Aus der Klinik für kleine Haustiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover Untersuchung von Endostatin freisetzenden Stammzellimplantaten zur Behandlung des Glioblastoms im Rattenmodell INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Kerstin Kleinschmidt aus Paderborn Hannover 2006
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Aus der Klinik für kleine Haustiere
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Untersuchung von Endostatin freisetzenden Stammzellimplantaten
zur Behandlung des Glioblastoms im Rattenmodell
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die
Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Kerstin Kleinschmidt
aus Paderborn
Hannover 2006
Wissenschaftliche Betreuung: Univ. Prof. Dr. vet. med. Ingo Nolte
1. Gutachter: Univ. Prof. Dr. vet. med. Ingo Nolte
2. Gutachter: Univ. Prof. Dr. phil. nat. Stephan Steinlechner
Tag der mündlichen Prüfung: 23. November 2006
Fördernde Institutionen: International Neuroscience Institute
3.5.1 Zellkultur................................................................................................... 53 3.5.1.1 Kultivierung der Gliomzellen .............................................................. 54 3.5.1.2 Kryokonservierung der Gliomzellen ................................................... 55 3.5.1.3 Auftauen der Gliomzellen................................................................... 56 3.5.1.4 Vitalzellzählung .................................................................................. 56
3.5.2 Behandlung der Gliomzellen vor der Implantation.................................... 57 3.5.3 Behandlung der CellBeads® vor der Implantation .................................... 59 3.5.4 Stereotaktische Implantationstechnik ....................................................... 60
3.5.4.1 Stereotaktische Implantation der Gliomzellen .................................... 62 3.5.4.2 Stereotaktische Implantation der CellBeads®..................................... 63
4.1.3 Koordinaten zur intrazerebroventrikulären Implantation der CellBeads® .. 86 4.1.4 Koordinaten für die BT4Ca-Inokulation und zweizeitige Operation .......... 88
4.2 Untersuchung der Wirksamkeit ................................................................... 91
4.2.1 Histologischer Nachweis der Implantate................................................... 91 4.2.2 Nachweis der Endostatinfreisetzung aus den CellBeads®........................ 91
4.2.2.1 Bildtafel 3 ........................................................................................... 93 4.2.3 Untersuchung der Tumorvaskularisierung................................................ 94
5.1 Diskussion der Methodik............................................................................ 109
5.1.1 Tierexperimentelles Modell..................................................................... 109 5.1.1.1 Gliomzelllinie BT4Ca........................................................................ 109 5.1.1.2 Histologie des Tumors ..................................................................... 110 5.1.1.3 Intrazerebroventrikuläre Implantation der CellBeads® ..................... 111 5.1.1.4 Biokompatibilität der implantierten CellBeads® ................................ 112
5.1.2 Untersuchungsmethoden ....................................................................... 113 5.1.2.1 Immunhistologische Untersuchung der Endostatinfreisetzung ........ 113 5.1.2.2 Wirksamkeitsuntersuchung der Endostatin CellBeads®................... 114
5.2 Diskussion der Ergebnisse der Wirksamkeitsuntersuchung.................. 118
5.2.1 Endostatinfreisetzung aus den CellBeads® ............................................ 118 5.2.2 Wirksamkeit der Endostatin sezernierenden CellBeads® ....................... 119
5.2.2.1 Immunhistologisch dargestellte Blutgefäßdichte .............................. 120 5.2.2.2 Tumorvolumina und Korrelation mit der Blutgefäßdichte ................. 123
5.3 Aussicht und Schlussbetrachtung ............................................................ 127
Beeinträchtigungen des Erinnerungsvermögens und der Sensorik sowie
Persönlichkeitsveränderungen (BRUCE et al. 2005).
Hochmaligne Gliome und diffus intrinsische Ponsgliome haben eine infauste
Prognose (JOHANNESEN et al. 2002). Die mittlere Überlebenszeit nach der
Diagnosestellung beträgt trotz intensiver chirurgischer, radio- und
chemotherapeutischer Interventionen derzeit selten mehr als 12 bis 15 Monate und
nur 8-12% der Betroffenen überleben bis zu zwei Jahren oder länger (KIOI et al.
2006).
Die Inzidenz der Glioblastome liegt bei etwa 1 bis 3 Krankheitsfällen pro 100.000
Einwohner, dies entspricht etwa 4000 bis 5000 Neuerkrankungen pro Jahr in
Deutschland. 60% der primären Glioblastome treten bei Erwachsenen älter als 50
Jahre auf (BRUCE et al. 2005). In einer klinischen Studie von 1976 lag der Anteil der
betroffenen Kinder bei 8,8% (DOHRMANN et al.1976).
2 Literaturübersicht 5
2.1.2 Histologie
Die Histogenese der Glioblastome nimmt ihren Ursprung in den Gliazellen. Die
Gesamtheit der Gliazelle mit ihren das Stützgewebe bildenden Ausläufern wird als
Glion bezeichnet. Zu den Gliazellen zählen verschiedene Zelltypen mit
verschiedenen physiologischen Aufgaben im Zentralnervensystem. Astrozyten
übernehmen Stütz- und Versorgungsfunktionen, die Mikroglia ist Bestandteil des
Abwehrsystems, Zellen der Oligodendroglia bilden die Markscheiden im zentralen
Nervensystem und Schwannsche Zellen umscheiden die peripheren Nervenfasern.
Astrozyten sind neben den Endothelzellen die Zellen des Zentralnervensystems, die
unter physiologischen Umständen zur Proliferation befähigt sind. Der Zellumsatz liegt
dann bei weniger als 1%. Neuere Arbeiten weisen daraufhin, dass auch andere nicht
neoplastisch entartete Zelltypen des ZNS, insbesondere Neurone zur Neogenese in
der Lage sind (YAMASHITA et al. 2006, WRIGHT et al. 2006). Kommt es zu einer
Störung der regulären Proliferations- und Apoptosemechanismen, kann es zur
tumorösen Entartung von Astrozyten oder Zellen der Oligodendroglia kommen, die
dann Grundlage für ein Astrozytom, Oligodendrogliom oder einen Mischtumor als
Endstadium dieser Veränderung darstellen. Der Anteil der proliferierenden und damit
die Wachstumsrate des Tumors bestimmenden Gliomzellen beträgt etwa 15 bis 30%.
Trotz einer hohen Zellverlustrate von 10 bis 80% verdoppelt sich das Tumorvolumen
alle 40 bis 50 Tage (HOSHINO 1984). Das Glioblastoma multiforme stellt sich
makroskopisch vielfältig mit Nekrosebezirken, stark vaskularisierten Bereichen und
mit teilweise großen durch Einblutungen hervorgerufenen Kavernen dar. Typisch ist
die glasige, weiche, teilweise zerfließende Textur. Am häufigsten zeigen sich
zerebello-medullär gelegene Gliome im frontotemporalen Bereich, die sich bei
Diagnosestellung oft schon über den die Gehirnhälften verbindenden Balken hinaus
bis in die andere Hemisphäre ausgedehnt haben (Schmetterlingsgliom).Histologisch
stellt sich das Glioblastom im entdifferenzierten Zustand mit einem weitgehend
pleomorphen Zellbild dar, welches durch zahlreiche Mitosen, aber auch funktionale
Zellen gekennzeichnet ist.
6 2 Literaturübersicht Zudem zeigen sich perifokal ödematisierte Strukturen und nekrotische Bereiche
werden von solchen mit deutlich erhöhter Zelldichte - so genannten Pseudopalisaden
- umgeben.
Dazu kommen Gefäßneubildungen, die durch ihre vermehrte Anzahl, abnorme
Größe und auftretende glomeruläre Strukturen gekennzeichnet sind (WAGGENER et
al. 1976). Die Blutgefäße innerhalb eines Glioblastoms weisen eine endotheliale
Hyperplasie von bis zu zehn Endothelzellen in einem Gefäßquerschnitt auf, sind
gewunden und zum Teil fenestriert (BREM et al. 1972).
2.1.3 Pathophysiologische Grundlagen
Wie GREENE u. HARVEY 1964 bereits zeigten, kommt es in der Regel nicht zur
Entstehung tumorferner Metastasen, da abgeschwemmte Gliomzellen nicht an den
Gefäßendothelien haften, in andere Gewebe einwandern und auch nicht
proliferationsfähig anwachsen können.
Die Vaskularisierungsdichte und Morphologie der Tumorblutgefäße sind
Malignitätskriterien zur Abgrenzung zwischen Gliomen der Grade III und IV nach
WHO und stellen außerdem ein entscheidendes prognostisches Kriterium dar (LEON
et al. 1996). So dient die Blut-Hirn-Schranke (BHS), die sich aus Kapillarendothel,
Basalmembran und Oberflächenmembranen der Astrozytenausläufer
zusammensetzt, in physiologischer Weise als Stoffwechselbarriere, die passiv nur
von niedermolekularen lipophilen Substanzen passiert werden kann. Bei
pathologischen Veränderungen wie Fieber, durch Bakterientoxine, aber auch durch
den Einfluss von Neoplasien kann es zu einer erhöhten Permeabilität und in Folge
dessen zur Ödembildung kommen. Die korrelierend mit dem Glioblastoma multiforme
neugebildeten Blutgefäße weisen Strukturveränderungen auf, die mit einer Störung
der BHS einhergehen.
2 Literaturübersicht 7 Sie weisen eine geringere Dichte ihres Zellverbandes mit aufgelockerten Tight
Junctions und einer veränderten Transporterproteinexpression auf, die wiederum auf
die Wirkung des vermehrt freigesetzten "Vascular Endothelial Growth Factor" (VEGF)
zurückgeführt wird (ESSER et al. 1998). Aus der vermehrten Durchlässigkeit der
Gefäße, der damit einhergehenden Ödematisierung und dem gleichzeitig innerhalb
des knöchernen Schädels zunehmenden Tumorvolumen resultiert eine Steigerung
des Gehirndrucks. Die damit einhergehende Kopfschmerzsymptomatik wird vom
Patienten meist zuerst wahrgenommenen.
2.1.4 Einteilung der Gliome und Diagnostik
Die Definition hochgradiger Gliome basiert auf histologischen Kriterien. Klinisch
erfolgt diese Klassifizierung anhand von Probebiopsien oder reseziertem
Tumorgewebe. Neben der astrozytären oder oligodendrogliären Differenzierung der
Tumorzellen werden vor allem die Merkmale der Malignität beurteilt: zelluläre
Anaplasie, mitotische und apoptotische Figuren, hohe Zelldichte,
Blutgefäßneubildung und -struktur sowie Anzahl und Ausdehnung von intratumoralen
Nekrosen (KLEIHUES u. SOBIN 2000). Die Zellen des Glioblastoma multiforme
stellen sich als anaplastische, wenig differenzierte, runde oder pleomorphe Zellen mit
teilweise mehreren meist atypischen Zellkernen dar (REARDON u. WEN 2006).
Klinisch werden Gliome in erster Linie radiomorphologisch mittels
Computertomographie (CT) und Magnetresonaztomographie (MRT) klassifiziert, da
gerade bei Hirnstammgliomen die Morbidität in Folge von Resektionen hoch und
außerdem die prognostische Relevanz der Histomorphologie gering ist. Hierbei
werden typische diffuse intrinsische Ponsgliome, typische Mittelhirngliome, dorsal
exophytische zerebello-medulläre Gliome und untypische Hirnstammgliome
unterschieden.
8 2 Literaturübersicht Zur Planung des therapeutischen Vorgehens und der Beurteilung der prognostischen
Aussichten nach einer operativen Tumorentfernung oder -reduktion werden vor allem
die Ausdehnung und Lokalisation der Neoplasien in CT und MRT dargestellt und
bewertet.
Neue molekularbiologische und immunhistologische Möglichkeiten der Diagnostik
erlauben die Darstellung von durch die Tumorzellen exprimierten Proteinen, die nicht
nur als Proliferations-, sondern auch als Identifikationsmerkmale nutzbar sind
(FACOETTI et al. 2006).
2.1.5 Klinisch-therapeutische Konsequenzen
Derzeit beschränkt sich die Therapie auf ein massives palliatives Vorgehen mit einer
chirurgischen Tumorresektion, der eine Strahlen- und/ oder Chemotherapie folgen.
Die komplette Resektion des Tumors ist auf Grund seines diffus-infiltrativen
Wachstums in der Regel ausgeschlossen, so dass der Operationserfolg auf die
Tumorreduktion beschränkt bleibt (BELLO et al. 2002). KIRSCH et al. (2000a)
beschrieben, dass das Glioblastom Metastasen hemmende Proteine sezerniert und
es durch die operative Reduktion des Primärtumors auf Grund des Wegfalls dieser
Proliferation hemmenden Wirkung zu einer Erhöhung der Rezidivrate kommen kann.
MAUFFREY (2006) zeigte aber, dass die radikale Operation direkt im Anschluss an
die Diagnosestellung die einzig wirksame Therapie ist. Sie führt eindeutig zu einer
Lebenszeitverlängerung bei im Gegensatz zur systemischen Chemo-
therapeutikagabe weitgehend erhaltener Lebensqualität. Dennoch birgt der Eingriff
Risiken wie körperliche und geistige Einbußen mit einer bei der Resektion von
Stammhirngliomen hohen Mortalität und auf Grund der sehr hohen Rezidivrate einer
mittleren Überlebenszeit von nur 12 bis 15 Monaten (BARKER et al. 1998, RAINOV
et al. 2006)
2 Literaturübersicht 9 STEWART ermittelte 2002 im Rahmen eines Reviews über die generelle
systemische Verabreichung von Chemotherapeutika bei Glioblastoma multiforme
Patienten eine Verlängerung der mittleren Überlebenszeit von 2 Monaten. BOIARDI
et al. (1999) stellten anhand einer klinischen Studie fest, dass die Überlebenszeit bei
lokal behandelten Glioblastompatienten mit 21 Monaten im Vergleich zu 15 Monaten
bei ausschließlich systemisch mittels Chemotherapeutika (Cisplatinum) behandelten
Patienten verlängert war. ANDERSEN et al. (2006) beschrieben zudem, dass auch
eine radiotherapeutische Behandlung lediglich mit einer Verlangsamung des
Krankheitsprozesses verbunden war, das Tumorvolumen aber stetig weiter zunahm.
Trotz zahlreicher Therapieansätze hat es nach DEORAH et al. (2006) seit den
achtziger Jahren durch die Anwendung der bis heute klinisch eingesetzten
Behandlungsmethoden keine signifikante Steigerung in den Überlebensraten bei
Glioblastompatienten gegeben.
Auf Grund dessen befassen sich aktuelle Untersuchungen mit dem Einsatz neuer
Therapien wie zum Beispiel der Immuntherapie, Radioimmuntherapie oder der
Beeinflussung der Neovaskularisierung (Antiangiogenese), insbesondere unter dem
Gesichtspunkt der Entwicklung lokaler Applikationsmöglichkeiten.
10 2 Literaturübersicht
2.1.6 Neue Behandlungsansätze
Einen neuen therapeutischen Ansatz zeigen Methoden aus dem Bereich der
Nanotechnologie und der Mikroverkapselung auf. Hier sind viele verschiedene
Möglichkeiten der Bekämpfung von Gehirntumoren in der Entwicklung, zu denen
sowohl lokale Immuno- und Radiotherapie, der Einsatz von Neuronen generierenden
Zellen als auch der von „Medikamentenpumpen“ gehört. Vorteil all dieser
Behandlungsansätze ist, dass sie direkt am Zielort in hohen Dosen wirken (DUNN u.
BLACK 2003). Dabei kommen minimal invasiv implantierbare Mikrokapseln und so
genannte „Bioreaktoren“ zum Einsatz. Diese enthalten verkapselte Wirkstoffe oder
Wirkstoff sezernierende Zellen und lassen so eine genaue und sichere Applikation
von therapeutischen Substanzen selbst an schwer zugänglichen Orten wie dem
operativ kaum erreichbaren Hirnstammgliom zu. BRANNON-PEPPAS u.
BLANCHETTE (2004) beschrieben mehrere Studien aus den vergangenen fünf
Jahren, die aufzeigten, dass diese als Medikamententransporter genutzten
Implantate die Applikation eines breiten Wirkstoffspektrums ermöglichten, das von
Chemotherapeutika über Angiogenesehemmer bis hin zu Radio- und
Immuntherapeutika reichte.
Die hohe Vaskularisierungsdichte des Tumors ist ein therapeutisch genutzter
Angriffspunkt. Ziel ist, die Versorgung des Tumors mit Nährstoffen und Sauerstoff zu
unterbinden, indem man antiangiogenetisch auf ihn einwirkt.
Die Folgen sind sowohl eine Tumorreduktion als auch eine langfristige
Wachstumshemmung (SON et al. 2006). Gerade im letzten Jahrzehnt wurden viele
antiangiogenetisch wirkende Proteine und ihre Wirkung auf das Wachstum von
Neoplasien untersucht. Im experimentellen Einsatz und teilweise auch bereits in der
klinischen Erprobungsphase sind Endothelzellen supprimierende Proteine wie zum
Beispiel Angiostatin, Endostatin, Avicine, Interleukin-12, Flavopiridol und Interferon
alpha. Ziel ist die minimal invasive Applikation direkt in den Tumor, um sowohl die
Blut-Hirn-Schranke zu umgehen als auch den Verlust durch Metabolisierung zu
minimieren (BRANNON-PEPPAS u. BLANCHETTE 2004).
2 Literaturübersicht 11 Bei der Anwendung des Gamma-Knifes, das auch als „Strahlenskalpell“ bezeichnet
wird und im Jahre 1968 von LEKSEL erstmalig eingesetzt wurde, werden mittels γ-
Strahlung sowohl die Tumorzellen selbst als auch die Endothelzellen der sie
versorgenden Gefäße dauerhaft geschädigt. Die Nebenwirkungen sind auf Grund der
bei einer Abweichung von nur 0,3 mm sehr hohen Präzision, mit der man auf die
neoplastischen Gewebe einwirken kann, gering. HSIEH et al. (2005) zeigten in einer
Retrospektivstudie über 5 Jahre eine allgemeine verlängerte mittlere Überlebenszeit
von 16,7 Monaten bei mittels Gamma-Knife strahlentherapierten Patienten, die
neben der direkten Tumorzellschädigung ebenfalls auf die Zerstörung
proliferierender Blutgefäße und die Unterversorgung der Gliomzellen zurückgeführt
wird.
