Øvelse: Dyrkning og vurdering af antallet af ......Bioteknologi A BIND 1 Side Øvelse: Måling af vækst af E coli 1af 3 Øvelse: Dyrkning og vurdering af antallet af mikroorganismer

B I O T E K N O L O G I A B I N D 1 copy N U C L E U S F O R L A G middot W W W N U C L E U S D K

I S B N 9 7 8 - 8 7 - 9 0 3 6 3 - 9 6 - 3

KAPITEL 5 ndash MIKROBIEL VAEligKST OG PROD hellip Bioteknologi A BIND 1

Oslashvelse Maringling af vaeligkst af E coli

Side 1 af 3

Oslashvelse Dyrkning og vurdering af antallet af mikroorganismer i et flydende vaeligkstmedie Af Lone Als Egebo Baseret paring siderne 109-118

Indledning Man kan dyrke og foslashlge vaeligksten af en mikroorganisme i et laboratorium Nogle af de mikroorganismer som er nemme at dyrke er kolibakterier Escherichia coli Under ideelle forhold har kolibakterier en generationstid paring ca 20 min

Figur 1 Ecoli Kilde Royaltyfri stockillustrations-ID 133011737

Man kan foslashlge vaeligksten af E coli ved at maringle taeligtheden af den i en flydende kultur paring forskellige tidspunkter Det kan man fx goslashre ved hjaeliglp af et spektrofotometer Normalt bruger man et spektrofotometer til at maringle en oploslashsning af et farvet stofs evne til at absorbere lys Indtil koncentrationen af farvestof paring et tidspunkt bliver saring taeligt at det absorberer alt lys er der en lineaeligr sammenhaeligng mellem farvestoffets koncentration og dets evne til at absorbere lys En kultur af en mikroorganisme er meget mindre ensartet end en farvet oploslashsning I stedet for en absorption sker der derfor en brydning og dermed en spredning af lyset og man kalder det derfor optisk densitet (OD) naringr man maringler paring kulturer af mikroorganismer

Resultatet af en maringling bliver dog vist som en absorbans (A) paring spektrofotometerets display og afhaelignger ogsaring lineaeligrt af kulturens koncentration dvs af antallet af mikroorganismer indtil kulturen bliver for taeligt Absorbansen der typisk ligger mellem 0 og 1 maringles ved boslashlgelaeligngden 550 nm Er absorbansen 1 antages det at svare til 12106 cellermL

Man kan ogsaring maringle taeligthed af Ecoli ved hjaeliglp af et densitometer Dette apparat virker i princippet paring samme maringde som et spektrofotometer Forskellen er at resultatet angives i en enhed der hedder McFarland units hvor 1 McF antages at svare til 3106 cellermL Apparatet skal ikke nulstilles og proslashven skal ikke haeligldes op Det er derfor nemmere at bruge men mindre praeligcist

B I O T E K N O L O G I A B I N D 1 copy N U C L E U S F O R L A G middot W W W N U C L E U S D K

I S B N 9 7 8 - 8 7 - 9 0 3 6 3 - 9 6 - 3

KAPITEL 5 ndash MIKROBIEL VAEligKST OG PROD hellip Bioteknologi A BIND 1

Oslashvelse Maringling af vaeligkst af E coli

Side 2 af 3

For at faring et konkret maringl for antallet af mikroorganismer ved en bestemt taeligthed kan man kombinere taeligthedsmaringlingen med udpladning og optaeliglling af mikroorganismer i en petriskaringl med et vaeligkstmedie Man kan ogsaring kombinere taeligthedsmaringlingen med brug af et taeligllekammer i et mikroskop

Evt kan man ved brug af filtrering maringle paring biomassen af bakterier ligesom man evt kan maringle paring deres forbrug af glucose i forbindelse med vaeligkst

Formaringl At foslashlge vaeligksten af kolibakterier i et flydende vaeligkstmedie og at vurdere antallet af celler paring forskellige tidspunkter

