefulness of immunohistochemical examinations and T-cell receptor γ gene (TCRγ) rearrangement analysis in the diagnosis of MF. Immunohistochemical reactions were per- formed with antibodies to CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8 and CD20 cell markers of skin infiltrates. TCRγ rearrange- ments were detected using the method of polymerase chain reaction with the subsequent separation of products by tem- perature gradient gel electrophoresis. The studied group consisted of 49 patients with MF and 25 patients with in- flammatory dermatoses. In the majority of MF skin infiltra- tes cells expressed the immunophenotype: CD2+, CD3+, CD4+, CD5+, CD7-, CD8- and CD20- did not vary signi- ficantly from phenotypes observed in chronic inflammatory dermatoses. Dominant clones with TCRγ rearrangement we- re detected in 85% of MF skin biopsies and in 63% of MF peripheral blood cells whereas in the control group in 11% and 14% of cases, respectively. Statistically significant dif- ferences were found in the occurrence of clonal T-cells in skin infiltrates between patients with MF and the control group. A statistical analysis of TCRγ rearrangement in pe- Streszczenie Ziarniniak grzybiasty (MF) jest najczêœciej wystêpuj¹cym pierwotnym ch³oniakiem skóry T-komórkowym, który w po- cz¹tkowym okresie choroby czêsto sprawia trudnoœci diagno- styczne. Celem pracy by³a ocena przydatnoœci badañ immu- nohistochemicznych oraz rearan¿acji genu γ receptora limfo- cytów T (TCRγ) w diagnostyce ziarniniaka grzybiastego (MF). Reakcje immunohistochemiczne prowadzono z przeciwcia³a- mi przeciw markerom CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD20 komórek nacieków skórnych. Do analizy rearan¿acji TCRγ zastosowano metodê PCR z elektroforetycznym rozdzia- ³em heterodupleksów w ¿elu, w gradiencie temperaturowym. Badaniami objêto 49 chorych na MF w ró¿nych stadiach oraz 25 chorych z dermatozami zapalnymi. W wiêkszoœci nacieków skórnych MF na komórkach stwierdzano immunofenotyp CD2+, CD3+, CD4+, CD5+, CD7-, CD8-, CD20-, podobny do wystêpuj¹cego w przewlek³ych zapalnych chorobach skó- ry. Dominuj¹ce klony z rearan¿acj¹ TCRγ wykryto w wycin- kach skórnych u 85%, a w komórkach krwi obwodowej u 63% ogó³u chorych z MF, podczas gdy w grupie kontrolnej odpo- wiednio u 11 i 14% chorych. Stwierdzono statystycznie istot- ne ró¿nice w porównaniu wystêpowania klonów limfocytów T w naciekach skórnych u chorych z MF w stosunku do cho- rych z grupy kontrolnej. Analiza statystyczna wyników rearan-
7
Embed
Zastosowanie badań immunohistochemicznych i technik ... 1/2 albo Vγ 9iJγ 1/2. Nastêpnie otrzymane produkty u¿ywa-no jako matrycê wkolejnej rundzie amplifikacji, wktórej wy-
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Postêpy Dermatologii i Alergologii XX; 2003/2 73
Adres do korespodencji: dr med. Mariola Pawlaczyk, Katedra i Klinika Dermatologii AM, ul. Przybyszewskiego 49, 60-355 Poznañ,e-mail: [email protected]
MARIOLA PAWLACZYK1, ELŻBIETA PORĘBA2, VIOLETTA FILAS3, TAMARA BANASIAK3,LUCYNA KRAMER4, JAN BRĘBOROWICZ3, ANNA GOŹDZICKA-JÓZEFIAK2
1 Katedra i Klinika Dermatologii AM im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu, kierownik Katedry i Kliniki prof. dr hab. med.Wojciech Silny; 2 Zakład Wirusologii Molekularnej Instytutu Biotechnologii UAM, kierownik Zakładu prof. dr hab. AnnaGoździcka-Józefiak; 3 Katedra Onkologii AM im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu, kierownik Katedry prof. dr hab. med.Jan Bręborowicz; 4 Katedra i Zakład Informatyki i Statystyki AM im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu, kierownik Katedry i Zakładu prof. dr hab. Jerzy Moczko
AbstractMycosis fungoides (MF) is the most common primary
