Validasi (Repaired)

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Pengukuran molekul melalui eksitasi elektron dari keadaan energi dasar

ke keadaan energy tereksitasi dengan adanya energi (E) atau panjang gelombang

(λ) yang sesuai. Energi yang diperlukan berasal dari sumber radiasi dari lampu

hidrogen atau lampu deutreum untuk UV atau lampu tungsten untuk visible.

Daerah pengukuran (region) panjang gelombang :

Ultraviolet (UV) : 200 - 380 nm

Sinar tampak (Vis) : 380 - 780 nm

Metode spektrofotometri UV – Vis terutama untuk analisis kuantitatif

berpedoman pada hukum Lambert-Beer dengan rumus :

A = - Log T dan A = b.c

Dimana, A = absoban = ekstingsi spesifik

T = Transmittan

b = tebal lapisan / larutan

c = konsentrasi

Untuk analisis kualitatif, metode spektrofotometri UV-vis sebagai data penunjang.

1.2 Rumusan Masalah

- Bagaimana menentukan validasi (akurasi dan presisi) pada penetapan kadar

asam salisilat menggunakan metode spektrofotometri visibel.

1.3 Tujuan

Mahasiswa dapat melakukan dan menjelaskan :

1. Metode spektrofotometri UV-Vis

2. Tahapan pengukuran analisis

3. Mengetahui komponen spektrofotometri UV-vis

4. Fungsi masing-masing komponen instrumen spektrofotometer UV – vis

5. Penetapan kadar asam salisilat dengan metode spektrofotometer UV – vis

6. Validasi metode dan kalibrasi alat/instrument

7. Pengolahan data dan menyimpulkan hasil percobaan

1

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Spektrofotometri Ultraviolet

Spektrofotometri serapan merupakan pengukuran suatu interaksi antara

radiasi elektromagnetik dan molekul atau atom dari suatu zat kimia. Teknik yang

sering digunakan dalam analisi farmasi meliputi sperktrofotometri ultraviolet,

vahay tampak, infra merah dan serapan atom. Jangkauan panjang gelombang

untuk daerah ultraviolet adalah 190-380 nm, daerah cahaya tampak 380-780 nm,

daerah infra merah dekat 780-3000 nm, daerah infra merah 2,5-40 µm atau

4000-250 cm-1 (Ditjen POM,1995).

Radiasi ultraviolet dan sinar tampak siabsorbsi oleh molekul organik

aromatik, molekul yang mengandung elektron-π terkonjugasi dan atau atom yang

mengandung electron-n, menyebabkan transisi electron di orbital treluarnya dari

tingkat energi elektron dasar ke tingkat energi elektron tereksitasi lebih tinggi.

Besarnya serapan radiasi tersebut sebanding dengan banyaknya molekul analit

yang mengabsorbsi sehingga dapat digunakan untuk analisis kuantitatif

(Satiadarma,2004).

Hal-hal yang harus diperhatikan pada analisis spektrofotometri ultraviolet :

a. Pemilihan Panjang Gelombang Maksimum

Panjang gelombang yang digunakan untuk analisis kuantitatif adalah

panjang gelombang dimana terjadi serapan maksimum. Untuk memperoleh

panjang gelombang serapan maksimum, dilakukan dengan membuat kurva

hubungan antara absorbansi dengan panjang gelombang dari suatu larutan

baku pada konsentrasi tertentu.

b. Pembuatan Kurva Kalibrasi

Dibuat seri larutan baku dari zat yang akan dianalisis dengan berbagai

konsentrasi. Masing-masing absorbansi larutan dengan berbagai konsentrasi

diukur, kemudian dibuat kurva yang merupakan hubungan antara absorbansi

dengan konsentrasi. Bila hukum Lambert-Beer terpenuhi maka kurva kalibrasi

berupa garis lurus

2

c. Pembacaan Absorbansi Sampel atau Cuplikan

Absorbansi yang terbaca pada spektrofotometer hendaknya antara 0,2

sampai 0,6. anjuran ini berdasarkan anggapan bahwa pada kisaran nilai

absorbansi tersebut kesalahan fotometrik yang terjadi adalah paling minimal

(Ginandjar dan Rohman, 2007).

