Utilização de Polimorfismos em Análises Forenses · Relembrando... Polimorfismo Genético É a coexistência de alelos múltiplos em um lócus cromossômico; regiões do genoma

Utilização de

Polimorfismos em

Análises Forenses

Relembrando...

Polimorfismo Genético É a coexistência de alelos múltiplos em um lócus cromossômico; regiões do genoma nas quais existem variações entre as pessoas.

Polimorfismo de sítio de restrição (RFLP)

Polimorfismo de nucleotídeo único (SNP)

Polimorfismos de inserção/deleção (indels)

Polimorfismos de minissatélites (VNTR)

Polimorfismos de microssatélites (STR)

Qual a importância desses

polimorfismos?

Fonte de variabilidade;

Permitem construir um perfil genético

indivíduo-específco “DNA fingerprint”;

importante em Medicina Forense

Por que analisar tais

polimorfismos no DNA?

Determinação de paternidade;

Resolução de casos criminais envolvendo:

Estupro;

Homicídio;

Rapto;

Troca ou abandono de crianças.

De onde pode ser extraído o DNA?

Sangue padrão-ouro;

células epiteliais da mucosa oral: saliva, pontas de cigarro, selos e envelopes, gomas de mascar, copos, tampas de caneta mordidas,...;

Pêlos e fios de cabelo (com ou sem o bulbo capilar);

Unhas;

Esfregaços;

De onde pode ser extraído o DNA?

Manchas de material biológico: líquido seminal, urina, saliva, sangue;

Tecidos de biópsias cirúrgicas;

Ossadas (carbonizadas ou não);

Tecidos mumificados ou congelados;

Células deixadas por impressão digital;

Dentes;

outras

Como extrair o DNA?

Técnicas específicas para cada tipo de

amostra;

CUIDADO: O sucesso da tipagem de DNA

depende basicamente da qualidade e

quantidade de DNA extraído

Métodos disponíveis para

utilização:

VNTRs estudados com sondas multilocais;

STRs estudados com PCR;

DNA mitocondrial (mtDNA);

STRs do Cromossomo Y;

Técnicas mais recentes.

VNTRs estudados com sondas

multilocais

Princípio do método: após clivagem por

endonucleases, cada indivíduo tem um

padrão de bandas específico com tamanhos

determinados pela presença, ou não, do sítio

da enzima e pela quantidade de repetições

em tandem. Para que possa-se visualizar,

esses fragmentos devem ser hibridizados a

sondas radioativas de seqüência invariável.

VNTRs estudados com sondas

multilocais

Técnica de custo razoável;

DNA não degradado;

Quantidade suficiente de DNA;

Várias dificuldades inerentes à técnica.

VNTRs estudados com sondas

multilocais

Teste de paternidade:

VNTRs estudados com sondas

multilocais

Identificação de um criminoso:

STRs estudados com PCR

Princípio do método: Reação de PCR

utilizada para copiar extensivamente

várias regiões de STR, fornecendo

fragmentos de tamanhos diferentes

visualizados por eletroforese em gel de

poliacrilamida ou por seqüenciamento

STRs estudados com PCR

Recuperação de DNA em amostras de tecidos e fluidos

Amostra (tecidos e

fluidos)

Quantidade

recuperada

Análise de RFLP Análise de STR

1mL de sangue 20 a 40mg SIM SIM

Manchas de

sangue seco de

1cm3

200ng NÃO SIM

Sêmen 150 a 300mg por

mL

SIM SIM

Sêmen (esfregaço

vaginal pós-coito)

0 a 3mg (DNA dos

espermatozóides)

SIM SIM

Cabelo com raiz

(contendo bulbo

capilar)

1 a 750ng por fio NÃO SIM

Saliva 1 a 10mgpor mL SIM SIM

Retirado de “Os exames de DNA nos Tribunais”, Revista Ciência Hoje (vol. 29, nº 169 - março/2001)

Vantagem sobre a técnica de VNTR:

como o DNA é “amplificado”, a amostra a

ser analisada pode ter uma quantidade

inicial muito menor.

Mesmo existindo contaminação por DNA

de outras espécies, a técnica de PCR é

específica o suficiente para amplificar

apenas o DNA humano

STRs estudados com PCR

OBS: Quantas regiões são necessárias?

mtDNA

Características importantes: Também contém regiões polimórficas que

permitem a “individualização”;

Descendentes recebem apenas da mãe permite

traçar a linhagem materna de uma pessoa;

É mais resistente à degradação que o DNA

nuclear.

taxa mutacional do mtDNA é 5-10 vezes maior que

a do DNA nuclear poucos mecanismos de

reparo permitem que as variações nos

nucleotídeos sejam acumuladas

Princípio do método: Reação de PCR com

o objetivo de copiar extensivamente

regiões polimórficas presentes no DNA

mitocondrial, analisado posteriormente por

sequenciamento

mtDNA

mtDNA

Utilizado quando a amostra em questão tem

uma quantidade pequena ou não tem DNA

nuclear;

mtDNA

Utilizado na identificação de corpos em grandes desastres comparar a seqüência de interesse com a obtida nos possíveis irmãos ou ascendentes maternos;

Identificação de maternidade sem o pai (p/ filhos e filhas)

Não identifica um indivíduo específico;

Estudos históricos ou evolutivos.

mtDNA

STRs crY

Características importantes:

Também contém regiões polimórficas

que permitem a “individualização”;

Homens recebem apenas do pai

permite traçar a linhagem paterna de um

homem;

Crossing-over com o crX em regiões

homólogas entre os 2 cromossomos.

STRs crY

STRs crY

Identificação de paternidade sem o pai (p/

filhos);

Elucidação de estupro (mistura de DNA);

Não identifica um indivíduo específico;

Estudos históricos ou evolutivos;

Técnicas mais recentes

SNPs Minisseqüenciamento;

São muito numerosos;

Baixa taxa de mutação;

Requer maior nº de marcadores;

Indels

Estudados em produtos de amplificação muito curtos

(50pb ou menos) vantagem sobre STRs em estudos

de DNA extremamente degradado (ex: cadáver em

estado avançado de decomposição ou carbonizado)

E no futuro...

Bancos completos de perfil de criminosos

OBS:

Inglaterra

CODIS – Combined DNA Index System (1994)

Amostra de DNA “retrato falado”