-
VETERINARSKA STANICA 40 (5), 2009.
ORIGINALNI ZNANSTVENI RAD
257
Dokaz i izdvajanje goveeg koronavirusa uzronika neonatalnog
proljeva teladiIvana Lojki, T. Bedekovi, . a i M. Lojki
Dr. sc. Ivana LOJKI, znanstvena suradnica, Tomislav BEDEKOVI,
dr. vet. med., asistent, dr. sc. eljko A, dr. vet. med., znanstveni
suradnik, dr. sc. Mirko LOJKI, dr. vet. med., redoviti profesor,
Hrvatski veterinarski institut, Zagreb
Sindrom neonatalnog proljeva vrlo je est u novoroene teladi i
uzrokuje znatne gospodarske tete. Karakter-izira ga proljev te
posljedino de-hidracija, odbijanje hrane, slabost i uginue (Naylor,
2002.). Proljev je vodenasto ut, siv ili zelenkast te moe sadravati
i tragove krvi. Mnogo je uzronika neonatalnog proljeva, a oni
bolest mogu uzrokovati pojedinano ili je infekcija mjeovita. Od
virusa su najee rotavirusi i koronavirusi, za-tim parvovirusi,
torovirusi, kalicivi-rusi, norovirusi i pestivirus proljeva
goveda/bolesti sluznice goveda. Meu bakterijskim uzronicima
najprisut-niji su enterotoksini E. coli. Od ostalih uzronika mogu
se nai Cryptosporidia i Coccidia (Snodgrass i sur., 1986.).
Rotavirusi su najei uzronici akutnog virusnog gastroenteritisa u
mladih ivotinja i djece irom svijeta
(Bern i Glass, 1994.). Pripadaju rodu Ro-tavirus, porodici
Reoviridae, a seroloki se klasificiraju u 7 skupina (AG) (Es-tes,
2001.). Ipak, najei uzronik pro-ljeva u ljudi i ivotinja je
rotavirus sku-pine A.
Govei koronavirus (BCV) je enter-opatogeni virus to se umnaa u
zre-lim enterocitima duodenuma i kolona, uzrokujui u novoroene
teladi teki proljev (Mebus i sur., 1973., Tsunemitsu i Saif, 1995.)
i akutnu crijevnu infekciju goveda to se pojavljuje uglavnom
ti-jekom zimskih mjeseci tzv. zimsku di-zenteriju (Dea i sur.,
1995., Saif i sur., 1991.), a esto izaziva i infekcije
respira-tornog trakta teladi (Tsunemitsu i sur., 1991.). BCV je
jednolanani RNK virus iz roda Coronavirus, porodice Corona-viridae,
red Nidovirales. Tri su skupine koronavirusa odreene na temelju
pripadajuih epitopa na glikoproteinu
Uvod
-
IVANA LojKI, T. BEdEKoVI, . A I M. LojKI
VETERINARSKA STANICA 40 (5), 257-262, 2009.258
ovojnice i nukleotidnog slijeda, a BCV pripada skupini 2
(Cavanagh, 1995). I rotavirusi i koronavirusi najee se izdvajaju iz
izmeta bolesne teladi izmeu jednog dana i tri tjedna starosti.
Ovi se uzronici mogu dokazati raznim tehnikama kao to su
izdva-janje virusa na staninoj kulturi, elek-tronska mikroskopija,
ELISA (imuno-enzimni test), kromatografija i RT-PCR (lanana
reakcija polimerazom uz pre-thodnu reverznu transkripciju). Prve
dvije spomenute tehnike su dugotrajne i neekonomine, dok ELISA test
za do-kazivanje antigena za govei koronavi-rus i rotavirus moe biti
neekonomian kada se pretrauje mali broj uzoraka. Danas je RT-PCR
tehnika od izbora zbog brzine i specifinosti te je po-godna i na
malom broju uzoraka. Za brzo dokazivanje uzronika na terenu u
uporabi su i nitrocelulozne test trake razliitih proizvoaa to
djeluju na principu kromatografije.
Svrha ovog rada je dokazivanje najeih virusnih uzronika
neonatal-nog proljeva teladi te njihovo izdvaja-nje. Ovo je ujedno
i prvi dokaz i izdva-janje BCV kao uzronika neonatalnog proljeva
teladi Hrvatskoj.
Materijal i metodeUzorci izmeta prikupljeni su od
ukupno 16 teladi. Telad je bila u dobi od 5 do 12 dana,
podrijetlom s dvije farme s oko 50 grla. Bolest je trajala oko 10
dana. Na farmi A je peti dan nakon pojave simptoma etiri teleta
uginulo.
Uzorci izmeta razrijeeni su s 9 volumena MEM-a (Minimum
Essential
Media) (pH 7,4) i centrifugirani 10 min. pri 1000 x g. Virusna
RNA izdvojena je iz 140 L nadtaloga suspenzije izmeta uporabom
QiAMP Viral RNA Mini kit (Qiagen, Njemaka). Virusna RNA prevedena
je reverznom transkrip-cijom (RT) u komplementarnu DNA sa
Supersccript III (Invitrogen, SAD). Lanana reakcija polimerazom
(PCR) napravljena je s JumpStart RedTaq polimerazom (Sigma,
Njemaka) uz koritenje specifinih poetnica za dio gena za
nukleokapsidu (N) veliine 406 bp (parova baza) BCV (Tsunemitsu i
sur. 1999.) i dio gena za virusni pro-tein 6 (VP6) veliine 294 bp
goveeg rotavirusa A (BRV-A). Poetnice za do-kazivanje BRV
dizajnirane su prema nukleotidnoj sekvenci br. X53667 u banci gena
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Produkti reakcije PCR provjere-ni su
elektroforezom u gelu agaroze. Komercijalno ivo cjepivo to sadri
oba virusa upotrijebljeno je kao pozi-tivna kontrola za izdvajanje
virusne RNK i RT-PCR, a kao negativna kon-trola koritena je
suspenzija crijevnog sadraja juneta podrijetlom s farme bez
prisutnih klinikih znakova bolesti. Suspenzije svih pozitivnih
uzoraka in-okulirane su na linijsku staninu kult-uru BEK (Bovine
Embryonic Kidney). Prije inokulacije suspenzija je tretirana kroz
milipore veliine 0,45 m te inku-birana na 37oC kroz 120 minuta.
Nakon toga suspenzija je odlita iz boica s kul-turom, a stanice dva
puta isprane te je dodan MEM i tripsin (5 g/ml). Stan-ice su
svakodnevno pregledavane na prisutnost citopatskog uinka (CPE).
-
Dokaz i izdvajanje goveeg koronavirusa uzronika neonatalnog
proljeva teladi
VETERINARSKA STANICA 40 (5), 257-262, 2009. 259
RezultatiSakupljeno je 16 uzoraka izmeta
teladi u dobi do 14 dana podrijetlom s dvije farme u sredinjoj
Hrvatskoj. Te-lad je bila u dobi do 14 dana, a proljev je trajao
oko pet dana. Elektroforezom proizvoda reakcije PCR od ukupno 6
pretraenih uzoraka podrijetlom s farme A, otkrivena su tri uzorka
pozi-tivna na BCV i dva na BRV. Na farmi B, od ukupno 10 pretraenih
uzoraka 8 ih je bilo pozitivno na BCV, a samo jedan na BRV. Mijeana
infekcija bila je prisutna u po jednom uzorku s obje farme.
Specifinost umnaanja odreenih fragmenata oba virusa
potvrena je uspjenim umnaanjem pozitivnih kontrola (slika 1). Na
kul-turi stanica BEK, CPE tipian za ko-ronavirus uoen je nakon pet
pasaa te je uspjeno umnaanje BCV potom potvreno ponovnim
izdvajanjem virusne RNK iz nadtaloga suspen-zije stanica i
umnaanjem specifinog odsjeka metodom RT-PCR. Ipak, umnaanje BRV na
linijskoj staninoj kulturi BEK nije uspjelo.
RaspravaGubitci teladi u ranom postnatal-
nom razdoblju svake su godine sve vei i kreu se ve preko 15%.
Kao glavni uzrok proljeva najei su virusi (rota-, korona-, virusni
proljev teladi uzro-kovan pestivirusima i dr.) i bakterije
(enterotoksini E. coli). Ovi uzronici koji su u naoj goveoj
populaciji sve-prisutni, a u pravilu mogu dovesti do tekih
oboljenja s akutnim tijekom bolesti i nerijetko izazvati uginue.
Pa-togenetski u pravilu najprije dolazi do infekcija u duodenumu
ili kolonu to dovodi do oteenja sluznice crijeva pa time pogoduje
sekundarnoj bakteri-jskoj infekciji. Telad se moe zaraziti ve i za
vrijeme samog telenja i kratko nakon telenja. U tom trenutku telad
jo nije u stanju aktivno izgraditi lokalnu imunost koja bi
sprijeila nastanak in-fekcije pa se preporuuje cijepljenje visoko
breih krava i junica s cjepiv-om protiv rotavirusa, koronavirusa i
enterotoksogenih sojeva E. coli, koja potie tvorbu kolostralnih
protutijela u cijepljenih krava i junica, kao sredstvo izbora.
Aktivnim cijepljenjem potie se
Slika 1. Elektroforeza amplikona reakcije RT-PCR. M: 50-bp DNA
marker; Stupac 1: pozitivna kontrola za BCV; Stupac 2: BCV
pozitivni uzorak, Stupac 3: pozitivna kontrola za BRV.
-
IVANA LojKI, T. BEdEKoVI, . A I M. LojKI
VETERINARSKA STANICA 40 (5), 257-262, 2009.260
poveanje razine protutijela u kolostru-mu i u mlijeku te
posljedino pasivna zatita njihove teladi sa svrhom sman-jenja
uestalosti i trajanja neonatalnih proljeva. Cijepljenje djeluje
prije svega i na produenje izluivanja majinskih protutijela i time
zatiuje sluznicu cri-jeva od uzronika proljeva.
Na dvije farme goveda virolokim je tehnikama utvrena mjeovita
in-fekcija s rotavirusima i koronavirusima te enterotoksigenom E.
coli koja se po-javljuje sekundarno i dodatno oteava kliniku sliku.
Ovakva je slika neona-talnog proljeva karakteristina za telad
stariju od 7 dana, stoga je i rotavirus bio slabije zastupljen od
koronavirusa. Te-renske je izolate BCV neto tee, ali ne i nemogue
prilagoditi rastu na in vitro. Ipak, u literaturi je zabiljeen
uspjean rast i izolacija BCV na sljedeim stani-cama: BEK-1 (Bovine
embryonic kid-ney), VERO (African green monkey kidney), MDBK
(Madin-Darby bovine kidney), PK-15 (Porcine kidney) i HRT-18 (Human
rectal tumor) koje su se pokazale i najosjetljivije (Tsunemitsu i
sur; 1991.). Na kulturi stanica BEK, CPE tipian za koronavirus uoen
je nakon pet pasaa, a uspjeno je umnaanje BCV potom potvreno
ponovnim izdvajanjem virusne RNK iz nadtalo-ga suspenzije stanica i
umnaanjem specifinog odsjeka metodom RT-PCR. Ipak, umnaanje BRV na
lini-jskoj staninoj kulturi BEK nije us-pjelo. Budui da je
izdvajanje BCV na staninoj kulturi BEK bilo uspjeno ra-zlog ne
moemo pripisati inhibitornim supstancama u uzorcima izmeta. Kako su
samo tri uzorka dala pozitivnu PCR reakciju na BRV, dok ih je ak 11
bilo
pozitivno na BCV, moemo zakljuiti da je bolest ve bila u
kasnijem tijeku te da u uzorcima izmeta vie nije bilo vi-jabilnog
rotavirusa. Budui da se meto-dom PCR dokazuje samo dio genoma
virusa, za pretragu nije potreban ivi virus. Tako su koritenjem
specifinih oligonukleotidnih poetnica za BCV i BRV umnoeni dijelovi
genoma oba virusa tono oekivanih veliina, to je potvreno i uspjenim
umnaanjem pozitivnih kontrola.
Na temelju dobiveni rezultata mo emo zakljuiti da je na dvjema
istraivanim farmama utvrena mje-ovita infekcija s rotavirusima i
koro-navirusima.
SaetakU cilju dokazivanja i izdvajanja
najeih virusnih uzronika neona-talnog proljeva teladi uzeti su
uzorci izmeta teladi s dvije farme u sredinjoj Hrvatskoj. Telad je
bila u dobi do 14 dana, a proljev je trajao oko pet dana. Budui da
su korona- i rotavirusi najei uzronici neonatalnog prolje-va teladi
izdvojena je virusna RNK iz uzoraka izmeta te napravljena lanana
reakcija polimerazom uz prethod-nu reverznu transkripciju (RT-PCR)
koritenjem specifinih oligonukleo-tidnih poetnica za gen
nukleokapside goveeg koronavirusa (BCV) i za gen VP6 goveeg
rotavirusa A (BRV-A). Elektroforeza proizvoda reakcije PCR u gelu
agaroze pokazala je odsjeak veliine 406 parova baza za BCV i 294 za
BRV- A kako u uzorku pozitivne kontrole tako i u testiranim
uzorcima.
-
Dokaz i izdvajanje goveeg koronavirusa uzronika neonatalnog
proljeva teladi
VETERINARSKA STANICA 40 (5), 257-262, 2009. 261
Tri su, od ukupno est uzoraka, bila pozitivni na BCV, a dva na
BRV od te-ladi podrijetlom s farme A. Na farmi B specifian je
odsjeak BCV bio prisutan u 8 od ukupno 10 uzoraka, a samo je jedan
uzorak dao pozitivnu reakciju na BRV. Mijeana infekcija bila je
prisutna u po jednom uzorku s obje farme. Sus-penzije izmeta svakog
uzorka inokuli-rane su na stanice bubrega goveeg em-brija (BEK).
Citopatski uinak tipian za koronavirus uoen je nakon pet pasaa te
je metodom RT-PCR potvreno izd-vajanje BCV. Ovo je ujedno prvi
dokaz i izdvajanje BCV kao uzronika neona-talnog proljeva teladi u
nas.