2.2 Hukum Lambert-Beer

Menurut Hukum Lambert, serapan berbanding lurus terhadap ketebalan sel

yang disinari. Menurut Hukum Beer, yang hanya berlaku untuk cahaya

monokromatik dan larutan yang sangat encer, serapan berbanding lurus dengan

konsentrasi (banyak molekul zat). Kedua pernyataan ini dapat dijadikan satu

dalam Hukum Lambert-Beer, sehingga diperoleh bahwa serapan berbanding lurus

terhadap konsentrasi dan ketebalan sel, yang dpat ditulis dalam persamaan :

A = a.b.c g/liter atau A = ε.b.C mol/liter

Dimana : A = serapan (tanpa dimensi)

a = absorptivitas (g-1 cm-1 )

b = ketebalan sel (cm)

C = Konsentrasi (g.l-1 )

ε = absorptivitas molar (M-1 cm-1 )

Jadi dengan Hukum Lambert-Beer konsentrasi dapat dihitung dari

ketebalan sel dan serapan. Absorptivitas merupakan suatu tetapan dan spesifik

untuk setiap molekul pada panjang gelombang dan pelarut tertentu.

2.3 Penggunaan Spektrofotometri Ultraviolet

- Analisis kualitatif

Kegunaan spektrofotometri ultraviolet dalam analisis kualitatif sangat

terbatas, karena rentang daerah radiasi yang relatif sempit hanya dapat

mengakomodasi sedikit sekali puncak absorbsi maksimum dan minumum, karena

itu identifikasi senyawa yang tidak diketahui, tidak memungkinkan (Satiadarma,

2002).

3

- Analisis kuantitatif

Analisis kuantitatif secara spektrofotometri dapat dilakukan dengan

metode regresi dan pendekatan.

1. Metode Regresi

Analisis kuantitatif dengan metode regresi yaitu dengan menggunakan

persamaan garis regresi yang didasarkan pada harga serapan dan konsentrasi

standar yang dibuat dalam beberapa konsentrasi, paling sedikit menggunakan

5 rentang konsentrasi yang meningkat yang dapat memberikan serapan yang

linier, kemudian diplot menghasilkan suatu kurva yang disebut dengan kurva

kalibrasi. Konsentrasi suatu sampel dapat dihitung berdasarkan kurva tersebut.

2. Metode Pendekatan

Analisis kuantitatif dengan cara ini dilakukan dengan membandingkan serapan

standar yang konsentrasinya diketahui dengan serapan sampel. Konsentrasi

sampel dapat dihitung melalui rumus perbandingan C = As.Cb/Ab dimana

As = serapan sampel, Ab = serapan standar, Cb = konsentrasi standar, dan C =

konsentrasi sampel (Holme dan Peck, 1983)

2.4 Instrumen Spektrofotometri

Menurut konfigurasinya, spektrofotometri visibel dibagi dalam:

1. Single Beam

2. Double Beam

3. Multi Channel

1. Single Beam

4

2. Double Beam

3. Multi Channel

- Komponen Instrumentasi Spektrofotometer Visibel

a. Sumber radiasi, lampu deuterium/hidrogen digunakan untuk daerah UV pada

panjang gelombang dari 200-380 nm, sementara lampu halogen kuarsa atau

lampu tungsten digunakan untuk daerah visibel (pada panjang gelombang

antara 380-780 nm)

b. Monokromator : digunakan untuk merubah sinar polikromatik menjadi sinar

monokromatik. Alatnya dapat berupa prisma ataupun grating. Untuk

mengarahkan sinar monokromatis yang diinginkan dari hasil penguraian.

5

c. Kuvet : pada pengukuran didaerah tampak, kuvet kaca atau kuvet kaca corex

dapat digunakan, tetapi untuk pengukuran pada daerah UV kita harus

menggunakan sel kuarsa karena gelas tidak tembus cahaya pada daerah ini.

d. Detektor : Peranan detektor adalah merubah sinyal kimia menjadi sinyal lisrik.

e. Suatu amplifier yang berfungsi mengukur sinyal listrik dengan kekuatan

beberapa kali besaran.

f. Sistem pembacaan yang memperlihatkan besarnya isyarat listrik (Khopkar,

1990; Rohman, 2007; Day and Underwood, 1981)

2.5 Validasi

Validasi adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu pada

prosedur penetapan yang dipakai untuk membuktikan bahwa parameter tersebut

memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita, 2004).

