Page 1
Zastosowania wielowymiarowego NMR
• chemia: 2D NMR rutynowe pomiary : COSY, NOESY, ROESY, HSQC, HMBC, itd.
• biomolekuły 2D, 3D, 4D dobrze zdefiniowane wąskie zakresy spektralne
• widma wielowymiarowe (2D, 3D) są też coraz bardziej popularne w badaniach fazy stałej
• MRI – te same metody (2D, 3D), ale próbkowanie
przestrzeni odwrotnej gradientami B0
Page 2
Co dają widma wielowymiarowe?
• poprawa separacji sygnałów
• poprawa czułości przy pośredniej detekcji jąder o niskim g
• identyfikacja jąder wzajemnie oddziałujących – problem podstawowy: przypisanie sygnałów
odpowiednim atomom
• pośredni pomiar widm wielokwantowych
• obrazowanie (MRI) – przestrzenne zróżnicowanie częstości rezonansowych
Page 3
jednowymiarowe widmo NMR białka
Page 4
widmo dwuwymiarowe
Page 5
i trójwymiarowe
HNCACB
Page 6
Problemy rosną z liczbą wymiarów czyli :
• ograniczenia związane z próbką (nieistotne w większości przypadków)
- stężenie, g, B0, T, własności relaksacyjne
• i próbkowaniem (metodologiczne) - liczba punktów (ewolucji w wymiarach pośrednich) szybko rośnie z liczbą
wymiarów
- rozdzielczość jest proporcjonalna do maksymalnego czasu ewolucji (teoremat Nyquista)
N – wymiarowy eksperyment :
Dla ni punktów w wymiarze i : n1 n2 .... nN-1 2N-1 pomiarów 1D
t N exc mix i
t i
N–1
(w przypadku MRI zmiana amplitudy PFG zamiast czasu)
Page 7
W praktyce 2D:
• liczba pomiarów 1D
n2D= (t1max sw1 + 1) 2
przykład (500 MHz) t1max=0.05 s, sw1=3.5 kHz (1H 7ppm) lub 20 kHz (13C 160 ppm)
rozdzielczość 20 Hz
n2D= 352 (1H) lub 2002 (13C)
czas pomiaru (2 akumulacje po 2 s):
24’ (1H) lub 2 h 13’ (13C)
Page 8
i 3D
• liczba pomiarów 1D
n2D= (t1max sw1 + 1) (t2max sw2 + 1) 4
przykład (500 MHz) t1max=t2max=0.05 s, sw1=3.5 kHz (1H) sw2= 20 kHz (13C)
rozdzielczość 20 20 Hz
n3D= 2818816
czas pomiaru (2 akumulacje po 2 s): ~4 miesiące
Page 9
wpływ indukcji B0
• wraz z wielkością B0 rośnie czułość:
S/N~B01.5
• ale zakresy spektralne także rosną z proporcjonalnie do B0
• przykład: 500 MHz 700 MHz
aby uzyskać tę samą rozdzielczość w :
widmach 2D czas pomiaru wzrośnie o 40% (7/5)
widmach 3D dwukrotnie (7/5)2
Page 10
wpływ indukcji B0
• wraz z wielkością B0 rośnie czułość:
S/N~B01.5
• ale zakresy spektralne także rosną z proporcjonalnie do B0
• przykład: 500 MHz 700 MHz
aby uzyskać tę samą rozdzielczość w :
widmach 2D czas pomiaru wzrośnie o 40% (7/5)
widmach 3D dwukrotnie (7/5)2
Page 11
wpływ indukcji B0
• wraz z wielkością B0 rośnie czułość:
S/N~B01.5
• ale zakresy spektralne także rosną z proporcjonalnie do B0
• przykład: 500 MHz 700 MHz
aby uzyskać tę samą rozdzielczość w :
widmach 2D - czas pomiaru wzrośnie o 40% (7/5)
widmach 3D – czas pomiaru wzrośnie dwukrotnie (7/5)2
Page 12
Jak obejść problem próbkowania?
• Widma projekcyjne ND 2D (próbkowanie radialne) zawodzi przy dużej liczbie sygnałów
Koźmiński & Zhukov, Kim & Szyperski
• Rekonstrukcja z projekcji (też próbkowanie radialne) Kupče & Freeman
• Kodowanie przestrzenne – pomiary jednoprzebiegowe (EPI) Frydman et al.
