Utilizzo di sistemi LC/MS e LC/MS-MS nell'ambito del TDM dei farmaci anti-infettivi Lorena Baietto (MSc, PhD) Laboratorio di Farmacologia Clinica e Farmacogenetica Università degli Studi di Torino Facoltà di Medicina e Chirurgia, Dipartimento di Scienze Mediche Ospedale Amedeo di Savoia (Torino)
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Utilizzo di sistemi LC/MS e
LC/MS-MS nell'ambito del
TDM dei farmaci anti-infettivi
Lorena Baietto (MSc, PhD)
Laboratorio di Farmacologia Clinica e Farmacogenetica
Università degli Studi di Torino
Facoltà di Medicina e Chirurgia, Dipartimento di Scienze Mediche
Ospedale Amedeo di Savoia (Torino)
ARGOMENTI TRATTATI:
Utilità del TDM dei farmaci anti-infettivi in campo clinico
Metodi che abbiamo validato in laboratorio per il
dosaggio dei farmaci antinfettivi nella pratica clinica
Esempi di utilizzo dei sistemi LC-MS e LC-MS-MS nel
dosaggio di alcuni farmaci:
- HPLC-MS nel dosaggio dei farmaci antifungini in
plasma ed in plasma spottato su supporto Dried Plasma
Spots
- UPLC-MS-MS nel dosaggio della colistina in plasma
- UPLC-MS-MS nel dosaggio della daptomicina in
plasma e liquor
ARGOMENTI TRATTATI:
Utilità del TDM dei farmaci anti-infettivi in campo clinico
Metodi che abbiamo validato in laboratorio per il
dosaggio dei farmaci antinfettivi nella pratica clinica
Esempi di utilizzo dei sistemi LC-MS e LC-MS-MS nel
dosaggio di alcuni farmaci:
- HPLC-MS nel dosaggio dei farmaci antifungini in
plasma ed in plasma spottato su supporto Dried Plasma
Spots
- UPLC-MS-MS nel dosaggio della colistina in plasma
- UPLC-MS-MS nel dosaggio della daptomicina in
plasma e liquor
IL THERAPEUTIC DRUG MONITORING
DEFINIZIONE: Il monitoraggio terapeutico dei farmaci è un processo che consiste nell'utilizzare le concentrazioni dei farmaci nei liquidi biologici, i principi della farmacocinetica e i criteri della farmacodinamica per ottimizzare la terapia farmacologica del singolo individuo
ridurre i rischi di effetti collaterali, o tossici, ed aumentare, quindi, i benefici dati dal farmaco al paziente .
MIGLIORARE L’EFFICACIA E RIDURRE LA COMPARSA DI RESISTENZA
TDM e TERAPIA
ANTINFETTIVA:
Correlare l’efficacia e la tossicità di un farmaco con le
concentrazioni plasmatiche
Studiare le interazioni con altri farmaci co-somministrati
Valutare l’efficacia e la tossicità in pazienti con alterazioni
Instrument Pump model Autosampler model Detector Software Column
HPLC (Waters) Binary pump model
1525 717
Micromass ZQ mass detector
Empower Pro software Atlantis dC-18 3µ column (150mm×2.1mm id)
ARGOMENTI TRATTATI:
Utilità del TDM dei farmaci anti-infettivi in campo clinico
Metodi che abbiamo validato in laboratorio per il
dosaggio dei farmaci antinfettivi nella pratica clinica
Esempi di utilizzo dei sistemi LC-MS e LC-MS-MS nel
dosaggio di alcuni farmaci:
- HPLC-MS nel dosaggio dei farmaci antifungini in
plasma ed in plasma spottato su supporto Dried Plasma
Spots
- UPLC-MS-MS nel dosaggio della colistina in plasma
- UPLC-MS-MS nel dosaggio della daptomicina in
plasma e liquor
HPLC-MS nel dosaggio plasmatico
dei farmaci antifungini
Antifungini triazoli
Prevenzione e terapia delle infezioni fungine invasive
Farmacocinetica non lineare
Alta variabilità tra i pazienti
Hope WW et al. Curr Opin Infect Dis. 2008;21:580-586.
Efficacy cut-off in prophylaxis
Itraconazole: Ctrough > 0.5 mg/L
Voriconazole: Ctrough > 0.5 mg/L
Posaconazole: Ctrough > 0.5 mg/L
Efficacy cut-off in therapy
Itraconazole: Ctrough > 1 mg/L
Voriconazole: Ctrough > 2 mg/L
Posaconazole: Ctrough > 1 mg/L
Toxicity cut-off in therapy
Itraconazole: Ctrough > 17.1 mg/L
Voriconazole: Ctrough > 5.5 mg/L
Posaconazole: not defined
Andes D et al. Antimicrob Agents Chemother 2009;53(1):24-34; Lestner JM et al. Clin Infect Dis. 2009;49:928-930.