2.1.7 Glioblastome bei Hund und Katze
Tumoren des zentralen Nervensystems sind beim Hund nicht so selten, wie lange
Zeit angenommen, bei der Katze treten sie häufig auf. Wie beim Menschen sind die
Folgen für das betroffene Tier unabhängig vom Malignitätsgrad der Neoplasie auf
Grund der Verdrängung funktionellen Gehirngewebes drastisch (NOLTE u. NOLTE
2001). Nach HEIDNER et al. (1991) liegen die mittleren Überlebenszeiten nach der
Diagnosestellung ohne Behandlung oder nur mit symptomatischer Therapie bei einer
Woche, nach der Tumorresektion bei 3 Wochen. Intrakranielle Neoplasien treten
beim Hund häufiger auf als beim Menschen (LIPSITZ et al. 2003). So sind es beim
Hund im Jahr 14,5 Fälle pro 100.000 im Vergleich zu 4-5 Fällen beim Menschen
(STOICA et al. 2004). Das GBM ist weltweit bei Hunden sehr selten und tritt bei
Katzen etwas häufiger auf. Besonders häufig sind brachycephale Rassen betroffen
mit einer Rassedisposition für Boston Terrier, Englische Bulldoggen und
insbesondere Boxer. Die Inzidenz ist bei über 6 Jahre alten Hunden erhöht. Einen
geschlechtsspezifischen Einfluss gibt es nicht (OBERMAIER et al. 1995, STOICA et
al. 2004).
12 2 Literaturübersicht Die caninen glialen Tumoren sind den humanen sowohl morphologisch als auch
immunhistologisch sehr ähnlich und ebenfalls hauptsächlich in den
Gehirnhemispheren, dem Thalamus, dem Hypothalamus und dem Stammhirn
lokalisiert (STOICA et al. 2004). Sie zeigen ebenfalls eine erhöhte Zelldichte und
Vaskularisierung, Pleomorphismus, Zellkernpolygonie, mitotische Aktivität und die
Bildung von Nekrosen umgebenden Pseudopalisaden (LIPSITZ et al. 2003). Die
Vergleichbarkeit von Gliomen im Hund und im Menschen macht die klinischen
Erfahrungen und Retrospektiverkenntnisse aus der Veterinärmedizin zum einen
wichtig für die Humanmedizin, zum anderen ermöglicht diese die Anwendung von für
den Menschen entwickelten Medikamenten auch beim Hund (SNYDER et al. 2006).
Auch die mit schnell wachsenden Gehirntumoren einhergehenden Symptome bei
Hund und Katze ähneln denen des Menschen. So beschrieben LIPSITZ et al. (2003)
bei fünf Hunden mit GBM Ataxien bis hin zur Tetraparese, Kopfschiefhaltung,
Nystagmus und Benommenheit. Vier der fünf Tiere zeigten zudem einen Drang nach
rechts, der sich in im Kreisgehen und einer Kopf-rechts-Haltung äußerte. Ähnliche
Symptome beschrieben STOICA et al. 2004 und HIGGINS et al. 2001 für
Astrozytome und granuläre ZNS Tumoren bei Hunden. DICKINSON et al. (2000)
erhoben diese neurologischen Befunde ergänzt durch eine reduzierte optische
Antwort auf eine Drohreaktion bei zwei Katzen mit Oligodendrogliomen.
Grundsätzlich sind die therapeutischen Probleme bei der Behandlung glialer
Tumoren der Haustiere die gleichen wie in der Humanmedizin. Auch in der
Veterinärmedizin gibt es Ansätze zur chemotherapeutischen Behandlung von
Gliomen, wobei die meisten Berichte über Lomustin vorliegen. Die Resultate waren
jedoch nicht zufrieden stellend und es waren keine Verlängerungen der
Überlebenszeiten zu ermitteln (DOBSEN et al. 2003).
Die Diagnosestellung erfolgt beim Kleintier wie beim Menschen anhand der
Darstellung mittels Computertomographie (CT) oder Magnetic Resonance Imaging
(MRI). Eine Differenzierung der verschiedenen Gehirntumoren ist aber so aufgrund
der allegorischen Ähnlichkeit vieler Gehirntumoren in der Regel nicht möglich
(KRAFT et al. 1997, FUCHS et al. 2003).
2 Literaturübersicht 13 Die prognostische und damit therapieentscheidende Bedeutung des
Malignitätsgrades ist aber gerade bei intrakraniellen Neoplasien wie dem GBM aus
klinischer Sicht immens. Eine diagnostische Option stellt die Färbung und
lichtmikroskopische Darstellung von Zellausstrichen nach stereotaktisch platzierter
Nadelbiopsie dar (FERNANDEZ et al. 1997). So stellten VERNAU et al. (2001) dar,
dass sich das canine Glioblastom anhand seiner glomerulären Blutgefäßformation
sowie anhand einer vermehrten Karyomegalie gut von den besser differenzierten
Astrozytomen unterscheiden lässt. STOICA et al. (2004) entwickelten zudem
immunhistochemische Untersuchungsmethoden zur Spezifizierung von
Tumorbiopsien. So konnten sie in 84% der untersuchten Tiere positive
Immunreaktionen des sauren Gliafaserproteins (GFAP, Glial fibrillary acidic protein)
nachweisen. Außerdem konnten sie zeigen, dass sowohl das Tumorsupressorgen
p53 als auch der Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) reduziert waren.
NOLTE et al. konnten 2005 eine verbesserte MRI Darstellung intrakranieller
Tumoren und ihrer Demarkation durch die Anwendung von superparamagnetischen
Eisenoxiden (SPIO) als Kontrastmedien belegen.
Die singuläre Strahlentherapie von Gliomen bei Haustieren führt zu vergleichbaren
Erfolgen wie die Tumorresektion. BREARLY et al. fanden 1999 in einer Studie
mittlere Überlebenszeiten von 40 Wochen nach alleiniger Strahlentherapie und von
44 Wochen nach einer Kombination von Tumorresektion und Bestrahlung heraus.
Eine andere Studie (HEIDNER et al. 1991) ergab nur mittlere Überlebenszeiten von
20 Wochen nach strahlentherapeutischer Intervention. Im Vergleich zu den
Therapieerfolgen beim Menschen sind die Verlängerungen der Überlebenszeit nach
Behandlung beim Hund von einer auf bis zu 44 Wochen gravierend. Da aber in die
zum Hund vorliegenden Retrospektivstudien nicht nur das Glioblastoma multiforme,
sondern auch andere gliale Tumoren eingegangen sind, sind diese Daten nur
bedingt vergleichbar.
14 2 Literaturübersicht
2.2 Experimentelles Glioblastom-Modell
Für ein geeignetes Tiermodell zur Induktion eines reproduzierbaren Tumors gibt es
diverse Ansätze. Dabei wurden Gliomzellen, die zuvor in vitro kultiviert worden
waren, als Zellsuspensionen oder auch zusammenhängende in vivo oder in vitro
gezüchtete Tumorgewebe transplantiert. Besonderes Augenmerk liegt auf den
Variablen wie der verwendeten Tierart, der Tumorzelllinie, der Menge der
implantierten Gliomzellen, der Inokulationslokalisation sowie dem
Behandlungsbeginn und der Applikationsmethodik der angewendeten Therapeutika.
IWADATE et al. (2005) injizierten Ratten 105 Gliomzellen der Zelllinie 9L 4 mm
posterior und 3 mm lateral zur Kreuzungsstelle der Sutura interfrontalis und der
Sutura sagittalis (Bregma) nach Bohrlochtrepanation mittels einer Mikroliterspritze mit
einer 25-gauge Nadel direkt in das Parenchym der rechten Hemisphäre und starteten
die folgende Behandlung per Injektion an denselben Koordinaten, nachdem der
Tumor drei Tage gewachsen war.
In einem anderen Modell wurden Mäusen 5 x 104 U87 Gliomzellen nach
Schädeltrepanation intraparenchymal injiziert und acht Tage nach der
Tumorinokulation mit einer intraperitonealen Endostatininjektion begonnen
(SCHMIDT et al. 2004).
Für eine MRI (magnetic resonance imaging) Studie wurden Ratten C6-Gliomzellen
intrakraniell implantiert (BEAUCHESNE et al. 2003). BEUTLER et al. (1999)
verwendeten ebenfalls C6-Gliomzellen, implantierten diese aber subkutan in den
Nacken von Ratten sowie auch von Mäusen, um ein Glioblastommodell zu
entwickeln.
TSENG et al. (2004) implantierten Fischer-Ratten 105 RT-2-Tumorzellen, in 10 µl
Phosphatpuffer (PBS) suspendiert, subkutan in die rechte Flanke und starteten die
Behandlung direkt im Anschluss beziehungsweise nach fünf Tagen, um ein Modell
mit variablen Tumorgrößen zu entwerfen.
2 Literaturübersicht 15
YANG et al. (2005) entwickelten ein reproduzierbares Tumormodell, indem sie die
Zelllinie F98 aus CD-Fischerratten gewannen, nachdem sie diese mit N-ethyl-N-
Nitroseharnstoff behandelt hatten, um die Entartung der Zellen auszulösen. Nach der
in vitro Kultivierung der gewonnenen Zellen wurden jeweils 103, 104 und 105 dieser
zu CD-Fischer-Ratten syngenen Zellen stereotaktisch in den rechten Nucleus
caudatus implantiert. DRUCKREY u. LANDSCHUTZ (1971) generierten auf dieselbe
Weise zu BDIX-Ratten syngene BT4C-Gliomzellen. Die Syngenität dieser Zelllinie
zu BDIX-Ratten wurde durch die Typisierung der MHC-Komplexe überprüft
(BEUTLER et al. 1999).
Die Glioblastomzelllinie BT4C wurde häufig verwendet, um ein reproduzierbares
Glioblastom in Ratten hervorzurufen. Sie wurden zur Entwicklung eines
Gehirntumormodells erfolgreich per Injektionem nach Schädeltrepanation
intraparenchymal beziehungsweise in das Corpus Callosum von weiblichen BDIX-
Ratten implantiert (LEHTIMÄKI et al. 2003, GRIFFIN et al. 2003).
READ et al. (2001a) injizierten mittels einer Mikroliterspritze 8 x 103 BT4C
Gliomzellen intraparenchymal in die rechte Gehirnhemisphäre. Gleichzeitig
implantierten sie an derselben Stelle Endostatin produzierende „Bioreaktoren“, um
deren Wirksamkeit zu untersuchen. In einer anderen Arbeit wurden C6-Gliomzellen
verwendet, die als zusammenhängende Zellsphäroide auf Alginat nach der
Gehirnpräparation direkt auf den Gehirnhemisphären platziert wurden (READ et al.
2001b).
16 2 Literaturübersicht 2.3 Angiogenese
2.3.1 Einführung
Unter Angiogenese wird die von bereits bestehenden Gefäßen ausgehende kapillare
Einsprossung in das umgebende Gewebe als Folge der Proliferation, Differenzierung
und Migration von Endothelzellen verstanden. Diese Vorgänge sind im Körper streng
reguliert und bewegen sich in einer feinen Balance (PEROULIS et al. 2002).
Im gesunden adulten Organismus überwiegen die die Gefäßbildung hemmenden
Botenstoffe gegenüber der Konzentration der Aktivatoren. Bei einem proliferierenden
Glioblastom ist dieses Gleichgewicht zu Gunsten der Angiogeneseförderer
verschoben (O`REILLY et al. 1997). So synthetisieren Glioblastomzellen fünfzigmal
mehr Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) als Zellen eines geringergradigen
Astrozytoms (PLATE et al. 1993). Hinzu kommt, dass der Rezeptor für VEGF,
KDR/Flk-1, der von Endothelzellen in gesundem Gehirngewebe regulär nicht
exprimiert wird, von Tumorzellen in hohem Maße synthetisiert wird (PLATE et al.
1992). Ohne einen auslösenden Reiz haben Endothelzellen eine Teilungsrate von
nur 0,01%, was bedeutet, dass sich eine Endothelzelle bei Durchlaufen eines
normalen Zellzyklus nur ca. alle drei Jahre teilt. Erhöhte Teilungsraten findet man
beispielsweise während der Reproduktionszyklen, der Schwangerschaft, bei
Wundheilungsprozessen, im Zusammenhang mit der Retinopathia diabetica und
beim Wachstum von Tumoren (ENGERMANN et al. 1967; HOBSON u. DENEKAMP
1984).
2 Literaturübersicht 17 2.3.2 Angiogenese im Glioblastoma multiforme
Bis zu einer Größe von 2 mm³ werden die sich teilenden Gliomzellen durch Diffusion
aus der Umgebung und den Liquorfluß ausreichend versorgt. Proliferieren sie
darüber hinaus, ist das Wachstum von da an angiogeneseabhängig. Sobald die
morphologische Tumorbildung einmal begonnen hat, ist jede Zunahme der
Zellpopulation auf die Zubildung von Blutgefäßen angewiesen (FOLKMAN 1990),
wobei dann jede weitere Endothelzelle nach DHANABAI et al. (1999) rechnerisch
das Wachstum von 50 bis 100 Gliomzellen ermöglicht. Diese Abhängigkeit des
Tumorwachstums von der Entstehung neuer Blutgefäße wird auch durch die Abläufe
bei der Bildung von Tumormetastasen verdeutlicht. Häufig können Fernmetastasen
erst Monate oder Jahre nach der Operation des Primärtumors auftreten („tumor
dormancy“). Vermutlich hängt dies damit zusammen, dass zwischen der Entstehung
einer Mikrometastase und der Ausbildung von Kapillaren, die Voraussetzung für
einen klinisch relevanten Tumorprogress ist, eine längere zeitliche Verzögerung liegt
(„angiogenic switch“) (HOSSFELD et al. 2001).
Das Ausmaß der Blutgefäßneubildungen und das Auftreten hypoxischer Bereiche
sind direkt mit der Malignität und vor allem der schlechteren Prognose eines Tumors
assoziiert. Die Untersuchung der Tumorvaskularisation ist eine Möglichkeit zur
Abschätzung des Dysplasiegrades von Tumoren.
Werden Tumorzellen hypoxischem Stress ausgesetzt, so wird Hypoxia-Inducable-
Factor-1 (HIF-1) aktiviert, der die Transkription verschiedener Gene promotet. Es
werden Proteine sezerniert, die sich fördernd auf die Neovaskularisierung auswirken,
darunter Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), Glutaminasen (GLUTs) und
glykolytische Enzyme (PLATE et al. 1992). Unter normalen Sauerstoffbedingungen
und in gesundem Gewebe wird HIF-1 durch einen Proteasekomplex unterdrückt und
es finden keine angiogenetischen Prozesse statt (LUO et al. 2006).
18 2 Literaturübersicht
WESSELING et al. (1997) zeigten auf, dass in Glioblastomen ein Circulus vituosus
entsteht. Die Versorgung mit Blutgefäßen ist nicht nur Bedingung für die
Tumorproliferation. Eine erhöhte Vaskularisierungsdichte und die damit
einhergehende Interaktion zwischen Gliomzellen und Endothelzellen sowie die
erhöhte Nährstoffversorgung treiben die Gliomzellproliferation zudem voran. Diese
Gliomzellen wiederum rekrutieren durch die HIF-1 Ausschüttung neue Blutgefäße.
LUSE zeigte bereits 1960 mittels Elektronenmikroskopie, dass sich auch der
endotheliale Aufbau der Gefäßstrukturen im gesunden Gehirngewebe von denen
diverser Gehirntumoren deutlich unterschied. So war sowohl die allgemeine
Gefäßform anders strukturiert, wobei die Astrozytenendfüße durch Gliomzellen
ersetzt waren, als auch eine vermehrte Extrazellularmatrix mit doppelter
Basalmembran zu finden. Nachfolgende Studien zeigten ein verdünntes Endothel
sowie vermehrte Vesikel und Fenestrierungen (HIRANO u. MATSUI 1975). Der
kapillare Aufbau in einem Glioblastom ist in Abbildung 1 schematisch dargestellt.
2 Literaturübersicht 19
E
P
GZ
EZMEZM
AE
BMBA
L L
fE
P
Abbildung 1 Physiologische Struktur von Kapillaren (A) und Kapillaren im Glioblastom (B) modifiziert nach FISCHMANN (2004) Die Astrozytenendfüße (AE) sind im Tumor durch Gliomzellen (GZ) ersetzt. Die
Extrazellulärmatrix (EZM) ist vermehrt und weist eine Trennung der
Basalmembranen (BM) auf. Das Endothel (E) der Tumorgefäße ist schmal und
fenestriert (fE). (L)= Lumen, (P)= Perizyt
2.3.3 Therapieansätze zur Hemmung der Angiogenese
Die Inhibition der Angiogenese bietet einen Ansatz zur Behandlung von Tumoren,
Diabetes bedingter Nephropathie, Arthritis und Psoriasis, wohingegen die Stimulation
der Angiogenese beispielsweise zur Therapie von Erkrankungen der
Herzkranzgefäße, Herzversagen und bei Gewebeverletzungen eingesetzt wird
(PANDYA et al. 2006).
Aus der direkten Beziehung zwischen Prognose des GBM und seiner
Vaskularisierung ergibt sich die Hemmung der Blutgefäßneubildung als
therapeutischer Ansatz zu seiner Behandlung.
20 2 Literaturübersicht Alle Angiogenesehemmer wirken, anders als beispielsweise Chemotherapeutika,
fokussiert auf ihr Ziel, so dass sie aktiv gegen den Tumor, aber nicht toxisch
gegenüber Zellen des gesunden Gewebes sind (FOLKMAN 2006).
Die bislang am besten untersuchten endogenen Angiogenesefaktoren sind
endotheliale Wachstumsfaktoren wie VEGF, "Fibroblast Growth Factor" (FGF),
"Platelet-Derived Growth Factor" (PDGF), Angiogenin, Interleukin-8 (IL-8) und
Proteine aus der Familie der Matrixmetalloproteinasen. Es werden ständig weitere an
der Angiogenese beteiligte Faktoren und ihre Rezeptoren untersucht und damit
einhergehend auch immer mehr antiangiogenetisch wirksame Moleküle. Dazu
gehören vor allem die endogenen Faktoren Angiostatin, Endostatin,
Thrombospondin-1 und -2, und chemische Verbindungen wie das
Fumagillinanalogon AGM-1470 oder Inhibitoren der Matrixmetalloproteinasen wie
TIMP-1 (KUNZ u. HARTMANN 2002).
In den letzten Jahren wurde eine Reihe von Medikamenten entwickelt, die spezifisch
bestimmte Schritte der Neoangiogenese blockieren sollten. Die
Angiogeneseinhibitoren, die zurzeit klinisch getestet werden, lassen sich in vier
Klassen mit unterschiedlichen Wirkungsmechanismen aufteilen (HOSSFELD et al.
2001):
1) Matrixmetalloprotease-Inhibitoren
2) Inhibitoren für Endothelzellen
3) Inhibitoren der pro-angiogenetischen Faktoren
4) Integrinantagonisten
Derzeit sind 28 endogene Angiogeneseinhibitoren bekannt, wobei Endostatin der
erste ist, der als Fragment der Extrazellulärmatrix identifiziert wurde. Die ersten
Angiogeneseinhibitoren sind von der Food and Drug Administration (FDA) in den
USA und 28 Nationen für die Tumortherapie zugelassen worden (FOLKMAN 2006).
Für Endostatin gibt es noch keine Zulassung in den USA und in Europa. Einen
Überblick gibt die Tabelle 2.