cutaneous T-cell lymphoma which may be difficult to dia-gnose at the early stage. The aim of the study was to evalu-ate the usefulness of immunohistochemical examinations andT-cell receptor γ gene (TCRγ) rearrangement analysis in thediagnosis of MF. Immunohistochemical reactions were per-formed with antibodies to CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8and CD20 cell markers of skin infiltrates. TCRγ rearrange-ments were detected using the method of polymerase chainreaction with the subsequent separation of products by tem-perature gradient gel electrophoresis. The studied groupconsisted of 49 patients with MF and 25 patients with in-flammatory dermatoses. In the majority of MF skin infiltra-tes cells expressed the immunophenotype: CD2+, CD3+,CD4+, CD5+, CD7-, CD8- and CD20- did not vary signi-ficantly from phenotypes observed in chronic inflammatorydermatoses. Dominant clones with TCRγ rearrangement we-re detected in 85% of MF skin biopsies and in 63% of MFperipheral blood cells whereas in the control group in 11%and 14% of cases, respectively. Statistically significant dif-ferences were found in the occurrence of clonal T-cells inskin infiltrates between patients with MF and the controlgroup. A statistical analysis of TCRγ rearrangement in pe-
StreszczenieZiarniniak grzybiasty (MF) jest najczêœciej wystêpuj¹cym
pierwotnym ch³oniakiem skóry T-komórkowym, który w po-cz¹tkowym okresie choroby czêsto sprawia trudnoœci diagno-styczne. Celem pracy by³a ocena przydatnoœci badañ immu-nohistochemicznych oraz rearan¿acji genu γ receptora limfo-cytów T (TCRγ) w diagnostyce ziarniniaka grzybiastego (MF).Reakcje immunohistochemiczne prowadzono z przeciwcia³a-mi przeciw markerom CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8,CD20 komórek nacieków skórnych. Do analizy rearan¿acjiTCRγ zastosowano metodê PCR z elektroforetycznym rozdzia-³em heterodupleksów w ¿elu, w gradiencie temperaturowym.Badaniami objêto 49 chorych na MF w ró¿nych stadiach oraz25 chorych z dermatozami zapalnymi. W wiêkszoœci naciekówskórnych MF na komórkach stwierdzano immunofenotypCD2+, CD3+, CD4+, CD5+, CD7-, CD8-, CD20-, podobnydo wystêpuj¹cego w przewlek³ych zapalnych chorobach skó-ry. Dominuj¹ce klony z rearan¿acj¹ TCRγ wykryto w wycin-kach skórnych u 85%, a w komórkach krwi obwodowej u 63%ogó³u chorych z MF, podczas gdy w grupie kontrolnej odpo-wiednio u 11 i 14% chorych. Stwierdzono statystycznie istot-ne ró¿nice w porównaniu wystêpowania klonów limfocytówT w naciekach skórnych u chorych z MF w stosunku do cho-rych z grupy kontrolnej. Analiza statystyczna wyników rearan-
wierzchniowe komórek nacieków [8, 9], a w ostatnich latach
coraz szerzej stosuje siê techniki biologii molekularnej [10–12].
W procesie dojrzewania prawid³owe limfocyty T przecho-
dz¹ rearan¿acje regionów zmiennych, ³¹cz¹cych i sta³ych w ob-
rêbie genów receptora limfocytów T (T cell receptor, TCR),
w wyniku czego ka¿d¹ komórkê charakteryzuj¹ okreœlone
cz¹stki powierzchniowe, a wszystkie komórki siostrzane wy-
wodz¹ce siê z dojrza³ych limfocytów T wykazuj¹ ekspresjê
tych samych TCR. W procesach nowotworzenia zwi¹zanych
z monoklonaln¹ proliferacj¹ limfocytów T, do których zalicza
siê MF, liczba jednakowych komórek bêdzie wiêc wzrastaæ do
poziomu daj¹cego siê wykryæ technikami molekularnymi
[11–15].
Celem pracy by³a ocena przydatnoœci badañ immunohi-
stochemicznych markerów powierzchniowych komórek na-
cieków skórnych oraz analizy rearan¿acji genu γ TCR w dia-
gnostyce ziarniniaka grzybiastego.
Materiał i metodyBadaniami objêto materia³ pochodz¹cy od 49 chorych na
MF, w wieku od 34 do 82 lat, leczonych w Klinice Dermatolo-
gii AM w Poznaniu, b¹dŸ diagnozowanych w Katedrze Onko-
ripheral blood cells did not reveal any differences only inpatients with the MF in the early stage (IA) when comparedwith inflammatory dermatoses. Detection of TCRγ rearran-gement is a valid supplement to histopathologic and immu-nohistochemical examination in cases of suspected MF ho-wever the diagnosis should always be based on the analysisof examinations and clinical status of patients.
¿acji TCRγ w komórkach krwi obwodowej nie wykaza³a istot-nych ró¿nic tylko w stadium pocz¹tkowym (IA) MF w porów-naniu z dermatozami ³agodnymi. W przypadkach podejrzeniaMF, wykrycie rearan¿acji genu TCRγ stanowi cenne uzupe³-nienie diagnostyki histopatologicznej i immunohistochemicz-nej, jednak rozpoznanie powinno byæ zawsze stawiane na pod-stawie ca³oœciowej oceny badañ i stanu klinicznego chorych.
