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Vorlesung zum Praktikum Vorlesung zum Praktikum Klinische ChemieKlinische Chemie(3. Kurstag)(3. Kurstag)
Quantitative Quantitative AnalysenAnalysen
HHäämoglobinmoglobin
StStöörfaktorenrfaktoren
BilirubinBilirubin
SpektrofotometrieSpektrofotometrie
G. Schumann, Institut für Klinische Chemie, MHH
www.mh-hannover.de/schumann.html
LernzieleDefinition der labormedizinischen Messgröße (System – Analyt – Messgrößenart)Beurteilung von Analysenergebnissen: longitudinal, transversalUnterschiedliche Konzentrationen (Größenordnungen) von BlutbestandteilenBestimmungsverfahren für Gesamt-Hämoglobin und ReferenzintervalleFreies Hämoglobin: klinische Bedeutung (und Bestimmungsverfahren),alternative Messgrößen zur Beurteilung einer HämolyseEinflussgrößen: veränderliche, unveränderlicheStörfaktorenSensitivität und Spezifität (Unterschiede: analytische und diagnostische)Freies Hämoglobin: Störfaktor oder Einflussgröße?Methämoglobin, CarboxyhämoglobinPorphyrien (U-Porphobilinogennachweis bei akuter intermittierender Porphyrie)BilirubineIkterus-DifferentialdiagnoseAngeborene Störungen des BilirubinstoffwechselsNeugeborenen-IkterusSpektrofotometrieVerschiedene Kalibrierverfahren (für quantitative fotometrische Analysen)
285 300 [mg/100 ml]Cholesterin
Die Frage an den Arzt für Laboratoriumsmedizin:
Ist die Abnahme der Cholesterinkonzentration um 5 %
(mit großer Wahrscheinlichkeit) als therapeutischer Effekt zu betrachten?
5 %
• Patient bekommt Cholesterin-reduzierte Diät und Statine.• Die initiale Cholesterinkonzentration ist 300 mg/100 ml
285 300 [mg/100 ml]Cholesterin
2σ2σ
Zwei Messergebnisse sind hier signifikant (95 %) unterschiedlich, wenn die
5 % = 4 σ
Relative Unpräzision (Tag / Tag): CV = 1,25 %
Quantitative Analysen von Messgrößen[ System --- Analyt --- Messgrößenart ]
B - (Voll-) Blut oder Hämolysatggf. arteriell (AB) oder venös (VB)deklarieren
C - KapillarblutS - Serum
Überstand aus geronnenem Blut;Zellen und Fibrin sind abgetrennt
P - Plasmagerinnungshemmender Zusatzbei Blutentnahme
Vorsicht bei der Verwendung von Abkürzungen (Akronymen) !(http://de.wikipedia.org/wiki/PSA)
- Pacific Southwest Airlines, US-amerikanische Fluggesellschaft - Persistent Staging Area, ein Teil des Business Information Warehouse - Personal Sales Assistant - Personal-Service-Agentur - Personen-Such-Anlage Funkrufanlagen zum übermitteln von Textnachrichten - Persönliche SchutzAusrüstung - Persönlichkeits-Struktur-Analyse, ein Persönlichkeitsmodell aus der Arbeitspsychologie - PhthalSäureAnhydrid, chemische Verbindung - PostSparkassenAmt - Pressure Sensitive Adhesive (z. B. Beschichtung von Klebebändern) - Probabilistische SicherheitsAnalyse (engl. "probabilistic safety analysis", eine Methode zur
Sicherheitsanalyse komplexer technischer Systeme, z. B. von Kernkraftwerken - Problem Statement Analyzer, klassischer Ansatz des Requirements Engineering - Production Sharing Agreements - Profil-Simulations-Analyse - Prostataspezifisches Antigen, ein Glykoprotein, das v.a. von der Prostata sezerniert wird - PSA International, eine Management-Trainingsagentur- PSA Peugeot Citroën, Société Anonyme des Automobiles Peugeot (kurz Peugeot S.A.), ein
französischer Automobilkonzern - PSychoAnalytische Spezialabteilung in Larry Brent Romanen
Quantitative Analysen von Messgrößen[ System --- Analyt --- Messgrößenart ]
Stoffmengenkonzentration mol/l (mmol/l, µmol/l, nmol/l)Massenkonzentration g/l oder g/dl (g/100 ml)
(mg/l, µg/l, ng/l)
Internationale Einheiten Uarbiträre Einheiten (Units) beiMakromolekülen (Proteinen)Katalytische Enzymkonzentration- Substratumsatz pro Minute U/l : 60 =- Substratumsatz pro Sekunde kat/l (µkat/l)
nicht mg% !!!