2 Literaturübersicht 21
Tabelle 2 Von der FDA zugelassene Angiogeneseinhibitoren
Angiogenesis inhibitors approved by the FDA in the U.S. and in 28 other countries including endostatin (China) and Macugen (U.S. and Brazil) Date approved Drug Place Disease December 2003 Thalidomide Australia Multiple myeloma February 2004 Avastin U.S. (FDA) Colorectal cancer November 2004 Tarceva U.S. (FDA) Lung cancer December 2004 Avastin Switzerland Colorectal cancer December 2004 Macugen U.S. (FDA) Macular degeneration January 2005 Avastin European Union (25 countries) Colorectal cancer September 2005 Endostatin (Endostar) China (SFDA) Lung cancer aus: FOLKMAN (2006)
2.4 Endostatin
2.4.1 Einführung
Die Struktur des antiangiogenen Peptids Endostatin entsteht als Spaltprodukt der C-
terminalen, als „Non-Collagenous“ bezeichneten Domäne des Kollagen XVIII.
Ähnlich wie für Kollagen XVIII selbst (REHN et al. 1996) sind für Endostatin
verschiedene Varianten mit unterschiedlichen N-Termini und Längen beschrieben
worden (SASAKI et al. 1998). Zudem bestehen Unterschiede zwischen humanem
Endostatin und dem anderer Spezies. Die humanen Endostatinformen sind zum
Beispiel 12 Aminosäuren kürzer beziehungsweise 4, 9 und 14 Aminosäuren länger
als die murinen Endostatine (STÄNDKER et al. 1997, FELBOR et al. 2000). Aus
dieser Beobachtung lässt sich schließen, dass an unterschiedlichen
Produktionsorten und in verschiedenen Geweben wahrscheinlich unterschiedliche
Endostatinformen hergestellt werden, die eventuell differierende antiangiogenetische
Potenz haben. Die Genkarten für humanes Endostatin (COL18A1) als Spaltprodukt
von Kollagen, Typ XVIII, alpha 1, die Ratte (Rattus norvegicus, Col18a1; collagen,
type XVIII, alpha 1), Mausendostatin (Mus musculus, Col18a1; procollagen, type
XVIII, alpha 1), Hühnerendostatin (Gallus gallus, COL18A1; collagen, type XVIII,
alpha 1), den Zebrafisch (Danio rerio, AJ494837), die Fruchtfliege (Drosophila
melanogaster, CG331711; CG33171-PE, isoform E) und den Hund (Canis lupus f.
familiaris, LOC4747781, similar to Collagen alpha 1(XV) chain precursor) liegen vor.
22 2 Literaturübersicht
Für die Katze wurden das entsprechende Gen und Protein noch nicht beschrieben.
Die Sequenzhomologie zwischen humanem und caninem Endostatin beträgt 83.76%
auf Nukleinsäureebene beziehungsweise 82.27% auf Aminosäureebene
(WEIZMANN 2006). KAMSTOCK et al. (2006) infundierten Hunden mit
Weichteilsarkomen canine Endostatin DNA, um seine Tumor supprimierende
Wirkung zu untersuchen. Es wird vor allem in lymphoidem, konnektivem und
epithelialem Gewebe, der Nebenniere, dem Pankreas und der Niere sezerniert.
(MARNEROS, A. G. u. B. R. OLSEN 2005). Die strukturellen Unterschiede
ermöglichen eine Antikörper vermittelte Differenzierung und damit den
immunhistologischen Nachweis speziesverschiedener Endostatine (LI, et al. 2005).
So verwendeten ROSSMEISL et al. (2002) einen polyklonalen Kaninchen Antikörper
gegen rekombinantes canines Endostatin in einem enzymatischen Immunoassay
(EIA) zur Detektion der Endostatinkonzentration im Serum von an malignen
Neoplasien erkrankten Hunden.
Endostatin entsteht, indem es durch Pankreas-Elastase und Cathepsin L
proteolytisch aus der Non-Collagenous 1-Domäne des Kollagen XVIII, welches als
Gerüsteiweiß hauptsächlich in perivaskulären Membranen zu finden ist, abgespaltet
wird (WEN et al. 1999, FELBOR et al. 2000). Das entstehende Peptid ist 22 kD
schwer. In Abbildung 2 ist Kollagen mit seiner Endostatinendung schematisch
dargestellt.
Über die Halbwertszeit von Endostatin sind in der Literatur unterschiedliche Angaben
zu finden. So findet sich bei JOKI et al. (2000) die Angabe, nach 7 Stunden sei die
Hälfte des Proteins abgebaut. BJERKVIG et al. (2003) sprechen von 10,7 Stunden.
2 Literaturübersicht 23
Abbildung 2 Schematische Darstellung der Endostatinsynthese aus Kollagen XVIII
Cathepsin L und Pankreas-Elastase spalten Endostatin aus der Non-
Collagenous Domäne-1 des Kollagen XVIII proteolytisch ab.
2.4.2 Wirkungen
Nach wie vor ist der antiangiogene Wirkungsmechanismus des Endostatins nicht
vollständig geklärt. Es wirkt sich auf ein sehr breites Spektrum an Angriffspunkten im
Zusammenhang mit der Proliferation, Differenzierung, Migration und Apoptose von
neovaskulären Endothelzellen aus. Außerdem beeinflusst es sowohl die Verbindung
zwischen den Endothelzellen und der umgebenden Matrix als auch den
zytoskelettären Aufbau der Zellen selbst (DIXELIUS et al. 2002; KEEZER et al.
2003). KIM et al. zeigten 2002 auf, dass Endostatin an KDR/Flk-1, den Rezeptor des
VEGFs, bindet. Durch diese Bindung interagiert es mit der Signaltransduktion des
VEGF, indem es die VEGF induzierte Phosphorylierung der Kinase (Erk1/2) reduziert
und somit die nachfolgenden Angiogenese induzierenden intrazellulären Schritte
blockiert (PETERSEN et al. 2005, GETMANOVA et al. 2006).
Zusätzlich interagiert es mit den a5- und aV-Integrinen und die daraus folgende
Angiogenese hemmende Wirkung besteht eventuell in einem sich negativ auf die
Endothelzellproliferation auswirkenden antiadhäsiven Mechanismus (REHN et al.
2001, SUDHAKAR et al. 2003).
Non- Collagenous Domäne-1
Endostatin
--Elastase
Pankreas
Proteolyse
Cathepsin LCathepsin L
Proteolyse Kollagen XVIII
Non-Collagenous-Domäne-1
Pankreas Elastase
24 2 Literaturübersicht
Nach DHANABEI et al. (1999) hat Endostatin zudem eine damit einhergehende
Endothelzell-Apoptose fördernde Wirkung, für die die verminderte Expression der
antiapoptotischen Proteine Bcl-2 und Bcl-XI verantwortlich gemacht wird.
Außerdem bindet Endostatin an Heparin und auch an Heparansulfate. Für den
Zur Entwicklung therapeutischer Ansätze zur Behandlung des Glioblastoms wurden
alginatverkapselte xenogene Zellen bereits erfolgreich in immunkompetenten Ratten
(READ et al. 2001a) als Heterotransplantate in einem Mausmodell (JOKI et al. 2001)
und sowohl subkutan als auch intrakraniell bei Tumoren in Mäusen (READ et al.
2001b) angewendet.
38 2 Literaturübersicht
Grundsätzlich gibt es verschiedene Optionen zur intrazerebralen Behandlung mit
alginatverkapselten Zellen. Eine Möglichkeit ist die Applikation in das Liquor führende
System: den Subarachnoidalraum oder die Gehirnventrikel. Von dieser
Implantationslokalisation ausgehend ist die Verteilung therapeutischer Substanzen
durch die Fließrichtung der Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) gesteuert. Dieser Fluss ist
von der Produktionsstelle, dem Plexus Choroideus in den Ventrikeln, zu den
Arachnoidalvilli gerichtet, von wo aus der Liquor gefiltert und dem abführenden
venösen System zugeführt wird. Optional können Alginatbeads direkt in das
Parenchym implantiert werden, wo die Implantate fest im Gewebe liegen und
sezernierte Proteine in die direkte Umgebung abgeben. Bei der Implantation in
Liquor führende Räume kommt es zu einer weiter reichenden Verteilung der
Substanzen, aber auch zu einer größeren Verdünnung. Zur Behandlung des
Glioblastoms ist die Applikation in eine Tumorresektionshöhle oder direkt in das
Tumorgewebe hinein möglich. So werden möglichst hohe Konzentrationen
antitumoröser Wirkstoffe direkt am beziehungsweise im Tumor selbst erreicht
(VISTED et al. 2001).
Eine Glioblastomtherapie mittels mikroverkapselter Zellen ist nicht dazu geeignet alle
Tumorzellen zu vernichten und den Patienten zu heilen, sondern sie soll ein lokale
Tumorkontrolle erreichen und so aus einer definitiv tödlich verlaufenden Krankheit
ein chronisches, handhabbares Leiden machen (VISTED u. LUND-JOHANSEN
2003).
2 Literaturübersicht 39
2.6 Ziel der vorliegenden Arbeit
Das Ziel der vorliegenden Arbeit waren die Entwicklung eines reproduzierbaren
Glioblastommodells in der Ratte und die Untersuchung einer ex vivo Gentherapie zur
Behandlung eines induzierten Glioblastoma multiforme (GBM) mit
alginatverkapselten humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC), die so
gentechnisch modifiziert wurden, dass sie das antiangiogene Protein Endostatin
freisetzten. Zunächst sollte die Kultivierung der verwendeten Gliomzelllinie etabliert
und die zur Implantation geeignete Zellzahl zum Erhalt eines experimentellen GBM,
das qualitative Gruppenvergleiche zulässt, gefunden werden. Außerdem musste eine
stereotaktische Implantationstechnik zur Inokulation der Gliomzellen und zur
Implantation der zu untersuchenden Mikrokapseln entworfen werden. Dabei mussten
geeignete Koordinaten zur Gliomzellinokulation und zur Implantation der
Alginatbeads gefunden werden. Diese sollten einerseits eine Applikation der
Implantate intraparenchymal mit Kontakt zum Ventrikelsystem
(intrazerebroventrikulär) und andererseits eine intraparenchymale Implantation des
Tumors erlauben. Dabei sollten Mikrokapseln und Tumor zudem möglichst nah
beieinander lokalisiert sein, ohne dass aber die rein mechanische Einwirkung der
Implantation der Alginatbeads Auswirkungen auf das Tumorwachstum hatte. Im
Anschluss an die Etablierung des Modells war mittels immunhistologischer
Markierung der Nachweis der Endostatinfreisetzung und damit die Funktionalität der
verwendeten, von der Firma CellMed AG (Alzenau, Deutschland) hergestellten
Alginat-Mikrokapseln (CellBeads®) nach intrazerebraler Implantation aufzuzeigen.
Außerdem sollte die Wirksamkeit sowohl Endostatin sezernierende MSC
enthaltender CellBeads® (Endostatinbeads, ECB) als auch nicht genetisch
modifizierte hTERT-MSC enthaltender CellBeads® (Stammzellbeads, SCB) auf das
Glioblastom im Vergleich zu leeren Alginatkapseln (Leerbeads, LCB)
beziehungsweise unbehandelten Tumoren untersucht werden.
Untersuchungsparameter waren hierbei die Blutgefäßdichte und –morphologie sowie
das Tumorvolumen, die sowohl histologisch als auch immunhistologisch zu prüfen
waren.
40 2 Literaturübersicht
Aufbauend auf den Ergebnissen einer vorausgegangenen Dissertationsarbeit
(BARTSCH 2005) sollte die Wirksamkeit der verwendeten CellBeads® unter GLP-
Bedingungen (Good Laboratory Practice) als Voraussetzung für die Beantragung der
klinischen Anwendung getestet werden. Dazu war das tierexperimentelle
Glioblastommodell zu standardisieren und die Untersuchungsergebnisse unter den
Vorgaben der GLP zu quantifizieren.
Die Etablierung des Glioblastommodells in der BDIX-Ratte wurde nach folgenden
Gesichtspunkten durchgeführt:
1. Entwicklung einer standardisierten Kultivierung der verwendeten syngenen
Gliomzelllinie BT4Ca.
2. Überprüfung der geeigneten zu implantierenden BT4Ca-Zellzahl um einen
reproduzierbaren Tumor nach einer definierten Überlebenszeit zu erhalten.
3. Ermittlung der geeigneten Koordinaten und Applikationsmethodik für die
Implantation sowohl der Gliomzelllinie BT4Ca als auch der zu
untersuchenden CellBeads®.
Die Untersuchung der Wirksamkeit der Endostatin sezernierende humane mesenchymale Stammzellen enthaltenden CellBeads® auf das Glioblastom
erfolgte unter Berücksichtigung folgender Fragestellungen:
1. Kommt es nach einer Implantation Endostatin sezernierende hTERT-MSC
enthaltender Mikrokapseln (ECB) über einen Zeitraum von 12 Tagen zu
einer Wirkstofffreisetzung von Endostatin und wo ist das Protein
intrazerebral zu finden?
2. Besteht nach der Implantation Endostatin sezernierende hTERT-MSC
enthaltender Mikrokapseln (ECB) eine Wirksamkeit auf die Blutgefäßdichte
innerhalb des Glioblastoms?
3. Besteht nach der Implantation Endostatin sezernierende hTERT-MSC
enthaltender Mikrokapseln (ECB) eine Wirksamkeit auf das
Glioblastomwachstum?
3 Untersuchungsgut und Methoden 41
3 Untersuchungsgut und Methoden
3.1 Tiere
3.1.1 Herkunft
Die Versuchstiere wurden im SPF-Bereich des Institutes für Versuchstierkunde und
dem Zentralen Tierlaboratorium der Medizinischen Hochschule Hannover gezüchtet
und wurden zur Versuchsdurchführung in die Tierhaltung des S1-Bereiches des
International Neuroscience Institute Hannover (INI GmbH) überführt.
Zur Durchführung der Versuche zur Etablierung der Methodik wurden 31 weibliche
BDIX/Ztm-Ratten eingestellt. Diese waren zwischen 8 und 12 Wochen alt und wogen
zwischen 200 und 350 Gramm.
Für die Überprüfung der Wirksamkeit von Endostatin freisetzenden CellBeads® wurden 40 weibliche BDIX/Ztm-Ratten eingestellt. Die Tiere waren zum Zeitpunkt der
Versuchsdurchführung 10 bis 14 Wochen alt und wogen zwischen 250 und 350
Gramm.
3.1.2 Haltung und Fütterung
Die Tiere wurden in Gruppengrößen bis zu drei Tieren in Makrolon®- Käfigen Typ IV
unter kontrollierten, standardisierten Umweltbedingungen gehalten. Gefüttert wurde
ad libitum ein pelletiertes Haltungsfutter (Altromin® Alleinfuttermittel 1324, Altromin
GmbH, Lage). Die Tiere hatten stets freien Zugang zu Trinkwasser über Makrolon®-
Flaschen. Es wurde Standardweichholzgranulat für Labortiere (Altromin) als
Käfigeinstreu verwendet. Die Raumtemperatur betrug während der gesamten
Haltungsdauer 23°C ± 2°C bei einer Luftfeuchtigkeit von 55% ± 5%. Die Beleuchtung
erfolgte ausschließlich durch Kunstlicht bei <250 Lux im Raum und <60 Lux im
Käfigbereich in einem kontinuierlichen Tag-Nachtzyklus mit einer Dunkelphase von
12 Stunden und einer entsprechenden Hellphase von 6:00 bis 18:00 Uhr MEZ.
42 3 Untersuchungsgut und Methoden
Die Versuchstiere wurden wöchentlich in saubere Käfige mit frischer Einstreu
umgesetzt und erhielten zweimal wöchentlich frische Futterpellets und frisches
Trinkwasser.
Alle Tiere wurden frühestens nach einer Eingewöhnungszeit von einer Woche an die
herrschenden Umgebungsbedingungen operiert. Im Anschluss an die Operationen
wurden die Tiere für eine Dauer von mindestens 5 Tagen einzeln in Makrolon®-
Käfigen Typ III gehalten.
Die Haltung und Versuchsabläufe wurden in einem Versuchstierbuch dokumentiert.
Darin wurden Tierstamm, Geschlecht, Geburtsdatum, Einstellungsdatum, Herkunft,
Projektzugehörigkeit, Aktenzeichen des genehmigten Tierversuchsvorhabens,
Narkoseart, Art des Eingriffs, Datum des Eingriffs, Euthanasiemethode und -datum
festgehalten und diese Daten sowohl vom Experimentator als auch vom
Versuchsleiter durch Unterschrift bestätigt.
Alle Untersuchungen wurden durch die verantwortliche Regierungsbehörde
Hannover unter den Aktenzeichen 509.6-42502-04/758 und 33.42502-05/1022
genehmigt und fanden ausschließlich im S1- Bereich des International Neuroscience
Institute Hannover (INI GmbH) statt.
3.1.3 Narkose und Analgesie
Zur Durchführung der Experimente wurden die Tiere mittels intraperitonealer
Injektionsnarkose bestehend aus Ketanest® (Wirkstoff: Ketamin, 75 mg/kg KGW,
Pfizer, Karlsruhe, Deutschland) und Domitor® (Wirkstoff: Medetomidin, 0,2 mg/kg
KGW, Pfizer) für eine Dauer von durchschnittlich 45 Minuten narkotisiert.
Die Narkosetiefe wurde während des gesamten Eingriffs durch Überprüfung der
Reflexe anhand des Zwischenzehenreflexes und des Lidreflexes überwacht.
Bei Wiedereinsetzen eines Tiefenschmerzreflexes erfolgte eine Narkose-
verlängerung durch intraperitoneale Verabreichung von Ketanest® (20 mg/kg KGW).
3 Untersuchungsgut und Methoden 43
Bis zum Aufwachen standen die Tiere unter Beobachtung und wurden zur
Vermeidung einer Hypothermie warm gehalten. Zur postoperativen Analgesie wurde
den Tieren Novaminsulfon ratiopharm® (Wirkstoff: Metamizol-Natrium, 110 mg/kg
KGW, Ratiopharm, Ulm, Deutschland) oral nach Einsetzen des Schluckreflexes und
weiterhin über das Trinkwasser während des gesamten Untersuchungszeitraumes
verabreicht.
Die Tiere wurden während der gesamten postoperativen Phase zweimal täglich auf
ihr Allgemeinbefinden hin untersucht und die Befunde dokumentiert. War das
Allgemeinbefinden eines Tieres, insbesondere seine Futteraufnahme, gestört, so
wurde dieses euthanasiert.
3.2 Implantate: CellBeads®
3.2.1 Herkunft
Die alginatverkapselten Implantate (CellBeads®) wurden durch die Firma CellMed AG
(Alzenau, Deutschland) hergestellt und der INI GmbH zur Verfügung gestellt.