INEFFICACY
TOXICITY
Pla
sma
con
cen
trat
ion
s narrow
therapeutic window
Ctrough
Time
Instrument Pump model Autosampler model Detector Software Column
HPLC (Waters) Binary pump model
1525 717
Micromass ZQ mass detector
Empower Pro software Atlantis dC-18 3µ column (150mm×2.1mm id)
Procedura di estrazione: 50 µl di IS 200 µl di acetonitrile 200 µl di campione •Vortex per 10 sec •Cetrifug. per 10 min a 15000 rpm •Diluire SN 1:1 con acqua •Iniezione in HPLC-MS
Parametri valutati secondo le linee guida FDA1 Accuratezza Precisione Selettività Sensibilità Valori di accuratezza
e precisione < 15% ACCURATEZZA e PRECISIONE
Drugs Nominal value
(mg/L) Accuracy
(%) Precision (R.S.D.%)
Intra-day Inter-day
ITC
0.10 6.23 9.12 6.34
1.50 2.30 4.30 8.70
3.00 0.14 5.72 12.01
5.00 4.60 7.86 12.64
PSC
0.10 8.08 4.89 8.70
1.50 1.30 3.70 7.10
3.00 3.83 4.20 6.61
5.00 4.99 5.77 6.96
VRC
0.12 1.50 5.81 13.30
1.50 1.70 3.60 9.10
4.00 5.78 4.09 8.09
6.00 9.55 5.90 6.09
1 FDA. Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation; 2001.
SELETTIVITA’ e SENSIBILITA’
Assenza di picchi interferenti in plasma bianco
Buon limite di quantificazione (LOQ) che permette di quantificare anche le basse concentrazioni in modo preciso e accurato.
LOQ
Blank plasma
HPLC system
Detector Extraction procedure
Dry Step LLOQ
(mg/L)
Time of analysis
(min) References
HPLC UV SPE Yes 0.05-0.15 19 Gordien et al. 2009
HPLC MS-MS Protein precipitation
No 0.010 nr Chahbouni et al. 2010
HPLC MS-MS Protein precipitation
No 0.100 15 Verdier et al. 2010
HPLC MS Protein precipitation
No 0.030 15 Baietto et al. 2010
UPLC MS-MS Protein precipitation
No 0.020 5.1 Decosterd et al. 2010
UPLC UV Protein precipitation
Yes 0.050 6 Wissen et al. 2012
HPLC MS-MS SPE Yes 0.001 3 Beste et al. 2012
Gordien JB et al. J Pharm Biomed Anal 2009;50(5):932-8; Chahbouni A at al. Ther Drug Monit 2010;32(4):453-7; Verdier MC et al. Clin Chem Lab Med 2010;48(10):1515-22; Baietto L et al. Antimicrob Agents Chemother 2010;54(8):3408-13; Decosterd LA et al. Antimicrob Agents Chemother 2010;54(12):5303-15; Wissen at al. Beste KY et al. Clin Chim Acta 2012;413(1-2):240-5.
• Facile e rapida procedura di estrazione (turn around time = 1 day) • Piccolo volume di plasma necessario • Utilizzo della Quinoxaline come IS • Curva di calibrazione adatta alle concentrazione attese nella pratica
clinica • Ad oggi abbiamo analizzato circa 700 campioni provenienti dal Regina
Margherita e Molinette
MS vs UV
• MS permette di avere migliore sensibilità e
specificità rispetto a UV.
• Procedura di estrazione su MS è più
rapida e non richiede asciugatura (curva, qc e 2
campioni estratti in 30 min con metodo HPLC-MS).
• Metodo su MS richiede minor volume di
plasma (200 µl vs 300 µl).
• Corsa su MS più rapida (15 min vs 18
min).
• Possibilità di fare più iniezioni dello stesso
campione (5 vs 1).
Certificato relativo all’Interlaboratory Quality Control Program for TDM of antifungal drugs.
HPLC-MS nel dosaggio dei farmaci
antifungini in plasma spottato su supporto
Dried Plasma Spots
Dried blood spots (DBS) o dried plasma spots (DPS)?
DPS
DBS
• Nuovo metodo di raccolta dei campioni
• Campioni di sangue e di plasma possono essere conservati e inviati a temperatura ambiente (solo per farmaci stabili a R.T.)
• DPS migliori di DBS (studi clinici si riferiscono a livelli plasmatici; per DPS non è necessario correggere la concentrazione plasmatica per l’ematocrito).
1. 50 uL di plasma sono spottati su DSSD 2. Filtri vengono asciugati a r.t. per 30 min 3. Filtri vengono arrotolati e trasferiti in una provetta 4. Aggiunta di soluzione estraente e IS 5. Effettuato il tumbling per 15 min at 40 rpm 6. Fase organica è evaporata a 50°C 7. Campioni ricostituiti e iniettati in HPLC-MS
PROCEDURA DI ESTRAZIONE
Stabilità a temperatura ambiente dei triazoli su DPS
dopo 2 settimane degradazione <17%.
Baietto L et al. J. Antimicrob. Chemother. 2012;67:2645-2649
75
80
85
90
95
100
105
110
0 5 10 15 20 25 30
Pe
rce
nta
ge
re
ma
inin
g (
%)
Time (day)
ITC
PSC
VRC
Correlazione tra “metodo DPS” e “metodo non-DPS”
r2=0.994
r2=0.959
r2=0.991
Alta correlazione tra i due metodi di estrazione. Linear regression statistically significant (P<0.0001)
UPLC-MS-MS e dosaggio plasmatico
della colistina
COLISTINA
Antibiotico lipopeptidico usato come ultima “chance” di difesa
contro Psudomonas e Acinetobacter in pazienti critici
Formata da 30 polimixine, le principali sono la colistina A e la