• Spektroskopia kowariancyjna (naprawdę korelacyjna) Brüschweiler
• Metody niefourierowskie (MEM, MDD)
Billeter, Orekhov, Hoch
• Wielowymiarowa transformata Fouriera (dowolne próbkowanie) nasza grupa
czyli metody spektroskopii projekcyjnej
oraz:
Page 13
Jak obejść problem próbkowania?
• Widma projekcyjne ND 2D (próbkowanie radialne) zawodzi przy dużej liczbie sygnałów
Koźmiński & Zhukov, Kim & Szyperski
• Rekonstrukcja z projekcji (też próbkowanie radialne) Kupče & Freeman
• Kodowanie przestrzenne – pomiary jednoprzebiegowe (EPI) Frydman et al.
• Spektroskopia kowariancyjna (naprawdę korelacyjna) Brüschweiler
• Metody niefourierowskie (MEM, MDD)
Billeter, Orekhov, Hoch
• Wielowymiarowa transformata Fouriera (dowolne próbkowanie) nasza grupa
czyli metody spektroskopii projekcyjnej
oraz:
Page 14
spektroskopia projekcyjna: Próbkowanie radialne t1 i t2 w widmie trójwymiarowym
• Pomiar punktów wzdłuż promienia r pod kątem j
t2=r cos(j), t1=r sin(j) • Po jednowymiarowej transformacie Fouriera
względem r uzyskuje się widmo z kombinacją liniową częstości :
wr= cos(j) w2 + sin(j) w1 Niezbędne wyznaczenie znaków częstości • Analiza bezpośrednia – obliczanie częstości „Reduced Dimesionality”
• Widmo próbkowane wzdłuż promienia jest rzutem widma trójwymiarowego na płaszczyznę nachyloną pod kątem j rekonstrukcja z projekcji
t1
t2
r
j
Page 15
Widma o zredukowanej wymiarowości – czyli rekonstrukcja z pojedynczej projekcji
• Dla każdego sygnału trzeba rozwiązać układ równań liniowych, tj. trzeba zbadać różne kombinacje znaków częstości:
w= cos(j) w2 sin(j) w1 + …
– dwa wymiary dwie niewiadome / dwa równania – trzy wymiary trzy niewiadome / cztery równania – …
• Zawodzi gdy liczba sygnałów jest zbyt duża np. dla wielowymiarowych eksperymentów NOE dla biomolekuł potrzebna jest metoda pozwalająca odtworzyć widmo o wysokiej wymiarowości
Page 16
Prosty przykład
4D → 2D HACANH
j1= x/y, j2= x/y, (G1,y)/(-G1,-y)
Koźmiński & Zhukov, J. Biomol. NMR, 26, 157 (2003)
Page 17
HACANH
+++
+–+
+– –
++–
[H i)( , H (i-1) C (i), C (i-1) N(i)] ( ) H (i) ( )t tN 21a aa a
Page 18
Rekonstrukcja z projekcji
• częstości w widmach 2D z próbkowaniem czasu wzdłuż r pod kątem j :
w2 cos(j) + w1 sin(j) Efekt: projekcja widma 3D na płaszczyznę
nachyloną pod kątem j. konieczne jest wyznaczenie znaków
wszystkich częstości oryginalny pomysł - obrazowanie: Lauterbur, Nature, 242, 190 (1973) (obecnie w MRI stosuje się kodowanie
takie jak w przypadku spektroskopowym)
t1
t2
r
j
Page 19
Rekonstrukcja z projekcji Kupče & Freeman, J. Biomol. NMR, 27, 383 (2003)
F3 (1H)
F1 (13C)
F2 (15N)
• jeśli częstości F3 nie są
zdegenerowane wystarczą
dwie płaszczyzny :
F1F3 i F2F3
Page 20
Rekonstrukcja z projekcji Kupče & Freeman, J. Biomol. NMR, 27, 383 (2003)
F3 (1H)
F1 (13C)
F2 (15N)
F1F3 t2 =0 j= 0o
• jeśli częstości F3 nie są
zdegenerowane wystarczą
dwie płaszczyzny :
F1F3 i F2F3
Page 21