Zum Einsatz kamen leere CellBeads® (Leerbeads, LCB), die nur aus der Alginathülle
und Goldpartikeln zur besseren Sichtbarmachung bestanden. Außerdem wurden
CellBeads® verwendet, die vitale mesenchymale Stammzellen humanen Ursprungs
ohne gentechnische Modifikation enthielten (Stammzellbeads, SCB) und solche
CellBeads®, die humane mesenchymale Stammzellen enthielten, welche so
genetisch modifiziert wurden, dass sie humanes Endostatin sezernierten
(Endostatinbeads, ECB). In Abbildung 5 sind die verwendeten CellBeads®
dargestellt. Die verwendeten Zellklone wurden in der gentechnischen S1-Anlage der
Firma CellMed AG generiert und verkapselt.
Durch den Hersteller wurde die Vitalität der verwendeten Chargen in vitro mit Hilfe
eines Alamar Blue Monitoring über 60 Tage kontrolliert.
44 3 Untersuchungsgut und Methoden
Alamar Blue ist eine Substanz, die in ihrer oxidierten Form als blauer und in ihrer
reduzierten Form als roter Farbstoff vorliegt, der dann fluorimetrisch nachgewiesen
werden kann. Vitale Zellen sorgen durch ihre metabolische Aktivität für ein den
Farbstoff in seine detektierbare reduzierte Form überführendes Milieu.
Die Biokompatibilität der in dieser Arbeit verwendeten Stammzellkapseln wurde in
einer vorausgegangenen Dissertationsarbeit am International Neuroscience Institute
überprüft. Dazu wurden die Mikrokapseln sowohl BDIX/Ztm-Ratten als auch
immundefizienten Ztm:RNU-Ratten intraparenchymal implantiert und nach einem
Untersuchungszeitraum von 8 Wochen sowohl histomorphologisch als auch nach
Explantation der Implantate mittels SYBR Green Vitalitätsfärbung durch den
Hersteller überprüft. Dabei dringt ein fluoreszenzmikroskopisch grün darstellbarer
Farbstoff (SYBR) in die lebenden Zellen ein und die abgestorbenen Zellen stellen
sich durch Propidiumjodid angefärbt rot dar (BARTSCH, 2005).
Endostatinsekretion
Nährstoff diffusion
Sauerstoff diffusion
Abschirmung gegen das Immunsystem
CellBeads® mit Zellcore im Inneren und umgebender Alginatkapsel, die für die
Bestandteile der Empfängerabwehr nicht durchdringbar ist, aber die Ernährung und
Sauerstoffversorgung der Stammzellen mittels Diffusion erlaubt.
Abbildung 5
Nativaufnahme der
verwendeten CellBeads®
Abbildung 6
Schematische Darstellung der Diffusionsverhältnisse in Alginatbeads
587 µm
398 µm
3 Untersuchungsgut und Methoden 45
3.2.2 Verkapselungstechnologie
Die verwendete humane mesenchymale Stammzelllinie wurde durch einen
Gentransfer bei der Firma CellMed AG gentechnisch modifiziert. Um die
Synthetisierung von Endostatin durch die hMSC zu erreichen, wurde die
entsprechende Stammzelllinie mittels Transfektion verändert, indem ein
Plasmidvektor in ihren Zellkern eingeschleust wurde, in den zuvor die entsprechende
Endostatin cDNA kloniert worden war. Diese Einschleusung erfolgte durch eine
modifizierte Elektroporationsmethode, bei der ein elektrisches Feld angelegt wurde,
welches das Plasmid wiederum direkt in den Zellkern einschleuste. Das Verfahren
führte zudem zu einer „sanften“ Immortalisierung der Zellen, die mit einer stark
limitierten Zellteilung verbunden war. Nach Abschluss der Behandlung waren die
verwendeten Zelllinien maximal zu ein bis zwei Zellteilungen fähig. Die Biosicherheit
und Virusfreiheit wurden vom Hersteller getestet.
Die so veränderten Stammzellen und auch die nicht modifizierten hMSC wurden mit
einer Alginatlösung in einem 20 mM BaCl2-Fällbad vertropft. Die Zellzahl betrug
konstant 40 Millionen Zellen pro ml im Core, wobei der Durchmesser des Cores von
409 bis 457 µm und der Gesamtdurchmesser der CellBeads® von 541 bis 612 µm
variierte. Den Leerbeads wurde zur sowohl makroskopisch als auch mikroskopisch
besseren Wiederauffindbarkeit ein Goldanteil von 10% zugegeben. Im Anschluss an
die Verkapselung wurden die fertig gestellten CellBeads® für einen Tag bei +37°C
und 5% CO2 in Kultur genommen und anschließend kryokonserviert. Zur
Versuchsdurchführung wurden die Implantate auf Trockeneis verschickt und im
International Neuroscience Institute aufgetaut.
46 3 Untersuchungsgut und Methoden
3.3 Gliomzelllinie BT4Ca
3.3.1 Herkunft
Die Gliomzelllinie BT4Ca wurde von dem Institut für Zellbiologie (Tumorforschung)
des Universitätsklinikums Essen, Hufelandstraße 55, 45122 Essen generiert
(DEISSLER et al. 1996) und kryokonserviert. Bei dieser Zelllinie handelt es sich um
Glioblastomzellen, die durch die Applikation von Ethylnitroseharnstoff in BDIX/Ztm-
Ratten induziert worden sind. Auf diese Weise wurde eine zum Rattenstamm
syngene Zelllinie erzeugt (DRUCKREY u. LANDSCHUTZ 1971). Die Zellen wurden
bei ca. -70°C auf Trockeneis im Kryoröhrchen versandt und bei Ankunft im
International Neuroscience Institute sofort aufgetaut und kultiviert. Sie wuchsen
überwiegend homogen und hatten eine Generationszeit von durchschnittlich 10
Stunden. Nach ihrer Ankunft im International Neuroscience Institute wurde die
BT4Ca Zelllinie über 3 Passagen von je 5 Tagen kultiviert und vermehrt, um eine
Akklimatisierung an die veränderten Kulturbedingungen zu ermöglichen. Um eine
Zellbank anzulegen, aus der für jeden Versuch immer gleich behandelte
Zellportionen entnommen werden konnten, wurden die Zellen portioniert und in
flüssigem Stickstoff bei ca. -196°C kryokonserviert.
3.3.2 Syngenität
Vom Institut für Versuchstierkunde und dem Zentralen Tierlabor der Medizinischen
Hochschule Hannover wurde die Syngenität der verwendeten Gliomzelllinie zu dem
dort gezüchteten BDIX/Ztm-Rattenstamm anhand eines komplementabhängigen
Zytotoxizitätstestes zusätzlich überprüft. Dabei wurde eine antikörpervermittelte
Zelllyse dann ausgelöst, wenn oligospezifische Antikörper, welche spezifisch auf die
bei der Ratte bekannten MHC-Klasse I und II Komplexe reagieren, banden. Die
Zellmembran wurde dann durch eine komplementabhängige Reaktion zerstört und
zugegebenes Trypanblau, ein Indikatorfarbstoff für abgestorbene Zellen, färbte die
lysierten Zellen an.
3 Untersuchungsgut und Methoden 47
3.4 Versuchsplanung: Experimentelle Gruppen
3.4.1 Etablierung des Models
3.4.1.1 Tumorzellinokulation
Ziel der Versuche war es, die ideale BT4Ca-Zellzahl zur Implantation zu finden, um
ein Tumormodell zu entwickeln, mit dem man einen möglichst immer gleich großen
Tumor nach einer bestimmten Zeit reproduzieren kann. Bei der Verwendung der
BT4Ca Gliomzelllinie, der implantierten Zellzahl, den Implantationskoordinaten und
der Auswahl des Rattenstamms wurde sich an der bestehenden Literatur (READ et
al. 2001, LEHTIMÄKI et al. 2003, GRIFFIN et al. 2003) orientiert (Siehe Kapitel 2.3
Experimentelles Glioblastom-Modell).
Zur Bestimmung der optimalen Tumorzellzahl wurden insgesamt 14 BDIX/Ztm-
Ratten operiert, wobei jeweils 2 Tieren 2 x 103, 4 x 103, 6 x 103 und 8 x 103 BT4Ca-
Zellen injiziert wurden. Nach einem Versuchszeitraum von 12 Tagen wurden die
Bei den zur Bestimmung der Vaskularisierungsdichte herangezogenen Bildern wurde
zusätzlich die ausgewertete Lokalisation vermerkt (Bu/Bo/Bm, Fo/Fu/Fm).
3 Untersuchungsgut und Methoden 75
3.6.7.1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H.E.) zur Etablierung des Modells
Bei der histologischen Auswertung der H.E. gefärbten Schnitte zur
Versuchsetablierung wurde die Implantationstechnik zur intrazerebroventrikulären
Applikation der CellBeads® daran beurteilt, wie viele Mikrokapseln im Gewebe zu
finden waren, wo diese lagen und ob sie im Kontakt zum rechten Seitenventrikel
standen. Außerdem wurden die Gewebsreaktionen auf die CellBeads®
beziehungsweise auf den Stichkanal beurteilt.
Zur Etablierung des Glioblastommodells lag das Hauptaugenmerk auf der
histomorphologischen und strukturellen Beurteilung des Tumors, dabei wurden
besonders die Größe und Ausdehnung der experimentellen Gliome verglichen. Bei
den zur Entwicklung der zweizeitigen Applikation von Gliomzellen und Mikrokapseln
operierten Tieren wurden die Lage und die Tiefe der jeweiligen Stichkanäle und die
Lage und Entfernung des Tumors und der CellBeads® zueinander bewertet.
3.6.7.2 Immunhistologischer Nachweis des Endostatins
Mit Hilfe der immunhistochemischen Markierung humanen Endostatins erfolgte der
Nachweis der Proteinfreisetzung durch die Implantate und damit der
Funktionsfähigkeit der CellBeads®. Gleichzeitig wurde untersucht, wo der Wirkstoff
sich anreicherte. Die Auswertung erfolgte anhand einer Klassifikation in eine positive
oder negative Immunreaktion.
Dazu wurden die Gewebeschnitte lichtmikroskopisch mit dem BX51 Hellfeld
Mikroskop untersucht und in verschiedenen Vergrößerungen mit der SoftImage-
Kamera fotografiert. Besonderes Augenmerk wurde dabei auf die CellBeads®, das
sie direkt umgebende Gewebe, die Ventrikelwände, den Plexus Choroideus und den
Virchow Robin Raum als erwartete Gebiete der Endostatinanreicherung gelegt.
76 3 Untersuchungsgut und Methoden
3.6.7.3 Immunhistologie zur Untersuchung der Tumorvaskularisierung
Die lichtmikroskopische Auswertung der immunhistochemischen Anfärbung des von-
Willebrand-Faktor erfolgte nach dem Abfotografieren der Gewebeschnitte mit dem
BX51 Hellfeld Mikroskop und der SoftImage-Kamera mit dem 10-er Objektiv. Um
mehrere repräsentative Lokalisationen der Tumorvaskularisierung beurteilen zu
können, wurden 2 Gewebeschnitte pro Tier und 3 Regionen pro Gewebeschnitt
ausgewertet. Es wurden die Gewebeschnitte des in der Volumenauswertung
bestimmten größten Tumoranschnitts (größte Fläche) und der
Implantationslokalisation (Bregma -1 mm) in der rostrokaudalen Ausdehnung des
Tumors untersucht. An diesen beiden Lokalisationen wurde dann jeweils 1
Ausschnitt an der maximal dorsal liegenden, der am weitesten ventral liegenden
Tumorausdehnung und an einer immer auf dieselbe Weise angefahrenen und so
randomisierten Position zwischen den ersten beiden beurteilt.
Die 6 aufgenommenen Regionen (ROI, Region of Interest) wurden getrennt
ausgewertet und ihre Bezeichnung erfolgte als:
ROI- Fu (größte Fläche unten) ROI- Bu (Bregma -1 mm unten)
ROI- Fo (größte Fläche oben) ROI- Bo (Bregma -1 mm oben)
ROI- Fm (größte Fläche Mitte) ROI- Bm (Bregma -1 mm Mitte)
Die Auswertung erfolgte mittels mit der Software cell*f (Olympus) durchgeführter
Partikeldetektion. Dabei war ein fotografiertes Sichtfeld gleich der detektierten
Fläche (ROI). Durch die Verwendung des immer gleichen Objektivs wurde
sichergestellt, dass eine jedes Mal gleich große Fläche von 575321,78 µm2
untersucht wurde. Zunächst wurde eine Farbwertüberarbeitung durchgeführt, um die
positiv rot gefärbten Blutgefäßwände für die digitale Detektion deutlich von der
blauen Hämatoxylin-Gegenfärbung abzusetzen. Für alle Bilder wurden dieselben
einmal definierten Farb-, Gamma- und Sättigungswerte verwendet.
3 Untersuchungsgut und Methoden 77
Im Anschluss wurde ein Farbschwellwert bestimmt, bei dem Partikel eines
bestimmten Farbwertes als positiv detektiert wurden. Auch dieser einmal definierte
Wert wurde für alle Auswertungen gleichermaßen angewendet. Die Partikel, deren
Farbe diesen Schwellwert überschritten, wurden im Anschluss detektiert.
Blutgefäßanschnitte, deren nicht rot angefärbte Hohlraumvolumina von der Software
nicht detektiert wurden, wurden mittels Handwerkzeug hinzugefügt. Durch die
Software ermittelt beziehungsweise berechnet wurden die Anzahl der detektierten
Partikel, die Dichte der Partikel, die Gesamtfläche aller detektierten Partikel im ROI
und deren prozentualer Flächenanteil an der Fläche des ROI. Diese Daten wurden in
einer Datenbank archiviert und zur weiteren Berechnung in Excel übertragen.
Ermittelt wurden die Mittelwerte und Standardabweichungen der einzelnen Gruppen
für alle gemessenen Parameter.
3.6.7.4 H.E.-Färbung zur Untersuchung der Tumorgrößen
Die Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H.E.) der Gewebeschnitte aus der
Wirksamkeitsuntersuchung dienten der histomorphologischen Beurteilung, dem
Nachweis der Implantate, und zur Ermittlung der Tumorvolumina. Histologisch stellte
sich der Bereich des Glioblastoms dunkellila und der des gesunden
Gehirnparenchyms rot dar. Der zur Aufnahme der Gefrierschnitte auf Objektträger
entwickelten Systematik (Vergleich Kapitel 3.6.4) folgend wurde aus jedem
aufgenommenen Takt ein Gewebeschnitt ausgewertet. Das Tumorvolumen wurde
mit folgendem histomorphologischen Verfahren näherungsweise bestimmt: Gemäß
der entwickelten Systematik (Vergleich Kapitel 3.6.4) wurden in regelmäßigen
Abständen durch die gesamte Länge der rostrokaudalen Tumorausdehnung die
Gewebeschnitte mit dem 1,25-fach vergrößernden Objektiv in mehreren
Einzelaufnahmen abfotografiert und mittels rechnerischen Ränderabgleichs durch die
verwendete Software, der Bildmontagefunktion (Multiple Image Alignment), zu einem
Gesamtbild des Gewebeanschnitts zusammengefügt.
78 3 Untersuchungsgut und Methoden
Anschließend wurden die Flächen des histologisch darstellbaren, soliden
Tumorgewebes bei 50-facher Zoomfunktion mit der Messfunktion ausgemessen.
Die Berechnung des Teilvolumens zwischen zwei Gewebeschnitten erfolgte nach der
Formel für den Kegelstumpf:
Kegelstumpfvolumen = ( ) ( ) ( )
3²221²1 hrrrr ××+×+ π
Dabei entsprach der Takt als Abstand zwischen 2 Schnitten der Höhe h. Die Radien
r2 und r2 wurden als Äquivalentradien aus den gemessenen Flächen der
Tumoranschnitte jeweils vor und nach dem Takt mit folgender Formel ermittelt:
Äquivalentradius = π
lächegemesseneF
Das Gesamtvolumen eines Tumors ergab sich aus der Addition aller berechneten
Kegelstümpfe.
3 Untersuchungsgut und Methoden 79
3.7 Statistische Auswertung
Die Daten aus den Volumenberechnungen zum Vergleich der Tumorgrößen wurden
als arithmetische Mittelwerte statistisch ausgewertet. Dazu wurden die
arithmetischen Mittelwerte über alle durch die Addition der aus den gemessenen
Flächen berechneten Kegelstümpfe ermittelten Tumorgesamtvolumina einer
Versuchsgruppe miteinander verglichen.
Die anhand der Partikeldetektion ermittelten Daten zur Blutgefäßdichte wurden als
arithmetische Mittelwerte über alle 4 Gruppen ausgewertet.
Es wurden die arithmetischen Mittelwerte der detektierten Partikelflächen als
prozentualer Anteil der von den Gefäßen eingenommenen Fläche an 6
untersuchten ROI (Region of Interest) getrennt berechnet und miteinander
verglichen. Weiterhin wurden die arithmetischen Mittelwerte der Summen der von
den Gefäßen eingenommenen Flächen von den 3 jeweils in einem Tumoranschnitt
ausgewerteten ROI als Gefäßfläche Summe an beiden untersuchten
Gewebeanschnitten (Implantationslokalisation und größte Fläche) getrennt ermittelt.
Als Gefäßanzahl Summe wurde die Summe der mittels Partikeldetektion gezählten
Partikel über 3 ROI an jeweils der Implantationslokalisation und an dem
Tumoranschnitt mit der größten Tumorfläche berechnet.
Die statistische Auswertung erfolgte mittels der Berechnung des arithmetischen
Mittelwertes und der Standardabweichung (SD). Zunächst wurde eine mehrfaktorielle
Varianzanalyse ANOVA (one way analysis of variance) durchgeführt, um zu
ermitteln, ob mehrere unabhängige Variablen (oder Faktoren) einzeln oder in
beliebiger Kombination einen statistisch gesicherten Einfluss auf ein Merkmal
(abhängige Variable) haben. Mit der Varianz wurde die mittlere quadratische
Abweichung der Daten vom Mittelwert beschrieben. Um einen gesicherten, nicht
zufälligen Unterschied zwischen den einzelnen Versuchsgruppen zu belegen, wurde
dabei mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von kleiner 5% (P value < 0,05) gerechnet.
80 3 Untersuchungsgut und Methoden
Als Post Test zur Untersuchung der tatsächlichen Unterschiede zwischen den
Mittelwerten der Versuchsgruppen wurde der Tukey-Kramer multiple comparison
Test durchgeführt, bei dem alle Gruppen gegeneinander verglichen werden. Auch
hier wurde mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von kleiner 5% (P value <0,05)
gerechnet, welche aussagt, dass die errechneten Signifikanzen mit einer
Wahrscheinlichkeit von größer 95% „wahr“ sind.
Zur Bestimmung der Korrelation zwischen Blutgefäßdichte und Tumorvolumina
wurde die Summe der 3 pro Gewebeschnitt ermittelten Gefäßflächen den
Tumorvolumina für jede Versuchsgruppe getrennt gegenübergestellt.