Literatura1. BERN, C. and R. I. GLASS (1994): Im-
pact of diarrheal diseases worldwide. In: KAPIKIAN, A. Z.: Viral
Infections of the Gastrointestinal Tract, 2nd ed. Marcel Dekker,
New York (126).
2. CAVANAGH, D. (1995): The coronavi-rus surface glycoprotein
In: SIDDELL, S. G. The Coronaviridae. Plenum, New York
(73-113).
3. DEA, S., L. MICHAUD and G. MILA-NE (1995): Comparison of
bovine coro-navirus isolates associated with neona-tal calf
diarrhoea and winter dysentery in adult dairy cattle in Qubec. J.
Gen. Virol. 76, 12631270.
4. ESTES, M. K. (2001): Rotaviruses. In: Fields Virology, 4th
ed. Lippincott Wil-liams & Wilkins, Philadelphia
(17471785).
5. MEBUS, C. A., E. L. STAIR, M. B. RHODES and M. J. TWIEHAUS
(1973): Neonatal calf diarrhea: propa-gation, attenuation, and
characteristics of a coronavirus-like agent. Amer. J. Vet. Res. 34,
145-150.
6. NAYLOR, J. M. (2002): Neonatal Rumi-nant Diarrhea. In: SMITH,
B. P.: Large animal internal medicine. Mosby, St. Louis
(355-356).
7. SAIF, L. J., K. V. BROCK, D. R. RED-MAN and E. M. KOHLER
(1991): Win-ter dysentery in dairy herds: electron microscopic and
serological evidence for an association with coronavirus
in-fection. Vet. Rec. 128, 447449.
8. SNODGRASS, D. R., H. R. TERZOLO, D. SHERWOOD, I. CAMPBELL, J.
D. MENZIES and B. A. SYNGE (1986): Aetiology of diarrhoea in young
calves. Vet. Rec. 119, 31-34.
9. TSUNEMITSU, H. and L. J. SAIF (1995): Antigenic and
biological comparisons of bovine coronaviruses derived from
neonatal calf diarrhea and winter dys-entery of adult cattle. Arch.
Virol. 140, 13031311.
10. TSUNEMITSU, H., H. YONEMICHI, T. HIRAI, T. KuDo, S. ONOE, K.
MORI and M. SHIMIZU (1991): Isola-tion of bovine coronavirus from
feces and nasal swabs of calves with diar-rhea. J. Vet. Med. Sci.
53, 433-437.
11. TSUNEMITSU, H., D. R. SMITH and L. J. SAIF (1999):
Experimental inocu-lation of adult dairy cows with bovine
coronavirus and detection of corona-virus in feces by RT-PCR. Arch.
Virol. 144, 167-175.
-
IVANA LojKI, T. BEdEKoVI, . A I M. LojKI
VETERINARSKA STANICA 40 (5), 257-262, 2009.262
Detection and isolation of a bovine coronavirus in neo-natal
calf diarrhea in Croatia
Ivana LOJKI, Ph.D., Scientific Associate, Tomislav BEDEKOVI,
DVM, Assis-tant; eljko A, Ph.D., DVM, Scientific Associate; Mirko
LOJKI, Ph.D., DVM, Full Professor, Croatian Veterinary Institute,
Zagreb
Coronaviruses and rotaviruses are the most common viruses
involved in neonatal calf diarrhea. Fecal samples from diarrheic
calves were collected from two farms in the central part of
Croatia. For the detection of corona- and rotavirus, viral RNA was
extracted from fecal suspensions. Specific oli-gonucleotide primers
for PCR (poly-merase chain reaction) detection of a nucleocapsid
gene of bovine coronavi-rus (BCV) and VP6 gene of bovine type A
rotaviruses (BRV-A) were used. Aga-rose gel electrophoresis of PCR
ampli-fied products showed fragments of ex-pected size in positive
control sample as well as in tested samples. A 406-bp PCR product
of bovine coronavirus
was present in three tested samples and 294-bp product of bovine
type A rotavi-rus in two samples, all originated from farm A. On
farm B, bovine coronavi-rus was detected in eight samples and
rotavirus only in one sample. Mixed infection was present in one
sample on both farms. Suspension from each sample was also
inoculated into bovine embryo kidney cells (BEK). Cytopathic effect
typical for coronaviruses was observed after 5 passages the
isolation of the virus was confirmed by PCR. In this study, we
detected and isolated for the first time a bovine coronavirus
involved in calf neonatal diarrhea in Croatia.
OBAVIJEST
Od broja 6. za 2009. godinu asopis Veterinarska stanica uvodi
novu ru-briku pod naslovom Besplatni oglasnik u kojem se mogu
objaviti oglasi u svezi ponude i potranje poslova za doktore
veterinarske medicine. Va oglas e biti objavljen dva puta
uzastopce, a nakon toga samo na Va ponov-ljen zahtjev.
Oglas se dostavlja glavnom i odgovornom uredniku: doc. dr. sc
Marko Samardija, Heinzelova 55, 10000 Zagreb ili na e-mail:
[email protected].
-
VETERINARSKA STANICA 40 (5), 2009.
ORIGINALNI ZNANSTVENI RAD
263
Seroloka, bakterioloka i molekularna dijagnostika
paratuberkuloze domaih ivotinja u 2008. godiniMaja Zdelar-Tuk, S.
pii, Sanja Duvnjak, Ivana Rai i . Cvetni
Dr. sc. Maja ZDELAR-TUK, dr. vet. med., znanstvena suradnica,
dr. sc. Silvio PII, dr. vet. med., znan-stveni suradnik, Sanja
DUVNJAK, dipl. in. biol., znanstvena novakinja, Ivana RAI, dipl.
in. biol., struna suradnica, dr. sc. eljko CVETNI, dr. vet. med.,
znanstveni savjetnik, Hrvatski veterinarski in-stitut, Zagreb
Paratuberkuloza (Johneova bolest) je kronina zarazna bolest,
koja se kliniki oituje tekim nezaustavljivim proljevom i mravou, a
patoloko-anatomski zadebljanjem sluznice tank-og crijeva, osobito
ileuma. Opisana je najprije u goveda, a zatim u ovaca i koza no
dokazana je i u drugih vrsta preivaa u divljini (jelena, antilopa,
bizona, mu-flona i drugih). Osim preivaa, konji i mule su takoer
potvreni kao nositelji bakterije, ali bez klinikih znakova. U
pokusno zaraenih laboratorijskih ivotinja (mievi, takori, zeevi,
hrci i zamorci) te ptica (perad i golubo-vi) uoeno je takoer
umnoavanje uzronika (Frelier i sur., 1990., Beard i sur., 2001.).
Nedavno je prisutnost
uzronika potvrena i u lisica, zeeva, zerdava, lasica i jelena
(Beard i sur., 1999., Greig i sur., 1999., Kopecna i sur., 2008.).
Paratuberkuloza u mlijenoj in-dustriji uzrokuje velike tete s
obzirom na pad mlijenosti (Wilson i sur., 1993., Benedictus i sur.,
1997., Hendrick i sur., 2005., Lombard i sur., 2005.), smanjene
klaonike vrijednosti (Johnson-Ifearu-lundu i Kaneene, 1997.,
Johnson-Ifea-rulundu i sur., 1999.) i poveani remont stada (Ott i
sur., 1999.). Isto se tako, ne moe zaobii ni zoonotski znaaj
paratuberkuloze goveda u patogenezi Crohnove bolesti u ljudi
(Chiodini i sur., 1984., Hermon-Taylor i sur., 2000., Harris i
Lammerding, 2001., Greenstein i Collins, 2004.).
Uvod
-
Maja Zdelar-Tuk, S. pii, Sanja duvnjak, ivana rai i .
CveTni,
VETERINARSKA STANICA 40 (5), 263-271, 2009.264
Bolesne ivotinje i kliconoe fecesom izluuju velike koliine
uzronika i oneiuju okolinu, stelju, vodu i dr. irenje uzronika u
okolinu i iz cri-jeva u ostale organe inficiranih goveda uglavnom
je povezano s kliniki pre-poznatljivim oblikom bolesti (Antogno-li
i sur., 2008., Hasonova i sur., 2009.) Prirodnim putem uzronik
ulazi u or-ganizam ispaom na kontaminiranim panjacima, no kao velik
problem navo-di se infekcija novoroene teladi koja je osobito
prijemljiva za uzronika zbog nerazvijenog imunolokog sustava.
Glavni izvor infekcije za telad je mlijeko zaraenih krava ili
mlijeko zagaeno fecesom bolesnih ivotinja (Harris i Barletta,
2001.). Mogu je i intrauterini prijenos do kojeg dolazi uglavnom
kod fetusa ije su majke u uznapredovalom stadiju bolesti. Provedena
istraivanja pokazala su da su mlaa goveda znatno osjetljivija na
infekciju i razvoj klinikih znakova paratuberkuloze u usporedbi s
odraslim ivotinjama (Wa-ters i sur., 2003.). U nezaraene uzgoje
bolest se unosi inficiranim grlima ili kontaminiranom hranom, dok
Ay-ele (2004.) navodi mogunost infek-cije zaraenim sjemenom.
Poznata je i injenica vertikalnog prijenosa in utero (Whittington i
Windsor, 2009.). Smatra se takoer da infekciji pogoduje pretjer-ano
iskoritavanje, gravidnost i bolesti poremeenog metabolizma.
Otkrivanje goveda kliconoa i zaraenih stada najee se bazira na
serolokoj pretrazi imunoenzimskim testom (ELISA), koja je vrlo
osjetljiva za otkrivanje goveda koja izluuju velike koliine
uzronika fecesom (Whitlock i sur., 2000., Collins i sur.,
2005.).
U radu je opisana seroloka, bak-terioloka i molekularna
dijagnostika paratuberkuloze u domaih ivotinja tijekom 2008.
godine.
Materijal i metodeMaterijal za pretragu na paratuber-
kulozu dolazi u Laboratorij za bakteri-jske zoonoze temeljem
godinje Na-redbe MPRRR, koja propisuje kontrolu krvi i fecesa
bikova, ovnova i jareva koji slue za proizvodnju sjemena za umjetno
osjemenjivanje ili prirodni pri-pust te krv svih krava u laktaciji
prije formiranja novog uzgoja i novonabav-ljenih junica prije
uvoenja u uzgoj.
Tijekom 2008. godine u Laborato-riju za bakterijske zoonoze na
para-tuberkulozu je serolokim metodama pretraeno 13782 krvi goveda
te 15533 krvi ovnova i jareva, fecesi 33 goveda i 2017 ovnova i
jareva, izvreno je 7 bakteriolokih pretraga i 2 molekularne
identifikacije izolata uzronika.
U rutinskoj dijagnostici paratuber-kuloze u Laboratoriju za
bakterijske zoonoze krvi bikova, ovnova i jareva na paratuberkulozu
pretrauju se imu-noenzimskim testom probira (ELISA Paratuberculosis
Antibody Screen-ing, Institut Pourquier, Francuska), a serume koji
su reagirali pozitivno pretraujemo dodatno potvrdnim
imu-noenzimskim testom (ELISA Paratu-berculosis Antibody
Verification, Insti-tut Pourquier, Francuska).
Uzorke fecesa pretraujemo mikros-kopskom pretragom (bojanje po
Ziehl-Neelsenu). U sluaju uginua ivotinje, dostavljeni materijal
(intestinalni limfni
-
Seroloka, bakterioloka i molekularna dijagnostika
paratuberkuloze domaih ivotinja u 2008. godini
VETERINARSKA STANICA 40 (5), 263-271, 2009. 265
vorovi, dijelovi ileuma ili jejunuma, ili ileocekalna valvula)
pretraujemo mi-kroskopski te nasaivanjem materijala na hranjive
podloge. Porasle kolonije identificiramo molekularnim
metoda-ma.
Seroloke metode: ELISA Paratuberculosis Antibody
Screening i Verification, Institut Po-urquier, Francuska su
komercijalno pripremljeni dijagnostiki kitovi za paratuberkulozu
preivaa. Granina je vrijednost iznad koje je serum poziti-van je u
uputi za uporabu testa. Rezul-tati su oitavani na spektrofotometru
Tecan Sunrise, Austrija.
Bakterioloke metode: Kulturelna pretraga uzorka organa
i fecesa izvrena je prema opisanoj me-todi (Pavlik i sur.,
2000., Kopecna i sur., 2008.) Ukratko: svaki uzorak tkiva (oko 1 g)
homogeniziran je i dekontaminiran s 0,75% HPC (Heksadecilpiridinium
klorid, Merck KGaA, Darmstadt, Nje-maka) kroz 72 h. Uzorci fecesa
(oko 1 g) razmueni su u 30 ml sterilne de-stilirane vode, mijeani
kroz 30 minuta na vodoravnoj mjealici i ostavljeni na sobnoj
temperaturi kroz pola sata. Za-tim smo 5 ml nadtaloga
dekontamini-rali s 25 ml 0,9% HPC- a kroz 72 h na sobnoj
temperaturi. Kao podloga za uzgoj koristi se Herold-ova podloga s
mikobaktinom koju priprema Labora-torij za pripremu hranjivih
podloga i sterilizaciju HVI-a ili CATTLETYPE MAP HEYM (Labor
Diagnostic Leip-zig). Svaki uzorak nacijepili smo na 3 hranjive
podloge i inkubirali u termo-statu na 37 C tijekom 3-4 mjeseca
uz
jednotjedne kontrole porasta kolonija. Na tvrdoj hranjivoj
podlozi primarne kolonije Mycobacterium avium subspecies
paratuberculosis porastu u razdoblju od 5 tjedana do 6 mjeseci
(prosjeno 3 mje-seca), a za ovje sojeve i do 9 mjeseci.