Validasi perlu dilakukan oleh laboratorium terhadap :

Metode non standar

Metode yang dikembangkan sendiri

Metode standar yang digunakan diluar lingkup yang dimaksud

Metode standar yang dimodifikasi

Metode standar untuk menegaskan dan mengkonfirmasikan bahwa metode

tersebut sesuai dengan penggunaannya

Parameter analisis yang ditentukan pada validasi adalah: (www.google.com)

1. Accuracy (Ketepatan)

2. Precision (Ketelitian)

3. Selektivitas

4. Linieritas dan rentang

5. Batas Deteksi (Limit of Detection) dan Batas Kuantitasi (Limit of

Quatification)

6. Ketangguhan metode (ruggedness)

7. Kekuatan (Robustness)

6

Didalam praktikum kali ini, kinerja yang akan diuji adalah keselektifan

seperti uji akurasi (ketepatan) dan presisi (ketelitian). Dua hal ini merupakan hal

yang paling minimal harus dilakukan dalam verifikasi sebuah metode. Suatu

metoda yang presisi (teliti) belum menjadi jaminan bahwa metode tersebut

dikatakan tepat (akurat). Begitu juga sebaliknya, suatu metode yang tepat (akurat)

belum tentu presisi.

Hubungan antara akurasi dan presisi dalam uji metode dapat terjadi dalam

empat hal:

Akurasi dan presisi sama-sama rendah

Presisi tinggi, akurasi rendah

Presisi rendah, akurasi tinggi

Akurasi dan Presisi tinggi.

1. Akurasi

Akurasi dari suatu metode analisis adalah kedekatan nilai hasil uji yang

diperoleh dengan prosedur tersebut dari harga sebenarnya, seringkali dinyatakan

dalam persen perolehan kembali analit pada penentuan kadar sampel yang

mengandung analit dalam jumlah diketahui. Akurasi merupakan ukuran ketepatan

prosedur analisis.

Cara penentuan:Kecermatan ditentukan dengan dua cara yaitu :1. metode simulasi (spiked-placebo recovery). Dalam metode simulasi,

sejumlah analit bahan murni (senyawa pembanding kimia CRM atau

SRM) ditambahkan ke dalam campuran bahan pembawa sediaan farmasi

(plasebo) lalu campuran tersebut dianalisis dan hasilnya dibandingkan

dengan kadar analit yang ditambahkan (kadar yang sebenarnya).

2. metode penambahan baku (standard addition method). Dalam metode

penambahan baku, sampel dianalisis lalu sejumlah tertentu analit yang

diperiksa ditambahkan ke dalam sampel dicampur dan dianalisis lagi.

7

Selisih kedua hasil dibandingkan dengan kadar yang sebenarnya (hasil

yang diharapkan).

Dalam kedua metode tersebut, persen peroleh kembali dinyatakan sebagai

rasio antara hasil yang diperoleh dengan hasil yang sebenarnya. % Perolehan

kembali dapat ditentukan dengan cara membuat sampel plasebo (eksepien obat,

cairan biologis) kemudian ditambah analit dengan konsentrasi tertentu (biasanya

80% sampai 120% dari kadar analit yang diperkirakan), kemudian dianalisis

dengan metode yang akan divalidasi. Tetapi bila tidak memungkinkan membuat

sampel plasebo karena matriksnya tidak diketahui seperti obat-obatan paten, atau

karena analitnya berupa suatu senyawa endogen misalnya metabolit sekunder

pada kultur kalus, maka dapat dipakai metode adisi.

2. Presisi

Presisi dari suatu metode adalah derajat kesesuian diantara masing-masing

hasil uji, jika prosedur analisis ditetapkan berulang kali pada sejumlah cuplikan

yang diambil dari satu sanpel homogen. Presisi dinyatakan sebagai deviasi standar

atau deviasi standar relatif (koefisien variasi). Presisi dapat diartikan pula sebagai

derajat reprodusibilitas atau keterulangan dari prosedur analisis.

3. Selektivitas Atau Spesifisitas Suatu Metode

Selektivitas atau spesifisitas suatu metode adalah kemampuannya yang

hanya mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya

komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel. Selektivitas seringkali

dapat dinyatakan sebagai derajat penyimpangan (degree of bias) metode yang

dilakukan terhadap sampel yang mengandung bahan yang ditambahkan berupa

cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya, dan dibandingkan

terhadap hasil analisis sampel yang tidak mengandung bahan lain yang

ditambahkan.