Zur Ermittlung der Korrelationen von Tumorvolumen und Vaskularisierungsdichte
wurde die Funktion f(x) = a x X + Y zugrunde gelegt, wobei a die Steigung (slope) ist,
und X die Verschiebung auf der X-Achse (X-Intercept) und Y die Verschiebung auf
der Y-Achse (Y-Intercept) definiert. Liegt ein funktionaler Zusammenhang zwischen
X und Y vor, so lässt sich ein Stichprobenkorrelationskoeffizient r angeben, der
quadriert zu r² den Pearssonschen Korrelationskoeffizienten darstellt. Dieser
Koeffizient beschreibt die Güte des funktionalen Zusammenhangs zwischen zwei
Datenmengen (Goodness of Fit) und es wird von einer bestehenden Korrelation
gesprochen, wenn r² > 0,8 ist.
Alle statistischen Berechnungen und die graphische Darstellung wurden mit dem
Programm Prism® Version 4.03 (GraphPad Software Inc., San Diego, USA)
durchgeführt.
4 Ergebnisse 81
4 Ergebnisse
4.1 Entwicklung des Versuchsmodells
4.1.1 Zellkultur
4.1.1.1 Kultivierung
Die Untersuchungen zur Ermittlung der idealen Einsaatdichte und Passagedauer
zeigten, dass bei einer Einsaatdichte von 6 x 105 Zellen in eine 75 cm2 Flasche an
Tag 0 und einer Passagedauer von 2 Passagen mit einer Subkultivierung an Tag 3
nach der Einsaat und einem Mediumwechsel jeweils an Tag 1 nach der Einsaat die
Zellen eine weitgehende Homogenität und eine Bewuchsdichte von 80% +/- 10%
aufwiesen. Das auf den Zellen stehende Medium war jeweils an Tag 1 und 3 klar und
wies nur einen sehr geringen Anteil gelöster, abgestorbener Zellen auf. Es war
hellrötlich gefärbt und somit noch im für die Zellen optimalen pH- Bereich 7 bis 7,5.
4.1.1.2 Vitalzellzahl
Die Messung der Zellvitalität von BT4Ca-Zellen im Lagerungsversuch in sterilem
Phosphatpuffer (PBS) bei Raumtemperatur mittels Trypanblaufärbung und Zählung
in der Neubauer-Kammer zeigte einen zunehmenden Lebendzellverlust nach 4
Stunden. Dabei konnte ein logarithmischer Verlauf bei der Abnahme der vitalen
Zellen beobachtet werden.
Die Untersuchung mittels Cell-Counter (CASY®, cell counter and analysis system,
Schärfe) ergab, dass die Zellen in PBS bei Raumtemperatur bis zu 4 Stunden und
bei 4°C bis zu 5 Stunden problemlos gelagert werden konnten. In diesem Zeitrahmen
lag die Vitalität der Zellen über 90%. Alle Tiere, die in diesem Zeitrahmen mit ein und
derselben Zellsuspension operiert wurden, erhielten somit die gleiche Anzahl vitaler
BT4Ca-Zellen. Der Verlauf des Vitalzellzahlrückgangs wird in der Abbildung 10
dargestellt.
82 4 Ergebnisse
Aufgrund der ermittelten Ergebnisse wurde unter Einbeziehung von einer Stunde
Sicherheitsspanne eine maximale Verwendungszeit für die zur Operation
angesetzten Zellsuspensionen von 3 Stunden festgelegt, um eine gleich bleibende
implantierte Tumorzellzahl sicherzustellen.
Vitale BT4Ca Zellen bei Lagerung in PBS
0
20
40
60
80
100
120
0 2 4 6 8 10 Stunden
Lagerung bei RT Lagerung bei 4°C
Vitale Zellen [%]
Abbildung 10 Ergebnisse der Vitalzellzählung von BT4Ca-Zellen bei
Lagerung in PBS Deutliche Reduktion der vitalen Zellen nach 4 Stunden bei Lagerung bei
Raumtemperatur und nach 5 Stunden bei Lagerung im Kühlschrank
4.1.2 Experimentelles Glioblastom
Die Untersuchungen zur Etablierung eines reproduzierbaren Tumormodells ergaben
eine optimale zu implantierende Gliomzellzahl von 8 x 103 BT4Ca-Zellen von der
Schädeloberfläche ausgehend, nach Absenken der Kanülenspitze auf DV -5 mm, 4
mm tief im Gewebe injiziert. Histologisch zeigten sich nekrotisierte Bereiche, die von
solchen mit einer erhöhten Zelldichte eingegrenzt waren.
4 Ergebnisse 83
Die perifokalen Tumorbereiche wiesen ödematisierte Strukturen mit aufgelockerten
Zellverbänden auf. Vor allem in den zentralen Tumorbereichen war eine starke
Vaskularisierung mit einer großen Anzahl glomerulär gewundener Blutgefäße zu
sehen. Makroskopisch stellten sich die Tumoren vielfältig mit blasigen, zum Teil
blutig infiltrierten, kavernösen Strukturen und zerfließender Textur dar.
Makroskopische Abbildungen des Tumors sind in Abbildung 11 und 12 und
histologische Gewebeschnitte in Bildtafel 1 auf Seite 85 einzusehen.
Auch die Implantation von 6 x 103 BT4Ca-Zellen führte zur Ausbildung eines zur
Auswertung ausreichend voluminösen Tumors, allerdings waren hier die
Variabilitäten innerhalb der Tumorgrößen bei den untersuchten Tieren sehr groß, so
dass keine Reproduzierbarkeit gewährleistet war. Implantierte Zellzahlen von
weniger als 6 x 103 Zellen führten zu sehr unregelmäßigem Tumorwachstum und
schon bei Reduktion der inokulierten Zellzahl auf 4 x 103 BT4Ca-Zellen wuchs bei 1
von 2 Tier gar kein Tumor mehr an. Die beurteilten Gewebeschnitte sind beispielhaft
in Bildtafel 1 auf Seite 85 dargestellt und eine Übersicht über die erhobenen Befunde
ist Tabelle 5 auf Seite 84 zu entnehmen.
Tumor
Tumor
Abbildung 11 Experimentelles Gliom Abbildung 12 Experimentelles Gliom fixiert und kryokonserviert paraformaldehydfixiert verdrängendes Wachstum, Ventrikel blasige, gallertige, teilweise blutig
komprimiert infiltrierte Textur
84 4 Ergebnisse
Tabelle 5 Ermittlung der geeigneten Gliomzellzahl zur Etablierung eines reproduzierbaren Tumormodells
Injizierte Zellzahl, Stamm und Anzahl der Tiere, erhobene Befunde nach 12 Tagen
Versuchsdauer
Rattenstamm BDIX/Ztm Tierzahl n =
implantierte Tumorzellzahl
histologische Befunde
2 Tiere 2 x 103
BT4Ca-Zellen
beide Tiere:
kein morphologisches Tumorwachstum;
vereinzelte Gliomzellen im Stichkanal
2 Tiere 4 x 103
BT4Ca-Zellen
1 Tier: Tumor < 1 mm
1 Tier: Gliomzellen im Stichkanal, kein
morphologisches Tumorwachstum
2 Tiere 6 x 103
BT4Ca-Zellen
1 Tier: ca. 5 mm Tumordurchmesser
1 Tier: ca. 3 mm Tumordurchmesser
Tumoren oberflächlich auf Hirnrinde
2 Tiere 8 x 103
BT4Ca-Zellen
1 Tier: ca. 7,5 mm Tumordurchmesser
1 Tier: ca. 9 mm Tumordurchmesser
Wachstum in der Tiefe, bis an den Seitenventrikel
Wiederholung zur Überprüfung der Reproduzierbarkeit
3 Tiere 6 x 103
BT4Ca-Zellen
1 Tier: kein morphologisches Tumorwachstum
1 Tier: ca. 1 mm Tumordurchmesser
1 Tier: ca. 2,5 mm Tumordurchmesser
3 Tiere 8 x 103 BT4Ca-Zellen
alle Tumoren zwischen 7,5 und 10 mm
Durchmesser
Wachstum in der Tiefe, bis an den Seitenventrikel
4 Ergebnisse 85
4.1.2.1 Bildtafel 1
Bildtafel 1 H.E. Färbung zur Untersuchung der idealen Zellzahl zur Implantation und Darstellung der Tumorhistomorphologie
Tumoren (a) 12 Tage nach der Implantation von 2000 (A), 4000 (B), 6000 (C) und 8000 BT4Ca Gliomzellen (D/E/F/G/H/I); Gewundene, teils glomeruläre Blutgefäße (b) und Pseudopalisaden (c) (E/F); Übergang (d) von Pseudopalisaden (c) zu nekrotisierendem, aufgelockertem Gliomzellverband (e); Endothelzellproliferation (f), Migration (g) und Differenzierung (h) mit eingewanderten Erythrozyten (i)
B
E D
C A
G F
a a a
c b a
H I
d e
c
b c
f
h
g i
a
86 4 Ergebnisse
4.1.3 Koordinaten zur intrazerebroventrikulären Implantation der CellBeads®
Zur Implantation der CellBeads® intraparenchymal mit Kontakt zum liquorführenden
Ventrikelsystem wurde an den Koordinaten -1 mm AP (anterior-posterior), -2,8 mm
LM (latero-medial) und -5 mm DV (dorso-ventral) nach Vorbohren auf -6 mm DV zu
Bregma eine sichere Applikation der Implantate unter Eröffnung des rechten
Seitenventrikels ermöglicht. Dabei konnten mehrfach reproduziert zwischen 8 und 12
CellBeads® mit Kontakt zum rechten Seitenventrikel intraparenchymal in der rechten
Großhirnhemisphäre platziert werden. Einen Überblick gibt Tabelle 6 und die
mikroskopisch erhobenen Befunde sind beispielhaft in Bildtafel 2 auf Seite 90
einzusehen.
4 Ergebnisse 87
Tabelle 6 Ermittlung der zur Implantation der CellBeads® geeigneten stereotaktischen Koordinaten
Stamm und Anzahl der Tiere, Implantationskoordinaten, Befunde nach der
Implantation von 12 CB und nach 2 Tagen Versuchsdauer
Rattenstamm BDIX/Ztm Tierzahl n =
latero-mediale Koordinate (LM)
dorso-ventrale Koordinate (DV)
histologische Befunde
2 Tiere LM
-3,2 mm
DV -2,8 mm 2 CB nachweisbar
kein Kontakt zum Ventrikel
zu weit dorsal
2 Tiere LM
-3,2 mm
DV -3,5 mm 6 CB nachweisbar
kein Kontakt zum Ventrikel
zu weit lateral
2 Tiere LM
-3 mm
Vorbohren auf DV
-7 mm, Absetzen
bei DV -6 mm
kein CB nachweisbar
Stichkanal nicht im Ventrikel
zu tief, zu weit lateral
2 Tiere LM
-3 mm
Vorbohren auf DV
-6 mm, Absetzen
bei DV -5 mm
10 CB nachweisbar
kein Kontakt zum Ventrikel
2 Tiere LM
-2,8 mm
Vorbohren auf DV -6 mm, Absetzen
bei DV -5 mm
12 CB nachweisbar
CB stehen in Kommunikation
zum rechten Seitenventrikel
Wiederholung zur Überprüfung der Reproduzierbarkeit
3 Tiere LM
-2,8 mm
Vorbohren auf DV -6 mm, Absetzen
bei DV -5 mm
zwischen 8 und 12 CB
reproduzierbar mit Kontakt
zum Ventrikel nachgewiesen
88 4 Ergebnisse
4.1.4 Koordinaten für die BT4Ca-Inokulation und zweizeitige Operation
Zur Inokulation des Tumors einen Tag vor der Implantation der Mikrokapseln
erwiesen sich die Koordinaten -1 mm AP (anterior-posterior), -3,4 mm LM (latero-
medial) und -4 mm DV (dorso-ventral), nach Vorbohren auf -5 mm DV, als geeignet.
So waren die Tumoren auch nach der CellBead®-Implantation in ihrer Größe und
Ausdehnung nach 12 Tagen mit denen der Tiere, die nur Gliomzellen implantiert
bekamen, vergleichbar. Die implantierten CellBeads® waren trotz des stark
verdrängenden Wachstums des experimentellen Glioms auch nach 12 Tagen an der
geplanten Lokalisation zuverlässig nachzuweisen und intakt. In der Bildtafel 2 auf
Seite 90 ist die Kombination der beiden OPs anhand von Gewebeschnitten
dokumentiert und Tabelle 7 verschafft einen Überblick über die durchgeführte
Untersuchung.
4 Ergebnisse 89
Tabelle 7 Entwicklung der Methodik zur zweizeitigen Implantation von Tumorzellen und CellBeads®
Stamm und Anzahl der Tiere, implantierte Tumorzellzahl, implantierte Mikrokapseln,
Implantationskoordinaten, erhobene Befunde nach 12 Tagen Versuchsdauer
Ratten-stamm BDIX/Ztm Tierzahl n =
Tumor-inokulation rechte Hemisphäre Tag 0
CellBead® Implantation rechte Hemisphäre Tag 1
histologische Befunde
4 Tiere 8 x 10³ BT4Ca-
Zellen
AP -1 mm
LM -3,4 mm
DV -5/ -4 mm
12 leere
CellBeads®
AP -1 mm
LM -2,8 mm
DV -6/ -5 mm
zwischen 8 und 12 intakte CB mit
Kontakt zum rechten Seitenventrikel
nachgewiesen
alle Tumordurchmesser zwischen 8,5
und 10 mm
Tumorausdehnung bis an Ventrikel
reichend
Lage von CellBeads® und Tumor
zueinander so, dass sie in direkter
Kommunikation zueinander stehen
gegebene Reproduzierbarkeit
90 4 Ergebnisse
4.1.4.1 Bildtafel 2
Bildtafel 2 H.E. Färbung zur Ermittlung der idealen Implantationskoordinaten und zur Untersuchung der zweizeitigen OP
Nach Implantation von 12 CellBeads® (CB) an AP -1 mm: 2 Tage post OP: an LM -3,2 DV -2,8 mm (A) nur 2 CB nachweisbar; an LM -3,2 mm DV -3,5 mm (B) 6 CB nachweisbar aber kein Kontakt zum Ventrikel (V); an LM – 3 mm DV – 7/-6 mm (C) kein CB; an LM -3 mm DV -6/-5 mm (D) waren insgesamt 10 CB nachweisbar (nur 7 im Schnitt erkennbar) und LM -2,8 mm DV -6/-5 mm (E) 12 CB mit Kontakt zum Ventrikelsystem 12 Tage post OP: wobei an Tag 0 8 x 10³ BT4Ca an LM -3,4 DV -5/-4 mm und an Tag 1 12 CB an LM -2,8 mm DV -6/-5 mm implantiert wurden (F/G); CB mit Kontakt zum Ventrikelsystem und gleichzeitig tumornah lokalisiert, Tumor (a) im Wachstum unbeeinflusst
A
F
E D
C B
G
a
a
V V
CB CB
CB CB
CB CB
4 Ergebnisse 91
4.2 Untersuchung der Wirksamkeit
4.2.1 Histologischer Nachweis der Implantate
Bei allen 26 Tieren der 3 Versuchsgruppen, denen CellBeads® implantiert worden
waren, konnten die implantierten Mikrokapseln histologisch nachgewiesen werden.
Zur Auswertung der Ergebnisse aus den Untersuchungen zur Wirksamkeit des
Endostatins sollten nur Daten von Versuchstieren herangezogen werden, bei denen
mindestens 5 intakte Implantate nachgewiesen werden konnten. Dieses Kriterium
erfüllten alle operierten Tiere. Dabei wurde besonderes Augenmerk auf die
strukturelle Darstellung der äußeren Alginathülle und die Unversehrtheit des inneren
Zellcores gelegt. Beispielhaft sind die implantierten CellBeads® in den Abbildungen
der Bildtafel 5 auf Seite 105 einzusehen.
4.2.2 Nachweis der Endostatinfreisetzung aus den CellBeads®
Ziel war es zum einen das freigesetzte humane Endostatin und damit die
Funktionalität der Implantate nachzuweisen. Zum anderen sollte gezeigt werden, wo
im Gehirnschnitt das Endostatin nach intrazerebroventrikulärer Applikation der
sezernierende Zellen enthaltenden Implantate aufzufinden war, um Hinweise auf die
Verteilung zu erhalten.
In den Gewebeschnitten der Tiere aus der mit Endostatinbeads (ECB) behandelten
Gruppe III konnte eine deutlich positive Immunreaktion gezeigt werden, anhand derer
die Freisetzung des humanen Endostatins belegt werden konnte. Dazu wurden
jeweils 2 Gewebeschnitte pro Tier auf das Vorhandensein von Endostatin-Antikörper-
Präzipitaten hin untersucht. Es konnte bei 9 von 10 Tieren der mit Endostatinbeads
behandelten Gruppe III Endostatin nachgewiesen werden.
92 4 Ergebnisse
Zum Vergleich wurden stichprobenweise jeweils 3 Tiere aus allen 3 übrigen Gruppen
untersucht. In den Gewebeschnitten aus diesen Gruppen war keine positive
Immunreaktion nachweisbar.
Im Rahmen der Auswertung konnte eine deutlich positive Färbung der im Zellcore
der angeschnittenen CellBeads® liegenden Stammzellen gezeigt werden. Zudem war
die Alginathülle der Mikrokapseln an vielen Stellen ebenfalls positiv rot angefärbt.
Weiterhin war eine immunhistologisch positiv zu bewertende Anfärbung des die
CellBeads® direkt umgebenden Gewebes erkennbar. Im Bereich des experimentellen
Glioblastoms sowie des umgebenden Parenchyms konnten zudem multipel verteilte
immunpositive Aggregate dargestellt werden. Diese wurden in einer Entfernung von
bis zu 4 mm entfernt von den CellBeads® angereichert im Gewebe gezeigt. Eine
immunpositive Aktivierung konnte weiterhin in den Bereichen der Ventrikelwände und
des Virchow Robin Raumes ausgemacht werden. Die aufgefundenen
Endostatinpräzipitate sind beispielhaft in der Bildtafel 3 auf Seite 93 dargestellt.
4 Ergebnisse 93
4.2.2.1 Bildtafel 3
Bildtafel 3 Immunhistologische Färbung des humanen Endostatins nach der Implantation von Endostatin sezernierenden humanen mesenchymalen Stammzellen (EMSC) für 12 Tage
Das von den genmodifizierten Stammzellen sezernierte Protein konnte in den Stammzellen (A), im Alginat (al) (A/B), im direkt die CellBeads® umgebenden Parenchym (B/C), im Parenchym in einer Distanz von bis zu 4 mm zu den CellBeads® (D/H), im Tumorgewebe (G/H/J), im Virchow Robin Raum (E/F) und als Anlagerungen an den Gefäßen (I) nachgewiesen werden. Die Pfeile weisen auf die positiven Immunreaktionen hin.