Molekularne metodeIzolacija DNK iz bakterijske kultureUicu
kulture Mycobacterium sp.
razmutimo u 50 l destilirane vode u Eppendorfovoj kualici od 2
ml. Ovu smjesu grijemo 20 minuta na 99 oC u termobloku uz povremeno
tresenje. Po-tom kualice centrifugiramo na 14000 g kroz 1 minutu.
Za potrebe pretrage ko-ristimo 2 ili 5 l nadtaloga.
Molekularnu identifikaciju M. pa-ratuberculosis izvrili smo s
obzirom na prisutnost inzercijske sekvence IS900, karakteristine za
ovu vrstu (Green i sur., 1989.). U reakcijskoj mjeavini koristili
smo poetnice MP90 (5 GTT-CGGGGCCGTCGCTTAGG 3) i MP91 (5
GAGGTCGATCGCCCACGTGA 3) u koliini od 2,5 l (konana koncentra-cija
0,4 M) (Sanderson i sur., 1992.), 5 l DNK, 15 l vode i 25 l HotStar
Taq Master Mix- a (Qiagen). Umnoavanje je izvreno prema referenci
Gwozdz i sur. (1997.), a oekivana veliina pro-dukta iznosi 400
parova baza (pb).
RezultatiTijekom 2008. godine serolokim je
metodama ukupno pretraeno 13782 krvi goveda te 15533 krvi ovnova
i jareva. Za seroloki pozitivne ivotinje preporueno je klanje, a
materijal za bakterioloku pretragu uzorkovan je na liniji klanja.
Bakteriolokom pretragom
-
Maja Zdelar-Tuk, S. pii, Sanja duvnjak, ivana rai i .
CveTni,
VETERINARSKA STANICA 40 (5), 263-271, 2009.266
bojanjem razmaza po Ziehl-Neelsenu pretraena su 33 fecesa goveda
te 2017 fecesa ovnova i jareva. Radi kulturelne pretrage u
laboratorij je dostavljeno i pretraeno 7 uzoraka organa (tanka
crijeva i pripadajui limfni vorovi) i fecesa na hranjivoj podlozi
(Tablica 1). Molekularna identifikacija uzronika izdvojenih iz
mezenterijalnih limfnih vorova goveda izvrena je metodom lanane
reakcije polimeraze za 2 izolata (Slika 1.).
Slika 1. Molekularna identifikacija vrste M. para-tuberculosis:
PK- pozitivna kontrola, NK- nega-tivna kontrola, G1 i G2- izolati
M. paratuberculo-sis iz mezenterijalnih limfnih vorova goveda, 400
i 600- veliina produkta umnoavanja (broj parova baza)
RaspravaOtkako je opisana prvi puta 1895.
godine, paratuberkuloza se proirila gotovo cijelim svijetom s
izuzetkom nekih dijelova vedske (Herthnek, 2006.) i Australije
(Kennedy i Allworth,
2000.) Unato velikom ekonomskom utjecaju na mlijenu industriju
irom svijeta, educiranost uzgajivaa o po-sljedicama i tetnom
utjecaju bolesti je vrlo mala. Ekonomski gubitci oituju se
smanjenom proizvodnjom, preranim izluivanjem iz uzgoja,
veterinarskim trokovima i smanjenom klaonikom vrijednou
(Johnson-Ifearulundu i Kaneene, 1997., Johnson- Ifearulundu i sur.,
1999., Hasonova i Pavlik, 2006.). Osim ekonomskih gubitaka, vano je
spomenuti i potencijalnu zoonotsku ulogu M. paratuberculosis, s
obzirom da je otporan na pasterizaciju mlijeka i drugih mlijenih
proizvoda te kao takav predstavlja opasnost za ljudsko zdravlje
(Grant i sur., 2002.). Sve vie znanstvenih istraivanja (Chiodini i
sur., 1984., Hermon-Taylor i sur., 2000., Harris i Lammerding,
2001., Greenstein i Collins, 2004.) upuuje na povezanost
paratuberkuloze u mlijenih goveda i Chronove bolesti u ljudi, to je
prvi puta sugerirao Dalziel jo 1913. godine.
Raznolikost imunologije paratuber-kuloze i mnoga ogranienja u
postav-ljanju dijagnoze veliki su problem u kontroli i njezinu
suzbijanju. Seroloke, bakterioloke i molekularne metode u praktinoj
primjeni daju manje od 1%
Tablica 1. Prikaz serolokih i bakteriolokih pretraga u goveda,
ovaca i koza tijekom 2008. godine.
SEROLOKA I BAKTERIOLOKA PRETRAGA NA PARATUBERKULOZU
Vrsta ivotinje
Imunoenz-imski test
(ELISA)
Broj pozitivnih uzoraka
Broj kulturel-no pretraenih
uzoraka or-gana i fecesa
Broj kulturelno pozitivnih uzoraka
Broj mik-roskopski
pretraenih fecesa
Broj mik-roskopski pozitivnih
fecesa
Goveda 13782 25 5 2 33 0
Ovce i koze
15521 11 2 0 2107 (ovnovi i jarevi)
0
-
Seroloka, bakterioloka i molekularna dijagnostika
paratuberkuloze domaih ivotinja u 2008. godini
VETERINARSKA STANICA 40 (5), 263-271, 2009. 267
nespecifinih reakcija. Znatan postotak ivotinja u zaraenom stadu
u ranom stadiju bolesti ne pokazuje nikakve zna-kove bolesti, a
ivotinje jo nisu razvile imunosni odgovor ili poele izluiva-ti
mikobakterije pa se bolest ne moe nikakvim dijagnostikim metodama
otkriti (Collins, 1996.). Upravo stoga dostupne podatke o
prevalenciji treba uzeti s rezervom. Naime, smatra se da na svaku
kravu koja pokazuje klinike znakove bolesti dolazi 25 zaraenih
i-votinja, a samo se njih 15 do 25% mogu otkriti trenutno dostupnim
dijagnosti-kim metodama (Whitlock i sur., 2005.). Prisustvo
acidorezistentnih tapia u fecesu ovisi o fazi bolesti. U mladih
i-votinja, na poetku bolesti u fecesu ih se ne moe dokazati
tehnikama bojenja, a Coelho i sur. (2008.) su ih u uzgojima ovaca s
dokazanom paratuberkulozom bojanjem po Ziehl-Neelsenu ustvrdili u
ak 61,5% sluajeva. U 2008. godi-ni mikroskopski smo pretraili 2107
fecesa ovnova i jareva i 33 bikova s negativnim rezultatom to
ukazuje da paratuberkuloza nije znatno rairena u uzgojima ovaca i
koza. Takoer, ne postoje pouzdane seroloke metode, bakterioloke i
molekularne tehnike koje bi osigurale rano otkrivanje infek-cije u
mlijenih goveda (Dieguez i sur., 2009.). Bakterioloka se pretraga
fece-sa smatra najpouzdanijom metodom pretrage u ivih ivotinja i
omoguava otkrivanje 30-40% inficiranih ivotinja (Whitlock i sur.,
2000.). Podudarnost kulturelne pretrage s imunoenzimskim testom u
najveoj mjeri ovise o stadiju bolesti i starosti ivotinja. Tako su
Jubb i sur. (2004.) u istraivanju provedenom u Australiji utvrdili
u dvije, tri i etiri
godine starih goveda osjetljivost ELI-SA testa 1,2%, 8,9% i
11,6%, a u starijih goveda i do 20-30 %. Posebno izraena
osjetljivost ELISA testa nad RVK i GDP testovima, pogotovo u
subklinikom ti-jeku bolesti utvrena je i u istraivanji-ma ostalih
autora (Gwozdz i sur., 1997., Cvetni i sur., 2004., OIE 2008.).
Bakteri-oloka pretraga izvrena je na ogranie-nom broju uzoraka,
uglavnom neade-kvatno uzorkovanih na liniji klanja te stoga nije
mogue komentirati rezulta-te s obzirom na specifinosti seroloke i
bakterioloke pretrage. Molekularna dijagnostika, koja se u rutini
provodi lananom reakcijom polimerazom i temelji se na dokazu IS900
predstavlja brz nain identifikacije uzronika, a u 2008. godini
nadopunjena je uvoe-njem bre i osjetljivije kvantitativne RT-PCR
metode.
Na alost, ne postoji unificirani pro-gram otkrivanja, kontrole i
suzbijanja paratuberkuloze. U nacionalnim sta-dima s rairenom
paratuberkulozom u cilju kontrole i suzbijanja bolesti po-trebno je
pretraiti feces svih odraslih goveda dva puta godinje; seroloki
pretraiti krv ivotinja s proljevom; izluiti inficirane krave i
bikove; osigu-rati ist prostor za teljenje; od osobite je vanosti
nakon teljenja krave i telad dr-ati na nezagaenim panjacima;
spri-jeiti kontaminaciju panjaka te hrane i vode inficiranim
fecesom; sijeno uvati na mjestu sigurnom od kontaminacije; ne
koristiti isti pribor za ienje sta-je i hranjenje ivotinja (Roussel
i sur., 2005.). U Hrvatskoj se u cilju prevencije paratuberkuloze
vri seroloka kontro-la prilikom uvoenja novonabavljenih ivotinja u
uzgoj slobodan od bolesti i
-
Maja Zdelar-Tuk, S. pii, Sanja duvnjak, ivana rai i .
CveTni,
VETERINARSKA STANICA 40 (5), 263-271, 2009.268
periodika kontrola mukih rasplod-njaka, a prilikom uvoza
rasplodnih i-votinja zbog nepouzdanosti seroloke dijagnostike
zahtijevaju se i dodatne garancije da ivotinje potjeu iz uzgo-ja
slobodnih od paratuberkuloze. Naj-vaniji imbenik koji vodi do
uspjene kontrole paratuberkuloze je dosljedno provoenje navedenih
mjera tijekom dueg razdoblja.
SaetakTijekom 2008. godine u Laborato-
riju za bakterijske zoonoze na para-tuberkulozu serolokim je
metodama pretraeno 13782 krvi goveda te 15533 krvi ovnova i jareva.
Mikroskop-skom pretragom razmaza fecesa obo-jenih metodom po
Ziehl-Neelsenu pretraena su 33 fecesa goveda te 2017 fecesa ovnova
i jareva te kulturelno pretraeno 7 uzoraka tkiva ili fecesa na
hranjivoj podlozi. Molekularna iden-tifikacija uzronika izdvojenih
iz me-zenterijalnih limfnih vorova goveda izvrena je metodom lanane
reakcije polimeraze.
Paratuberkuloza nije gorui prob-lem u R. Hrvatskoj, iako u
svijetu nano-si velike ekonomske tete mlijenom govedarstvu i
ovarstvu. Dijagnostika bolesti je kompleksna i ne postoje
uni-formni programi kontrole i suzbijanja bolesti. Temeljem toga
potrebno je provoditi kontinuirane mjere kontrole bolesti s ciljem
brze dijagnostike pojave bolesti i sprijeavanja njezinog
irenja.
Literatura1. ANTOGNOLI, M. C., F. B. GARRY,
H. L. HIRST, J. E. LOMBARD, M. M. DENNIS, D. H. GOULD and M. D.
SALMAN (2008): Characterization of Mycobacterium avium subspecies
para-tuberculosis disseminated infection in dairy cattle and its
association with antemortem test results. Vet. Microbiol. 127,
300308.
2. AYELE, W. Y., M. BARTOS, P. SVAS-TOVA and I. PAVLIK (2004):
Distribu-tion of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in
organs of naturally infected bull-calves and breeding bulls. Vet.
Microbiol. 15, 103 (3-4), 209-217.
3. BEARD, P. M., D. HENDERSON, M. J. DANIELS, A. PIRIE, D.
BUXTON, A. GREIG, M. R. HUTCHINGS, I. McK-ENDRICK, S. RHIND, K.
STEVENSON and J. M. SHARP (1999): Evidence of paratuberculosis in
fox (Vulpes vulpes) and stoat (Mustela erminea). Vet. Rec. 145,
612613.
4. BEARD P. M., M. J. DANIELS, D. HEN-DERSON, A. PIRIE, K.
RUDGE, D. BUXTON, S. RHIND, A. GREIG, M. R. HUTCHINGS, I.
McKENDRICK, K. STEVENSON and J. M. SHARP (2001). Paratuberculosis
Infection of Nonru-minant Wildlife in Scotland. J. Clin. Microbiol.
39 (4), 1517-1521.
5. BENEDICTUS, G., A. DIJKHUIZEN and J. STELWAGEN (1997):
Economic losses due to paratuberculosis in dairy cattle. Vet. Rec.
121, 142-146.
6. CHIODINI, R. J., H. J. VAN KRUININ-GEN, R. S., MERKAL, W. R.
THAYER JR. and J. A. COUTU (1984): Characteristics of an
unclassified Mycobacterium spe-cies isolated from patients with
Crohns disease. J. Clin. Microbiol. 20, 966-971.
7. COELHO, A. C., M. L. PINTO, A. M. COELHO and J. RODRIGUES
(2008): Ziehl-Neelsen staining as a fast method in the diagnosis of
ovine paratubercu-losis. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. 60,
1097-1102.
-
Seroloka, bakterioloka i molekularna dijagnostika
paratuberkuloze domaih ivotinja u 2008. godini
VETERINARSKA STANICA 40 (5), 263-271, 2009. 269
8. COLLINS, D. M. (1996): Diagnosis of paratuberculosis. In:
Sweeney, R. W.: The veterinary clinics of North Ameri-ca-Food
animal practice. Paratubercu-losis (Johnes disease): W. B. Sounder
Company. Vol. 12, 357-371.
9. COLLINS, M. T., S. J. WELLS, K.S. PE-TRINI, J. E. COLLINS, R.
D. SCHULTZ and R. H. WHITLOCK (2005): Evaluati-on of five antibody
detection tests for di-agnosis of bovine paratuberculosis. Clin.
Diagn. Lab. Immunol. 12 (6), 685-692.
10. CVETNI, ., M. OCEPEK, S. PI-I, B. HABRUN, M. MITAK i B. KRT
(2004): Usporedba razliitih metoda dijagnostike paratuberkuloze u
uzgoju mlijenih goveda. Vet. Stanica 35 (1), 5-13.