Tab. 1. Stadium zaawansowania ziarniniaka grzybiastego wg klasyfikacji TNM*
Stadium T (tumor) N (lymph node) M (metastasis)
IA rumienie i nacieki <10% brak lymphadenopatii brakpowierzchni skóry (T1) lub zmiany odczynowe w wêz³ach
IB rumienie i nacieki >10% brak lymphadenopatii brakpowierzchni skóry (T 2) lub zmiany odczynowe w wêz³ach
IIA rumienie i nacieki lymphadenopatia ze zmianami brak
odczynowymi w wêz³ach ch³onnych
IIB guzy >1 (T3) brak lymphadenopatii lub zmiany brakodczynowe w wêz³ach
III erytrodermia (T4) lymphadenopatia ze zmianami brakodczynowymi w wêz³ach ch³onnych
IVA T1, T2, T3 lub T4 nacieki nowotworowe brakw wêz³ach ch³onnych
IVB T1, T2, T3 lub T4 zmiany odczynowe zajêcie narz¹dówlub nowotworowe w wêz³ach ch³onnych wewnêtrznych
*Podzia³ przyjêty przez Miêdzynarodow¹ Konferencjê okreœlaj¹c¹ zasady leczenia ch³oniaków skóry [16]
Postêpy Dermatologii i Alergologii XX; 2003/2 75
Zastosowanie badañ immunohistochemicznych i technik biologii molekularnej w diagnostyce ziarniniaka grzybiastego
logii AM w Poznaniu, w latach 1994–2002. Stadium MF ocenia-no wg klasyfikacji TNM, przedstawionej w tab. 1. [16]. Do grupkontrolnych w³¹czono 15 chorych na przewlek³y, rozsiany wy-prysk kontaktowy niealergiczny, 10 chorych na ³uszczycê oraz10 chorych na przy³uszczycê plackowat¹ drobnoogniskow¹. Ma-teria³ pobierany by³ przed wdro¿eniem leczenia i obejmowa³ wy-cinki skórne oraz u czêœci chorych krew obwodow¹. We wszyst-kich przypadkach rozpoznania potwierdzane by³y rutynowymibadaniami laboratoryjnymi z uwzglêdnieniem szczegó³owej oce-ny rozmazu krwi obwodowej, badaniem radiologicznym klatkipiersiowej oraz ultrasonograficznym jamy brzusznej, ocen¹ hi-stopatologiczn¹ i immunohistochemiczn¹ wycinków skórnychoraz wêz³ów ch³onnych w przypadku ich powiêkszenia. Bada-nia immunohistochemiczne markerów powierzchniowych CD2,CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD20 na komórkach naciekówskórnych wykonywano w skrawkach parafinowych i kriostato-wych, z zastosowaniem przeciwcia³ monoklonalnych firmy Da-ko i Novocastra oraz metody immnuohistochemicznej z kom-pleksem EnVision + HPR. Reakcje immunohistochemiczne uzna-wano za dodatnie, je¿eli barwi³o siê co najmniej 50% komórekjednoj¹drzastych nacieku. Oceny histopatologicznej i immuno-histochemicznej dokonywa³y niezale¿nie, dwie ró¿ne osoby.
Analizê rearan¿acji genu γ TCR przeprowadzono w wycin-kach skórnych i krwi obwodowej, stosuj¹c metodê PCR (poly-merase chain reaction, PCR), z elektroforetycznym rozdzia³emheterodupleksów w ¿elu, w gradiencie temperaturowym (HD-TGGE, heteroduplex temperature gradient gel electropho-resis). Do izolacji genomowego DNA z wycinków skórnychskrawano 10 skrawków po 10 µm ka¿dy. W celu odparafino-wania materia³ poddawano dzia³aniu ksylenu, a po odwirowaniui przep³ukaniu etanolem trawiono proteinaz¹ K [17]. Do izolacjigenomowego DNA z komórek nacieków skórnych i krwi obwo-dowej wykorzystano zestawy firmy QIAGEN; odpowiednio QIAamp DNA Mini Kit oraz QIAamp DNA Blood Kit. JakoœæDNA w próbkach sprawdzano technik¹ PCR z u¿yciem starte-rów specyficznych dla fragmentu genu ludzkiej β-globiny. Re-akcje amplifikacji fragmentów TCRγ prowadzono ze starteramikomplementarnymi do regionów V1-8 lub V9 oraz J1-2 TCRγzestawionymi w tab. 2. [18]. Mieszaniny reakcyjne o objêtoœcikoñcowej 20 µl zawiera³y: 50 ng DNA genomowego, 1 x stê¿o-ny bufor PCR, 200 µM ka¿dego dNTP, 1 µM ka¿dego z dwócholigonukleotydów, 1U/25 µl Taq DNA polimerazy. Reakcjê pro-wadzono, stosuj¹c nastêpuj¹ce profile termiczne: denaturacja