D E F G
H I
A C B
J
EMSC
al CB
CB CB
94 4 Ergebnisse
4.2.3 Untersuchung der Tumorvaskularisierung
Zunächst wurden die Histomorphologie und Struktur der Blutgefäße beurteilt. Dabei
zeigten sich vor allem in den zentralen und ventralen Tumorregionen der
unbehandelten Tiere stark vaskularisierte Bereiche mit bis zu 500 Gefäßanschnitten
pro Quadratzentimeter, die einen Durchmesser von bis zu 600 µm erreichten. In den
subarachnoidal gelegenen Randbereichen der Tumoren waren deutlich weniger und
feinere Kapillaren zu erkennen. Ein großer Anteil der Gefäße wies eine endotheliale
Hyperplasie sowie eine Vielzahl mitotischer Figuren auf und war zum Teil stark
gewunden mit kavernösen Ausbuchtungen. Die histomorphologische Untersuchung
der mit Endostatin CellBeads® behandelten Tumoren zeigte deutlich kleinere
Blutgefäße, deren Endothelien strukturierter und unauffälliger waren. Zudem wiesen
die Tumoren der behandelten Tiere, anders als die der Kontrolltiere avaskuläre
Bereiche ohne Gefäßanschnitte auf. Die histomorphologischen Befunde des Tumors
und seiner Blutgefäße sind in Bildtafel 1 auf Seite 85 dargestellt.
Die Untersuchung der Blutgefäßdichten erfolgte nach zwei verschiedenen
Auswertungsparametern, die über die Partikeldetektion der immunhistologisch rot
angefärbten Endothelien erhoben wurden.
Einmal wurde die Gesamtfläche der detektierten Endothelien einschließlich der
Gefäßlumina als prozentualer Anteil an der detektierten Fläche des ROI (Region of
Interest) gemessen und die arithmetischen Mittelwerte der Gruppen gegeneinander
statistisch ausgewertet. Dabei wurden die 6 pro Tier detektierten ROI getrennt
ausgewertet. Zusätzlich wurde die Summe der Gefäßflächen über die 3 jeweils in
einem der beiden ausgewerteten Gewebeschnitte (größte Fläche und
Implantationslokalisation) aufgenommenen ROI gebildet. Die Daten wurden ebenfalls
statistisch über alle Gruppen ausgewertet.
4 Ergebnisse 95
Der andere Auswerteparameter war die Anzahl der Blutgefäße an denselben
Lokalisationen. Diese Gefäßanzahl wurde als Summe der detektierten
Gefäßanschnitte über die aufgenommenen 3 ROI für die beiden Gewebeschnitte
getrennt bestimmt und verglichen.
An der Implantationslokalisation war die Vaskularisierungsdichte bei den mit
Endostatinbeads (ECB) behandelten Tieren nach allen Auswerteparametern und in
allen 3 ROI signifikant kleiner als bei den Kontrollgruppen. Die Fläche der Gefäße in
allen 3 ROI, die Summe der Flächen über alle 3 ROI und die Summe der
Gefäßanzahl über alle 3 ROI war bei den mit ECB behandelten Tieren der Gruppe I
signifikant kleiner als bei den Gruppen I, II und IV.
Signifikanzen der mit ECB behandelten Tiere an der Implantationslokalisation:
ECB vs BT4Ca P < 0,05
ECB vs LCB P < 0,01
ROI-Bo
ECB vs SCB P < 0,01
ECB vs BT4Ca P < 0,05 ROI-Bm
ECB vs LCB P < 0,001
ROI-Bu ECB vs LCB P < 0,001
ECB vs BT4Ca P < 0,001
ECB vs LCB P < 0,001
Summe Flächen Bo/Bu/Bm
ECB vs SCB P < 0,01
Summe Anzahl Bo/Bu/Bm ECB vs BT4Ca P < 0,01
96 4 Ergebnisse
Bei der nach ROI getrennten Auswertung der Gefäßflächen zeigte sich im ROI-Bm
(Bregma –1 mm Mitte) eine signifikante Reduktion bei der mit Stammzellbeads (SCB)
behandelten Gruppe IV gegenüber der mit Leerbeads (LCB) behandelten Gruppe II.
Diese Signifikanz fand sich auch in der Summe der Gefäßflächen über alle 3 ROI (an
Bregma -1 mm) wieder.
Signifikanzen der SCB Gruppe an der Implantationslokalisation:
ROI-Bm SCB vs LCB P < 0,05
Summe Flächen Bo/Bm/Bu SCB vs LCB P < 0,01
Des Weiteren zeigte sich in der Auswertung der Summen der Gefäßflächen, dass die
Gefäßanschnittsflächen der Kontrollgruppe I (nur BT4Ca) signifikant kleiner war als
die der mit leeren Beads behandelten Gruppe II (LCB).
Signifikanz bei der Kontrollgruppe gegenüber Gruppe II an der Implantations-
Lokalisation:
Summe Flächen Bo/Bm/Bu BT4Ca vs LCB P < 0,01
Bei der statistischen Auswertung der Blutgefäßdichten an der Lokalisation der
größten Tumoranschnittsfläche zeigte sich die mit ECB behandelte Gruppe III bei
der Beurteilung der Gefäßflächen an allen 3 getrennt berechneten ROI, der Summe
der Gefäßflächen über 3 ROI und bei der Auswertung der Gefäßanzahl signifikant
kleiner als alle anderen Gruppen.
Die Auswertung der Gefäßanzahl als Summe über 3 ROI an der größten
Tumorfläche war bei der Endostatinbead-Gruppe III (ECB) signifikant kleiner als bei
allen anderen.
4 Ergebnisse 97
Dabei bestanden keine Unterschiede der Gruppen I, II und IV zueinander.
Signifikanzen der mit Endostatin behandelten Gruppe I an der größten
Tumoranschnittfläche:
ECB vs BT4Ca P < 0,01
ECB vs LCB P < 0,001
ROI-Fo
ECB vs SCB P < 0,001
ECB vs BT4Ca P < 0,01
ECB vs LCB P < 0,001
ROI-Fm
ECB vs SCB P < 0,05
ECB vs BT4Ca P < 0,05
ECB vs LCB P < 0,001
ROI-Fu
ECB vs SCB P < 0,05
ECB vs BT4Ca P < 0,001
ECB vs LCB P < 0,001
Summe Flächen Fo/Fu/Fm
ECB vs SCB P < 0,001
ECB vs BT4Ca P < 0,01
ECB vs LCB P < 0,05
Summe Anzahl Fo/Fu/Fm
ECB vs SCB P < 0,01
Bei allen zur Gefäßfläche erhobenen Daten (in den 3 getrennt gemessenen ROI und
in der Summe über alle drei ROI) war zudem die Gefäßfläche der Kontrollgruppe I
(nur BT4Ca) signifikant kleiner als die der mit Leerbeads behandelten Gruppe II
(LCB). Signifikanzen der Kontrollgruppe gegenüber LCB:
ROI-Fo BT4Ca vs LCB P < 0,05
ROI-Fm BT4Ca vs LCB P < 0,001
ROI-Fu BT4Ca vs LCB P < 0,05
Summe Flächen Fo/Fu/Fm BT4Ca vs LCB P < 0,001
98 4 Ergebnisse
Die Gruppe IV (Stammzellbeads, SCB) zeigte bei der statistischen Auswertung der
Daten aus ROI-Fm (größte Fläche Mitte), ROI-Fu (größte Fläche unten) und bei
denen aus der Summe der Flächen über alle 3 ROI einen signifikanten Unterschied
zur Gruppe II (Leerbeads, LCB). Signifikanzen SCB gegenüber Leerbeads:
ROI-Fm SCB vs LCB P < 0,05
ROI-Fu SCB vs LCB P < 0,01
Summe Flächen Fo/Fu/Fm SCB vs LCB P < 0,001
Einen Überblick verschaffen die Graphen 1 bis 10 und die Abbildungen der Bildtafel
4 auf Seite 99. Die ausführlichen statistischen Daten sind dem Anhang beigefügt.
4 Ergebnisse 99
4.2.3.1 Bildtafel 4
Bildtafel 4 Immunhistologische Färbung des von-Willebrand-Faktors zur Beurteilung der Blutgefäßdichten nach 12 Tagen Übersichtsaufnahme mit dem 1,25er Objektiv (AI/AII/AIII/AIV) und beispielhafte Darstellung der mit dem 10er Objektiv zur Partikeldetektion aufgenommenen ventralen ROI (BI/BII/BIII/BIV); Endothelien (e) der intratumoralen Blutgefäße (b) rot angefärbt; Gliomzellen und Parenchym blau; Für Glioblastome typische, glomeruläre Struktur der Blutgefäße erkennbar (c).
Gruppe I (AI/BI) nur BT4Ca-Zellen
Gruppe II (AII/BII) BT4Ca-Zellen und
Implantation
leerer CellBeads®
Gruppe III (AIII/BIII) BT4Ca-Zellen und
Implantation
Endostatin sezernierender
hMSC CellBeads®
Gruppe IV(AIV/BIV) BT4Ca-Zellen und
Implantation
nicht genmodifizierter
hMSC CellBeads®
A I
A IV
A III
A II
B I
B II
B III
B IV
e
e
e
b
c
b
b
e
b
100 4 Ergebnisse
Prozentualer Anteil der von den Gefäßeneingenommenen Fläche
an der Fläche des ROI-Fo(größte Anschnittsfläche-oben)
Kontrolle LCB ECB SCB0
102030405060708090
* ** *
Graph 1
[% R
OI]
Prozentualer Anteil der von den Gefäßeneingenommenen Fläche
an der Fläche des ROI-Fm(größte Anschnittsfläche-mitte)
Kontrolle LCB ECB SCB0
102030405060708090
**
*
**
Graph 2
[% R
OI]
Prozentualer Anteil der von den Gefäßeneingenommenen Fläche
an der Fläche des ROI-Fu(größte Anschnittsfläche-unten)
Kontrolle LCB ECB SCB0
102030405060708090 **
*
**
Graph 3
[% R
OI]
Vaskularisierung an der größten Anschnittsfläche 1
Endostatinbeads (ECB) und Stammzellbeads (SCB)gegenüber Leerbeads (LCB) und der Kontrollgruppe
ROI= Region of Interest= 575321,78 µm²,Fläche über dieausgewertet wurde
= kennzeichnet statistischsignifikante Unterschiedezwischen den Gruppen
*
4 Ergebnisse 101
Prozentualer Anteil der von den Gefäßeneingenommenen Fläche
über alle drei ROI an der größten Anschnittsfläche
Kontrolle LCB ECB SCB0
2.5×105
5.0×105
7.5×105
1.0×106 ***
*
*
Graph 4
[µm
²]
Anzahl der Gefäßanschnitte überalle drei ROI an der größten Anschnittsfläche
Kontrolle LCB ECB SCB0
250050007500
100001250015000175002000022500 * *
*
Graph 5
Vaskularisierung an der größten Anschnittsfläche 2Endostatinbeads (ECB) und Stammzellbeads (SCB)gegenüber Leerbeads (LCB) und der Kontrollgruppe
ROI= Region of Interest= 575321,78 µm²,Fläche über dieausgewertet wurde
* = kennzeichnet statistischsignifikante Unterschiedezwischen den Gruppen
102 4 Ergebnisse
Prozentualer Anteil der von den Gefäßeneingenommenen Fläche
an der Fläche des ROI-Bo(Bregma -1 mm-oben)
Kontrolle LCB ECB SCB0
102030405060708090
***
Graph 6
[% R
OI]
Prozentualer Anteil der von den Gefäßeneingenommenen Fläche
an der Fläche des ROI-Bm(Bregma -1 mm-mitte)
Kontrolle LCB ECB SCB0
102030405060708090
***
Graph 7
[% R
OI]
Prozentualer Anteil der von den Gefäßeneingenommenen Fläche
an der Fläche des ROI-Bu(Bregma -1 mm-unten)
Kontrolle LCB ECB SCB0
102030405060708090 *
*
Graph 8
[% R
OI]
Vaskularisierung an der Implantationslokalisation 1
Endostatinbeads (ECB) und Stammzellbeads (SCB)gegenüber Leerbeads (LCB) und der Kontrollgruppe
ROI= Region of Interest= 575321,78 µm²,Fläche über dieausgewertet wurde
= kennzeichnet statistischsignifikante Unterschiedezwischen den Gruppen
*
4 Ergebnisse 103
Prozentualer Anteil der von den Gefäßeneingenommenen Fläche
über alle drei ROI an Bregma -1 mm
Kontrolle LCB ECB SCB0
2.5×105
5.0×105
7.5×105
1.0×106
*
*** *
Graph 9
[µm
2 ]
Anzahl der Gefäßanschnitte überalle drei ROI an Bregma -1 mm
Kontrolle LCB ECB SCB0
5000
10000
15000 *
Graph 10
Vaskularisierung an der Implantationslokalisation 1Endostatinbeads (ECB) und Stammzellbeads (SCB)gegenüber Leerbeads (LCB) und der Kontrollgruppe
ROI= Region of Interest= 575321,78 µm²,Fläche über dieausgewertet wurde
= kennzeichnet statistischsignifikante Unterschiedezwischen den Gruppen
*
Vaskularisierung an der Implantationslokalisation 2
104 4 Ergebnisse
4.2.4 Untersuchung der Tumorvolumina
Der Vergleich der Tumorvolumina erfolgte nach rechnerischer Auswertung der über
die ganze Länge des Tumors gemessenen Anschnittflächen als arithmetische
Mittelwerte aller Gruppen gegeneinander. Dazu wurden die Gewebeschnitte mittels
Hämatoxylin-Eosin (H.E.) gefärbt und die Flächen mit einer speziellen Software
(cell*f, Olympus) bei 1,25-facher Objektivvergrößerung gemessen. Da ein Tier aus
der Kontrollgruppe I (nur BT4Ca) am Tag 9 post operationem verstarb und bei 2
witeren Tieren die Implantation der Gliomzellen misslang, konnten in dieser Gruppe
nur 7 Tiere ausgewertet werden
Nach der statistischen Auswertung waren die Tumorvolumina der mit Endostatin
sezernierenden Stammzellen behandelten Tiere (Gruppe III, ECB) nicht signifikant
kleiner als die Tumoren bei den Tieren aus den anderen drei Gruppen. Es konnte
lediglich eine tendenzielle Verkleinerung gegenüber der mit Leerbeads (Gruppe II,
LCB) behandelten Gruppe gezeigt werden.
Einen signifikanten Unterschied gab es lediglich zwischen den Tumorvolumina der
Tiere aus der mit LCB behandelten Gruppe gegenüber der mit Stammzellbeads
(SCB) behandelten Gruppe. Dabei waren die Tumoren der mit SCB kleiner als die
Tumoren der mit LCB behandelten Tiere.
Es bestand kein signifikanter Unterschied der Tumorvolumina zwischen den Tieren
der Gruppe I (nur BT4Ca), der Gruppe II (Leerbeads, LCB) und den Tieren der
Gruppe III (Endostatinbeads, ECB). Signifikanzen der Tumorgrößenunterschiede
innerhalb der Gruppen I bis IV, einzige Signifikanz an SCB vs LCB:
BT4Ca vs ECB P > 0,05 SCB vs ECB P > 0,05
BT4Ca vs LCB P > 0,05 SCB vs LCB P < 0,05
BT4Ca vs SCB P > 0,05 ECB vs LCB P > 0,05
Die detaillierten Ergebnisse der statistischen Untersuchung sind im Anhang
aufgeführt. Zur graphischen Darstellung siehe Graph 11 und einen Überblick über die
Tumoren verschaffen die Abbildungen der Bildtafel 5 auf Seite 105.
4 Ergebnisse 105
4.2.4.1 Bildtafel 5
Bildtafel 5 H.E. Färbung zum Nachweis der Implantate und zur Auswertung der Tumorgrößen nach 12 Tagen
Tumoren (a) bei den Gruppen I bis IV (AI/AII/AIII/AIV) mit in Kommunikation zum Ventrikel (V) implantierten Leerbeads (LCB), Endostatin CellBeads® (ECB), nicht sezernierenden Stammzellbeads (SCB); Darstellung der implantierten CellBeads® und ihres Kontaktes zum Ventrikel (B/C); CellBeads® mit Alginatkapsel (al) und nicht sezernierenden Stammzellen (hMSC) (D), Endostatin sezernierende Stammzellen (EMSC) im CellBead® (E) und Goldpartikel (gp) im Leerbead (LCB) (F)
AI
AIV AIII
AII
a
aa
a
SCBECB
LCB
B
FE D
CECB
ECBSCB
LCB
LCB
VV
al EMSC al gphMSC
106 4 Ergebnisse
Kontrolle SCB ECB LCB0.0
2.5×10 10
5.0×10 10
7.5×10 10
1.0×10 11
1.2×10 11
1.5×10 11
1.7×10 11 *
Arithmetische Mittelwerte über die Tumorvolumina, gemessen als Flächen in µm² in definierten Abständen durch die Länge des Tumors und berechnet als Summe von Kegelstümpfen in µm³
[µm³]
Tumorvolumina
Endostatinbeads (ECB) und Stammzellbeads (SCB)gegenüber Leerbeads (LCB) und der Kontrollgruppenach 12 Tagen
Graph 11
*
= statistisch signifikanter Unterschied zwischen zwei Gruppen
4 Ergebnisse 107
4.2.5 Korrelation zwischen Tumorvolumen und Blutgefäßdichte
Um zu ermitteln, ob ein direkter Zusammenhang zwischen der Vaskularisierung des
Tumors und seinem Volumen bestand, wurden für jede Versuchsgruppe getrennt die
Korrelation zwischen den Gefäßflächen und dem Tumorvolumen bestimmt. Dazu
wurde die Summe der Gefäßflächen über die 3 an einer Lokalisation ausgewerteten
ROI (Region of Interest) gebildet. So entstand eine Gefäßflächensumme pro
Lokalisation (Bregma –1 mm oder größte Fläche) und pro Tier, deren Korrelation zu
den entsprechenden Tumorvolumina ermittelt wurde. Bei 7 Tieren in Gruppe I (nur
BT4Ca) macht das 14 Paare (Graph 12), für Gruppe II (LCB) 16 Paare (Graph 13),
für Gruppe III (ECB) 20 Paare (Graph 14) und für Gruppe IV (SCB) noch mal 16
Paare (Graph 15), deren Korrelation getrennt voneinander berechnet wurde.
Es zeigte sich, dass bei diesem Versuchsmodell das Tumorvolumen und die
Blutgefäßdichte nicht korrelierten (r² < 0,8). Die graphische Darstellung ist in Graph
12-15 einzusehen und die genauen statistischen Daten sind im Anhang aufgeführt.