Selektivitas metode ditentukan dengan membandingkan hasil analisis sampel yang

mengandung cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya atau

8

pembawa plasebo dengan hasil analisis sampel tanpa penambahan bahan-bahan

tadi.

Penyimpangan hasil jika ada merupakan selisih dari hasil uji keduanya.

Jika cemaran dan hasil urai tidak dapat diidentifikasi atau tidak dapat diperoleh,

maka selektivitas dapat ditunjukkan dengan cara menganalisis sampel yang

mengandung cemaran atau hasil uji urai dengan metode yang hendak diuji lalu

dibandingkan dengan metode lain untuk pengujian kemurnian seperti

kromatografi, analisis kelarutan fase, dan Differential Scanning Calorimetry.

Derajat kesesuaian kedua hasil analisis tersebut merupakan ukuran selektivitas.

Pada metode analisis yang melibatkan kromatografi, selektivitas ditentukan

melalui perhitungan daya resolusinya (Rs).

4. Linearitas dan Rentang

Linearitas adalah kemampuan metode analisis memberikan respon

proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Rentang metode adalah

pernyataan batas terendah dan tertinggi analit yang sudah ditunjukkan dapat

ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan, dan linearitas yang dapat diterima.

Linearitas biasanya dinyatakan dalam istilah variansi sekitar arah garis

regresi yang dihitung berdasarkan persamaan matematik data yang diperoleh dari

hasil uji analit dalam sampel dengan berbagai konsentrasi analit. Perlakuan

matematik dalam pengujian linearitas adalah melalui persamaan garis lurus

dengan metode kuadrat terkecil antara hasil analisis terhadap konsentrasi analit.

Dalam beberapa kasus, untuk memperoleh hubungan proporsional antara

hasil pengukuran dengan konsentrasi analit, data yang diperoleh diolah melalui

transformasi matematik dulu sebelum dibuat analisis regresinya.

Dalam praktek, digunakan satu seri larutan yang berbeda konsentrasinya

antara 50 – 150% kadar analit dalam sampel. Di dalam pustaka, sering ditemukan

rentang konsentrasi yang digunakan antara 0 – 200%. Jumlah sampel yang

dianalisis sekurang-kurangnya delapan buah sampel blanko.

Sebagai parameter adanya hubungan linier digunakan koefisien korelasi r

pada analisis regresi linier Y = a + bX. Hubungan linier yang r = +1 atau –1

bergantung pada arah garis. Sedangkan nilai a menunjukkan kepekaan analisis

9

terutama instrumen yang digunakan. Parameter lain yang harus dihitung adalah

simpangan baku residual (Sy). Dengan menggunakan kalkulator atau perangkat

lunak komputer, semua perhitungan matematik tersebut dapat diukur.

5. Batas Deteksi (Limit of Detection) dan Batas Kuantitasi (Limit of

Quatification)

Batas deteksi adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi

yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blangko. Batas

deteksi merupakan parameter uji batas. Batas kuantitasi merupakan parameter

pada analisis renik dan diartikan sebagai kuantitas terkecil analit dalam sampel

yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama. Penentuan batas deteksi

suatu metode berbeda-beda tergantung pada metode analisis itu menggunakan

instrumen atau tidak. Pada analisis yang tidak menggunakan instrumen batas

tersebut ditentukan dengan mendeteksi analit dalam sampel pada pengenceran

bertingkat. Pada analisis instrumen batas deteksi dapat dihitung dengan mengukur

respon blangko beberapa kali lalu dihitung simpangan baku respon blangko dan

formula di bawah ini dapat digunakan untuk perhitungan

Q = (k x Sb)/Sl

Q = LOD (batas deteksi) atau LOQ (batas kuantitasi)

k = 3 untuk batas deteksi atau 10 untuk batas kuantitasi

Sb = simpangan baku respon analitik dari blangko

Sl = arah garis linear (kepekaan arah) dari kurva antara respon terhadap

konsentrasi = slope (b pada persamaan garis y = a+bx).

