1 VL Mikrobiologie der Erdkruste SS 2004 Bert Engelen Untersuchung der tiefen Biosphäre Mikrobiologische und molekularbiologische Methoden VL Mikrobiologie der Erdkruste SS 2004 Bert Engelen Wie werden Bakterien eigentlich gezählt? Parkes, R.J., B.A. Cragg and P. Wellsbury, 2000
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Untersuchung der tiefen Biosphäre - pmbio.icbm.de · 3 VL Mikrobiologie der Erdkruste SS 2004 Bert Engelen Möglichkeiten zur Analyse von Bakteriengemeinschaften Kultivierung Molekularbiologie
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VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
Untersuchung der tiefen Biosphäre
Mikrobiologische und molekularbiologische Methoden
VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
Wie werden Bakterien eigentlich gezählt?
Parkes, R.J., B.A. Cragg and P. Wellsbury, 2000
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VL Mikrobiologie der Erdkruste
SS 2004 Bert Engelen
Autofluoreszenz von Chlorophyll a
Anfärbung mit Fluoreszenz-Farbstoffen: DAPI, Acridinorange, SYBR Green
Färbung von Wattsediment mit SYBR Green
Ph
oto
: B
. K
öp
ke
Pho
tos:
H.
Cyp
ionk
a
Eisensulfidflocke im Phasenkontrast
fluoreszierende Zellen
Kombination ausPhasenkontrast und
Fluoreszenz
Mikroskopie:
FlowcytometerDNA-Menge (2-4*106 Basenpaare pro Bakteriengenom)ATP * 250 BioC (in g)
Andere Methoden:
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MPN-Verfahren (Most Probable Number)Verdünnungsreihe in 3-5 Parallelen, Berechnung nach Formel (Tabelle)
auf Platten, Flüssigkultur
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6Verdünnung
9 mlMedium
1 ml plattieren
159 17 2 0 zu viele Kolonien
159 x 103 = 1,59 x 105
Kolonien x Verdünnung = Zellzahl
verändert nach Brock, 1997
A
H
G
F
E
D
C
1
B
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Kontrolle
Parallele 1
Parallele 2
Parallele 3
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
Lebendzellzahl (< 1%):
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Möglichkeiten zur Analyse von Bakteriengemeinschaften
Kultivierung Molekularbiologie
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Nachteil:
Weiterführende Untersuchungen oft nicht möglich
Viele Bakterien lassen sich nicht so einfach kultivieren
Enorm zeitintensiv
Vorteil:
Untersuchungen z.B. zur Physiologie, Gen-Regulation
oder Produktion von Metaboliten möglich
Umgehung von Kultivierungsschritten
Erfassung von bisher nicht kultivierten Organismen
Molekularbiologische Protokolle:
Kultivierungsabhängige Techniken:
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Proteobacteria
Syner
gist
es
Aci
doba
cter
ium
Nit
rosp
ira
Archaea 0,10
Fusobacteria
Spirochetes
Thermus/Deinococcus
CytophagalesGreen sulfur
FibrobacterLow G+C gram positive
Cyanobacteria
Flexistip
es
Planctomycetes
Verrucom
icrobia
Chlam
ydia
ActinobacteriaGreen non-sulfur
TM7
OP
8Te
rmite
gro
up I
OP11
WS6
TM6
Marine group A
OS-K
OP3
OP10WS1
OP5
OP9
Dictyglomus
Coprothermobacter
Thermotogales
Thermodesu
lfobacte
rium
Aquificales
Hugenholtz et al. 1997
Ca. 1/3 der Bakterienphyla
bestehen aus bisher nicht
kultivierten Bakterien!!!
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Kultivierung Anreicherung
Ilsolierung
Identifizierung
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Warum möchte man überhaupt Bakterien aus der Umwelt kultivieren?
• Biotechnologisch bzw. pharmazeutisch nutzbares Potenzial
(Produktion von Antibiotika oder Abbau von Kohlenwasserstoffen)
• In aquatischen Systemen werden 90% aller Stoffumsetzungen
durch Mikroorganismen bewirkt
• Bakterien dominieren die Biosphäre und und katalysieren
essenzielle Teile von biogeochemischen Kreisläufen
⇒ Beschreibung physiologischer Eigenschaften enorm wichtig für
das Verständnis von globalen ökologischen Prozessen
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Kultivierungstechniken
•• Koch‘sches Plattengussverfahren
• Ausstrichverfahren (mit Drigalski-Spatel)
• Membranfiltration
• Dreizehn-Strich-Methode
Festmedien
(Zugabe von Agar)
• Anreicherung (als „Batch“-Kultur)
•• Kontinuierliche Kultur
• MPN (Most Probable Number)-Methode
oder „dilution to extinction“
Flüssigmedien
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Cypionka, 2003
Dreizehn-Strich-Methode
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• Zusammensetzung des Mediums
• Temperatur
• pH-Wert
• O2 -Konzentration
• Salzkonzentration
• Licht
Was muss man bei der Kultivierungvon Bakterien beachten?
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„Dilution to extinction“ ⇒ Kultivierung abundanter aber langsamer wachsender
Bakterien
K-Strategen ⇒ langsam wachsende Arten, angepasst an geringe
Substratkonzentrationen
r-Strategen ⇒ schnellwüchsige Arten, hohe Wachstumsraten nur bei hohen
Substratkonzentrationen
Mikroorganismen, die an niedrige Substratkonzentrationen angepasst sind bezeichnet
man als oligotroph oder oligocarbophil.