„Die Glucose ist 25“??
Quantitative Analysen[ System --- Analyt --- Meßgrößenart ]
„Die Glucose ist 25“
Die Glucosekonzentration im Kapillarblut ist25 mmol/l
(Referenzintervall: 3,9 - 5,5 mmol/l)
Hyperglykämie!
Die Glucosekonzentration im Kapillarblut ist25 mg/100 ml
(Die Hb-Konzentration muss immer in Relation zur Erythrozytenzahl bzw. zum Hämatokrit beurteilt werden!)
Freies Hämoglobin im Plasma im Plasma (1)(1)
Der tägliche physiologische Abbau von ErythrozytenDer tägliche physiologische Abbau von Erythrozytenentspricht einem Hämoglobinumsatz von 6entspricht einem Hämoglobinumsatz von 6--7 g,7 g,davon 85% davon 85% extravaskulärextravaskulär..
Referenzintervall: < 100 mg/l (Angabe in µmol/l unüblich)
•• Die Blutprobe wird Die Blutprobe wird zentrifugiertzentrifugiert..
•• Das Serum ist durch freies Das Serum ist durch freies HbHb sichtbar rotsichtbar rot gefärbt.gefärbt.((deutlich mehr als 200 mg/l freies deutlich mehr als 200 mg/l freies HbHb!)!)
Handelt es sich hier um einen Handelt es sich hier um einen Störfaktor oder umoder um
eine eine Einflussgröße?? Die Frage kann man ohne zusätzliche Informationen nicht eindeutig beantworten!
Hämolyse: Einflussgröße und Störfaktor ?
Einflussgröße in vivo Veränderung (Beeinflussung) des zu bestimmenden Analyten
Störfaktor in vitro Veränderung (Beeinflussung) des zubestimmenden Analyten bzw. der Analytik
•• Die Blutprobe wird Die Blutprobe wird zentrifugiertzentrifugiert..
•• Das Serum ist durch freies Das Serum ist durch freies HbHb sichtbar rotsichtbar rot gefärbt.gefärbt.((deutlich mehr als 200 mg/l freies deutlich mehr als 200 mg/l freies HbHb!)!)
Handelt es sich hier um einen Handelt es sich hier um einen Störfaktor oder umoder um
eine eine Einflussgröße??
Datum 02.01.2008 03.01.2008 05.01.2008 06.01.2008 07.01.2008
Beurteilung von CK und Isoenzym CK-MBbei Verdacht auf einen Myokardinfarkt
Freies Hämoglobin im Plasma im Plasma (3)(3)
Von sichtbar hämolytischenProben, die im Labor bear-beitet werden, ist in wenigerals 5% der Fälle die Ursacheeine in vivo-Hämolyse.
95% Fehler: Falsche Blutentnahme, langer Transport, Erschütterungen beim Transport, Fehler bei der Gewinnung des Serums bzw. Plasmas im Labor( Blut gefroren, etc.)
Einflussgröße für die Hb-Konz. bei in vivo-(intravasaler)-HämolyseBeispiel (Sport):Ein Marathon (Marschhämoglobinurie)
Hämolyse als Einflussgröße:S-Creatinkinase (CK), S-Eisen, S-Gesamtprotein, S-Kalium, S-LDHS-Eiweiß-Elektrophorese,
Hämolyse in der präanalytischen Phase = Störfaktor
Hämolyse als Störfaktor:Bei diversen fotometrischen Verfahren
Hämolyse: Einflussgröße und Störfaktor
LDH-Bestimmung in einer hämolytischen ProbenS-LDH = 350 U/l (Referenzintervall: unter 247 U/l)
Störfaktor oder Einflussgröße ?
Sehr häufig wird eine LDH-Bestimmung bei der Indikation "Verdacht auf in vivo-Hämolyse" (fälschlich) angefordert
LDH1 Herzmuskel, Erythrozyten 113 h (Halbwertszeit)LDH5 Skelett, Leber 10 h (Halbwertszeit)
Hämolytischer Schub längst vorüber, LDH noch ⇑.LDH aus anderen Kompartimenten als Erythrozyten stören die Beurteilung bei der Fragestellung: Hämolyse JA oder NEIN?