Batas deteksi dan kuantitasi dapat dihitung secara statistik melalui garis

regresi linier dari kurva kalibrasi. Nilai pengukuran akan sama dengan nilai b pada

persamaan garis linier y = a + bx, sedangkan simpangan baku blanko sama dengan

simpangan baku residual (Sy/x.)

a. Batas deteksi (LoD)

Karena k = 3, Simpangan baku (Sb) = Sy/x, maka:

LoD = (3 Sy/x)/ Sl

b. Batas kuantitasi (LoQ)

Karena k = 10, Simpangan baku (Sb) = Sy/x, maka:

LoQ = (10 Sy/x)/Sl

10

Cara lain untuk menentukan batas deteksi dan kuantitasi adalah melalui

penentuan rasio S/N (signal to noise ratio). Nilai simpangan baku blanko

ditentukan dengan cara menghitung tinggi derau pada pengukuran blanko

sebanyak 20 kali pada titik analit memberikan respon. Simpangan baku blanko

juga dihitung dari tinggi derau puncak ke puncak, jika diambil dari tinggi puncak

derau atas dan bawah (Np-p) maka s0 = Np-p/5 sedangkan kalau dari puncak

derau bawah saja (puncak negatif) maka s0 = Np/2, selanjutnya perhitungan

seperti tersebut di atas. Lomit deteksi adalah nilai parameter auji batas, yaitu

konsentrasi analit terendah yang dapat dideteksi.

6. Ketangguhan metode (ruggedness)

Ketangguhan metode adalah derajat ketertiruan hasil uji yang diperoleh

dari analisis sampel yang sama dalam berbagai kondisi uji normal, seperti

laboratorium, analisis, instrumen, bahan pereaksi, suhu, hari yang berbeda, dll.

Ketangguhan biasanya dinyatakan sebagai tidak adanya pengaruh perbedaan

operasi atau lingkungan kerja pada hasil uji. Ketangguhan metode merupakan

ukuran ketertiruan pada kondisi operasi normal antara lab dan antar analis.

Ketangguhan metode ditentukan dengan menganalisis beningan suatu lot

sampel yang homogen dalam lab yang berbeda oleh analis yang berbeda

menggunakan kondisi operasi yang berbeda, dan lingkungan yang berbeda tetapi

menggunakan prosedur dan parameter uji yang sama.

Derajat ketertiruan hasil uji kemudian ditentukan sebagai fungsi dari

variabel penentuan. Ketertiruan dapat dibandingkan terhadap keseksamaan

penentuan di bawah kondisi normal untuk mendapatkan ukuran ketangguhan

metode. Perhitungannya dilakukan secara statistik menggunakan ANOVA pada

kajian kolaboratif yang disusun oleh Youden dan Stainer.

7. Kekuatan (Robustness)

Untuk memvalidasi kekuatan suatu metode perlu dibuat perubahan

metodologi yang kecil dan terus menerus dan mengevaluasi respon analitik dan

efek presisi dan akurasi. Sebagai contoh, perubahan yang dibutuhkan untuk

menunjukkan kekuatan prosedur HPLC dapat mencakup (tapi tidak dibatasi)

11

perubahan komposisi organik fase gerak (1%), pH fase gerak (± 0,2 unit), dan

perubahan temperatur kolom (± 2 - 3° C).

Perubahan lainnya dapat dilakukan bila sesuai dengan laboratorium.

Identifikasi sekurang-kurangnya 3 faktor analisis yang dapat mempengaruhi hasil

bila diganti atau diubah. Faktor risinal ini dapat diidentifikasi sebagai A, B, dan C.

Perubahan nilai faktor-faktor ini dapat diidentifikasi dengan a, b, dan c. Lakukan

analisis pada kondisi yang telah disebutkan pada pemeriksaan ketangguhan.

2.6. Sumber Kesalahan Dalam Analisis

Faktor yang memepengaruhi presisi dan bias di atas dapat diakibatkan oleh

kesalahan yang terjadi karena berbagai penyebab. Menurut Miller & Miller (2001)

tipe kesalahan dalam pengukuran analitik dapat dibagi menjadi tiga, yaitu:

1. Kesalahan serius (Gross error)

Tipe kesalahan ini sangat fatal, sehingga konsekuensinya pengukuran harus

diulangi. Contoh dari kesalahan ini adalah kontaminasi reagent yang digunakan,

peralatan yang memang rusak total, sampel yang terbuang, dan lain lain. Indikasi

dari kesalahan ini cukup jelas dari gambaran data yang sangat menyimpang, data

tidak dapat memberikan pola hasil yang jelas, tingkat reprodusibilitas yang sangat

rendah dan lain lain.