11. DIEGUEZ F. J., A. M. GONZALEZ, S. MENENDEZ, M. J. VILAR, M.
L. SA-NJUAN, E. YUS and I. ARNAIZ (2009): Evaluation of four
commercial serum ELISAs for detection of Mycobacterium avium subsp.
paratuberculosis infection in dairy cows. Vet. Journal 180,
231-235.
12. FRELIER, P. F., J. W. TEMPLETON, M. ESTES, H. W. WHITFORD
and R. D. KIENLE (1990): Genetic regulation of Mycobacterium
paratuberculosis infec-tion in recombinant inbred mice. Vet.
Pathol. 27, 362-364.
13. GRANT, I. R., E. I. HITCHINGS, A. McCARTNEY, F. FERGUSON and
M. T. ROWE (2002): Effect of Commercial-Scale High-Temperature,
Short-time Pasteurization on Viability Mycobacte-rium
paratuberculosis in Naturally Infec-ted Cows milk. Appl. Environ.
Micro-biol. 68 (2), 602-607.
14. GREEN, E. P., M. L. V. TIZARD, M. T. MOSS, J. THOMPSON, D.
J. WIN-TERBOURNE, J. J. MCFADDEN and J. HERMON-TAYLOR (1989):
Sequen-ce and characteristicss of IS900, an in-sertion element
identified in a human Chrons disease isolate of Mycobacteri-um
paratuberculosis. Nucleic Acid Res. 17, 9063-9073.
15. GREIG A., K. STEVENSON, D. HEN-
DERSON, V. PEREZ, V. HUGUES, I. PAVLIK, M. E. HINES, I.
McKEND-RICK and J. M. SHARP (1999): Epide-miological study of
paratuberculosis in wild rabbits in Scotland. J. Clin. Micro-biol.
37, 1746-1751.
16. GREENSTEIN, R. J. and M. T. CO-LLINS (2004): Emerging
pathogens: is Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis
zoonotic? Lancet 364, 396-397.
17. GWOZDZ, J. M., M. P. REICHEL, A. MURRAY, W. MANKTELOW, D. M.
WEST, K. G. THOMPSON (1997): De-tection of Mycobacterium avium
subsp. paratuberculosis in ovine tissues and blood by the
polimerase chain reaction. Vet. Microbiol. 51, 233-244.
18. HARRIS, J. E. and A. M. LAMMER-DING (2001): Crohns disease
and Mycobacterium avium subsp. paratu-berculosis: current issues.
J. Food Prot. 64, 2103-2110.
19. HARRIS, N. B. and R. G. BARLETTA (2001): Mycobacterium avium
subsp. paratuberculosis in Veterinary Medicine. Clin. Microbiol.
Rew., 14 (3), 489-512.
20. HASONOVA, L. and I. PAVLIK (2006): Economic impact of
paratuberculosis in dairy cattle herds: a review. Veteri-narni
Medicina 51 (5), 193-211.
21. HASONOVA, L., I. TRCKA, V. BABAK, Z. ROZSYPALOVA, R.
PRIBYLOVA and I. PAVLIK (2009): Distribution of Mycobacterium avium
subsp. paratuber-culosis in tissues of naturally infected cattle as
affected by age. Veterinarni Medicina 54 (6), 257-269.
22. HENDRICK, S. H., D. F. KELTON, K. E. LESLIE, K. D.
LISSEMORE, M. AR-CHAMBAULT and T. F. DUFFIELD (2005): Effect of
paratuberculosis on culling, milk production, and milk quality in
dairy herds. J. Am. Vet. Med. Assoc. 227, 1302-1308.
23. HERMON-TAYLOR, J., T. J. BULL, J. M. SHERIDAN, J. CHENG, M.
L. STELLA-KIS and N. SUMAR (2000): Causation of Crohns disease by
Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis.
-
Maja Zdelar-Tuk, S. pii, Sanja duvnjak, ivana rai i .
CveTni,
VETERINARSKA STANICA 40 (5), 263-271, 2009.270
Can. J. Gastroenterol. 14, 521-539.24. HERTHNEK, D. (2006):
Detection and
confirmation of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in
clinical sam-ples. Licentiate thesis. ISSN 1653-8315, ISBN
91-576-7167-2 Swedish Univer-sity of Agricultural Sciences.
25. JOHNSON-IFEARULUNDU, Y. J. and J. B. KANEENE (1997):
Epidemiology and economic impact of subclinical Johnes disease: a
review. Vet. Bull. 67, 437-447.
26. JOHNSON-IFEARULUNDU, Y. J., J. B. KANEENE and J. W. LLOYD
(1999): Herd level economic analysis of the impact of
paratuberculosis on dairy herds. J. Am. Vet. Med. Assoc. 214,
822-825.
27. JUBB, T. F., E. S. SERGEANT, A. P. CALLINAN and J. GALVIN
(2004): Estimate of the sensitivity of an ELISA used to detect
Johnes disease in Victo-rian dairy cattle herds. Aust. Vet. J. 82
(9), 569-573.
28. KENNEDY, D. J. and M. B. ALL-WORTH (2000): Progress in
national control and assurance programs for bovine Johnes disease
in Australia. Vet. Microbiol. 77, 443-451.
29. KOPECNA, M., I. PARMOVA, L. DVORSKA-BARTOSOVA, M. MORAVKOVA,
V. BABAK and I. PAV-LIK (2008): Distribution and transmis-sion of
Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis in farmed red deer
(Cer-vus elaphus) studied by faecal culture, serology and IS900
RFLP examination. Veterinarni Medicina 53, 510-523.
http://www.vri.cz/docs/vetmed/53-9-510.pdf
30. LOMBARD, J. E., F. B. GARRY, B. J. Mc-CLUSKEY and B. A.
WAGNER (2005): Risk of removal and effects on milk production
associated with paratuber-culosis status in dairy cows. J. Am. Vet.
Med. Assoc. 227, 1975-1981.
31. OIE (2008): Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for
Terrestrial Animals, Chapter 2. 1. 11.
32. OTT, S. L., S. J. WELLS and B. A. WAG-
NER (1999): Herd-level economic loss-es associated with Johnes
disease on US dairy operations. Prev. Vet. Med. 40, 179-192.
33. PAVLIK, I., L. MATLOVA, J. BARTL, P. SVASTOVA, L. DVORSKA
and R. WHITLOCK (2000): Parallel faecal and organ Mycobacterium
avium subsp. paratuberculosis culture of different pro-ductivity
types of cattle. Vet. Microbiol. 77, 309-324.
34. ROUSSEL, A. J., M. C. LIBAL, R. L. WHITLOCK, T. B.
HAIRGROVE, K. S. BARLING and J. A. THOMPSON (2005): Prevalence of
and risk factors for paratuberculosis in purebred beef cattle. J.
Am. Vet. Med. Assoc. 1, 226 (5), 773-778.
35. SANDERSON, J. D., M. T. MOSS, M. L. TIZARD and J. HERMON
TAYLOR (1992): Mycobacterium paratuberculosis DNA in Chrons disease
tissue. Gut 33, 890-896.
36. WATERS, W. R., J. M. MILLER, M. V. PALMER, J. R. STABEL, D.
E. JONES, K. A. KOISTINEN, E. M. STEADHAM, M. J. HAMILTON, W. C.
DAVIS, and J. P. BANNANTINE (2003): Early Induc-tion of Humoral and
Cellular Immune Responses during Experimental Myco-bacterium avium
subsp. Paratuberculosis Infection of Calves. Infection and
Im-munity 71 (9), 5130-5138.
37. WHITLOCK, R. H., S. J. WELLS, R. W. SWEENEY and TIEM J. VAN
(2000): ELISA and fecal culture for paratuber-culosis (Johnes
disease): sensitivity and specificity of each method. Vet.
Microbiol. 77, 387-398.
38. WHITLOCK, R. H., R. W. SWEENY, T. L. FYOCK and J. SMITH
(2005): MAP Super- Shedders: another factor in the control of
Johnes disease. In: MAN-NING, E. J. B., NIELSEN, S. S. (Eds.),
Proceedings of the 8th International Colloyuium on
Paratuberculosis. p. 164.
39. WHITTINGTON R. J. and P. A. WIND-SOR (2009): In utero
infection of cattle
-
Seroloka, bakterioloka i molekularna dijagnostika
paratuberkuloze domaih ivotinja u 2008. godini
VETERINARSKA STANICA 40 (5), 263-271, 2009. 271
with Mycobacterium avium subsp. para-tuberculosis: a critical
review and meta-analysis. The Veterinary Journal 179, 60-69.
40. WILSON, D. J., C. ROSSITER, H. R. HAN and P. M. SEARS
(1993): Associa-
tion of Mycobacterium paratuberculo-sis infection with reduced
mastitis, but with decreased milk production and increased cull
rate in clinically normal dairy cows. Am. J. Vet. Res. 54 (11),
1851-1857.
Serological, bacteriological and molecular diagnostics of
paratuberculosis of domestic animals in the year 2008
Maja ZDELAR-TUK, DVM, Ph.D., Scientific Associate, Silvio PII,
DVM, Ph.D., Scientific Associate, Sanja DUVNJAK, Grad. Molecular
Biology, Junior Researcher, Ivana RAI, Grad. Molecular Biology,
Assistant, eljko CVETNI, DVM, Ph.D., Scientific Advisor, Croatian
Veterinary Institute, Zagreb
During the year 2008 in Laboratory for Bacterial Zoonoses
different meth-ods were used for paratuberculosis diagnostics. By
serological methods (ELISA) the sera of 13782 cattle and 15533 rams
and capricorns were anal-ysed. The presence of acid-fast bacilli in
fecal smears collected from 33 bulls and 2017 rams and capricorns
was in-vestigated using Ziehl-Neelsen stain-ing, and we also
cultivated 7 tissue and fecal samples using special media
supplemented with mycobactin. Mo-lecular identification of
Mycobacte-rium paratuberculosis isolated from
bovine mesenteric lymph nodes was performed by PCR.
Paratuberculosis is not a burning problem in the Republic of
Croatia, although it causes enormous eco-nomic losses to the
livestock industry throughout the world. Diagnostics of
paratuberculosis is complex and there is not a unique scheme of
control and suppression of the disease. Therefore, to control the
spread of paratubercu-losis in cattle industry, it is needed to
carry out continuous measures with the purpose of quick disease
diagnos-tics and prevention of its spreading.
BILJEKE
VETERINARSKA KOLA U ZAGREBU. Njegovo kraljevsko Visoanstvo
nasljednik prijestolja propisao je ukazom od 31. kolovoza 0.g.
uredbu 0 us-trojenju veterinarske visoke kole u Zagrebu.
Novo doba (Vukovar), 99, 4, 1919 (god. 2) (l. listopada
1919.).
-
VETERINARSKA STANICA 40 (5), 2009.
ORIGINALNI ZNANSTVENI RAD
273
Utjecaj gravidnosti i laktacije na promjene metabolikog statusa
u mlijenih krava
Opskrbljenost energijom tijekom prijelaznog perioda izmeu kasne
gravidnosti i poetka laktacije (tri tjed-na prije poroda i tri
tjedna nakon po-roda) predstavlja vanu komponentu u odravanju
zdravlja i reprodukcijske sposobnosti mlijenih krava (Doepel i
sur., 2002.). Tijekom kasne gravidnosti poveavaju se potrebe fetusa
za gluko-zom i aminokiselinama, to zahtijeva prilagodbu majinog
metabolizma na te fizioloke promjene. Nakon poroda poveavaju se
potrebe mlijene lijezde za glukozom, aminokiselinama i mas-nim
kiselinama u svrhu sinteze laktoze, proteina i triglicerida mlijeka
to ini nutritivne zahtjeve jo izraenijim (Bell, 1995.). Takvi se
energetski zahtjevi teko mogu zadovoljiti unosom hrane,
stoga moe doi do neravnotee iz-meu unosa energije hranom i
uku-pnih energetskih zahtjeva, tj. do nas-tanka negativnog
energetskog stanja. Razvoju negativnog energetskog stanja osobito
su sklone mlijene krave koje su prekomjerno hranjene u suhostaju,
te nakon poroda imaju smanjen apetit i stoga hranom unose manju
koliinu energije (Rukkwamusk i sur., 1999.a).
Sredinju ulogu u uspostavljanju stanja energetske ravnotee imaju
pro-cesi metabolike prilagodbe koji se uglavnom odvijaju u jetri i
masnom tkivu, ali i u miiima (Herdt, 2000.). Oni obuhvaaju poveanje
glukoneo-geneze u jetri iz endogenih supstrata, smanjenje
iskoritavanja glukoze u per-ifernim tkivima, smanjenje lipoge neze
i
Mario Cikojevi, Stjepko ermak i Romana Turk
Mario CIKOJEVI i Stjepko ERMAK, apsolventi Veterinarskog
fakulteta Zagreb; dr. sc. Romana TURK, znanstvena suradnica,
Veterinarski fakultet Zagreb
Uvod
-
MARIo CIKojEVI, STjEpKo ERMAK I RoMANA TuRK
VETERINARSKA STANICA 40 (5), 273-280, 2009.274
poveanje mobilizacije masnih kiselina iz masnog tkiva te
eventualno poveanje mobilizacije aminokiselina iz miia u razdoblju
krajem gravidnosti (Drackley, 1999.). Te se promjene nastavljaju
ti-jekom puerperija i rane laktacije i bivaju jo izraenije, budui
da su energetski zahtjevi u tom razdoblju nekoliko puta vei nego
krajem gravidnosti (Bell, 1995.). Lipoliza dovodi do poveane
koncentracije slobodnih masnih kise-lina u krvi, koje se u jetri
esterificiraju u trigliceride, a zatim se iz jetre trans-portiraju
u obliku lipoproteina vrlo ni-ske gustoe, VLDL (engl. Very low
den-sity lipoproteins) (Drackley, 1999.). U ranoj laktaciji kod
krava s energetskim manjkom kapacitet jetre za odravanje ravnotee
izmeu izluivanja trigliceri-da u obliku VLDL-a i endogene sinteze
triglicerida nije uvijek dostatan. Triglic-eridi se nakupljaju u
jetri to dovodi do masne infiltracije jetre. Nemogunost potpune
metabolike prilagodbe na energetski manjak moe tako uzroko-vati
metabolike bolesti (masna infil-tracija jetre, ketoza, poroajna
pareza), zarazne bolesti (mastitis) te reproduk-cijske poremeaje
(zaostajanje postelji-ce, smanjena plodnost), (Rukkwa-musk i sur.,
1999.b). Ovakva se stanja mogu oitovati klinikim simptomima
naruenog opeg zdravlja ivotinja ili pak subklinikim tijekom to
kasnije dovodi do smanjene plodnosti i proiz-vodnje. Stoga
odreivanje pokazatelja metabolikog statusa i njihova pravilna
interpretacija imaju veliku vanost u praenju zdravlja i
reprodukcijskog sta-tusa krava.