Rekonstrukcja z projekcji Kupče & Freeman, J. Biomol. NMR, 27, 383 (2003)
F3 (1H)
F1 (13C)
F2 (15N)
F1F3 t2 =0 j= 0o
F2F3 t1 =0 j= 90o
• jeśli częstości F3 nie są
zdegenerowane wystarczą
dwie płaszczyzny :
F1F3 i F2F3
• w praktyce potrzeba wiele
• otrzymuje się prawdziwe
widmo trójwymiarowe
Page 22
kolejne projekcje pomagają usunąć
niejednoznaczności
F3 (1H)
F1 (13C)
F2 (15N)
j
Page 23
Kupče & Freeman, J. Biomol. NMR, 27, 383 (2003)
13C,15N-ubikwityna
F3 (1H) =8.77 ppm
F3 (1H) =7.28 ppm
F3 (1H) =8.31 ppm
dwie płaszczyzny
trzy płaszczyzny
rekonstrukcja konwencjonalne
Page 24
rekonstrukcja
• zaleta : „prawdziwe” widma wielowymiarowe
• wady:
– artefakty, które mogą tworzyć fałszywe sygnały
– zafałszowane kształty sygnałów
– zafałszowane stosunki intensywności
• wiele różnych podejść (deterministycznych i statystycznych) do rekonstrukcji widm
• jak dotąd żadna nie jest całkowicie wolna od wad i ogólna
Page 25
Transformacja Fouriera
- najlepsza estymata sygnałów okresowych
))(exp(),,(),,( 332211
1 2 3
321321 tttitttsSt t t
wwwwww =
),,(),,(),,(),,( 321
1
3212
2
3211
3
321 wwwwww StSttSttts FTFTFT
punkty przestrzeni czasu w rzędach i kolumnach
algorytm FFT
Podejście konwencjonalne sekwencyjna jednowymiarowa FT:
Page 26
Splot sygnału NMR z funkcją próbkowania i ograniczeniem czasu ewolucji – wybór pomiędzy aliasingiem i poszerzeniem
t
poszerzenie Ograniczenie czasu pomiaru
t1
identyczne kopie widma
aliasing próbkowanie
Page 27
Problem:
• teoremat Nyquista:
Δt<1/sw
• rozdzielczość:
Δn1/at
• dla danego czasu pomiaru konieczny kompromis między zakresami częstości a rozdzielczością
• czas pomiaru rośnie w postępie geometrycznym z liczbą wymiarów
Page 28
Aliasing
przez równoodległe punkty
można przeprowadzić więcej
niż jedną sinusoidę
but only one fits to randomly
distributed points
Page 29
Aliasing
przez równoodległe punkty
można przeprowadzić więcej
niż jedną sinusoidę
ale tylko jedna pasuje gdy
punkty rozłożone są losowo
Page 30
Aliasing
przez równoodległe punkty
można przeprowadzić więcej
niż jedną sinusoidę
ale tylko jedna pasuje gdy
punkty rozłożone są losowo
Wciąż obserwuje się aliasing powodowany zaokrąglaniem losowych współrzędnych
czasu i/lub wielkością kroku zegara spektrometru.
Jest to jednak nie znaczące –
n.p. 12.5 ns cykl zegara daje MHz okno spektralne wolne od aliasingu.
Page 31
FT i aliasing próbkowanie próbkowanie
konwencjonalne losowe
64 punkty
128 punktów
256 punktów
512 punktów
tmax=1s
1024 punkty
Page 32
FT i aliasing próbkowanie próbkowanie
konwencjonalne losowe
64 punkty
128 punktów
256 punktów
512 punktów
tmax=1s
1024 punkty
Page 33
próbkowanie losowe 2D - symulacja
• próbkowanie losowe brak aliasingu! • można osiągnąć większe czasu ewolucji (i
poprawić rozdzielczość) bez przedłużania eksperymentu!
Page 34
jak to osiągnąć:
• wielowymiarowa transformacja Fouriera w jednym kroku:
• przemienna algebra Clifforda: etc.