2. Kesalahan acak (Random error)

Golongan kesalahan ini merupakan bentuk kesalahan yang menyebabkan hasil

dari suatu perulangan menjadi relatif berbeda satu sama lain, dimana hasil secara

individual berada di sekitar harga rata-rata. Kesalahan ini memberi efek pada

tingkat akurasi dan kemampuan dapat terulang (reprodusibilitas). Kesalahan ini

bersifat wajar dan tidak dapat dihindari, hanya bisa direduksi dengan kehati-hatian

dan konsentrasi dalam bekerja.

3. Kesalahan sistematik (Systematic error)

Kesalahan sistematik merupakan jenis kesalahan yang menyebabkan semua

hasil data salah dengan suatu kemiripan. Hal ini dapat diatasi dengan:

a. Standarisasi prosedur

b. Standarisasi bahan

c. Kalibrasi instrumen

12

Secara umum, faktor yang menjadi sumber kesalahan dalam pengukuran

sehingga menimbulkan variasi hasil, antara lain adalah:

1. Perbedaan yang terdapat pada obyek yang diukur.

Hal ini dapat diatasi dengan:

a. Obyek yang akan dianalisis diperlakukan sedemikian rupa sehingga

diperoleh ukuran kualitas yang homogen

b. Mengggunakan tekhnik sampling dengan baik dan benar

2. Perbedaan situasi pada saat pengukuran

Perbedaan ini dapat diatasi dengan cara mengenali persamaan dan

perbedaan suatu obyek yang terdapat pada situasi yang sama. Dengan demikian

sifat-sifat dari obyek dapat diprediksikan.

3. Perbedaan alat dan instrumentasi yang digunakan

Cara yang digunakan untuk mengatasinya adalah dengan menggunakan

alat pengatur yang terkontrol dan telah terkalibrasi.

4. Perbedaan penyelenggaraan/administrasi

Kendala ini diatasi dengan menyelesaikan permasalahannon-teknis dengan

baik sehingga keadaan peneliti selalu siap untuk sehingga melakukan kerja.

5. Perbedaan pembacaan hasil pengukuran

Kesalahan ini dapat diatasi dengan selalu berupaya untuk mengenali alat atau

instrumentasi yang akan digunakan terlebih dahulu.

Dari lima faktor penyebab kesalahan dalam bidang analitik maka peralatan

dan instrumentasi sangat berpengaruh. Peralatan pada dasarnya harus

dikendalikan oleh pemakainya. Untuk peralatan mekanis yang baru relatif semua

sistem sudah berjalan dengan optimal, sebaliknya untuk alat yang sudah berumur

akan banyak menimbulkan ketidak optimuman karena komponen aus, korosi dan

sebagainya. Demikian juga peralatan elektrik, pencatatan harus selalu dikalibrasi

dan dicek ulang akurasinya. Untuk peralatan yang menggunakan sensor atau

detektor maka perawatan dan kalibrasi akan berperan penting.

13

2.7. Prosedur Asli

Ditimbang seksama lebih kurang 0,200 gram asam salisilat, larutkan

dalam 10 ml metanol dalam bekerglas. Pindahkan ke dalam labu ukur 100,0 ml

secara kuantitatif, tambahkan metanol sampai garis tanda, kemudian dikocok ad

homogen. Dari larutan tersebut dibuat berbagai kadar dengan pengenceran,

ditambahkan pereaksi larutan Fe3+ sampai diperoleh warna merah ungu

maksimum baru ditambahkan metanol sampai volume tertentu. Larutan diukur

pada panjang gelombang maksimum di daerah visibel, dengan metanol + pereaksi

larutan Fe3+ sebagai blanko. Hitung kadar asam salisilat dalam sampel

(AOAC,2000).