Cilj ovog rada je bio istraiti poka-zatelje metabolikog statusa,
tj. koncen-
traciju glukoze, triglicerida, kolestero-la, ureje, kreatinina i
mokrane kiseline u serumu mlijenih krava tijekom grav-idnosti i
laktacije s posebnim osvrtom na metabolizam tijekom prijelaznog
perioda izmeu kasne gravidnosti i rane laktacije.
Materijal i metode
ivotinje i uzorci krviNa podruju sjeverozapadne i is tone
Hrvatske u istraivanje je ukljueno ukupno 187 mlijenih krava
holstein-frizijske i simentalske pasmine koje su bile u razliitim
razdobljima reproduk-cijskog ciklusa te smo ih podijelili u est
skupina i to: 1) gravidnost do 3 mjeseca (n=38), 2) gravidnost 3-5
mjeseci (n=16), 3) gravidnost 6-8 mjeseci (n=36), 4) gravidnost 9
mjeseci (n=12), 5) puer-perij 10-15 dana (n=21), 6) srednja
lak-tacija (6-10 tjedana).
Uzorke krvi uzimali smo Vacutainer
sistemom iz v. jugularis u epruvete bez antikoagulansa te ih 15
minuta centrifu-girali pri 3.000 okr/min. Serume odvojene od ugruka
pohranili smo u zamrziva na 20 C do izvoenja analiza.
Odreivanje metabolikog statusa
Koncentraciju glukoze odreivali smo GOD-PAP metodom uporabom
oksid-aze glukoze i peroksidaze (Boeringer Mannheim Diagnostica,
Mannheim, Nje maka).
Koncentraciju triglicerida u serumu odreivali smo GPO-PAP
metodom s
-
Utjecaj gravidnosti i laktacije na promjene metabolikog statusa
u mlijenih krava
VETERINARSKA STANICA 40 (5), 273-280, 2009. 275
oksidazom glicerol-fosfata (Herbos Di-jagnostika, Sisak,
Hrvatska), a koncen-traciju ukupnog kolesterola u serumu smo
odreivali CHOD-PAP metodom (Herbos Dijagnostika, Sisak,
Hrvatska).
Koncentraciju ureje u serumu odreivali smo metodom
kontinu-iranog mjerenja uz prisutnost ureaze (Herbos Dijagnostika,
Sisak, Hrvatska).
Koncentracija kreatinina odreena je kolorimetrijskom metodom s
pi-krinskom kiselinom (Herbos Dijagnos-tika, Sisak, Hrvatska), a
koncentracija mokrane kiseline kolorenzimskom metodom uz urikazu i
peroksidazu (Herbos Dijagnostika, Sisak, Hrvatska). Sva su
odreivanja provedena na au-tomatskom analizatoru Technicon
RA-1000.
Statistika obrada podatakaStatistiki znaajna razliitost iz
me-
u skupina izraunata je pomou Tukey HSD testa, a vrijednosti
P
-
MARIo CIKojEVI, STjEpKo ERMAK I RoMANA TuRK
VETERINARSKA STANICA 40 (5), 273-280, 2009.276
osam mjeseci (114,4 mol/L) i tijekom devetog mjeseca gravidnosti
(121,4 mol/L) nego u prvom tromjeseju gravidnosti (99,5 mol/L).
Najnia kon-centracija kreatinina izmjerena je u pu-erperiju (88,4
mol/L) i bila je statistiki znaajno manja od koncentracije u
sku-pini krava gravidnih izmeu tri i pet mjeseci (112,6 mol/L),
onih gravid-nih izmeu est i osam mjeseci (114,4 mol/L), krava
gravidnih devet mjeseci (121,4 mol/L) te oteljenih krava u srednjoj
laktaciji (110,2 mol/L).
Koncentracija mokrane kiseli ne je bi-la statistiki znaajno
manja u krava grav-idnih izmeu est i osam mjeseci (56,0 mol/L) nego
u prvom tromjeseju
gravidnosti (75,6 mol/L). Izmeu os-talih skupina ivotinja
koncentracija mokrane kiseline nije se statistiki znaajno
razlikovala.
RaspravaPrijelazni period izmeu kasne
gravidnosti i rane laktacije predstav-lja fazu katabolizma
usmjerenog na pripremu za porod i poetak laktacije (Drackley i
sur., 2005.). Intenzivni tijek metabolizma u tom razdoblju oituje
se promjenama koncentracija metabolita u krvi, osobito promjenama
koncen-tracija lipidnih sastojaka krvi (Rukkwa-musk i sur.,
1999.a).
Tablica 1. Srednje vrijednosti (SD) koncentracije glukoze,
triglicerida, kolesterola, ureje, kreatinina i mokrane kiseline u
serumu krava tijekom reprodukcijskog ciklusa
Gravidnost
Puerperij (P)
Srednja lak-tacija
(L)
do 3 mjese-ca (G1)
3-5 mje-seci(G2)
6-8 mjeseci(G3)
9 mjeseci(G4)
Glukoza (mmol/L) 4,72,0 4,81,2 3,60,9
*G1 3,91,3 3,21,5*G1,G2 4,81,3*p
Trigliceridi (mmol/L) 0,200,08 0,200,06 0,260,11
*G1,P 0,300,07*G2,P 0,080,03*G1,G2,G3,G4 0,230,09*P
Kolesterol (mmol/L) 5,01,5 4,71,2 3,50,7
*G1 3,20,6*G1,G2 2,40,5*G1,G2,G3 4,91,5*G3,G4,P
Urea(mmol/L) 4,42,0 3,22,0 3,91,6 4,62,0 5,11,8
*G2 3,20,7*P
Kreatinin(mol/L) 99,5 18,7 112,62,0 114,417,5
*G1 121,421,9*G1 88,411,8*G2,G3,G4 110,220,3*P
Mokrana kiselina (mol/L)
75,631,9 65,222,3 56,019,1*G1 67,836,1 63,78,0 58,117,0
*statistiki znaajna razlika prema naznaenoj skupini (P
-
Utjecaj gravidnosti i laktacije na promjene metabolikog statusa
u mlijenih krava
VETERINARSKA STANICA 40 (5), 273-280, 2009. 277
Zbog velikih energetskih zahtje-va u prijelaznom periodu dolazi
do znaajnog pada koncentracije glukoze. U ovom je radu
koncentracija glukoze bila statistiki znaajno manja u seru-mu krava
krajem gravidnosti i tijekom puerperija to je u skladu s nalazima
drugih autora koji takoer navode smanjenu koncentraciju glukoze u
se-rumu tijekom rane laktacije, to je odraz poveanih zahtjeva
fetusa i mlijene lijezde za glukozom. To rezultira ener-getskim
manjkom koji ima za posljedi-cu mobilizaciju tjelesnih rezervi
masti i razvoj masne infiltracije jetre (Baird, 1982., Reid i
Roberts, 1983., Reid, 1986., Vazquez-Anon i sur., 1994.). Zbog
nes-razmjera izmeu ulaska masnih kise-lina u jetru i izluivanja
triglicerida u obliku lipoproteina koliina triglicerida se u jetri
poveava neposredno poslije poroda, dok se koncentracije
triglic-erida i kolesterola u serumu naglo smanjuju (Mazur i sur.,
1988., Marcos i sur., 1990., Grummer, 1993.). U skladu s ovim
spoznajama su i rezultati naeg istraivanja, koji pokazuju porast
kon-centracije triglicerida u serumu tijekom gravidnosti i nagli
pad nakon poroda, odnosno u ranoj laktaciji to takoer navode Marcos
i sur. (1990.) i Turk i sur. (2005.). Poveana koncentracija
tri-glicerida pri kraju gravidnosti mogla bi biti rezultat smanjene
razgradnje i/ili prekomjerne sinteze triglicerida u tom razdoblju
(Marcos i sur., 1990.). Koncentracija kolesterola u serumu
istraenih mlijenih krava pokazivala je trend smanjivanja tijekom
gravidnosti te osobito u puerperiju, da bi u razdo-blju srednje
laktacije imala vrijednosti kao i na poetku gravidnosti.
Ponovno
je poveanje koncentracije kolesterola i triglicerida u kasnijoj
laktaciji takoer naeno u drugim istraivanjima (Pysera i Opalka,
2000.,Turk i sur., 2004., Turk i sur., 2008.a., 2008.b.).
Koncentracija ureje je bila znaajno vea u puerperi-ju, dok je u
razdoblju srednje laktacije ponovno bila znaajno manja nego u
puerperiju to su takoer utvrdili Loor i sur. (2005.). Razlog tome
je to se ti-jekom negativnog energetskog balansa mobiliziraju i
proteini skeletnog miija kao izvor aminokiselina potrebnih za
glukoneogenezu u jetri i metabolizam u mlijenoj lijezdi (Herdt,
2000.). Vea koncentracija ureje ima tetan utjecaj na plodnost
djelujui tetno na razvoj jajne stanice, proces oplodnje i razvoj
embri-ja (Jorritsma i sur., 2003., Rhoads i sur., 2006.). Vea
koncentracija kreatinina u serumu krava krajem gravidnosti u naem
istraivanju moe biti isto tako posljedica pojaanih katabolikih
pro-cesa miia krave budui da je kreat-inin produkt endogenog
metabolizma miia (Castillo i sur., 2005.). Mokrana kiselina je
prisutna u krvnoj plazmi kao vaan antioksidans (Miller i sur.,
1993.) i njezina je koncentracija u naem radu bila smanjena krajem
gravidnosti ukazujui na poveanu koliinu slo-bodnih radikala koji se
stvaraju tijekom procesa metabolike prilagodbe na manjak
energije.
Rezultati ovog rada su pokazali promjene koncentracija
metabolita u krvi kao odraz procesa metabolike prilagodbe u jetri,
masnom tkivu i miiima u prijelaznom razdoblju to moe imati tetne
posljedice na zdravlje i reprodukciju krava u kasni-joj laktaciji.
Stoga odreivanje poka-
-
MARIo CIKojEVI, STjEpKo ERMAK I RoMANA TuRK
VETERINARSKA STANICA 40 (5), 273-280, 2009.278
zatelja metabolikog statusa, njihova pravilna interpretacija i
razumijevanje patofiziolokih procesa ukljuenih u metaboliku
prilagodbu na nedostatak energije ima veliku vanost u praenju
zdravlja i reprodukcijske sposobnosti krava da bi se sprijeile
posljedice u kasnijoj laktaciji i ekonomski gubici u
proizvodnji.
SaetakManjak energije koji se esto javlja u
razdoblju kasne gravidnosti i rane lak-tacije moe dovesti do
metabolikih i reprodukcijskih poremeaja. Biolokim procesima
metabolike prilagodbe na manjak energije dolazi do interak-cije
metabolike energije u razliitim tkivima kao to su jetra, masno
tkivo i miii. Stoga je cilj ovog rada bio istraiti pokazatelje
metabolikog sta-tusa u serumu krava tijekom gravid-nosti i
laktacije tj. koncentraciju glu-koze, triglicerida, kolesterola,
ureje, kreatinina i mokrane kiseline s poseb-nim osvrtom na
metabolizam tijekom prijelaznog razdoblja izmeu kasne gravidnosti i
rane laktacije. Koncen-tracija glukoze bila je znaajno manja (P
-
Utjecaj gravidnosti i laktacije na promjene metabolikog statusa
u mlijenih krava
VETERINARSKA STANICA 40 (5), 273-280, 2009. 279
5. DRACKLEY, J. K. (1999): Biology of dairy cows during
transition period: the final frontier? J. Dairy Sci. 82,
2259-2273.
6. DRACKLEY, J. K., H. M. DANN, G. N. DOUGLAS, N. A. J.
GURETZKY, N. B. LITHERLAND, J. P. UNDERWOOD and J. J. LOOR (2005):
Physiological and pathological adaptation in dairy cows that may
increase susceptibility to periparturient diseases and disor-ders.
Ital. J. Anim. Sci. 4, 323-344.
7. GRUMMER, R. R. (1993): Etiology of lipid-related metabolic
disorders in periparurient dairy cows. J. Dairy Sci. 76,
3882-3896.
8. HERDT, T. H. (2000): Ruminant adap-tation to negative energy
balance: In-fluences on the etiology of ketosis and fatty liver.
Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract. 16, 215-231.
9. JORRITSMA, R., T. WENSING, T. A. M. KRUIP, P. L. A. M. VOS
and J. P. T. M. NOORDHUIZEN (2003): Metabolic changes in early
lactation and impaired reproductive performance in dairy cows. Vet.
Res. 34, 11-36.
10. LOOR, J. J., H. M. DANN, R. E. EVERTS, R. OLIVEIRA, C. A.
GREEN, N. A. J. GURETZKY, S. L. RODRIGUEZ-ZAS, H. A. LEWIN and J.
K. DRACKLEY (2005): Temporal gene expression pro-filing of liver
from periparturient dairy cows reveals complex adaptive mecha-nisms
in hepatic function. Physiol. Ge-nomics 23, 217-226.