w 94oC przez min, przy³¹czanie starterów w 55oC przez 1,5 min,polimeryzacjê w 70oC przez 1,5 min. W pierwszej rundzie am-plifikacji stosowano pary starterów zewnêtrznych V1-8γ i Jγ1/2 albo Vγ 9 i Jγ 1/2. Nastêpnie otrzymane produkty u¿ywa-no jako matrycê w kolejnej rundzie amplifikacji, w której wy-korzystywano odpowiednio startery komplementarne do we-wnêtrznych sekwencji genów Vγ 1-8 i Jγ 1/2 albo Vγ 9 i Jγ 1/2.Po pierwszej rundzie amplifikacji rejonu Vγ 1-8 i Jγ 1/2 otrzy-mywano produkty o wielkoœci ok. 480 par zasad, a po drugiej420 par zasad. Amplifikowane fragmenty rejonu Vγ 9 i Jγ 1/2wynosi³y odpowiednio 400 i 380 par zasad. Do oceny rearan-¿acji jako kontrolê negatywn¹ stosowano DNA wyizolowanyz krwi osób zdrowych, a jako kontrole pozytywne DNA wyizo-lowany z komórek Jurkat (rearan¿acje w rejonie V1-8γ) orazDNA wyizolowany z krwi obwodowej chorego na ostr¹ bia-³aczkê limfatyczn¹ T-komórkow¹ γδ+ (rearan¿acje w rejonieVγ9). Wszystkie reakcje PCR przeprowadzono w aparacie UNOII firmy Biometra. Otrzymane produkty rozdzielano w 2% ¿e-lu agarozowym, zawieraj¹cym bromek etydyny, w celu spraw-dzenia efektu amplifikacji. Produkty otrzymane w reakcji am-plifikacji denaturowano w 95oC przez 5 min, a nastêpnie rena-turowano w 55oC przez 20 min w celu uzyskaniaheterodupleksów. Rozdzia³ elektroforetyczny prób prowadzo-no w 8% ¿elu poliakryloamidowym zawieraj¹cym 7M mocz-nik, w gradiencie temperatury (35–55oC) przez 3 godz. przy na-piêciu 450 V, z u¿yciem aparatu TGGE Maxi firmy Biometra.Po zakoñczeniu elektroforezy ¿ele barwiono srebrem, stosuj¹czestaw Silver Stain, firmy Kucharczyk i fotografowano.
Analizê statystyczn¹ wyników przeprowadzono przy po-mocy testu dok³adnego Fishera (p=0,05). Dla porównanina wy-ników monoklonalnoœci w poszczególnych grupach zastoso-wano test Manna-Whitthney’a, przyjmuj¹c dla wycinków skór-nych p=0,0027, a dla krwi obwodowej p=0,0216.
dz¹ce od chorych na MF w ró¿nych stadiach choroby i wycin-ki od wszystkich chorych z grupy kontrolnej oraz krew obwo-dow¹ od 40 chorych na MF i wszystkich z grupy kontrolnej.
Wiêkszoœæ limfocytów w naciekach skórnych MF wyka-
zywa³a fenotyp CD2+ CD3+ CD4+ CD8- (fot. 1. i 2.), za wy-
j¹tkiem 4 przypadków w stadium IIB i 2 w stadium IVA MF,
Tab. 2. Startery stosowane do amplifikacji fragmentów receptora γγ limfocytów T
Runda PCR Starter Vγγ (5'-3') Starter Jγγ (5'-3')
I Vγ 1-8 zewnêtrzny GGAGCTTCTAGCTTTCCTGTCTC lub Jγ zewnêtrznyVγ 9 zewnêtrzny CGTCGACAACAAGTGTTGTTCCAC
GGAATTCCAAATTCTTGGTTTA
II Vγ 1-8 wewnêtrzny CTCGAGTGCGCTGCCTACAGAGAGGlub Jγ wewnêtrznyVγ 9 wewnêtrzny GGATCCACTGCCAAAGAGTTTCTTCTCGAGTGCGCTGCCTACAGAGAG
z ekspresj¹ CD8+ CD4-. Os³abion¹ ekspresjê CD5 obserwo-wano u 7 chorych (stadia IIA, IIB, III, IVA), a CD3 u 4 cho-rych w stadium IIB, III, IVA. W nielicznych przypadkach(dwóch w stadium IA, dwóch w stadium IB i jednym w sta-dium IIA) w naciekach MF stwierdzono ekspresjê CD7+. Tyl-ko pojedyncze komórki nacieków nowotworowych MF wyka-zywa³y reakcjê z przeciwcia³em CD 20. W grupie kontrolnejw wiêkszoœci stwierdzano immunofenotyp komórek naciekówskórnych: CD2+ CD3+ CD4+ CD5+ CD7- CD8-, z wyj¹tkiem3 przypadków przewlek³ego wyprysku i 3 przypadków przy-³uszczycy plackowatej, w których wystêpowa³a ekspresjaCD7+. Analiza statystyczna ekspresji CD7+ nie wykaza³a istot-
nych ró¿nic miêdzy grup¹ MF a grup¹kontroln¹.