14

BAB III

METODE PELAKSANAAN

3.1 Prinsip Reaksi

Reaksi :

asam salisilat FeCl3 Ferri salisilat

(tdk berwarna) (kuning) (ungu)

3.2 Alat dan Bahan

Alat

• Spektrofotometer UV-Vis : 1

• Lampu Tungsten : 1

• Kuvet : 1

• Timbangan Analitik : 1

• Labu Ukur 25,0 ml ; 50,0 ml : 12 ; 4

• Beaker glass 100 ml ; 150 ml : 1 ; 1

• Pipet volum 2,0 ml : 1




• Pipet ukur 10,0 ml : 1

Bahan

- Asam salisilat pharmaceutical grade

- FeCl3 pro analisis

- Metanol pro analisis

- Aquadest

15

3 + Fe3+ Fe3 + 3 H+

3.3 Cara Kerja

1. Pembuatan Baku Induk I ( BI1)

Ditimbang asam salisilat sebanyak ± 125 mg ( 129,2 mg )

Massukan ke dalam labu ukur 50,0 ml, larutkan dengan metanol

Tambahkan metanol ad garis tanda ( 2584 ppm )

2. Pembuatan Baku Induk II ( BI1)

Dipipet 5,0 ml dari larutan baku induk I

Masukkan ke dalam labu ukur 50,0 ml

Tambahkan metanol ad garis tanda ( 258,4 ml )

3. Pembuatan Larutan Baku Kerja

1. Dipipet 1,0 ml + 3,0 ml FeCl3 0,5 %, kocok ad homogen+ metanol ad 25,0

ml, kocok ad homogen (10,34 ppm)

2. Dipipet 2,0 ml + 3,0 ml FeCl3 0,5 %, kocok ad homogen + metanol ad

25,0 ml, kocok ad homogen (20,67 ppm)







4. Pembuatan Larutan Blanko

Dipipet 3,0 ml larutan FeCl3 0,5 % dimasukkan kedalam labu 25,0 ml lalu

ditambahkan metanol sampai garis tanda, kocok homogen.

5. Preparasi Larutan Sampel

Ditimbang saksama ±300 mg sampel padat asam salisilat, larutkan ke dalam

metanol, masukkan ke dalam labu ukur 50,0 ml, kemudian ditambahkan

metanol sampai garis tanda, lalu saring ( sampel induk A). Dipipet 3,0 ml

16

larutan sampel induk masukkan ke dalam labu ukur 25,0 ml, tambahkan 3,0

ml larutan FeCl3 0,5 %, kocok ad homogen. Kemudian tambahkan metanol

ad garis tanda dan kocok homogen→sampel B.

6. Validasi

Validasi I

1. V1 = 3,0 ml sampel B + 1,0 ml BI II+3,0 ml FeCl3, kocok ad

homogen + metanol ad 25,0 ml, kocok ad homogen.