),(),( 2121 wwStts FT
),()exp(),()exp(),( 21
0 0
2222111121
max1
1
max2
2
ttwtittstiSt
t
t
t
= =
= wwww
)exp()exp(),( 22211121 tititts =
12
3
2
2
2
1 === iii
31221 iiiii ==
Page 35
400 MHz 3D HNCA ubikwityny 512 punktów Kazimierczuk, Zawadzka, Koźmiński, Zhukov J Biomol NMR, 36, 157 (2006)
konwencjonalne losowe w3(1H) = 8.10
ppm
w3(1H) = 8.74 ppm
Page 36
Rezultat:
brak aliasingu
szerokość linii zdeterminowana relaksacją poprzeczną
brak dodatkowych parametrów
artefakty – o amplitudzie proporcjonalnej do pierwiastka kwadratowego z liczby punktów
Artefakty są zdeterminowane częstością piku i rozkładem próbek można je obliczyć i usunąć
Page 37
schematy próbkowania
• widmo 3D HNCACB dla różnych rozkładów
Page 38
• stosunek amplitudy sygnałów do artefaktów (S/A) nie zależy od gęstości próbkowania i wymiarowości eksperymentu
• S/A jest proporcjonalny do pierwiastka kwadratowego z liczby punktów
• można mierzyć widma o dowolnie wysokiej wymiarowości z rozdzielczością ograniczoną jedynie procesami relaksacyjnymi
Page 39
Poziom artefaktów nie zależy od gęstości próbkowania K. Kazimierczuk, A. Zawadzka, W. Koźmiński, J. Magn. Reson. 197, 219-228 (2009)
symulacje 1D - 250 punktów
różny czas pomiaru – stały poziom artefaktów
tmax=4s, Q=3.12 tmax=8s, Q=1.56 tmax=16s, Q=0.78
tmax=32s, Q=0.39 tmax=1 month, Q=4.8 x 10-6 tmax=1 year, Q=3.97 x 10-7
Page 40
Poziom artefaktów nie zależy od gęstości próbkowania K. Kazimierczuk, A. Zawadzka, W. Koźmiński, J. Magn. Reson. 197, 219-228 (2009)
symulacje 1D - 250 punktów
różny czas pomiaru – stały poziom artefaktów
tmax=4s, Q=3.12 tmax=8s, Q=1.56 tmax=16s, Q=0.78
tmax=32s, Q=0.39 tmax=1 month, Q=4.8 x 10-6 tmax=1 year, Q=3.97 x 10-7
Page 41
Poziom artefaktów nie zależy od gęstości próbkowania K. Kazimierczuk, A. Zawadzka, W. Koźmiński, J. Magn. Reson. 197, 219-228 (2009)
symulacje 1D - 250 punktów
różny czas pomiaru – stały poziom artefaktów
tmax=4s, Q=3.12 tmax=8s, Q=1.56 tmax=16s, Q=0.78
tmax=32s, Q=0.39 tmax=1 month, Q=4.8 x 10-6 tmax=1 year, Q=3.97 x 10-7
Page 42
Poziom artefaktów nie zależy od gęstości próbkowania K. Kazimierczuk, A. Zawadzka, W. Koźmiński, J. Magn. Reson. 197, 219-228 (2009)
symulacje 1D - 250 punktów
różny czas pomiaru – stały poziom artefaktów
tmax=4s, Q=3.12 tmax=8s, Q=1.56 tmax=16s, Q=0.78
tmax=32s, Q=0.39 tmax=1 month, Q=4.8 x 10-6 tmax=1 year, Q=3.97 x 10-7
Page 43
Poziom artefaktów nie zależy od gęstości próbkowania K. Kazimierczuk, A. Zawadzka, W. Koźmiński, J. Magn. Reson. 197, 219-228 (2009)
symulacje 1D - 250 punktów
różny czas pomiaru – stały poziom artefaktów
tmax=4s, Q=3.12 tmax=8s, Q=1.56 tmax=16s, Q=0.78
tmax=32s, Q=0.39 tmax=1 miesiąc, Q=4.8 x 10-6 tmax=1 year, Q=3.97 x 10-7
Page 44
Poziom artefaktów nie zależy od gęstości próbkowania K. Kazimierczuk, A. Zawadzka, W. Koźmiński, J. Magn. Reson. 197, 219-228 (2009)
symulacje 1D - 250 punktów
różny czas pomiaru – stały poziom artefaktów
tmax=4s, Q=3.12 tmax=8s, Q=1.56 tmax=16s, Q=0.78
tmax=32s, Q=0.39 tmax=1 miesiąc, Q=4.8 x 10-6 tmax=1 rok, Q=3.97 x 10-7
Page 45
Q=0.013
Q=0.54
Q=59.52 Q=33.3
Q=0.97
poziom artefaktów nie zależy od wymiarowości
Page 46
Iteracyjne czyszczenie widm J. Stanek, W. Koźmiński, J. Biomol. NMR. submitted
700 MHz 3D 13C-edited
NOESY-HSQC .