Wenn in vivoWenn in vivo--HämolyseHämolyse ausgeschlossen istausgeschlossen ist(Hämolyse wurde beim Probentransport erzeugt)
Andere Störfaktoren als Hämoglobin
Lipide (Trübung bei fotometrischen Analysen)Bilirubin (Störung von Indikatorreaktionen)Paraproteine (Trübung bei fotometrischen Analysen)(monoclonale Komponenten, M-Gradient)Kreuzreagierende Komponenten bei immun-chemischen Verfahren (z.B. Arzneimittel-Metabolite)Humane anti-Maus-Antikörper (Störung von IA)Antikoagulanzien (Serum-Elektrophorese, S-K, S-Fe)Infusionslösungen (Verdünntes Serum)Bakterien, HefenPharmaka (z.B. Benzoylpenicilline bei Proteinbestimmung)
Analytische Spezifität
Die Eigenschaft eines analytischen Verfahrens, nur die Messgröße (die Komponente, den Analyten) zu messen, der zu erfassen beabsichtigt ist (aber nichts anderes!).
Analytische Sensitivität (Empfindlichkeit)
(a) Die Eigenschaft eines analytischen Verfahrens, die kleinste Konzentrationsdifferenz innerhalb des Messbereiches sicher unterscheiden zu können.
(b) Bei Vorhandensein der Messgröße ein Messsignal zu erhalten, dass sicher von Null unterschieden werden kann.
PhotometrischeAnalyse des
freien Hämoglobins(Oxyhämoglobin)
ohne Derivatisierung
Messung beidrei Wellenlängen
λ = 577 nmλ = 562 nmλ = 602 nm
(Alternative zurCyan-Meth-Hb-Methode)
Soret-Banden
Freies Hämoglobin im Plasmaim Plasma
Alternative Messgrößen zum freien Hb:
Haptoglobin: ⇓ bei Hämolyse⇑ bei Akute-Phase-Reaktion
Lactatdehydrogenase (LDH)(hohe katalytische Konzentration in den Erythrozyten)
(sehr unterschiedliche Halbwertszeiten der Isoenzyme!)
Methämoglobin im Blut
Ursache von erhöhter Hämiglobin-Konzentration im Blut:Verstärkte Oxidation von Hb durch Gifte Nitrobenzol
AnilinPhenylhydrazinNitritKaliumchlorat
(HbF ist besonders oxidations-empfindlich;Hämiglobinbildung bei Kleinkin-dern und Säuglingen deshalbeher möglich und kritisch)
Gestörte Aktivität des Enzyms Hämiglobin-Reductase
Analyse bei λ = 630 nm(zur Bestimmung des relativen Anteils)
Referenzintervall(Hämiglobin im Blut): 0,2 - 1,0 %
Bilirubine:Unkonjugiertes (locker an Albumin gebunden) α-BilirubinMonokonjugiertes (mit Glukuronsäure) ß-BilirubinDikonjugiertes (mit Glukuronsäure) γ-BilirubinDelta- (kovalent an Albumin gebunden) δ-Bilirubin
(Indirekt bedeutet: Bilirubin, das locker an Albumin gebunden ist, muss mit verdrängenden Stoffen wie Coffein oder Benzoat freigesetzt werden, bevor es im Test reagiert.)
BilirubinBilirubinPräanalytik (= Phase zwischen Blutentnahme und Analyse)Präanalytik (= Phase zwischen Blutentnahme und Analyse)
Referenzintervall (Bilirubin im Serum): bis 17 µmol/l
Klinische BedeutungIkterus-DiagnoseObjektivierung des Ikterus bevor eindeutige klinische Anzeichen vorliegen.
Sklerenikterus bei S-Bilirubinkonz. von 35 - 40 µmol/l
Nicht wasserlösliches Bilirubin
unkonjugiertes Bilirubin
wasserlösliches Bilirubin
konjugiertes Bilirubin
Analytik für GesamtAnalytik für Gesamt--BilirubinBilirubin im im SerumSerumDiazoDiazo--ReaktionReaktion: : Kupplung mit diazotierter SulfanilsäureKupplung mit diazotierter Sulfanilsäure
Azopigment
Klinische Bedeutung
Ikterus-Differentialdiagnose
Hämolytischer Ikterus unkonj. Bili ↑
Hepat. u. posthepatischer Ikterus konj. Bili ↑↑
Hämolytischer Ikterus,
wenn die Clearance-Kapazität der Leber überfordert ist, bei z.B.
Spektrofotometrische AnalysenSpektrofotometrische Analysen(2) Berechnung über eine Kalibrierfunktion
Extinktion
Konzentration
Nur bei linearer Beziehung zwischenExtinktion und Konzentration kann einFaktor (= Steigung der Kalibrierfunkt.)verwendet werden
Bei nicht-linearer Beziehung zwischen Extinktion und Konzentration(z.B. bei immunchemischen Verfahren) muss die Kalibrierfunktionmit mehreren (> 5) Kalibratoren ermittelt werden.