Materialer sect Kulturer af kolibakterier paring agarplade sect Termostatvandbad med rystefunktion sect Spektrofotometer med kuvetter sect Densitometer sect Mikropipetter med sterile spidser sect Pr gruppe sect Startkultur af Ecoli sect 150 mL flydende naeligringsmedium i konisk kolbe sect 2 reagensglas med flydende naeligringsmedie

Fremgangsmaringde Udfoslashres af laeligreren et par dage i forvejen

Overfoslashr bakteriekolonier fra agarpladen til et reagensglas med naeligringsmedie Stil reagensglasset i et termostatvandbad med rystefunktion gennemluftning eller omroslashring ved 37 degC Efter en dag har man en startkultur der er i den stationaeligre fase

Overfoslashr 10 mL startkultur til en konisk kolbe med flydende medie Overfoslashr 1000 μL startkultur til hver at de to reagensglas Taelignd spektrofotometeret Udtag med jaeligvne mellemrum en proslashve af kulturen til maringling i spektrofotometeret (taeligthed maringlt som lsquoabsorbansrsquo) Vurdeacuter selv med udgangspunkt i organismens generationstid hvor ofte der skal udtages en proslashve

B I O T E K N O L O G I A B I N D 1 copy N U C L E U S F O R L A G middot W W W N U C L E U S D K

I S B N 9 7 8 - 8 7 - 9 0 3 6 3 - 9 6 - 3

KAPITEL 5 ndash MIKROBIEL VAEligKST OG PROD hellip Bioteknologi A BIND 1

Oslashvelse Maringling af vaeligkst af E coli

Side 3 af 3

Klargoslashring af spektrofotometer 1 Taelignd computeren 2 Forbind spektrofotometret til computeren via USB-kablet Start Logger Pro softwaren op

programmet finder selv spektrofotometeret 3 Spektrofotometret skal nu kalibreres foslashr brug (en slags nulstilling) I menuen Forsoslashg vaeliglges

Kalibrer Spectrometer vent ca 90 sekunder mens lampen varmer op 4 Fyld en kuvette 34 op med sterilt vaeligkstmedium VIGTIGT Hold kun fingrene paring de rillede sider

af kuvetten Saeligt den i kuvetteholderen saring lyset kan skinne igennem de klare (ikke-rillede) sider 5 Vaeliglg Afslut kalibrering og dernaeligst ok

Maringling af optisk densitet (OD) paring bakteriekulturer 1 Vaeliglg det regnbuefarvede ikon 2 Vaeliglg opsamlingstilstand Abs vs tid 3 Vaeliglg boslashlgelaeligngde (l) svarende til 550 nm (eller den vaeligrdi som kommer taeligttest paring) og

dernaeligst ok 4 Anbring proslashven i kuvetteholderen Aflaeligs absorbansen (svarer til OD) i nederste venstre hjoslashrne

Indtast samhoslashrende vaeligrdier mellem tid og absorbans fx i Excel 5 Gentag punkt 4 med de oslashvrige proslashver 6 Maringlingerne i spektrofotometeret kan suppleres af maringlinger i densitometeret

Resultater og resultatbehandling 1 Opstil et skema hvor der anfoslashres samhoslashrende vaeligrdier af tid OD og antal celler 2 Udarbejd dernaeligst en graf der viser sammenhaeligngen mellem tid og celleantal 3 Udarbejd samme graf med logaritmisk skala paring y-aksen 4 Hvis der er maringlt biomasse ogeller glucose fremstilles i samme diagram grafer som funktion af

tid

Diskussion 1 Analyseacuter graferne At analysere en graf vil sige at man beskriver og forklarer dens forloslashb 2 Hvad er fordelen ved at starte med en kultur der er i den stationaeligre fase 3 Sammenlign evt data fra spektrofotometeret og densitometeret Stemmer resultaterne

overens 4 Hvilke fejlkilder og usikkerheder kan der vaeligre ved fremgangsmaringden Vides det fx helt praeligcist

hvor mange bakterier der er 5 Hvordan kan man evt faring et mere praeligcist maringl for antallet af bakterier i en flydende kultur 6 Kom med eksempler paring industriel anvendelse af Ecoli

Konklusion Er formaringlet opfyldt Hvorforhvorfor ikke