Validasi II







7. Lakukan pengukuran absorban pada panjang gelombang maksimum.

17

BAB IV

HASIL PENGAMATAN DAN ANALISIS DATA

1. Penimbangan baku induk Asam Salisilat 125 mg (range : 112,5 mg–137,5 mg)

Botol timbang + zat = 12,9926 g

Botol timbang kosong = 12,8634 g

Bobot zat = 0, 1292 g

2. Penimbangan sampel 300 mg (range : 270 mg – 330 mg)

Botol timbang + zat = 12,8565 g

Botol timbang kosong = 12,5466 g

Bobot zat = 0,3099 g

3. Pengukuran Transmittan (λ= 545 nm)

Larutan Kadar (ppm) % T A=-log T

r = 0,9985

a = 0,0075

b = 0,0133

BK 1 10,34 73,14 0,1358

BK 2 20,67 52,29 0,2816

BK 3 31,01 36,43 0,4385

BK 4 41,34 27,53 0,5602

BK 5 51,68 20,70 0,6840

4. Pengukuran absorbansi sampel dan kadar sampel

Nama % T A=-log T

Nur Andini 57,25 0,2422

Y = bx + a

0,2422 = 0,0133 x - 0,0075

x = 17,6466 ppm

18

5. Pengukuran Transmittan Validasi (=545 nm)

Validasi I % T A=-log T

V1 41,38 0,3832

V2 41,39 0,3831

V3 41,39 0,3831

Validasi II % T A=-log T

V1 30,56 0,5148

V2 30,51 0,5156

V3 30,51 0,5156

6. Kadar absorbansi :

1. Validasi 1

Y = bx + a

0,3832 = 0,0133x - 0,0075

x = 28,2481 ppm

Y = bx + a

0,3831 = 0,0133x - 0,0075

x = 28,2406 ppm

Y = bx + a

0,3831 = 0,0133x - 0,0075

x = 28,2406 ppm

2. Validasi 1

Y = bx + a

0,5148 = 0,0133x - 0,0075

x = 38,1428 ppm

Y = bx + a

0,5156 = 0,0133x - 0,0075

x = 38,2030 ppm

Y = bx + a

0,5156 = 0,0133x - 0,0075

x = 38,2030 ppm

19

7. Perhitungan Kadar % Recovery ( Uji Ketepatan=Akurasi )

1. Validasi I

= 54,02 %1. Validasi 2

Rerata = rata-rata % recovery validasi I= 54,93 %

SD = 1,5819

8. Perhitungan KV ( Uji Presisi=Ketelitian )

1. Validasi I

= 2,88 %

= 3,32 %

20

6. Perhitungan kadar asam salisilat dalam sampel Kadar sampel 19,78 ppm = 19,78 mg / 1000

= 0,99 mg / 50,0 ml

Sampel untuk pengukuran dari 3,0 ml yang dipipet dari sampel induk : 3,0 ml sampel induk = 3,0 ml x 0,0198 mg / 1 ml sampel

= 0,0594 mg

= 0,4950 mg

Jadi, dalam 100,0 ml larutan sampel mengandung 1,98x10-3 mg asam salisilat.

= 1,25 % b/v

21

BAB V

PEMBAHASAN

Berdasarkan praktikum Penentuan Validasi ( Akurasi dan Presisi) pada

Penetapan Kadar Asam Salisilat dengan Metode Spektrofotometri Visibel yang

dilakukan, didapatkan hasil yang telah memenuhi persyaratan validasi yaitu untuk

akurasi semakin mendekati 100% dan untuk presisi <2% data semakin memenuhi

persyaratan/bagus. Berikut hasil yang diperoleh :

• Validasi I

→ Rata-rata %recovery : 102,52 %

→ Presisi : 0,04 %

• Validasi II

→ Rata-rata %recovery : 99,34 %

→ Presisi : 0,17 %

Perlu diperhatikan dalam praktikum kali ini agar pereaksi yang digunakan

disesuaikan dengan jumlah sampe dan baku induk yang dipipet. Penggunaan

peeaksi, dalam hal ini FeCl3 yang terlalu banyak akan menyebakan larutan yang

akan diukur absorbansinya menjadi sangat pekat dan tidak mau terbaca pada

spektrofotometer.

Dalam hal alat juga perlu diperhatikan, karena alat juga berperan dalam

ketepatan dan ketelitian suatu data. Jangan lupa untuk mem-blanko

spektrofotometer visibel karena seperti yang kita ketahui spektrofotometer

didalam laboratorium sering tidak stabil terlebih jika ada getaran, oleh karena itu

kita harus sering mem-blanko atau mengkalibrasi alat.

Apabila kita menginginkan suatu data yang memenuhi syarat akurasi dan

presisi jangan lupa untuk memperhatikan beberapa faktor seperti dari segi

preparasi sampel, ketepatan saat meng-ad kan, maupun dari pembacaan

absorbansi agar data yang kita peroleh syarat ketepatan dan ketelitiannya

terpenuhi.

22

BAB VI

KESIMPULAN

1. Absorbansi Kadar Sampel = 17,65 ppm

2. Akurasi validasi I = 102,49 %

II = 99,44 %

3. Presisi validasi I = 2,88 %

II = 0,04 %

4. Kadar asam salisilat dalam sampel = 0,57 %.

23

DAFTAR PUSTAKA

Sastrohamidjojo, H. 1991. Spektroskopi. Yogyakarta : Liberty.

Khopkar, S.M. 2007. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: UI-Press.

Watson, David G. 2007. Analisis Farmasi Edisi 2. Jakarta : Penerbit Buku

Kedokteran EGC.

Anonym. 2008. Verifikasi dan Validasi Metode. www.google.com

Anonym. 2007. Validasi Metode Analisis. www.google.com

Harmita. 2004. Petunjuk pelaksanaan validasi Metode dan Cara Perhitungannya. www.google.com

Anonym. 2009. Sistem Kalibrasi. www.google.com

24

http://www.google.com/



Validasi (Repaired)

Documents