Wyniki analizy rearan¿acji genu γ TCRzestawiono w tab. 3. Próby uznawano zamonoklonalne, jeœli w smudze DNA na ¿e-lu widoczny by³ pojedynczy pr¹¿ek (fot.3.). Dominuj¹ce klony z rearan¿acj¹ TCRγstwierdzono w naciekach skórnych u 79%,a w komórkach krwi obwodowej u 63%ogó³u chorych z MF. Monoklonalnoœæ wy-stêpowa³a we wszystkich próbkach cho-rych w stadium IVA. W stadium IIB re-aran¿acje wystêpowa³y u 90% chorychw limfocytach nacieków skórnych orazu 78% we krwi obwodowej. Porównywal-ny odsetek rearan¿acji stwierdzono w sta-diach IIA i III, zarówno w wycinkach, jaki komórkach krwi obwodowej. W pocz¹t-kowym stadium IA MF rearan¿acje stwier-dzono u 75% chorych w wycinkach skór-nych, ale tylko w 37,5% w komórkachkrwi obwodowej. W trzech przypadkachprzewlek³ego wyprysku i u jednego cho-rego z przy³uszczyc¹ plackowat¹ wykrytodominuj¹ce klony w wycinkach skórnych.Analiza rearan¿acji TCRγ we krwi obwo-dowej u chorych z grupy kontrolnej da³adodatnie wyniki u 2 chorych na wypryskoraz u 3 z 10 chorych na przy³uszczycêplackowat¹.
Stwierdzono statystycznie istotne ró¿-nice w porównaniu wystêpowania klo-nów limfocytów T w naciekach skórnychu chorych z MF w stosunku do chorychz grup kontrolnych. Analiza statystycznawyników rearan¿acji TCRγ w komórkachkrwi obwodowej nie wykaza³a istotnychró¿nic tylko w stadium IA.
OmówieniePoszukiwania nowych metod diagno-
stycznych gwarantuj¹cych prawid³owerozpoznanie pierwotnych ch³oniaków skó-ry w pocz¹tkowym okresie choroby, kon-centrowa³y siê przez wiele lat na bada-
niach immunohistochemicznych i genetycznych. Oznaczanieimmunofenotypów komórek nowotworowych nacieków skór-nych stanowi podstawy obowi¹zuj¹cych aktualnie klasyfikacjipierwotnych ch³oniaków skóry [7]. Przedstawione przez nas ba-dania immunohistochemiczne wykaza³y utratê niektórych mar-kerów powierzchniowych na limfocytach T w naciekach skór-nych w stadiach zaawansowanych MF, co przemawia za proce-sem z³oœliwym, jednak w pocz¹tkowym okresie chorobyantygeny powierzchniowe wykazywa³y podobn¹ ekspresjê w MFi przewlek³ych, zapalnych chorobach skóry, co potwierdzaj¹ tak-¿e liczne doniesienia innych autorów [5, 7–9, 20–22]. W wiêk-szoœci przypadków na komórkach nacieków MF nie stwierdza-
Fot. 1. Dodatnia reakcja z przeciwcia³em anty-CD4 w nacieku skórnym u cho-rego w stadium IIA ziarniniaka grzybiastego (pow. 400 razy)
Fot. 2. Ujemna reakcja z przeciwcia³em anty-CD8 w nacieku skórnym u chore-go w stadium IIA ziarniniaka grzybiastego (pow. 400 razy)
Postêpy Dermatologii i Alergologii XX; 2003/2 77
Zastosowanie badañ immunohistochemicznych i technik biologii molekularnej w diagnostyce ziarniniaka grzybiastego
no dodatnich reakcji z przeciwcia³em an-ty-CD7, ale podobny immunofenotyp cha-rakteryzowa³ grupê kontroln¹. Zwiêksze-nie liczby pacjentów grupy kontrolnej mo-g³oby wp³yn¹æ na wykazanie istotnychró¿nic dyskryminuj¹cych nacieki MF oddermatoz zapalnych, jak przedstawi³ toBergman i wsp. [23]. W swojej pracyobejmuj¹cej wiêksz¹ liczbê chorych auto-rzy wykazali istotne ró¿nice w ekspresjiCD7, pozwalaj¹ce na ró¿nicowanie przy-padków MF od zapalnych chorób skóry[23]. Obserwacji Bergmana i wsp. nie po-twierdzaj¹ jednak inne badania. Wydajesiê, ¿e ujemna reakcja z przeciwcia³em an-ty-CD7 w sytuacjach w¹tpliwych nie prze-s¹dza o nowotworowym charakterze na-cieku skórnego [5, 9, 12, 19, 20].