1.5 mM ubiquitin on 700
MHz
w3 (1H) = –0.185 ppm
Poisson disc sampling .
cutoff level of 0.35%
(relative to diagonal peak
amplitude)
2000 data points
t1,max = 30 ms,
t2,max = 12.5 ms
θ = 0.048
Widmo
konwencjon
alne
MEM
MDD
MFT +
iterative
cleaning
Page 47
transformacja oszczędnościowa SMFT
• wysoka wymiarowość i rozdzielczość
– problem wielkości plików
• 3D – dziesiątki GB - możliwe
• 4D – do TB, łatwe w przyszłości
• 5D, 6D – PB (peta bajty) lub więcej
• rozwiązanie: widma NMR są raczej puste, obliczajmy tylko te miejsca w których są sygnały!
Page 48
transformacja oszczędnościowa SMFT
• wysoka wymiarowość i rozdzielczość
– problem wielkości plików
• 3D – dziesiątki GB - możliwe
• 4D – do TB, łatwe w przyszłości
• 5D, 6D – PB (peta bajty) lub więcej
• rozwiązanie: widma NMR są raczej puste, obliczajmy tylko te miejsca w których są sygnały!
Page 49
transformacja oszczędnościowa SMFT
• wysoka wymiarowość i rozdzielczość
– problem wielkości plików
• 3D – dziesiątki GB - możliwe
• 4D – do TB - łatwe w przyszłości
• 5D, 6D – PB (peta bajty) lub więcej
• rozwiązanie: widma NMR są raczej puste, obliczajmy tylko te miejsca w których są sygnały!
Page 50
transformacja oszczędnościowa SMFT
• wysoka wymiarowość i rozdzielczość
– problem wielkości plików
• 3D – dziesiątki GB - możliwe
• 4D – do TB - łatwe w przyszłości
• 5D, 6D – PB (peta bajty) lub więcej
• rozwiązanie: widma NMR są raczej puste, obliczajmy tylko te miejsca w których są sygnały!
Page 51
transformacja oszczędnościowa SMFT
• wysoka wymiarowość i rozdzielczość
– problem wielkości plików
• 3D – dziesiątki GB - możliwe
• 4D – do TB - łatwe w przyszłości
• 5D, 6D – PB (peta bajty) lub więcej
• rozwiązanie: widma NMR są raczej puste, obliczajmy tylko te miejsca w których są sygnały!
Page 52
Sparse MFT
C H
R
C
O
N
H
H
C H
C
R
N
O
C H C H
R R
C C
O O
N
H
H H
C H
C
R
N N
O
A B C D E
w 1
w2
A
B
C
D
E
w3
Page 53
Sparse MFT
C H
R
C
O
N
H
H
C H
C
R
N
O
C H C H
R R
C C
O O
N
H
H H
C H
C
R
N N
O
A B C D E
w 1
w2
A
B
C
D
E
w3
Page 54
Sparse MFT
C H
R
C
O
N
H
H
C H
C
R
N
O
C H C H
R R
C C
O O
N
H
H H
C H
C
R
N N
O
A B C D E
w 1
w2
A
B
C
D
E
w3
Page 55
Sparse MFT
C H
R
C
O
N
H
H
C H
C
R
N
O
C H C H
R R
C C
O O
N
H
H H
C H
C
R
N N
O
A B C D E
w 1
w2
A
B
C
D
E
w3
Page 56
Sparse MFT
C H
R
C
O
N
H
H
C H
C
R
N
O
C H C H
R R
C C
O O
N
H
H H
C H
C
R
N N
O
A B C D E
w 1
w2
A
B
C
D
E
w3
Page 57
Sparse MFT
C H
R
C
O
N
H
H
C H
C
R
N
O
C H C H
R R
C C
O O
N
H
H H
C H
C
R
N N
O
A B C D E
w 1
w2
A
B
C
D
E
w3
Page 58
G21C-E22N-H
E22C-A23N-H
A23-L24N-H
L24C-A25N-H
A25C-V26N-H V26C-Q27N-H