11. MARCOS, E., A. MAZUR, P. CARDOT and Y. RAYSSIGUIER (1990):
The effect of pregnancy and lactation on serum lipid and
apolipoprotein B and A-I levels in dairy cows. J. Anim. Physiol.
Anim. Nutr. 64, 133-138.
12. MAZUR, A., E. GUEUX, Y. CHILL-IARD and Y. RAYSSIGUIER
(1988): Changes in plasma lipoproteins and liver fat content in
dairy cows during early lactation. J. Anim. Physiol. Anim. Nutr.
59, 233-237.
13. MILLER, J. K., E. BRZEZINSKA-SLE-BODZINSKA and F. C. MADSEN
(1993):
Oxidative stress, antioxidants and ani-mal function. Symposium:
Antioxidants, immune response and animal function. J. Dairy Sci.
76, 2812-2823.
14. PYSERA, B. and A. OPALKA (2000): The effect of gestation and
lactation of dairy cows on lipid and lipoprotein patterns and
composition in serum during winter and summer feeding. J. Anim.
Feed Sci. 9, 411-424.
15. REID, I. M. (1986): Diagnosis of fatty liver in dairy cows.
Isr. J. Vet. Med. 42, 399-403.
16. REID, I. M. and C. J. ROBERTS (1983): Subclinical fatty
liver in dairy cows current research and future prospects. Irish
Vet. J. 37, 104-110.
17. RHOADS, M. L., R. P. RHOADS, R. O. GILBERT, R. TOOLE and W.
R. BUT-LER (2006): Detrimental effects of high plasma urea nitrogen
levels on viability of embryos from lactating dairy cows. Anim.
Reprod. Sci. 91, 1-10.
18. RUKKWAMSUK, T., T. A. M. KRUIP and T. WENSING (1999a):
Relation-ship between overfeeding and over-conditioning in the
problems of high producing dairy cows during the post-parturient
period. Vet. Quart. 21, 71-77.
19. RUKKWAMSUK, T., T. WENSING and T. A. M. KRUIP (1999b):
Relationship between triaylglycerol concentracion in the liver and
first ovulation in post-partum dairy cows. Theriogenology 51,
1133-1142.
20. TURK, R., D. JURETI, D. GERE, N. TURK, B. REKI, V.
SIMEON-RU-DOLF and A. SVETINA (2004): Serum paraoxonase activity
and lipid param-eters in the early postpartum period of dairy cows.
Res. Vet. Sci. 76, 57-61.
21. TURK, R., D. JURETI, D. GERE, N. TURK, B. REKI, V.
SIMEON-RU-DOLF, M. ROBI and A. SVETINA (2005): Serum paraoxonase
activity in dairy cows during pregnancy. Res. Vet. Sci. 79,
15-18.
22. TURK, R., D. JURETI, D. GERE, G. BAI, M. MILEEVI, Z.
FLEGAR-
-
MARIo CIKojEVI, STjEpKo ERMAK I RoMANA TuRK
VETERINARSKA STANICA 40 (5), 273-280, 2009.280
METRI, N. TURK and A. SVETINA (2008a): Bovine
platelet-activating fac-tor acetylhydrolase (PAF-AH) activity
related to fertility. Anim. Reprod. Sci. 105, 344-353.
23. TURK, R., D. JURETI, D. GERE, A. SVETINA, N. TURK and Z.
FLEGAR-METRI (2008b): Influence of oxida-tive stress and metabolic
adaptation on
PON1 activity and MDA level in tran-sition dairy cows. Anim.
Reprod. Sci. 108, 98-106.
24. VAZQUEZ-AON, M., S. BARTICS, M. LUCK, R. R. GRUMMER and J.
PINHEIRO (1994): Peripartum liver triglyceride and plasma
metabolites in dairy cows. J. Dairy Sci. 77, 1521-1528.
Influence of Pregnancy and Lactation on Metabolic Status in
Dairy Cows
Mario CIKOJEVI and Stjepko ERMAK, final year students; Romana
TURK, Ph.D., Scientific Associate, Faculty of Veterinary Medicine,
Zagreb
Energy deficit that often occurs in late pregnancy and early
lactation could lead to metabolic and reproduc-tive disorders.
Biological processes of metabolic adaptation to negative en-ergy
balance involve interactions of metabolic fuels taking place in
various tissues like liver, adipose tissue and skeletal muscles.
The objective of this study was to investigate the metabolic status
of cows during pregnancy and lactation, i. e. the serum
concentrations of glucose, triglyceride, cholesterol, urea,
creatinine and uric acid. A sig-nificantly lower glucose
concentration (P
-
VETERINARSKA STANICA 40 (5), 2009.
PREGLEDNI LANAK
281
Iskoriteni pivski kvasac - sirovina za izdvajanje -gluka-na
primjenjivog u biotehnologiji i biomediciniVlatka Petravi-Tominac,
Vesna Zechner-Krpan, S. Sreec, B. antek,D. poljari, H. Valpoti,
Maja Popovi i I. Valpoti
Dr. sc. Vlatka PETRAVI-TOMINAC, dipl. in. biotehnol., via
asistentica., dr. sc. Vesna ZECH-NER-KRPAN, dipl. in. biotehnol.,
izv. prof., dr. sc. Boidar ANTEK, dipl. in. biotehnol., red. prof.,
Prehrambeno-biotehnoloki fakultet Zagreb; dr. sc Sinia SREEC, dipl.
in., prof. visoke kole, Visoko gospodarsko uilite u Krievcima,
Daniel POLJARI, dr. vet. med, asistent, dr. sc. Hrvoje VALPOTI, dr.
vet. med, vii asistent, dr. sc. Maja POPOVI, dr. vet. med., izv.
prof., dr. sc. Ivica VALPOTI, dipl. in. biol., red. prof.,
Veterinarski fakultet Zagreb
UvodPredmet su ovoga rada -glukani,
a njihove se bioloke aktivnosti meusobno razlikuju ovisno o
ke-mijskoj strukturi, izvoru iz kojeg su izolirani i o
primijenjenoj metodi izo-lacije. -glukani su polimeri glukoze
(-glukopiranoze) u kojima su glu-kozne jedinice povezane
glikozidnim vezama izmeu hemiacetalnog kisika na C-1 atomu jednog
monosaharidnog ostatka i jedne od etiriju hidroksilnih skupina
vezanih na C-2, C-3, C-4 ili C-6 atomu drugog monosaharidnog
ostatka (Stone i Clarke, 1992.). Ovi spojevi mogu biti a i
konfiguracije. Primjeri razliitih -glukana, izoliranih iz razliitih
izvora (bakterija, kvasaca,
algi, gljiva i viih biljaka), prikazani su u tablici 1.
Pored primjena razliitih -glukana u medicini i farmaciji, mogua
je i nji-hova primjena u prehrambenoj (Wylie-Rosett, 2002.,
Thammakiti i sur., 2004.) i kozmetikoj industriji (Pillai i sur.,
2005.). Mogu se koristiti i u veterinar-skoj medicini i u
proizvodnji krmiva (Wheatcroft i sur., 2002.) to je i pred-met
zanimanja ovog lanka.
Najee spominjano svojstvo -glukana je imunostimulacija. Broj
razliitih -glukana je veliki skoro kao i broj izvora koritenih za
njihovu izo-laciju, a unato brojnim istraivanjima nemogue je rei da
je samo jedan
-
VLATKA pETRAVI-ToMINAC, VESNA ZEChNER-KRpAN, S. SREEC, B. ANTEK,
d. poLjARI, h. VALpoTI, MAjA popoVI I I. VALpoTI
VETERINARSKA STANICA 40 (5), 281-295, 2009.282
odreeni glukan optimalni imunomod-ulator (Vetvicka, 2001.).
Prema nekim autorima, najaktivniji su razgranati -1,3-D-glukani,
koji se ponekad na-zivaju (13),(16)--D-glukani, a u literaturi se
zbog jednostavnosti esto navode samo kao (13)--glukani. Svi oni
imaju zajedniku strukturu, a to je glavni lanac, koji se sastoji od
(13)-povezanih -D-glukopiranozil jedinica, uzdu kojega su nasumce
smjetene -D-glukopiranozil jedinice vezane 16-vezama. Zbog toga
imaju strukturu nalik na ealj, ali strukture i konformacije ovih
polimera variraju, kao i njihove aktivnosti (Bohn i BeMi-ller,
1995.).
Mehanizam djelovanja -1,3-glu-kana jo uvijek nije potpuno
rasvijetljen i postoje razliita miljenja o struk-turi molekule
potrebnoj za postizanje fiziolokog uinka (Tokunaka i sur., 2000.).
Za bioloku aktivnost ove sku-pine spojeva vani su razliiti
fizikalno-kemijski imbenici kao to su primarna struktura, molna
masa, razgranatost, konformacija, naboj polimera, toplji-vost,
dimenzije estica netopljivih -glukana (Tzianabos, 2000., Vetvicka,
2001., Hromdkov i sur., 2003.). Jo uvijek nije dovoljno razjanjeno
koja je struktura potrebna za bioloku ak-tivnost -glukana. Neki
autori navode da je trostruka uzvojnica bioloki naj-aktivnija
konformacija (Bohn i BeMi-ller, 1995., Ha i sur., 2002.), dok drugi
smatraju da struktura uzvojnice nema nikakvog utjecaja na aktivnost
(Kulicke i sur., 1997.).
U ovom radu posebna je panja posveena primjeni iskoritenog
piv-skog kvasca kao sirovine za proizvod-
nju -glukana i njegovih derivata. U veini hrvatskih pivovara
najvei dio iskoritenog pivskog kvasca, zaostalog nakon proizvodnje
piva, isputa se u ot-padne vode to dovodi do oneienja prirodnih
vodotokova organskim ma-terijalom. Primjena je pivskog kvasca kao
krmiva na granici rentabilnosti. Is-tovremeno mnogi sastojci
njegove bio-mase, meu kojima je i -glukan, mogu postii viu cijenu
od samog kvasca. Osim izravne primjene u raznim podrujima,
izolirani se -glukan moe preraditi i u druge proizvode koji imaju
veliku komercijalnu vrijednost.
Bioloka aktivnost razliitih -glukanaObjavljen je niz radova o
-glu-
kanima i njihovim derivatima koji se spominju kao komercijalno i
kliniki zanimljivi pripravci s brojnim mogunostima medicinske
primjene (Gardiner, 2000., Gardiner i Carter, 2000., Tzianabos i
sur., 2000., Vetvicka, 2001., Zekovi i sur., 2005.). Bioloke
aktivnosti -glukana su ukratko prika-zane u tablici 2.
Prema procjeni Svjetske zdravst-vene organizacije (engl. World
Health Organisation, WHO) zbog oekivanog produljenja ivotnog
vijeka, ali i poveanja zagaenja okolia, tijekom sljedea dva
desetljea oekuju se epi-demijski razmjeri porasta uestalosti
malignih kao i drugih civilizacijskih bolesti (Kath i Kulicke,
1999.). injenica je da brojni stresovi, kao i nezdrava prehrana
slabe imunosni sustav to pogoduje nastanku bolesti. Stoga se sve
vie istrauju djelatne tvari koje mogu modificirati tjelesne
obrambene mehanizme, a takve tvari farmakoloki
-
Iskoriteni pivski kvasac - sirovina za izdvajanje -glukana
primjenjivog u biotehnologiji i biomedicini
VETERINARSKA STANICA 40 (5), 281-295, 2009. 283
su klasificirane kao imunomodulatori ili modifikatori biolokog
odgovora (engl. biological response modifiers, BRMs). U ovu skupinu
spojeva spadaju i -glukani (Tokunaka i sur., 2000., Tzianabos i
sur., 2000.).
Mehanizam djelovanja -(13)-glukana je poveanje
imunokompe-tencije domaina putem sistemske aktivacije imunolokog
sustava ime se pojaavaju nespecifini obrambeni mehanizmi domaina.
Time se ujedno postie alternativni uinak neklinikoj uporabi
antibiotika. Ovo je osobito vano obzirom na porast broja bak-terija
rezistentnih na odreene anti-biotike (Walsh i Fanning, 2008.,
Bar-ton, 2000.) te na rezidualne antibiotike prisutne u hrani
(Cerniglia i Kotarski, 1999.). Budui da je u Europskoj Uniji od
sijenja 2006. godine zabranjeno koritenje antibiotskih promotora
ras-ta u uzgoju ivotinja postoji potreba za adekvatnom zamjenom
koja e osigurati visoku proizvodnost i dobro zdravstveno
stanje.
Mnoga su istraivanja pokazala postojanje jake imunostimulacijske
aktivnosti -glukana njegovom prim-jenom kod velikog broja razliitih
orga-nizama, ukljuujui insekte (Chen i sur., 1999., Wilson i sur.,
1999., Ma i Kanost, 2000.), gujavice (Vetvicka, 2001.), ribe (Cook
i sur., 2003.), rakove (Suphan-tharika i sur., 2003.), pilie,
mieve, takore, kunie, zamorie, ovce, svinje i goveda (Vetvicka,
2001.), a i ovjeka (Keller, 2000., Gardiner, 2000., Gardiner i
Carter, 2000., Vetvicka, 2001., Brown i Gordon, 2003.). Veina
eksperimental-nih podataka dobivena je istraivanjem razliitih
ivotinjskih modela, dok
se o imunostimulaciji -glukanom u ovjeka zna relativno malo
(Vetvicka, 2001.).
Sposobnost reguliranja imuno lo-kog sustava smatra se najvanijom
biolokom aktivnou -glukana, bu-dui da je s ovom aktivnou usko
povezana veina njegovih uinaka (Gardiner, 2000., Gardiner i Carter,
2000.). Kao objanjenje imunoregulacije -glukanom najee se spominje
nje-gov utjecaj na makrofage. Makrofagi zapoinju i reguliraju imu
noloke pro-cese, ili izravno fagocitozom ili neiz-ravno tako to
prikazuju epitope an-tigena na vlastitoj povrini kako bi se mogli
vezati T i B-limfociti koji potiu efektorsku reakciju, ovisno o
vrsti pri-kazanog antigena (Keller, 2000.).