Od momentu wprowadzenia do dia-gnostyki pierwotnych ch³oniaków skórytechnik biologii molekularnej, monoklo-nalnoœæ wykrywano pocz¹tkowo opiera-j¹c siê na technice Southern blot, jednakliczba komórek T w naciekach we wcze-snych okresach MF mo¿e okazaæ siê nie-wystarczaj¹ca do wykazania dominuj¹ce-go klonu t¹ metod¹ [18]. Czu³oœæ badañ wzros³a po wprowa-dzeniu do analizy monoklonalnoœci techniki PCR. LimfocytyT mog¹ prezentowaæ 2 rodzaje ³añcuchów αβ i γδ, co sprawia,¿e w badaniach diagnostycznych wykorzystywaæ mo¿na rearan-
¿acje w obrêbie czterech genów. Wiêkszoœæ skórnych limfocy-tów T wykazuje ekspresjê αβ TCR. Amplifikacja tych ³añcu-chów jest jednak doœæ trudna z uwagi na du¿¹ liczbê segmen-tów zmiennych, st¹d w celu wykrycia klonalnoœci wykorzystu-
Fot 3. Produkty amplifikacji TCRγγ 1-8 rozdzielone metod¹ elektroforezy w ¿e-lu w gradiencie temperatury. Linie 7, 14, 15, 16, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 –produkty poliklonalne; linie – 5, 6, 8, 10, 11 produkty monoklonalne; linie – 1,9, 12, 13 produkty biklonalne; linia – 2, 3, 4 produkty oligoklonalne. 17 markermasy pUC19/MspI. Linia 18 – kontrola dodatnia (DNA izolowany z komórekJurkat)
Tab. 3. Wyniki analizy rearan¿acji genu γγ receptora limfocytów T w wycinkach skórnych i krwi obwodowej u chorychna ziarniniaka grzybiastego i w grupach kontrolnych
je siê czêœciej amplifikacjê ³añcucha γTCR. W prezentowanejpracy zastosowano technikê PCR opracowan¹ przez Woodai wsp. [18], skojarzon¹ z czu³¹ metod¹ elektroforetycznego roz-dzia³u uzyskanych produktów amplifikacji w ¿elu w gradien-cie temperatury [24–26]. Uzyskane przez nas wyniki wykry-wania monoklonalnoœci w naciekach skórnych s¹ podobne doprzedstawionych przez innych autorów [18, 27–29]. Bergmani wsp. wykazali rearan¿acje klonalne TCRγ w naciekach skór-nych u 69% chorych z klasycznym MF [23], a Dadej w 88%[30]. Nieznacznie ni¿szy odsetek rearan¿cji stwierdzono w sta-dium IA MF (37,5%) w komórkach krwi obwodowej w porów-naniu z doniesieniami Muche i wsp. [24], którzy w tym stadiumMF wykryli rearan¿acje u 46,2% chorych. Z punktu widzeniaklinicznego i patologicznego MF, zgodnie z definicj¹ pierwot-nych ch³oniaków skórnych T-komórkowych, rozwija siê w skó-rze i przez 6 mies. od pocz¹tku choroby nie powinien dawaæprzerzutów do wêz³ów ch³onnych czy narz¹dów wewnêtrznych[6, 7]. Badania z wykorzystaniem technik biologii molekular-nej wskazuj¹ na mo¿liwoœæ pozaskórnego rozsiewu nowotwo-rowych limfocytów T ju¿ we wczesnym okresie choroby,o czym œwiadczy wystêpowanie klonów komórek T we krwiobwodowej w stadiach IA i IB MF.
Ciekawe wydaje siê wykrycie rearan¿acji w komórkachkrwi obwodowej chorych z przy³uszczyc¹ plackowat¹ drobno-ogniskow¹. Dermatoza ta od kilku lat stanowi przedmiot kon-trowersji wœród dermatologów; przez jednych uwa¿ana jest zaprekursora MF, inni zaœ traktuj¹ przy³uszczycê plackowat¹w odmianie wieloogniskowej jako stadium rumieniowe MF[31]. Muche i wsp. wykazali wysoki odsetek klonów limfocy-tów T we krwi obwodowej chorych na przy³uszczycê placko-wat¹ drobnoogniskow¹, przy braku tych klonów w naciekachskórnych. Autorzy t³umacz¹ ten fakt mo¿liwoœci¹ wystêpowa-nia miejscowej odpowiedzi immunologicznej skutecznie redu-kuj¹cej nacieki klonalne w skórze [25].
Czêstoœæ wykrywania klonów komórkowych w badanymmateriale zale¿y od kilku czynników: warunków technicznych,w tym sposobu ekstrakcji DNA, rodzaju zastosowanych star-terów i techniki rozdzia³u produktów amplifikacji, badanegomateria³u oraz interpretacja wyników [11, 15, 18, 24, 26, 27,30]. Rearan¿acje wykrywa siê czêœciej w œwie¿ych mro¿onychwycinkach ni¿ w skrawkach parafinowych [18, 22, 30]. Z dru-giej strony stosowanie materia³u zatopionego w parafinieupraszcza procedury diagnostyczne i pozwala na retrospektyw-n¹ ocenê materia³u. Zwiêkszanie czu³oœci stosowanych tech-nik mo¿e jednak doprowadziæ do wykrywania pojedynczychklonów reaktywnych limfocytów w zmianach skórnych w prze-biegu zmian zapalnych skóry [11, 30, 32]. Potwierdzaj¹ to wy-kryte przez nas rearan¿acje w komórkach nacieków u chorychna wyprysk.