Q27-E28N-H
E28C-R29N-H
R29C-L30N-H
L30-K31N-H
4D HNCACO CsPIN protein (92 aa)
• przekroje CA-CO dla par N-HN
• 1800 t1/t2/t3 punktów
• 0.65% eksperymentu konwencjonalnego
(ok. 4 miesięcy) • 20 godzin pomiaru
N
Ca
Cb
H
O
C
Ca
Cb
N
H
C
O
Page 59
G21C-E22N-H
E22C-A23N-H
A23-L24N-H
L24C-A25N-H
A25C-V26N-H V26C-Q27N-H
Q27-E28N-H
E28C-R29N-H
R29C-L30N-H
L30-K31N-H
4D HNCACO CsPIN protein (92 aa)
• przekroje CA-CO dla par N-HN
• 1800 t1/t2/t3 punktów
• 0.65% eksperymentu konwencjonalnego
(ok. 4 miesięcy) • 20 godzin pomiaru
N
Ca
Cb
H
O
C
Ca
Cb
N
H
C
O
Page 60
G21C-E22N-H
E22C-A23N-H
A23-L24N-H
L24C-A25N-H
A25C-V26N-H V26C-Q27N-H
Q27-E28N-H
E28C-R29N-H
R29C-L30N-H
L30-K31N-H
4D HNCACO CsPIN protein (92 aa)
• przekroje CA-CO dla par N-HN
• 1800 t1/t2/t3 punktów
• 0.65% eksperymentu konwencjonalnego
(ok. 4 miesięcy) • 20 godzin pomiaru
N
Ca
Cb
H
O
C
Ca
Cb
N
H
C
O
Page 61
G21C-E22N-H
E22C-A23N-H
A23-L24N-H
L24C-A25N-H
A25C-V26N-H V26C-Q27N-H
Q27-E28N-H
E28C-R29N-H
R29C-L30N-H
L30-K31N-H
4D HNCACO CsPIN protein (92 aa)
• przekroje CA-CO dla par N-HN
• 1800 t1/t2/t3 punktów
• 0.65% eksperymentu konwencjonalnego
(ok. 4 miesięcy) • 20 godzin pomiaru
N
Ca
Cb
H
O
C
Ca
Cb
N
H
C
O
Page 62
G21C-E22N-H
E22C-A23N-H
A23-L24N-H
L24C-A25N-H
A25C-V26N-H V26C-Q27N-H
Q27-E28N-H
E28C-R29N-H
R29C-L30N-H
L30-K31N-H
4D HNCACO CsPIN protein (92 aa)
• przekroje CA-CO dla par N-HN
• 1800 t1/t2/t3 punktów
• 0.65% eksperymentu konwencjonalnego
(ok. 4 miesięcy) • 20 godzin pomiaru
N
Ca
Cb
H
O
C
Ca
Cb
N
H
C
O
Page 63
G21C-E22N-H
E22C-A23N-H
A23-L24N-H
L24C-A25N-H
A25C-V26N-H V26C-Q27N-H
Q27-E28N-H
E28C-R29N-H
R29C-L30N-H
L30-K31N-H
4D HNCACO CsPIN protein (92 aa)
• przekroje CA-CO dla par N-HN
• 1800 t1/t2/t3 punktów
• 0.65% eksperymentu konwencjonalnego
(ok. 4 miesięcy) • 20 godzin pomiaru
N
Ca
Cb
H
O
C
Ca
Cb
N
H
C
O
Page 64
G21C-E22N-H
E22C-A23N-H
A23-L24N-H
L24C-A25N-H
A25C-V26N-H V26C-Q27N-H
Q27-E28N-H
E28C-R29N-H
R29C-L30N-H
L30-K31N-H
4D HNCACO CsPIN protein (92 aa)
• przekroje CA-CO dla par N-HN
• 1800 t1/t2/t3 punktów
• 0.65% eksperymentu konwencjonalnego
(ok. 4 miesięcy) • 20 godzin pomiaru
N
Ca
Cb
H
O
C
Ca
Cb
N
H
C
O
Page 65
G21C-E22N-H
E22C-A23N-H
A23-L24N-H
L24C-A25N-H
A25C-V26N-H V26C-Q27N-H
Q27-E28N-H
E28C-R29N-H
R29C-L30N-H
L30-K31N-H
4D HNCACO CsPIN protein (92 aa)
• przekroje CA-CO dla par N-HN
• 1800 t1/t2/t3 punktów
• 0.65% eksperymentu konwencjonalnego
(ok. 4 miesięcy) • 20 godzin pomiaru
N
Ca
Cb
H
O
C
Ca
Cb
N
H
C
O
Page 66
G21C-E22N-H
E22C-A23N-H
A23-L24N-H
L24C-A25N-H
A25C-V26N-H V26C-Q27N-H
Q27-E28N-H