U literaturi je opisano vie naina primjene -glukana. Pripravci
se glu-kana u veterinarskoj i humanoj upora-bi mogu primijeniti
potkono, oralno, intranazalno ili parenteralno (Wheat-croft i sur.,
2002.). Oralna primjena je svakako zanimljiva zbog svoje
praktinosti i mogunosti tretmana u mnotvenoj proizvodnji. Pri
oralnoj primjeni -1,3-glukan ne podlijee promjenama u elucu jer je
otporan na kiselinu, a osim toga u crijevima nema enzima za njegovu
razgradnju u monosaharide ili disaharide koji bi se mogli
apsorbirati kroz crijevne sti-jenke. S druge strane, makrofagi koji
se nalaze u crijevnoj sluznici imaju odgovarajue receptore i mogu
vezati estice -1,3-glukana, nakon ega sli-jedi aktivacija ovih
stanica. Kasnije makrofagi migriraju do Payerovih ploa, izluuju
citokine i tako induci-raju imunosnu reakciju.
-
VLATKA pETRAVI-ToMINAC, VESNA ZEChNER-KRpAN, S. SREEC, B. ANTEK,
d. poLjARI, h. VALpoTI, MAjA popoVI I I. VALpoTI
VETERINARSKA STANICA 40 (5), 281-295, 2009.284
Primjenom -1,3-glukana znatno se poveava proliferacija
makrofaga, fagocitoza i sekrecija protupalnih ci-tokina i to
podjednako u ivotinja i ovjeka. Makrofagi osoba koje su primile
-1,3-glukan pokazali su bolju citolitiku aktivnost prema stanicama
tumora u odnosu na osobe koje nisu tretirane (Keller, 2000.).
Zahvaljujui stimulaciji imunosnog sustava, -1,3-glukan ima
antiinfekcij-ski uinak i pokazuje antimikrobno djelovanje prema
razliitim patogenim mikroorganizmima (bakterijama, kvas-cima i
virusima) kao to je prikazano u tablici 3. Osim preventivne
funkcije, -glukani mogu usporiti tijek ve ranije uznapredovalih
infekcija te smanjiti rizik od postoperativnih infekcija (Kim i
sur., 2006.).
Postoji sinergistiko djelovanje -glu-kana s antibioticima te je
njegovom primjenom mogue smanjiti potrebnu koliinu konvencionalnih
antibio-tika. U kombinaciji s uobiajenim an-tibioticima -glukan se
moe koris-titi u lijeenju niza bolesti (Vetvicka i sur., 2002.).
Takoer je dokazano sinergistiko djelovanje -glukana s antifungalnim
lijekovima (Ber, 1997., Gardiner, 2000.).
-1,3-glukan se moe koristiti i kao adjuvant u kombinaciji s
antiinfek-tivnim i antineoplastinim agensima, radioterapijom,
pripravcima koji se primjenjuju povrinski i raznim nutri-jentima
(Ber, 1997.). Bioloku aktivnost imaju ne samo topljivi, ve i
netopljivi -glukani (Vetvicka, 2001.). Netopljivi -glukani mogu
posluiti kao sirovine za razliite postupke derivatizacije, ime se
dobivaju topljivi derivati po-
godniji za neke oblike primjene (Wil-liams i sur., 1992.). Mogua
je i imu-nostimulacija primjenom netopljivih pripravaka -glukana
(Hunter, 2002.), pri emu je tijekom proizvodnje vano postii male
dimenzije estica prip-ravka, koje odgovaraju dimenzijama
odgovarajuih receptora. Aglomeri-ranje estica netopljivog -glukana
takoer moe nepovoljno utjecati na njegovu aktivnost (Hunter,
2002.). Sto-ga je pri definiranju fizikalno-kemijskih svojstava
pojedinih netopljivih prip-ravaka potrebno istraiti i raspodjelu
estica po veliini. Dimenzije i mikros-kopska morfologija estica
-glukana ovise o tehnolokim postupcima primi-jenjenim tijekom
izolacije te odabranoj metodi i tehnolokim parametrima suenja i
usitnjavanja (Hunter, 2002., Hromdkov i sur., 2003.).
Primjena u veterinarskoj medicini i proizvodnji krmiva
S obzirom da -glukan djeluje na brojne vrste (Vetvicka, 2001.)
vano podruje primjene stoga moe biti i na tritu dodataka krmivima i
veterinar-skih lijekova koji se rabe za gospodar-ski znaajne vrste
domaih ivotinja.
Prilikom intenzivnog uzgoja pe-radi, goveda, riba i rakova
uporabom -glukana kao aditiva u krmivima sma njuje se pojava
infekcija, ime se poboljava rast i smanjuje potreba za do-datkom
antibiotika (Keller, 2000., Hayen i Pollmann, 2001., Wheatcroft i
sur., 2002.).
Istraivanja tvari koje nespecifino djeluju na imunoreakcije
postaju sve
-
Iskoriteni pivski kvasac - sirovina za izdvajanje -glukana
primjenjivog u biotehnologiji i biomedicini
VETERINARSKA STANICA 40 (5), 281-295, 2009. 285
znaajnija i sa stajalita veterinarske med-icine. Sve vie se
komercijalno vanih ivotinja uzgaja u stresnim uvjetima i poticanje
njihovog imuniteta komercijal-nim imunostimulansima mo e izrazito
smanjiti smrtnost induciranu bolestima vezanim uz stres.
U ivotinja, glukani su testirani ne samo kao specifini
stimulansi, ve i kao dodatak trenutno koritenim cje-pivima
(Vetvicka, 2001.). Nikl i All-bright (1993.) su opisali mogunost
stimulacije imunolokog sustava riba iz porodice Salmonidae i
pojaavanja
Slika 1. Kemijska struktura -glukana u kvascu Saccharomyces
cerevisiae (Izvor: Kath i Kulicke, 1999.)
Slika 2. Sastav i struktura stanine stijenke kvasca
Saccharomyces cerevisiae (Izvor: Osumi, 1998.)
-
VLATKA pETRAVI-ToMINAC, VESNA ZEChNER-KRpAN, S. SREEC, B. ANTEK,
d. poLjARI, h. VALpoTI, MAjA popoVI I I. VALpoTI
VETERINARSKA STANICA 40 (5), 281-295, 2009.286
djelovanja cjepiva -glukanima izoli-ranim iz viih gljiva
(skleroglukanom i izofilanom) koji su sadravali -1,3-vezan glavni
lanac i -1,6-vezanu glu-kozu. Ova dva spomenuta topljiva glukana
izolirani su iz gljive roda Scle-rotium, odnosno gljive
Schyzophyllum commune (hrv. obina dvolisnica) po kojima su i dobili
trivijalne nazive.
Imunoloki uinci izofilana omo-guuju zatitu od bakterijskih
infekcija u ivotinja, streptokoknih infekcija u riba i Sendai
virusne infekcije u mieva (Bohn i BeMiller, 1995.).
Opisana je primjena -glukana u kombinaciji s vitaminima, u cilju
poboljanja otpornosti vodenih ivo-tinja (riba, rakova i
beskraljenjaka) te toplovodnih i hladnovodnih dekora-tivnih riba
(Krzinger, 2001.).
Cook i sur. (2003.) su opisali pri-mjenu komercijalnog
imunostimulacij-skog pripravka EcoActivaTM, izoliranog iz kvasca
Saccharomyces cerevisiae. Pri-pravak je sadravao glukan i manan, a
prosjena veliina estica bila je manja od 1 m. Dodatkom ovog
pripravka peletima hrane koritene u prehrani
Stanine stijenke kvasca (oko 20% s.tv.)
ALKALNA IZOLACIJA
Pranje vodom
KISELINSKA IZOLACIJA
Pranje vodom
UKLANJANJEMANOPROTEINA
Pranje vodom
Slika 3. Shema postupaka izolacije -glukana iz iskoritenog
pivskog kvasca
VLANI PREPARAT A
VLANI PREPARAT AK
VLANI PREPARAT AKM
-
Iskoriteni pivski kvasac - sirovina za izdvajanje -glukana
primjenjivog u biotehnologiji i biomedicini
VETERINARSKA STANICA 40 (5), 281-295, 2009. 287
riba vrste Pagrus auratus postignut je utjecaj na parametre
nespecifinog imuniteta i brzinu rasta, to sugerira prednost
rutinskog dodavanja ovog pripravka u riblju hranu.
Hayen i Pollmann (2001.) navode mogunost oralne primjene
-glukana, izoliranog iz kvasca, kao komponen-te krmiva u svrhu
poveanja rasta i-votinja.
Opisano je protektivno i anti-in-fektivno djelovanje kvaevog
neto-pljivog -glukana, istraeno in vivo u mievima koji su zaraeni
antraksom (Vetvicka i sur., 2002.). Oralnom prim-jenom doza od 2 i
20 mg/kg, bez upor-abe drugih lijekova, postignuto je 100%
preivljavanje tijekom 10 dana, dok je u kontrolnoj skupini smrtnost
bila 50%.
Izolacija -glukana iz bio-mase iskoritenog pivskog kvasca
Stanine stijenke kvasca Saccharomy-ces cerevisiae jedan su od
najeih iz-vora (13),(16)--D-glukana. Cije la stanina stijenka
kvasca Saccharomyces cerevisiae sadri 85-90% polisaharida i 10-15%
bjelanevina (Hong i sur., 1994., Nguyen i sur., 1998.).
Polisaharidni dio stanine stijenke ine manan koji je topljiv u
vodi, alkalno-topljivi glu-kan, alkalno-netopljivi glukan i male
koliine hitina (Klis, 1997.). Glukanska komponenta stanine stijenke
kvasca esto se naziva samo glukan ili kvaev glukan (engl. yeast
glucan). Kemijska struktura glukana u kvascu Saccharo-myces
cerevisiae prikazana je slikom 1, dok slika 2 prikazuje sastav i
strukturu
stanine stijenke ovog kvasca (Osumi, 1998.).
Kada se govori o izolaciji -glukana iz kvasaca, kao sirovina se
prvenst-veno spominje pekarski kvasac Sac-charomyces cerevisiae
(Bohn i BeMiller, 1995., andula i sur., 1995., Ber, 1997., Ohno i
sur., 1999., andula i sur., 1999., Ueno, 2000., Hunter i sur.,
2002., Jordan i sur., 2002., Aguilar-Uscanga i Fran-cois, 2003.,
Hromdkov i sur., 2003.), meutim -glukan se moe uspjeno izolirati i
iz pivskog kvasca (Thanardkit i sur., 2002., Suphantharika i sur.,
2003., Thammakiti i sur., 2004.; Liu i sur., 2008.). b-glukan
izoliran iz staninih stijenki kvasca moe nai iroku prim-jenu u
razliitim podrujima. Izolaci-jom b-glukana iz sekundarnog
proiz-voda, kao to je otpadni pivski kvasac, -glukan postaje
visokovrijedna sirovi-na za mnoge proizvode na podruju medicine,
farmacije, kozmetike, vete-rine i prehrambene industrije.
Postupci izolacije -glukana iz piv-skog kvasca koji su opisani u
dostupnoj literaturi namijenjeni su uglavnom proizvodnji preparata
predvienih za primjenu u razliitim namirnicama (Thammakiti i sur.,
2004., Worrasin-chai i sur., 2006., Santipanichwong i
Suphantharika, 2007., Liu i sur., 2008.). Meutim, pripravci se
dobiveni iz piv-skog kvasca mogu primijeniti i za
imu-nostimulaciju, to je dokazano in vitro i in vivo u rakova
(Wheatcroft i sur., 2002., Thanardkit i sur., 2002., Suphan-tharika
i sur., 2003.) i riba (Wheatcroft i sur., 2002.).
Openito, pivovare proizvode velike koliine pivskog kvasca kao
sekundar-ni proizvod koji se moe koristiti kao
-
VLATKA pETRAVI-ToMINAC, VESNA ZEChNER-KRpAN, S. SREEC, B. ANTEK,
d. poLjARI, h. VALpoTI, MAjA popoVI I I. VALpoTI
VETERINARSKA STANICA 40 (5), 281-295, 2009.288
Tablica 1. Primjeri b-glukana razliitih struktura, izoliranih iz
razliitih izvora (Izvor: Stone i Clarke, 2002.)
VRSTA GLUKANA(OPIS STRUKTURE)
PRIMJERI Prirodni izvor trivijalni naziv -glukana
(13)-b-glukani (linearni,homogeni)
Bakterija Alcaligenes faecalis kurdlan Alga Euglena gracilis
paramilon Poria cocos pahiman Vitis vinifera (vinova loza) kaloza
Ameriki ari Larix laricina laricinan
(13), (16)-b-glukani (linearni s (16)-vezanim grananjima
Alga Laminaria sp. laminarin Raina snijet Claviceps purpurea
glukan stijenke Bijela plijesan Sclerotinia sclerotiorum glukan
stijenke
(13), (16)-b-glukani (linearni s (16)-vezanim -glukozil ili
-gentobiozil grananjima)
Smea alga Eisenia bicyclis laminarin Gljiva Lentinula edodes
glukan stijenke
(13), (16)-b-glukani (tzv. razgranata sruktura)
Kvasac Saccharomyces cerevisiae glukanstijenke Gljiva
Schizophyllum commune glukan stijenke
(13),(14)-b-glukani (linearni) -glukani itarica Islandski liaj
Cetraria islandica lihenin
(13),(14)-b-glukani (linearni sa (14)-b-vezanim -glukozil
grananjima)
Gljiva bukovaa Pleurotus ostreatus glukan stijenke
Tablica 2. Bioloka aktivnost -glukana (Izvor: Gardiner i Carter,
2000.)