Prism® Version 4.03 Statistik GraphPad Software Inc.,
San Diego, USA
Sterilbank (Heraeus Hera Safe)
Zentrifuge (Megafuge 1 OR)
Zellkultur
Zellkultur
Kendro Laboratory
Products GmbH, Hanau,
Deutschland
Abzug Histologie/
Immunhistologie
Köttermann, Uetze-
Hennigsen, Deutschland
170 9 Anhang
Brutschrank (NAPCO Series 5400
Co2-Incubator)
Sterilbank Telstar AH-100
Kultivierung der
Gliomzellen
Vorbereitung der
Implantate
Labotect GmbH,
Göttingen, Deutschland
Inversmikroskop Leica DM IRB Beurteilung der
Gliomzellen
Leica, Bensheim,
Deutschland
Kühlschrank 4°C Zellkulturreagenzien Liebherr, Biberach an der
Riss, Deutschland
Kryostat Gefriermikrotom (Microm
HM 560 Cryo-Star)
Gefrierschnitte MICROM International
GmbH, Walldorf,
Deutschland
Gefriertruhe -80°C Einfrieren der
Gliomzellen
National Lab GmbH,
Mölln, Deutschland
Mikroskop Olympus BX51 Hellfeld
Digitalkamera (Color View Soft
Imaging System)
cell*f Imaging Software for Life
Sciences Microscopy
Auswertung
Bildaufnahme
Bildbearbeitung/
Messungen/
Partikeldetektion
Olympus, Hamburg,
Deutschland
Omnilab MR 3001 K Magnetrührer Omnilab, Bremen,
Deutschland
Kühlschrank 4 °C Chemikalien Robert Bosch GmbH,
Stuttgart, Deutschland
Messer Sec 35, Low Profile
Blades
Gefrierschnitte Richard-Allan Scientific,
Kalamazoo, USA
9 Anhang 171
Cell-Counter (CASY®, cell counter
and analysis system
Vitalzellzählung Schärfe System GmbH,
Reutlingen, Deutschland
Bohr- und Fräsgerät Minimot 40/E Kraniotomie Proxxon, Niersbach,
Deutschland
Gefrierschrank –20°C (Economic
no Frost)
Lagerung der
Gehirne/
Zellkulturalliquots
Robert Bosch GmbH,
Stuttgart, Deutschland
172 9 Anhang
9.2 Reagenzien
9.2.1 Färbungen
Alkoholreihe und Xylol
2 x 1 Min. 70% Ethanol
2 x 1 Min. 96% Ethanol
2 x 1 Min. 100% Ethanol
3 x 1 Min. 100% Xylol
HCl-EtOH für H.E. Färbung
100 ml Aqua dest.
100 ml Ethanol absol.
0,5 ml Salzsäure (30%ig)
Peroxidase Block für Immunhistologie
5333 µl Wasserstoffperoxid
400 ml PBS (0,1 M, DakoCytomation)
9.2.2 Perfusionsfixierung
PBS (Phosphatpuffer)
nach DAKO Handbuch, 0,1 M auf 1 Liter Aqua dest. (pH 7,2)
1,48 g NA2HPO4
0,43 g KH2PO4
7,20 g NaCl
9 Anhang 173
PFA (Paraformaldehydlösung)
1 L PBS (0,1 M)
40 g PFA
unter Rühren auf 60°C unter Abzug erhitzen, Klären mit NaOH, filtrieren, Lagerung
bei 4°C, Verwendung bis nächsten Tag
Sucroselösung
70 g PBS (0,1 M)
30 g Sucrose
9.2.3 Zellkultur
Kulturmedium
174 ml DMEM High Glucose
20 ml fetales Kälberserum
2 ml Natriumpyruvat
2 ml Penicillin Streptomycin
2 ml L-Glutamat
nach dem Auftauen im Wasserbad steril unter der Werkbank in autoklavierte
Glasflasche pipettieren, Lagerung bei 4°C, Verwendbar 1 Woche
Einfriermedium
180 ml DMEM High Glucose
20 ml fetales Kälberserum
nach dem Auftauen im Wasserbad steril unter der Werkbank in autoklavierte
Glasflasche pipettieren, sofort verwenden
174 9 Anhang
9.3 Färbeprotokolle
9.3.1 Färbeprotokoll Hämatoxylin-Eosin-Färbung
Zeit Färbeschritt 30 Min. OT bei Raumtemperatur auftauen lassen
10 Min. Spülen in Leitungswasser
3 Min. Inkubation in Hämatoxylin
5 Min. Wässern in fließendem Leitungswasser zum Bläuen
1 Sek. Differenzieren in 0,15%HCl-EtOH
5 Min. Wässern in fließendem Leitungswasser zum Spülen
3 Min. Spülen in Aqua dest.
2 Min. Inkubation in Eosin
2 x 1 Min. Spülen in Aqua dest.
Alkoholreihe zum Entwässern
Xylol
Eindecken mit Entellan
9 Anhang 175
9.3.2 Färbeprotokoll Immunhistologie
Immunhistologie Endostatin/ vWF Host: Rabbit Dako K400811 PBS (Phosphate Buffered Saline) TRS (Target Retrieval Solution) 1L (900ml Aqua dest.+ 100ml TRS) PrimärAk Verdünnung in Antibody Diluent (anti human endostatin, bzw. anti-vWF)
SC (Shandon Clips) Zeit Vorgang
60 Min bei RT auftauen in schwarzen Schiffchen 3x5 Min Phosphatpuffer waschen (0,1 mol/L) 2x15 Min Peroxidase Block [5333,33µl H2O2 auf 400ml
Phosphatpuffer (0,1 mol/L)]
2x5 Min PBS Dako waschen 1x5 Min waschen TRS (Target Retrieval Solution) 30 Min Kochen mit TRS erhitzen auf >92°C, OT rein,
Zeit erst messen, wenn >94°C erreicht
20 Min In Puffer stehend abkühlen lassen, dann in kalten Puffer überführen
SC In Shandon Clips einklemmen mit TRS SC 30 Min Blocking Antibody Diluent SC 30 Min Primär AK verdünnt in Antibody Diluent,
bzw. negative Kontrolle 1:400
SC 2x5 Min waschen TRS 500µl SC 30 Min Polymer SC 2x5 Min waschen TRS 500µl SC 26 Min Chromogen
mit Aqua dest. Waschen (schnell Spritzflasche) 1 Min Hämatoxylin 2x in 5 Ammoniak (0,037 mol/L), tauchen 2x5 Min Aqua Dest. waschen Eindecken mit Faramount
176 9 Anhang 9.4 Protokolle der Versuchsdurchführung
OP-Protokoll BT4Ca Inokulation und CB Implantation
Projekt Tier Tag der Einstellung
KGW (g)
m / w OP-DatumTag 0
OP-Beginn OP-Dauer
Endostatin EN g w Min
Injektionen Uhrzeit
Vol./Med. ml Ket. ml Dom.
Nadel Nadel IA0 AP Bregma AP
LM LM DV DV
Bohrlochkoordinaten AP-1; LM-2,8 bis AP-1; LM3,4
Bregma Koordinaten Ergebnis
AP -1 LM –3,4
DV BT4Ca-Impl. -5/-4 Anzahl BT4Ca Flasche Inj. Volumen
verwendete Hamiltonkanüle: ga 19, spitz
OP-Datum Tag 1
OP-Beginn OP-Dauer
Min
Injektionen Uhrzeit
Vol./Med. ml Ket. ml Dom.
Bregma Koordinaten Ergebnis
AP -1 LM -2,8
DV CB-Impl. -6/-5 aufgezogen Restinhalt Implantiert 1.Impl. 2.Impl.
verwendete Hamiltonkanüle: ga 19, spitz Perfusionsdatum:__________________________
9 Anhang 177 Schneideprotokoll für 6000-10000 µm langen Tumor Datum:_________ Seite 1 Taktlänge 360µm Takt µm S OT Bez. Bemerkng
Takt µm S
OT Bez. Bemerkng
1 0-120 1 1 HE A 1+2 7 2880-3000 289 13 HE A 7+8 0-120 2 2880-3000 290 0-120 3 2 HE B 1+2 2880-3000 291 14 HE B 7+8 0-120 4 2880-3000 292 0-120 5 3 vWF A 1+2 2880-3000 293 15 vWF A 7+8 0-120 6 2880-3000 294 0-120 7 4 vWF B 1+2 2880-3000 295 16 vWF B 7+8 0-120 8 2880-3000 296 2 480-600 49 1 HE A 1+2 8 3360-3480 337 13 HE A 7+8 480-600 50 3360-3480 338 480-600 51 2 HE B 1+2 3360-3480 339 14 HE B 7+8 480-600 52 3360-3480 340 480-600 53 3 vWF A 1+2 3360-3480 341 15 vWF A 7+8 480-600 54 3360-3480 342 480-600 55 4 vWF B 1+2 3360-3480 343 16 vWF B 7+8 480-600 56 3360-3480 344 3 960-1080 97 5 HE A 3+4 9 3840-3960 385 17 HE A 9+10 960-1080 98 3840-3960 386 960-1080 99 6 HE B 3+4 3840-3960 387 18 HE B 9+10 960-1080 100 3840-3960 388 960-1080 101 7 vWF A 3+4 3840-3960 389 19 vWF A 9+10 960-1080 102 3840-3960 390 960-1080 103 8 vWF B 3+4 3840-3960 391 20 vWF B 9+10 960-1080 104 3840-3960 392 4 1440-1560 145 5 HE A 3+4 10 4320-4440 433 17 HE A 9+10 1440-1560 146 4320-4440 434 1440-1560 147 6 HE B 3+4 4320-4440 435 18 HE B 9+10 1440-1560 148 4320-4440 436 1440-1560 149 7 vWF A 3+4 4320-4440 437 19 vWF A 9+10 1440-1560 150 4320-4440 438 1440-1560 151 8 vWF B 3+4 4320-4440 439 20 vWF B 9+10 1440-1560 152 4320-4440 440 5 1920-2040 193 9 HE A 5+6 11 4800-4920 481 21 HE A 11+12 1920-2040 194 4800-4920 482 1920-2040 195 10 HE B 5+6 4800-4920 483 22 HE B 11+12 1920-2040 196 4800-4920 484 1920-2040 197 11 vWF A 5+6 4800-4920 485 23 vWF A 11+12 1920-2040 198 4800-4920 486 1920-2040 199 12 vWF B 5+6 4800-4920 487 24 vWF B 11+12 1920-2040 200 4800-4920 488 6 2400-2520 241 9 HE A 5+6 12 5280-5400 529 21 HE A 11+12 2400-2520 242 5280-5400 530 2400-2520 243 10 HE B 5+6 5280-5400 531 22 HE B 11+12 2400-2520 244 5280-5400 532 2400-2520 245 11 vWF A 5+6 5280-5400 533 23 vWF A 11+12 2400-2520 246 5280-5400 534 2400-2520 247 12 vWF B 5+6 5280-5400 535 24 vWF B 11+12 2400-2520 248 5280-5400 536
Endostatin: OT: Endo 2,2 + 1,6 bis Endo - 2,56 + - 3,14; jeweils 4 Schnitte/OT; 2 Lokalisationen/ OT, alles in doppelter
Ausführung
178 9 Anhang Seite 2 Ta kt µm S OT Bez. Bemerkng
Takt µm S OT Bez. Bemerkng
13 5760-5880 577 25 HE A 13+14 19 8640-8760 865 37 HE A 19+20 5760-5880 578 8640-8760 866 5760-5880 579 26 HE B 13+14 8640-8760 867 38 HE B 19+20 5760-5880 580 8640-8760 868 5760-5880 581 27 vWF A 13+14 8640-8760 869 39 vWF A 19+20 5760-5880 582 8640-8760 870 5760-5880 583 28 vWF B 13+14 8640-8760 871 40 vWF B 19+20 5760-5880 584 8640-8760 872
14 6240-6360 625 25 HE A 13+14 20 9120-9240 913 37 HE A 19+20 6240-6360 626 9120-9240 914 6240-6360 627 26 HE B 13+14 9120-9240 915 38 HE B 19+20 6240-6360 628 9120-9240 916 6240-6360 629 27 vWF A 13+14 9120-9240 917 39 vWF A 19+20 6240-6360 630 9120-9240 918 6240-6360 631 28 vWF B 13+14 9120-9240 919 40 vWF B 19+20 6240-6360 632 9120-9240 920
15 6720-6840 673 29 HE A 15+16 21 9600-9720 961 41 HE A 21+22 6720-6840 674 9600-9720 962 6720-6840 675 30 HE B 15+16 9600-9720 963 42 HE B 21+22 6720-6840 676 9600-9720 964 6720-6840 677 31 vWF A 15+16 9600-9720 965 43 vWF A 21+22 6720-6840 678 9600-9720 966 6720-6840 679 32 vWF B 15+16 9600-9720 967 44 vWF B 21+22 6720-6840 680 9600-9720 968
16 7200-7320 721 29 HE A 15+16 22 10080-10200 1009 41 HE A 21+22 7200-7320 722 10080-10200 1010 7200-7320 723 30 HE B 15+16 10080-10200 1011 42 HE B 21+22 7200-7320 724 10080-10200 1012 7200-7320 725 31 vWF A 15+16 10080-10200 1013 43 vWF A 21+22 7200-7320 726 10080-10200 1014 7200-7320 727 32 vWF B 15+16 10080-10200 1015 44 vWF B 21+22 7200-7320 728 10080-10200 1016
17 7680-7800 769 33 HE A 17+18 23 10560-10680 1057 45 HE A 23+24 7680-7800 770 10560-10680 1058 7680-7800 771 34 HE B 17+18 10560-10680 1059 46 HE B 23+24 7680-7800 772 10560-10680 1060 7680-7800 773 35 vWF A 17+18 10560-10680 1061 47 vWF A 23+24 7680-7800 774 10560-10680 1062 7680-7800 775 36 vWF B 17+18 10560-10680 1063 48 vWF B 23+24 7680-7800 776 10560-10680 1064
18 8160-8280 817 33 HE A 17+18 24 11040-11160 1105 45 HE A 23+24 8160-8280 818 11040-11160 1106 8160-8280 819 34 HE B 17+18 11040-11160 1107 46 HE B 23+24 8160-8280 820 11040-11160 1108 8160-8280 821 35 vWF A 17+18 11040-11160 1109 47 vWF A 23+24 8160-8280 822 11040-11160 1110 8160-8280 823 36 vWF B 17+18 11040-11160 1111 48 vWF B 23+24 8160-8280 824 11040-11160 1112
Zusätzliche OT:
Nr. Bez. was Nr. Bez. Was Nr. Bez. wasNr. Bez. was
9 Anhang 179
Zellzahlbestimmung
• Neubauerzählkammer und Deckglas mit 70%igem EtOH reinigen • Zellen je nach Pellet Größe mit bis zu 8ml Medium resuspendieren • 10µl Zellsuspension mit 10µl Trypanblau mischen: 10µl in Kammer geben • 4 Quadrate auszählen • Zellen auf dem linken und oberen Rand nicht mitzählen • Berechnung der Zellzahl
o Summe der Quadrate :2 (wenn mit Trypanblau) o Summe der Quadrate :4 (wenn ohne Trypanblau) o x 104 = Zellzahl pro ml o x Anzahl der ml in denen Zellen gelöst sind = Zellzahl gesamt
Datum: Flasche Trypan-
blau A B C D :2 (m.Tr.)