E28C-R29N-H
R29C-L30N-H
L30-K31N-H
4D HNCACO CsPIN protein (92 aa)
• przekroje CA-CO dla par N-HN
• 1800 t1/t2/t3 punktów
• 0.65% eksperymentu konwencjonalnego
(ok. 4 miesięcy) • 20 godzin pomiaru
N
Ca
Cb
H
O
C
Ca
Cb
N
H
C
O
Page 67
G21C-E22N-H
E22C-A23N-H
A23-L24N-H
L24C-A25N-H
A25C-V26N-H V26C-Q27N-H
Q27-E28N-H
E28C-R29N-H
R29C-L30N-H
L30-K31N-H
4D HNCACO CsPIN protein (92 aa)
• przekroje CA-CO dla par N-HN
• 1800 t1/t2/t3 punktów
• 0.65% eksperymentu konwencjonalnego
(ok. 4 miesięcy) • 20 godzin pomiaru
N
Ca
Cb
H
O
C
Ca
Cb
N
H
C
O
Page 68
D180-V181
G182-V183
V183-D184
V181-G182
D184-N185
4D HNCACO 0.5 mM Maltose Binding Protein
(MBP) (370 residues)
700 MHz RT HCN probe
• przekroje CA-CO dla
par N-HN • 6700 t1/t2/t3 punktów
• 5.5 % eksperymentu konwencjonalnego
(ok. 2 miesięcy) • 83 godzin pomiaru
N
Ca
Cb
H
O
C
Ca
Cb
N
H
C
O
Page 69
D180-V181
G182-V183
V183-D184
V181-G182
D184-N185
4D HNCACO 0.5 mM Maltose Binding Protein
(MBP) (370 residues)
700 MHz RT HCN probe
• przekroje CA-CO dla par N-HN
• 6700 t1/t2/t3 punktów
• 5.5 % eksperymentu konwencjonalnego
(ok. 2 miesięcy) • 83 godzin pomiaru
N
Ca
Cb
H
O
C
Ca
Cb
N
H
C
O
Page 70
4D HN(CA)NH CsPIN protein (92 aa)
• przekroje N-HN • każda para N-HN
skorelowana jest z jednostką poprzednią i następną
• 1800 t1/t2/t3 punktów
• 0.49% eksperymentu konwencjonalnego
(ok. 6 miesięcy) • 22 godzin pomiaru
E22N-H A23N-H L24N-H A25N-H V26N-H
Q27N-H E28N-H R29N-H L30N-H K31N-H
N
Ca
Cb
H
O
C
Ca
Cb
N
H
C
O
N
H
Page 71
4D HN(CA)NH CsPIN protein (92 aa)
E22N-H A23N-H L24N-H A25N-H V26N-H
Q27N-H E28N-H R29N-H L30N-H K31N-H
• przekroje N-HN • każda para N-HN
skorelowana jest z jednostką poprzednią i następną
• 1800 t1/t2/t3 punktów
• 0.49% eksperymentu konwencjonalnego
(ok. 6 miesięcy) • 22 godzin pomiaru
N
Ca
Cb
H
O
C
Ca
Cb
N
H
C
O
N
H
Page 72
5D
• HCCCONH-TOCSY ubikwityna
• przekroje H-C dla każdej trójki: Ni+1-HNi+1-COi)
• 2000 t1/t2/t3/t4 punktów
• 0.005% czasu konwencjonalnego
(ok. 140 lat) • 61 godzin pomiaru
N
Ca
Cb
H
O
C
Ca
Cb
N
H
C
O
H
C H
H
Page 73
L24 K41
G54 V77
6D
• HCCCACONH-TOCSY CsPIN (92 residues) • przekroje H-C (dla: Ni+1-HNi+1-COi-CAi) • 1650 t1/t2/t3/t4/t5 punktów
• 0.0066 % eksperymentu konwencjonalnego (ok. 197 lat) • 114 godzin pomiaru
N
Ca
Cb
H
O
C
Ca
Cb
N
H
C
O
H
C H
H
Page 74
pomiar sprzężeń
• HNCO {Ca}
• 6 sprzężeń dla jednego sygnału w układzie E.COSY
• 4900 punktów t1/t2
• 2.6% gęstości konwencjonalej
• 31 godzin pomiaru
• zamiast 50 dni
conventional random
Kazimierczuk K, Zawadzka A, Koźmiński W, Zhukov I
J. Am. Chem. Soc. 130 (2008) 5404-5405