Aktivnost Opis
Regulacija imunosnog sustava
modulira otputanje citokina iji je cilj borba protiv infekcije
pomae pri zacjeljivanju rana modulira funkcioniranje imunosnog
sustava
Prototumorsko djelovanje
stimulira oslobaanje protutijela, koja oznaavaju maligne stanice
raka kako bi one bile prepoznate i unitene inhibira rast i irenje
tumora
Djelovanje na ope zdravlje sniava razinu kolesterola u krvi
poboljava iskoritavanje glukoze
-
Iskoriteni pivski kvasac - sirovina za izdvajanje -glukana
primjenjivog u biotehnologiji i biomedicini
VETERINARSKA STANICA 40 (5), 281-295, 2009. 289
Tablica 3. Aktivnost -glukana prema nekim patogenim
mikroorganizmima
Skupina patogenih mikroorga-nizama
Mikroorganizam Referenca
Bakterije
Staphylococcus aureus Di Luzio i sur. (1979.), Liang i sur.
(1998.), Gardiner (2000.), Chen i Seviour (2007.)
Escherichia coli Gardiner (2000.)
Bacillus anthracis Vetvicka i sur. (2002.), Chen i Seviour
(2007.)
Streptococcus Browder i sur. (1983.), Whittington i sur.
(2005.), Chen i Seviour (2007.)
Mycobacterium tuberculosis Hetland i sur. (1998.), Chen i
Seviour (2007.)
Kvasci Candida albicans Ber (1997.), Chen i Seviour
(2007.)Paracoccidioides brasiliensis Gardiner (2000.)
Virusi
Virus hepatitisa Vetvicka (2001.), Chen i Seviour (2007.)
Herpes simplex (HSV) Ber (1997.), Vetvicka i sur. (2002.), Zhang
i sur. (2004.)
Virus humane imunodefici-jencije (HIV)
Koizumi i sur. (1993.); Ber (1997.), Chen i Seviour (2007.)
Humani papilomavirus (HPV) Vetvicka (2001.)Virus gripe Vetvicka
(2001.)Citomegalovirus Vetvicka (2001.)
Tablica 4. Iskoritenja triju postupaka izolacije b-glukana
razvijenih u naem laboratoriju i mase pri-pravaka -glukana koje je
mogue izolirati iz procijenjene godinje proizvedene mase
iskoritenog pivskog kvasca
Postupci izolacije Iskoritenja (%)* Mogua godinja proizvodnja
-glukana iz iskoritenog pivskog kvascau Republici Hrvatskoj
(t)**
Alkalni 13,64 477,4Alkalno-kiselinski 11,84 414,4
Alkalno-kiselinski s uklanjanjem mano-proteina
8,08 282,8
* Izraeno kao postotak izraunat na temelju mase suhe tvari u
izoliranim vlanim pripravcima -glukana i mase suhe tvari
iskoritenog pivskog kvasca
** Izraeno kao masa suhe tvari pripravka -glukana koja se moe
izolirati iz procijenjene godinje proizvodnje iskoritenog pivskog
kvasca (3500 t suhe tvari kvasca) u Republici Hrvatskoj
-
VLATKA pETRAVI-ToMINAC, VESNA ZEChNER-KRpAN, S. SREEC, B. ANTEK,
d. poLjARI, h. VALpoTI, MAjA popoVI I I. VALpoTI
VETERINARSKA STANICA 40 (5), 281-295, 2009.290
dodatak stonoj hrani (Mari i tefani., 1987., Hayen i Pollman,
1995., Wheat-croft i sur., 2002., Cook i sur., 2003.), suha aktivna
biomasa ili sirovina za proizvodnju kvaevog ekstrakta (Sucher i
sur., 1975.). Veina se kvasca prodaje nakon toplinske inaktivacije
ili se smatra industrijskim otpadom.
Primjena je pivskog kvasca kao krmiva na granici rentabilnosti.
Istovre-meno, mnogi sastojci iskoritene bio-mase, a meu njima i
-glukan, mogu postii viu cijenu od samog kvasca. Osim izravne
primjene u raznim podrujima, izolirani se -glukan moe dalje
preraditi i u druge proizvode puno vee komercijalne
vrijednosti.
Kao pokuaj rjeavanja proble-ma gospodarenja otpadnim pivs-kim
kvascem, istodobno poveanjem profitabilnosti procesa proizvodnje
piva, u sklopu tehnologijskog pro-jekta provedenoga na Zavodu za
bio-kemijsko inenjerstvo Prehrambeno-biotehnolokog fakulteta
Sveuilita u Zagrebu, razvijeni su razliiti postupci izolacije
-glukana iz iskoritenog piv-skog kvasca
(http://tprojekti.mzos.hr/prikaz_det.asp?offset=120&ID=3033).
Primijenjena su tri postupka izolacije netopljivog -glukana:
alkalni, alkalno-kiselinski i alkalno-kiselinski postupak s
uklanjanjem manoproteina.
Iskoritenja spomenutih postupaka prikazana su u tablici 4. Zbog
postupka zatite intelektualnog vlasnitva au-torima nije doputen
detaljni opis triju razliitih procesa izolacije te je predoena samo
pojednostavljena she-ma primijenjenih postupaka (slika 3).
Izolirani su pripravci osueni razliitim metodama i optimirani
su
parametri suenja u cilju proizvodnje estica s dimenzijama
odgovarajuim za postizanje optimalne bioloke ak-tivnosti. Testovima
provedenim in vitro dokazana je stimulacija proiz-vodnje TNF- koja
je posti gnuta izoli-ranim preparatima nakon liofilizacije i suenja
rasprivanjem (Petravi Tomi-nac, 2008.).
Uz vanost potvrivanja bioloke aktivnosti dobivenih preparata,
pri razmatranju procesa izolacije potrebno je osvrnuti se na
ekonomsku (tablica 4) i ekoloku opravdanost proizvod-nje b-glukana
iz biomase iskoritenog pivskog kvasca. Prosjena proizvodnja piva u
Hrvatskoj iznosi oko 3,5 milijuna hL, stoga koliina iskoritenog
pivskog kvasca koja se godinje proizvede od-govara oko 3500 tona
suhe tvari. Pivo-vare koje su locirane blie tvrtkama za proizvodnju
stone hrane i des-tilerijama zbog transportnih trokova preputaju
proizvedeni pivski kva-sac tim tvrtkama kao sporedni proiz-vod.
Obzirom na navedenu procjenu godinje proizvodnje pivskog kvasca,
primjenom spomenutih postupaka izo-lacije mogla bi se godinje
proizvesti masa -glukana koja bi odgovarala 282,8 477,7 tona suhe
tvari, ovisno o primi-jenjenom postupku izolacije i stupnju
proiavanja -glukana postignutom u pojedinim procesima. Vano je
na-glasiti da -glukan moe postii veu komercijalnu vrijednost nego
sam piv-ski kvasac. Zbog viestruke mogue pri mjene b-glukana,
visoke cijene koju moe postii kao i njegove deficitar-nosti na
svjetskom tritu, u prvom redu uzrokovane velikom potranjom, oito da
bi se proizvodnjom b-glukana
-
Iskoriteni pivski kvasac - sirovina za izdvajanje -glukana
primjenjivog u biotehnologiji i biomedicini
VETERINARSKA STANICA 40 (5), 281-295, 2009. 291
iz iskoritenog pivskog kvasca mogle dodatno zaraditi ogromne
svote novca. Ilustracije radi, dovoljno je spomenuti da se
pakiranje koje sadri ukupno 12 g kvaevog -glukana namijenjenog za
ljudsku uporabu prodaje po cijeni 29 EUR.
ZakljuakIz navedenih podataka moe se
zakljuiti da se izolacijom -glukana iz iskoritenog pivskog
kvasca moe maksimalizirati ukupna profitabil-nost procesa
proizvodnje piva. Stoga koritenje pivskog kvasca kao sirovine za
proizvodnju -glukana predstavlja tehnoloki i ekonomski prihvatljiv
iz-bor za pivovare.
Saetak-glukani se u prirodi mogu nai u
razliitim prirodnim izvorima i velik broj istraivanja pokazao je
njihove jake imunostimulacijske uinke u razliitim organizmima.
-glukani mogu nai primjenu u medicini i farmaciji, pre-hrambenoj,
kozmetikoj i kemijskoj in-dustriji, kao i u veterinarskoj medicini
i u proizvodnji krmiva. Iskoriteni se pivski kvasac, dobiven pri
proizvodnji piva kao sekundarni proizvod, moe koristiti kao
sirovina za izdvajanje -glukana. Unato injenici da se ve-like
koliine pivskog kvasca koriste kao krmivo, odreene se koliine jo
uvijek tretiraju kao tekui otpad. -glukan je jedna od komponenata
koja moe postii veu komercijalnu vrijednost nego sam pivski kvasac
te tako moe
maksimalizirati ukupnu profitabil-nost procesa proizvodnje piva.
Stoga proizvodnja -glukana, kao i drugih visokovrijednih proizvoda
baziranih na -glukanu, iz iskoritenog pivskog kvasca predstavlja
isplativ tehnoloki i ekonomski izbor za pivovare.
Ovaj pregledni rad je proizaao iz vla-stitih istraivanja u
okviru tehnologij-skog projekta TP-01/0058-12 Postupak izolacije
-glukana iz kvaeve biomase MZO RH provedenog na Zavodu za
biokemijsko inenjerstvo Prehrambeno-biotehnolokog fakulteta
Sveuilita u Za-grebu
(http://tprojekti.mzos.hr/prikaz_det.asp?offset=120&ID=3033), a
rezultati ovih istraivanja bit e primijenjeni u podruju biomedicine
u okviru znanstvenog projekta Zavoda za biologiju Veterinarskog
fakulteta Sveuilita u Zagrebu: Kolidiareja i kolien-terotoksemija
prasadi: mukozna imunost i imunomodulacija (053-0532265-2255).
Literatura1. AGUILAR-USCANGA, B. and J. M.
FRANCOIS (2003): A study of the yeast cell wall composition and
structure in response to growth conditions and mode of cultivation.
Lett. Appl. Micro-biol. 37, 268-274.
2. BARTON, M. D. (2000): Antibiotic use in animal feed and its
impact on human health. Nutrition Research Reviews. 13,
279-299.
3. BER, L. (1997): Yeast-derived -1,3-glucan: an adjuvant
concept. Am. J. Nat. Med. 4, 21-24.
4. BOHN, J. A., and J. N. BEMILLER (1995): (13)--D-glucans as
biological response modifiers - a review of struc-ture-functional
activity relationships. Carbohyd. Polym. 28, 3-14.
5. BROWDER, W., J. RAKINIC, R. MC-NAMEE, E. JONES, D. WILLIAMS
and N. DI LUZIO (1983): Protective effect of nonspecific
immunostimulation in
-
VLATKA pETRAVI-ToMINAC, VESNA ZEChNER-KRpAN, S. SREEC, B. ANTEK,
d. poLjARI, h. VALpoTI, MAjA popoVI I I. VALpoTI
VETERINARSKA STANICA 40 (5), 281-295, 2009.292
postsplenectomy sepsis. J. Surg. Res. 35, 474-479.
6. BROWN, G. D. and S. GORDON (2003): Fungal -glucans and
mamma-lian immunity. Immunity 19, 311-315.
7. CERNIGLIA, C. E. and S. KOTARSKI (1999): Evaluation of
Veterinary Drug Residues in Food for Their Potential to Affect
Human Intestinal Microflora. Regulatory Toxicology and
Pharmacol-ogy 29, 238-261.
8. CHEN, C., A. F. ROWLEY, R. P. NEW-TON and N. A. RATCLIFFE
(1999): Identification, purification and prop-erties of a
-1,3-glucan-specific lectin from the serum of the cockroach,
Bla-berus discoidalis which is implicated in immune defence
reactions. Comp. Bio-chem. Phys. B 122, 309319.
9. CHEN, J. and R. SEVIOUR (2007): Re-view - Medicinal
importance of fungal -(1-3), (1-6)-glucans. Mycol. Res. 111,
635-652.
10. COOK, M. T., P. J. HAYBALL, W. HUTCHINSON, B. F. NOWAK and
J. D. HAYBALL (2003): Administration of a commercial
immunostimulant prep-aration, EcoActivaTM as a feed supple-ment
enhances macrophage respirato-ry burst and the growth rate of
snapper (Pagrus auratus, Sparidae (Bloch and Schneider)) in winter.
Fish Shellfish Im-mun. 14, 333-345.
11. DI LUZIO, N. R., D. L. WILLIAMS, R. B. MCNAMEE, B. F.
EDWARDS and A. KITAHAMA (1979): Comparative tumor-inhibitory and
anti-bacterial ac-tivity of soluble and particulate glucan. Int. J.
Cancer 24, 773-779.
12. GARDINER, T. (2000): Beta-Glucan Biological Activities: A
Review. Glyco-Science 1, 1-6.
13. GARDINER, T. and G. CARTER (2000): Beta-Glucan Biological
Activities: A Review (condensed version). GlycoSci-ence 1, 1 -
2.
14. HA, C. H., K. H. LIM, Y. T. KIM, S. T. LIM and C. W. KIM
(2002): Analysis of alkali-soluble glucan produced by Saccharomyces
cerevisiae wild type and mutants. Appl. Microbiol. Biotechnol. 58,
370-377.
15. HAYEN, D. G. and D. S. POLLMANN (2001): Animal feeds
comprising yeast glucan. US Patent 6214337.
16. HETLAND, G., M. LOVIK and H. G. WIKER (1998): Protective
effect of -glucan against Mycobacterium bovis, BCG infection in
BALB/c mice. Scand. J. Immunol. 47, 548-553.
17. HONG, Z., P. MANN, N. H. BROWN, L. E. TRAN, K. J. SHAW, R.
S. HARE and B. DIDOMENICO (1994): Cloning and characterization of
KNR 4, a yeast gene involved in (1,3)--glucan synthe-sis. Mol.
Cell. Biol. 14, 1017-1025.
18. HROMADKOVA, Z., A. EBRINGERO-VA, V. SASINKOVA, J. ANDULA, V.
HRIBALOVA and J. OMELKOVA (2003): Influence of the drying method on
the physical properties and immu-nomodulatory activity of the
particu-late (13)--D-glucan from Saccharo-myces cerevisiae.
Carbohyd. Polym. 51, 9-15.