Monoklonalnoœæ nie zawsze musi byæ jednoznaczna z roz-rostem z³oœliwym. Z drugiej strony, badania prowadzone przezAsthony-Key’a i wsp. [22] i Bergmana i wsp. [23] udowodni-³y, ¿e dermatozy z pogranicza MF, w których wystêpowa³y klo-nalne rearan¿acje komórek T mimo braku w momencie usta-lania rozpoznania kryteriów klinicznych i histopatologicznychodpowiadaj¹cych MF, po pewnym czasie uleg³y transformacjiw MF. Chorzy z tzw. klonalnym zapaleniem skóry (clonal der-matitis) powinni wiêc byæ objêci obserwacjami klinicznymi
i histopatologicznym z uwagi na mo¿liwoœæ rozwoju CTCL[22, 23, 30, 33].
W œwietle prezentowanych wyników w³asnych oraz licz-nych doniesieñ innych autorów okazuje siê, i¿ analiza klonalno-œci dostarcza cennych dodatkowych informacji potwierdzaj¹-cych rozrost nowotworowy [10, 12, 18, 23, 24, 27, 30]. Nie mo¿-na jednak wyników tego badania traktowaæ jako odrêbnegokryterium diagnostycznego, a jedynie jako badanie uzupe³nia-j¹ce diagnostykê histopatologiczn¹, immunohistochemiczn¹ i ca-³oœciow¹ analizê stanu klinicznego pacjenta [6, 7, 30, 32–34).
Wnioski1. Badania immunohistochemiczne z u¿yciem przeciwcia³
przeciw antygenom powierzchniowym: CD2, CD3, CD4,CD5, CD7, CD8, CD20 komórek nacieków skórnych niepozwalaj¹ na ró¿nicowanie pocz¹tkowego okresu ziarni-niaka grzybiastego z przewlek³ymi, zapalnymi choroba-mi skóry.
2. Analiza monoklonalnoœci na podstawie badania rearan¿a-cji genu γTCR dostarcza istotnych danych potwierdzaj¹-cych nowotworowy charakter dermatoz.
3. Rozpoznanie ziarniniaka grzybiastego powinno byæ zawszestawiane na podstawie ca³oœciowej oceny badañ histopa-tologicznych, immnunohistochemicznych, analizy mono-klonalnoœci oraz stanu klinicznego chorych.
2. Fung MA, Murphy MJ, Hoss DM, et al.: Practical evaluationand management of cutaneous lymphoma. J Am Acad Derma-tol, 2002, 46, 325-57.
3. Bernengo MG, Burg G, Duvic M, et al.: Update on erythroder-mic cutaneous T-cell lymphoma: report of the international so-ciety for cutaneous lymphomas. J Am Acad Dermatol, 2002,46, 95-106.
4. Yeh A, Hudson A, Prieto V, et al.: Reassessment of lympho-cytic atypia in the diagnosis of mycosis fungoides. Mod Pa-thol, 2001,14, 285-88.
5. Kempf W, Dummer R, Burg G: Approach to lymphoprolifera-tive infiltrates of the skin. The difficult lesions. Am J Clin Pa-thol, 1999, 111 (suppl. 1), S84-S93.
7. Willemze R, Kerl H, Sterry W, et al.: EORTC classificationfor primary cutaneous lymphomas. A proposal from the Cu-taneous Lymphoma Study Group of the European Organiza-tion for Research and Treatment of Cancer (EORTC). Blo-od, 1997, 90, 354-71.
8. Ralfkiaer E, Wollf-Sneedorff A, Thomsen K, et al.: Immuno-phenotypic studies in cutaneous T-cell lymphomas: clinical im-plications. Br J Dermatol, 1993, 129, 655-59.
9. Preesman AH, Toonstra J, van der Putte SCJ, et al.: Immuno-phenotyping on simultaneously occuring plaques and tumoursin mycosis fungoides and Sezary syndrome. Br J Dermatol,1993, 129, 660-66.
10. Kohler S, Zehnder JL: Use of the polymerase chain reactionin the evaluation of the cutaneous T-cell infiltrates. DermatolClin, 1999, 17: 657-66.
Postêpy Dermatologii i Alergologii XX; 2003/2 79
Zastosowanie badañ immunohistochemicznych i technik biologii molekularnej w diagnostyce ziarniniaka grzybiastego
11. Wood GS: T-cell receptor and immunoglobulin gene rearran-gements in diagnosing skin disease. Arch Dermatol, 2001, 137:1503-506.
12. Bakels V, Oostveen J, Preesman A, et al.: Differentiation be-tween actinic reticuloid and cutaneous T cell lymphoma by Tcell receptor γ gene rearrangements analysis and immunophe-notyping. J Clin Pathol 1998,51,154-158.
13. Terhune MH, Cooper KD: Gene rearrangements and T-celllymphomas. Arch Dermatol, 1993, 129, 1484-490.
14. Li N, Bhawan J: New insight into the applicability of T-cell re-ceptor γ gene rearrangement analysis in cutaneous T-cell lym-phoma. J Clin Pathol, 2001, 28, 412-8.
16. Proceeding of the International Concensus Conference onCTCL Treatment and Recommendations Boston. J Am AcadDermatol, 1997, 36, 949-54.