:4 (o.Tr.) = Zellzahl Kammer[x104]
x ml
Zellzahl/Flasche
pro 75cm2 Flaschen 6x105 Zellen einsetzen Volumen berechnen nach Formel: X ml= 5
5
10106×××
zyml
X= in Zellkulturflasche einzusetzen Y = Menge Medium, in dem das Pellet aufgenommen wurde Z = Anzahl der Zellen pro Flasche Flasche Menge in ml, die 6x105 Zellen
enthalten
180 9 Anhang 9.5 Statistik
9.5.1 Vaskularisierungsdichte
Statistik Vaskularisierung an der größten Tumoranschnittsfläche Parameter Value Fläche Gefäße Fo Table Analyzed Fläche Gefäße oben (gr. Anschnittsfläche Tumor) One-way analysis of variance P value P<0.0001 P value summary *** Are means signif. different? (P < 0.05) Yes Number of groups 4 F 19,29 R squared 0,6662 Bartlett's test for equal variances Bartlett's statistic (corrected) 39,07 P value P<0.0001 P value summary *** Do the variances differ signif. (P < 0.05) Yes ANOVA Table SS df MS Treatment (between columns) 4065 3 1355 Residual (within columns) 2037 29 70,23 Total 6102 32 Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. q P value 95% CI of diff Kontrolle vs LCB -12,28 4,003 P < 0.05 -24.10 to -0.4558 Kontrolle vs ECB 17,07 5,846 P < 0.01 5.815 to 28.33 Kontrolle vs SCB -2,166 0,7064 P > 0.05 -13.99 to 9.654 LCB vs ECB 29,35 10,44 P < 0.001 18.51 to 40.18 LCB vs SCB 10,11 3,412 P > 0.05 -1.310 to 21.53 ECB vs SCB -19,24 6,844 P < 0.001 -30.07 to -8.403 Fläche Gefäße Fm Table Analyzed Fläche Gefäße mitte (gr. Anschnittsfläche Tumor) One-way analysis of variance P value P<0.0001 P value summary *** Are means signif. different? (P < 0.05) Yes Number of groups 4 F 31,12 R squared 0,763 Bartlett's test for equal variances Bartlett's statistic (corrected) 27,13 P value P<0.0001 P value summary *** Do the variances differ signif. (P < 0.05) Yes ANOVA Table SS df MS Treatment (between columns) 9726 3 3242 Residual (within columns) 3021 29 104,2 Total 12750 32 Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. q P value 95% CI of diff Kontrolle vs LCB -26,6 7,123 P < 0.001 -41.00 to -12.21 Kontrolle vs ECB 18,97 5,334 P < 0.01 5.263 to 32.68 Kontrolle vs SCB -9,882 2,646 P > 0.05 -24.28 to 4.515 LCB vs ECB 45,58 13,31 P < 0.001 32.38 to 58.77 LCB vs SCB 16,72 4,634 P < 0.05 2.814 to 30.63 ECB vs SCB -28,85 8,428 P < 0.001 -42.05 to -15.66
9 Anhang 181
Statistik Vaskularisierung an der größten Tumoranschnittsfläche Fläche Gefäße Fu Table Analyzed Fläche Gefäße unten (gr. Anschnittsfläche Tumor) One-way analysis of variance P value P<0.0001 P value summary *** Are means signif. different? (P < 0.05) Yes Number of groups 4 F 14,8 R squared 0,6049 Bartlett's test for equal variances Bartlett's statistic (corrected) 6,815 P value 0,078 P value summary ns Do the variances differ signif. (P < 0.05) No ANOVA Table SS df MS Treatment (between columns) 8441 3 2814 Residual (within columns) 5514 29 190,1 Total 13950 32 Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. q P value 95% CI of diff Kontrolle vs LCB -23,16 4,589 P < 0.05 -42.61 to -3.706 Kontrolle vs ECB 20,4 4,245 P < 0.05 1.878 to 38.92 Kontrolle vs SCB 1,603 0,3176 P > 0.05 -17.85 to 21.05 LCB vs ECB 43,55 9,417 P < 0.001 25.73 to 61.38 LCB vs SCB 24,76 5,079 P < 0.01 5.968 to 43.55 ECB vs SCB -18,8 4,064 P < 0.05 -36.62 to -0.9686 Summe Fläche Gefäße Fu/Fo/Fm Table Analyzed Summe Fläche Gefäße (größte Anschnittsfläche Tumor) One-way analysis of variance P value P<0.0001 P value summary *** Are means signif. different? (P < 0.05) Yes Number of groups 4 F 54,46 R squared 0,8493 Bartlett's test for equal variances Bartlett's statistic (corrected) 9,144 P value 0,0274 P value summary * Do the variances differ signif. (P < 0.05) Yes ANOVA Table SS df MS Treatment (between columns) 2,102E+12 3 7,007E+11 Residual (within columns) 3,731E+11 29 12870000000 Total 2,475E+12 32 Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. q P value 95% CI of diff Kontrolle vs LCB -356900 8,598 P < 0.001 -516900 to -196900 Kontrolle vs ECB 324700 8,215 P < 0.001 172400 to 477100 Kontrolle vs SCB -60130 1,448 P > 0.05 -220100 to 99870 LCB vs ECB 681600 17,92 P < 0.001 535000 to 828300 LCB vs SCB 296800 7,401 P < 0.001 142200 to 451400 ECB vs SCB -384800 10,11 P < 0.001 -531500 to -238200
182 9 Anhang
Statistik Vaskularisierung an der Implantationslokalisation Parameter Value Fläche Gefäße Bo Table Analyzed Fläche Gefäße oben (Bregma -1 mm) One-way analysis of variance P value 0,0004 P value summary *** Are means signif. different? (P < 0.05) Yes Number of groups 4 F 8,169 R squared 0,458 Bartlett's test for equal variances Bartlett's statistic (corrected) 27,82 P value P<0.0001 P value summary *** Do the variances differ signif. (P < 0.05) Yes ANOVA Table SS df MS Treatment (between columns) 3147 3 1049 Residual (within columns) 3724 29 128,4 Total 6871 32
Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. q P value 95% CI of diff
Kontrolle vs LCB -5,549 1,338 P > 0.05 -21.53 to 10.43 Kontrolle vs ECB 16,48 4,174 P < 0.05 1.261 to 31.70 Kontrolle vs SCB -6,416 1,547 P > 0.05 -22.40 to 9.568 LCB vs ECB 22,03 5,796 P < 0.01 7.380 to 36.68 LCB vs SCB -0,8663 0,2162 P > 0.05 -16.31 to 14.58 ECB vs SCB -22,9 6,024 P < 0.01 -37.55 to -8.247 Fläche Gefäße Bm Table Analyzed Fläche Gefäße mitte (Bregma -1 mm) One-way analysis of variance P value P<0.0001 P value summary *** Are means signif. different? (P < 0.05) Yes Number of groups 4 F 10,23 R squared 0,5143 Bartlett's test for equal variances Bartlett's statistic (corrected) 27,48 P value P<0.0001 P value summary *** Do the variances differ signif. (P < 0.05) Yes ANOVA Table SS df MS Treatment (between columns) 8279 3 2760 Residual (within columns) 7820 29 269,7 Total 16100 32
Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. q P value 95% CI of diff
Kontrolle vs LCB -19,65 3,27 P > 0.05 -42.81 to 3.512 Kontrolle vs ECB 23,07 4,032 P < 0.05 1.016 to 45.13 Kontrolle vs SCB 6,639 1,105 P > 0.05 -16.52 to 29.80 LCB vs ECB 42,72 7,757 P < 0.001 21.49 to 63.95 LCB vs SCB 26,29 4,528 P < 0.05 3.913 to 48.67 ECB vs SCB -16,43 2,983 P > 0.05 -37.66 to 4.796
9 Anhang 183
Statistik Vaskularisierung an der Implantationslokalisation Fläche Gefäße Bu Table Analyzed Fläche Gefäße unten (Bregma -1 mm) One-way analysis of variance P value 0,0002 P value summary *** Are means signif. different? (P < 0.05) Yes Number of groups 4 F 8,964 R squared 0,4811 Bartlett's test for equal variances Bartlett's statistic (corrected) 20,55 P value 0,0001 P value summary *** Do the variances differ signif. (P < 0.05) Yes ANOVA Table SS df MS Treatment (between columns) 8093 3 2698 Residual (within columns) 8728 29 301 Total 16820 32 Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. q P value 95% CI of diff Kontrolle vs LCB -24,14 3,803 P > 0.05 -48.61 to 0.3268 Kontrolle vs ECB 18,06 2,987 P > 0.05 -5.244 to 41.36 Kontrolle vs SCB 4,885 0,7694 P > 0.05 -19.59 to 29.36 LCB vs ECB 42,2 7,252 P < 0.001 19.77 to 64.63 LCB vs SCB 29,03 4,733 P < 0.05 5.388 to 52.67 ECB vs SCB -13,17 2,264 P > 0.05 -35.60 to 9.256 Summe Fläche Gefäße Bu/Bo/Bm Table Analyzed Summe Fläche Gefäße (Bregma -1 mm) One-way analysis of variance P value P<0.0001 P value summary *** Are means signif. different? (P < 0.05) Yes Number of groups 4 F 24,55 R squared 0,7175 Bartlett's test for equal variances Bartlett's statistic (corrected) 18,07 P value 0,0004 P value summary *** Do the variances differ signif. (P < 0.05) Yes ANOVA Table SS df MS Treatment (between columns) 1,701E+12 3 5,669E+11 Residual (within columns) 6,697E+11 29 23090000000 Total 2,37E+12 32 Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. q P value 95% CI of diff Kontrolle vs LCB -283900 5,105 P < 0.01 -498200 to -69540 Kontrolle vs ECB 331400 6,259 P < 0.001 127300 to 535500 Kontrolle vs SCB 29390 0,5284 P > 0.05 -185000 to 243700 LCB vs ECB 615300 12,07 P < 0.001 418900 to 811800 LCB vs SCB 313300 5,831 P < 0.01 106200 to 520400 ECB vs SCB -302000 5,926 P < 0.01 -498500 to -105600
184 9 Anhang
Statistik Gefäßanzahl an der größten Tumoranschnittsfläche und an der Implantationslokalisation Summe Anzahl Gefäße Fu/Fo/Fm Table Analyzed Summe Anzahl Gefäße (größte Anschnittsfläche Tumor) One-way analysis of variance P value 0,0059 P value summary ** Are means signif. different? (P < 0.05) Yes Number of groups 4 F 5,089 R squared 0,3449 Bartlett's test for equal variances Bartlett's statistic (corrected) 18,42 P value 0,0004 P value summary *** Do the variances differ signif. (P < 0.05) Yes ANOVA Table SS df MS Treatment (between columns) 445000000 3 148300000 Residual (within columns) 845300000 29 29150000 Total 1290000000 32 Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. q P value 95% CI of diff Kontrolle vs LCB 663,6 0,3359 P > 0.05 -6952 to 8279 Kontrolle vs ECB 7705 4,096 P < 0.05 454.0 to 14960 Kontrolle vs SCB -1139 0,5764 P > 0.05 -8754 to 6477 LCB vs ECB 7042 3,889 P < 0.05 62.11 to 14020 LCB vs SCB -1803 0,9443 P > 0.05 -9160 to 5555 ECB vs SCB -8844 4,884 P < 0.01 -15820 to -1865 Summe Anzahl Gefäße Bu/Bo/Bm Table Analyzed Summe Anzahl Gefäße (Bregma -1 mm) One-way analysis of variance P value 0,0043 P value summary ** Are means signif. different? (P < 0.05) Yes Number of groups 4 F 5,442 R squared 0,3602 Bartlett's test for equal variances Bartlett's statistic (corrected) 20,2 P value 0,0002 P value summary *** Do the variances differ signif. (P < 0.05) Yes ANOVA Table SS df MS Treatment (between columns) 317800000 3 105900000 Residual (within columns) 564500000 29 19460000 Total 882200000 32 Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. q P value 95% CI of diff Kontrolle vs LCB 2583 1,6 P > 0.05 -3640 to 8806 Kontrolle vs ECB 8214 5,343 P < 0.01 2288 to 14140 Kontrolle vs SCB 2677 1,658 P > 0.05 -3546 to 8900 LCB vs ECB 5631 3,805 P > 0.05 -72.83 to 11330 LCB vs SCB 94,25 0,0604 P > 0.05 -5918 to 6106 ECB vs SCB -5536 3,741 P > 0.05 -11240 to 167.1
9 Anhang 185 Erhobene Daten zu Blutgefäßflächen an der größten Tumoranschnittsfläche größte Anschnittsfläche Flächen
Fläche ROI µm²: 575321,78 Fläche ROIx3 1725965,338 BT4Ca Gesamtsumme Flächen ROIs [µm²] 12081757,4 oben mitte unten Tier Fläche Klasse Fläche Klasse Fläche Klasse Summe Flächen/Tier Flächenanteil/Tier Flächenanteil/Gruppe µm² µm² µm² µm² % %
186 9 Anhang Erhobene Daten zu Gefäßflächen an der Implantationslokalisation Bregma -1 Flächen
Fläche ROI µm²: 575321,78 Fläche ROIx3 1725965,34 BT4Ca Gesamtsumme Flächen ROIs [µm²] 12081757,37 oben mitte unten Tier Fläche Klasse Fläche Klasse Fläche Klasse Summe Flächen/Tier Flächenanteil/Tier Flächenanteil/Gruppe µm² µm² µm² µm² % %
Statistik der Tumorvolumina Parameter Value Table Analyzed Data 1 One-way analysis of variance P value 0,0209 P value summary * Are means signif. different? (P < 0.05) Yes Number of groups 4 F 3,784 R squared 0,2813 Bartlett's test for equal variances Bartlett's statistic (corrected) 0,2622 P value 0,967 P value summary ns Do the variances differ signif. (P < 0.05) No ANOVA Table SS df MS Treatment (between columns) 2,029E+22 3 6,762E+21 Residual (within columns) 5,183E+22 29 1,787E+21 Total 7,211E+22 32 Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. q P value Kontrolle vs SCB 22490000000 1,454 P > 0.05 Kontrolle vs ECB -10960000000 0,7439 P > 0.05 Kontrolle vs LCB -47320000000 3,059 P > 0.05 SCB vs ECB -33450000000 2,359 P > 0.05 SCB vs LCB -69820000000 4,671 P < 0.05 ECB vs LCB -36360000000 2,565 P > 0.05 95% CI of diff Kontrolle vs SCB -37140000000 to 82120000000 Kontrolle vs ECB -67740000000 to 45820000000 Kontrolle vs LCB -107000000000 to 12310000000 SCB vs ECB -88100000000 to 21200000000 SCB vs LCB -127400000000 to -12210000000 ECB vs LCB -91020000000 to 18290000000
192 9 Anhang Summen der gemessene Anschnittsflächen
Tumorflächen Endostatinbeads und Stammzellbeads gegenüber Leerbeads und Kontrolle Kontrollgruppe CB037/ SCB Tier Vol Takt Tier Vol Takt EN80 8,1335E+10 480 EN84 2,2939E+10 360 EN83 1,6803E+11 600 EN96 5,4875E+10 480 EN93 6,4975E+10 480 EN97 1,0536E+11 480 EN102 3,0934E+10 480 EN105 5,4586E+10 360 EN106 4,7249E+10 480 EN110 1,3476E+11 600 EN122 9,407E+10 480 EN114 3442419538 120 EN123 1,206E+11 480 EN117 8,8809E+10 480 EN120 4,9209E+10 480 Mittelwert µm³ 8,6742E+10 6,4249E+10 Mittelwert mm³ 86,742235 64,2485135 STBW µm³ 4,6521E+10 4,3223E+10 STBW mm³ 46,5213758 43,2227401 CB038/ ECB CB039/ LCB Tier Vol Takt Tier Vol Takt EN82 1,0143E+11 720 EN79 9,762E+10 540 EN85 1,2343E+11 600 EN88 9,669E+10 600 EN98 1,2912E+11 600 EN94 1,471E+11 480 EN103 9,884E+10 480 EN100 8,0734E+10 480 EN108 5,0943E+10 480 EN101 1,5007E+11 600 EN112 1,0706E+10 360 EN111 1,7994E+11 600 EN118 1,4567E+11 600 EN115 1,4243E+11 600 EN119 1,0633E+11 480 EN116 1,7793E+11 600 EN121 7,5597E+10 480 EN124 1,3495E+11 600 Mittelwert µm³ 9,7702E+10 1,3406E+11 Mittelwert mm³ 97,7015568 134,064787 STBW µm³ 4,1727E+10 3,7974E+10 STBW mm³ 41,7269779 37,9737898 Verwendete Formeln Äquivalentradius r = √ A⁄π Kegelstumpf V = 1⁄3* (r1² + r1*r2 + r2²) Kegel 1⁄3* G* h r1= Radius 1= Radius der ersten Fläche r2= Radius 2= Radius der zweiten Fläche G= Grundfläche bei nur einer Fläche h= Höhe= Takt zwischen den Schnitten Tumorvolumina wurden berechnet als Summe der Kegelstümpfe zwischen zwei ausgemessenen Tumorflächen addiert mit als Kegel berechneten Ausgleichswerten bei Tumorüberständen vor oder nach dem letzten auswertbaren Schnitt.
9 Anhang 193
9.5.3 Korrelationen zwischen Vaskularisierung und Tumorvolumina
Statistik zur Bestimmung der Korrelationen Seite 1 Gefäßfläche Y Intercept Gruppe I BT4Ca Tumorvol. vs. Summe Gefäßflächen aus 6 ROI Best-fit values Slope 0.000002015 ± 0.0000006729 Y-intercept when X=0.0 261500 ± 65170 X-intercept when Y=0.0 -1,298E+11 1/slope 49640095% Confidence Intervals Slope 0.0000005484 to 0.000003481 Y-intercept when X=0.0 119500 to 403500 X-intercept when Y=0.0 -711800000000 to -35480000000 Goodness of Fit r² 0,4276 Sy.x 108400Is slope significantly non-zero? F 8,964 DFn, DFd 1.000, 12.00 P value 0,0112 Deviation from zero? Significant Data Number of X values 14 Maximum number of Y replicates 1 Total number of values 14 Number of missing values 0Gruppe II LCB Tumorvol. vs. Summe Gefäßflächen aus 6 ROI Best-fit values Slope 0.000002254 ± 0.000001048 Y-intercept when X=0.0 611800 ± 79540 X-intercept when Y=0.0 -2,714E+11 1/slope 44360095% Confidence Intervals Slope 0.000000007024 to 0.000004502 Y-intercept when X=0.0 441200 to 782400
X-intercept when Y=0.0 -107700000000000 to -101400000000
Goodness of Fit r² 0,2485 Sy.x 169400Is slope significantly non-zero? F 4,63 DFn, DFd 1.000, 14.00 P value 0,0494 Deviation from zero? Significant Data Number of X values 16 Maximum number of Y replicates 1 Total number of values 16 Number of missing values 0
194 9 Anhang
Statistik zur Bestimmung der Korrelationen Seite 2 Gefäßfläche Y Intercept Gruppe III ECB Tumorvol. vs. Summe Gefäßflächen aus 6 ROI Best-fit values Slope 0.0000004169 ± 0.0000002559 Y-intercept when X=0.0 67430 ± 26980 X-intercept when Y=0.0 -1,618E+11 1/slope 239900095% Confidence Intervals Slope -0.0000001208 to 0.0000009545 Y-intercept when X=0.0 10760 to 124100 X-intercept when Y=0.0 Goodness of Fit r² 0,1285 Sy.x 45300Is slope significantly non-zero? F 2,654 DFn, DFd 1.000, 18.00 P value 0,1207 Deviation from zero? Not Significant Data Number of X values 20 Maximum number of Y replicates 1 Total number of values 20 Number of missing values 0Gruppe IV SCB Tumorvol. vs. Summe Gefäßflächen aus 6 ROI Best-fit values Slope -0.0000002097 ± 0.0000009280 Y-intercept when X=0.0 479700 ± 128700 X-intercept when Y=0.0 2,287E+12 1/slope -476800095% Confidence Intervals Slope -0.000002200 to 0.000001781 Y-intercept when X=0.0 203700 to 755800 X-intercept when Y=0.0 Goodness of Fit r² 0,003635 Sy.x 131900Is slope significantly non-zero? F 0,05108 DFn, DFd 1.000, 14.00 P value 0,8245 Deviation from zero? Not Significant Data Number of X values 16 Maximum number of Y replicates 1 Total number of values 16 Number of missing values 0
9 Anhang 195
9.6 Danksagung
Herrn Prof. Dr. med. T. Brinker herzlichen Dank für die wissenschaftliche Betreuung,
vielmehr aber noch für das immer wieder Mutmachen und für viele gute Tipps. Herrn
Univ. Prof. Dr. vet. med. I. Nolte danke ich für die Übernahme der Betreuung und für
die Gelegenheit anderthalb Jahre lang in der Onkologiesprechstunde lernen zu
dürfen. Herrn Prof. Dr. med. Dr. hc mult Dr. M. Samii danke ich für die Bereitstellung
der Forschungseinrichtungen des INI Hannover und für tolle Feste. Frau PD Dr. med.
P. Klinge vielen Dank für die nette und hilfreiche Beratung in immunhistologischen
Dingen. Der Internationalen Stiftung Neurobionik Hannover und dem
Bundesministerium für Bildung und Forschung danke ich für die finanzielle
Projektunterstützung. Bei der Firma CellMed AG bedanke ich mich für die
Bereitstellung der Implantate und vor allem bei Frau Dr. Christine Wallrapp für die
geduldige und immer freundliche Unterstützung und Hilfe.
Ganz herzlichen Dank an all die, die diese Arbeit möglich gemacht haben und
geholfen haben, wo sie konnten. Allen voran das ganze Laborteam: Steffen Baltes
für Rat und Tat; Christiane Bartling und Jana Unger für viele bunte Schnitte und noch
vieles mehr; Ina Freund, Caro Mallig, Pia Rittmann und allen anderen für eine
wirklich gute Zeit, für Trost, für Kaffee, fürs Zuhören und für Hilfe überall.
Vielen Dank auch an all meine fleißigen Korrekturleser und Übersetzungshelfer.
Ein besonderer Dank geht an meine ganze WG, die mir ohne ein Wort darüber zu
verlieren immer wieder wochenlang den Rücken frei gehalten und ein schönes
Zuhause gegeben hat. Ihr seid die Größten.
Den Engeln und Allen die dazu gehören, danke ich dafür, dass sie mir die Familie
sind, die sie sind und für ihr Verständnis.
Ich danke meinen Freunden, denn ganz sicher ist: Ohne Eure Unterstützung wäre
ich da so nicht durchmarschiert: Nicole Hartmann, Juliane Körte, Enrico Schulz, Anna
Heile, Doro Kollmann, Peter Krause, Mario Kollmann und allen anderen. Es ist