17. Wright DK, Manos MM: Sample preparation from paraffinembedded tissues. W: PCR protocols: a guide to methods andapplications. Academic Press, New York, 1990, 153-58.
18. Wood G, Tung R, Haeffner A, et al.: Detection of clonal T-cellreceptor γ gene rearrangements in early mycosis fungoides/Se-zary syndrome by polymerase chaine reaction and denaturinggradient gel electrophoresis (PCR/DGGE). J Invest Dermatol,1994, 103, 34-41.
19. Ralfkiaer E.: Controversies and discussion on early diagnosisof cutaneous T-cell lymphoma. Phenotyping. Dermatol Clin,1994, 12, 329-34.
20. Smoller BR, Bishop K, Glusac EJ, et al.: Lymphocyt antigenabnormalities in inflammatory dermatoses. Appl Immunohi-stochem, 1995, 3, 127-31.
21. Pawlaczyk M, Filas V, Brêborowicz J, Silny W: Badania im-munohistochemiczne nacieków skórnych u chorych z ziarni-niakiem grzybiastym. Doniesienie wstêpne. Przegl Dermatol,1997, 84, 19-26.
22. Asthon-Key M, Diss TC, Du MQ, et al.: The value of polyme-rase chain reaction in the diagnosis of cutaneous T-cell infil-trates. Am J Surg Pathol, 1997, 21, 743-47.
23. Bergman R, Faclieru D, Sahar D, et al.: Immunophenotypingand T-cell receptor γ gene rearrangement analysis as an adjunctto the histopathologic diagnosis of mycosis fungoides. J AmAcad Dermatol, 1998, 39, 554-59.
24. Muche M, Lukowsky A, Asadullah K, et al.: Demonstrationof frequent occurrence of clonal T cells in peripheral blood ofpatients with primary cutaneous T-cell lymphoma. Blood, 1997,4, 1636-42.
25. Muche M, Lukowsky A, Heim J, et al.: Demonstration of fre-quent occurrence of clonal T cells in peripheral blood but notin the skin of patients with small plaque parapsoriasis. Blood,1999, 94, 1409-1417.
26. Scheller U, Muche M, Sterry W, et al.: Detection of clonal T cells in cytaneous T cell lymphoma by polymerase chainereaction: comparison of mutation detection enhancement-po-lyacrylamide gel electrophoresis, temperature gradient gel elec-trophoresis and fragment analysis of sequencing gels. Electro-phoresis, 1998, 19, 653-58.
27. Bachelez H, Bioul L, Flageul B, et al.: Detection of clonal T-cell receptor γ gene rearrangements with the use of polyme-rase chain reaction in cutaneous lesions of mycosis fungoidesand Sezary syndrome. Arch Dermatol, 1995, 131, 1027-31.
28. Bottaro M, Berti E, Biondi A, et al.: Heteroduplex analysis of T-cell receptor γ gene rearrangements for diagnosis and monitoringof cutaneous T-cell lymphomas. Blood, 1994, 83, 3271-78.
29. Theodorou I, Bigorgane C, Delfau MH, et al.: VJ rearange-ments of the TCRγ locus in peripheral T-cell lymphomas: ana-lysis by polymerase chain reaction and denaturating gradientgel electrophoresis. J Pathol, 1996, 178, 303-10.
30. Dadej K, Gaboury L, Lamare L, et al.: The value of clonalityin the diagnosis and follow-up of patients with cutaneous T-cell infiltrates. Diagn Mol Pathol, 2001, 10, 78-88.
31. Burg G, Dummer R: Small plaque (digitate) parapsoriasis isan abortive cutaneous T-cell lymphoma and is not mycosis fun-goides. Arch Dermatol, 1995, 131, 336-8.
32. Wood G: Analysis of clonality in cutaneous T cell lymphomaand associated diseases. Ann New York Acad Sciences, 2001,941, 26-30.
33. Delfau-Larue MH, Laroche L, Wechsler J, et al.: Diagnosticvalue of dominant T-cell clones in peripheral blood in 363 pa-tients presenting consecutively with a clinical suspicion of cu-taneous, lymphoma. Blood, 2000, 96, 2987-92.
34. Dippel E, Assaf C, Hummel M, et al.: Clonal T-cell receptorg-chain gene rearrangement by PCR-based genescan analysisin advanced cutaneous T-cell lymphoma: a critical evaluation.J Pathol, 1999, 188, 146-54.
Praca wykonana zosta³a dziêki programowi badañ w³a-snych nr 501-2-12-03 AM im. Karola Marcinkowskiegow Poznaniu.
Podziêkowania: Autorzy pragn¹ podziêkowaæ Panu doc.Ansgarowi Lukowsky z Kliniki Dermatologii Uniwersyteckie-go Szpitala Charite, Uniwersytetu Humboldta w Berlinie, zanieocenion¹ pomoc w opracowaniu metody analizy rearan¿a-cji genu γ receptora TCR i interpretacji uzyskanych wyników.