Mikroorganismen, die hohe Substratkonzentration benötigen, bezeichnet man als
copiotroph.
Wen kann ich anreichern?
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Habitat Kultivierungseffizienz
Meerwasser 0.001 - 0.1 %
Mesotropher See 0.1 - 1 %
Belebtschlamm 1 - 15 %
Boden 0.3 %
Kultivierungseffizienz von Bakterien aus der Umwelt
Amann et al. 1995
Kultivierungseffizienz (%):
MPN-Zahl x 100
Gesamtzellzahlder Ursprungsprobe
(%) =
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Potenzielle Gründe für den geringen Kultivierungserfolg
Manche Bakterien gehen in einen sogenannten „viable but non
culturable“ –Zustand über, wenn sie unter Stress geraten (z.B.
Der Cholera-Erreger Vibrio cholerae geht durch osmotischen und Nährstoff-Stress in den
VBNC-Zustand über.... z.B. wenn die Zellen ins Meerwasser geraten sind
⇒ Überdauerung im Meerwasser, Kontaminationsquelle da Zellen
irgendwann wiederbelebt werden können und dann infektiös sind!
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Kultivierung unter verschiedenen Inkubationsbedingungen
25°C
15°C 4°C
21 % O2 20°C
21%
O2
3% O
2
0% O
2
Bruns et al. 2003
Mögilichkeit: Kultivierung in
Gradienten, da nur ein Bruchteil der
zu kultivierenden Bakterien
geeignete Bedingungen vorfindet!
Temperatur
Sauerstoff
Sub
stra
t
Kultivierungsmaschine?
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Molekularbiologie
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V2
V1
V3
V5
V6V7
V8
V9
5’
3’
Yve
s V
ande
Pee
r(1
996)
, mod
ifiz
iert
hoch variabel
absolut konserviert
E. coli, aber nicht in > 75% aller Bakterien
Die prokaryontische 16S rRNA
In einzelnen Bereichen der rRNA
geht die „molekulare Uhr“
unterschiedlich schnell.
Mutationen in konservierten
Regionen sind entwicklungs-
geschichtlich früher entstanden, als
Änderungen in variablen Regionen.
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Kary B. Mullis, 1983
Prinzip der Polymerase Chain Reaction
Denaturierung- Schmelzen der DNA
Annealing- Primeranlagerung
Elongation- Kettenverlängerung
DNA-Doppelstrang 5´
5´
3´
3´
5´
5´
3´
3´
5´
5´
3´
3´
5´
5´
3´
3´
5´
5´
3´
3´
5´ 3´
5´3´
94 °C
50-65 °C
72 °C
n ×
- eine „ molekularbiologische Pinzette“
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Vereinzelung von Sequenzen aus der Umweltdurch Klonierung
Ligation von PCR-Produkten an überhängende Ts
Klonierung von PCR-Produkten in eine „multiple cloning site“
Selektion von Plasmid tragenden Zellen durch Antibiotika-Resistenz
Blue/white-Screening von Zellen mit Insert tragenden Plasmiden
Reamplifikation der Inserts durch flankierende Primer
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Analyse einer Klonbank
Amplifikation der 16S rDNA
TA-cloning
blue-white screening
A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12
B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12
C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12
D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12
E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E11 E12
F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11 F12
G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9 G10 G11 G12
H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H10 H11 H12
Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaft
Sequenz Analyseeinzelner Klone
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Doppelstrang
Einzelstränge
Teilweise geschmolzen
PCR-Produkt
Den
atur
iere
nder
Gra
dien
t
Ele
ktro
ph
ore
se
+
-
DGGE (engl.: Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)Trennung in denaturierenden Gelen
anhand des Schmelzverhaltens der PCR-Produkte, chemischer Gradient
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Den
atur
iere
nder
Gra
dien
t
Schematischer Verlauf einer DGGE
BakterienReinkulturen
BakterienGemeinschaften
Ele
ktro
phor
ese
+
-
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Clusteranalyse
Bildanalyse
Digitalisierung
Umwelt-Probe
Extraktion
PCR
16S rDNA der Bakteriengemeinschaft
NukleinsäurenDNA
DGGE
Fingerprints der Bakterien-
gemeinschaft
Sequenzierung
16S rDNA/rRNASequenzen
PhylogenetischeZuordnung
„Fingerprinting“ von Bakteriengemeinschaften
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Beispiele zur Untersuchung von Bakteriengemeinschaften der tiefen Biosphäre
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The deep biosphere and the subseafloor ocean New evidence suggests that vast microbial populations may live within a broad range of temperatures and pressures, where sediment and rock appear to provide life-sustaining resources. Microbes that characterize these extreme environments are now broadly considered a potential source of new bio-materials and are the basis of ideas for new biotechnical applications, such as water treatment and microbially enhanced oil recovery...
IODP will probe this environment globally, providing the first comprehensive characterization of this ocean below the seafloor.
The international ocean drilling program (IODP) will focus on three broad scientific themes:
Environmental change, processes and effects
Solid earth cycles and geodynamics
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Meteor Ausfahrt 51/3 (11.11.2001 – 10.12.2001)
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Beprobung von tieferen Sedimentschichten mit dem Schwerelot
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Top Bottom
Schwerelot-Kern mit Sapropelen S1, S3, S4 und S5 (85 cm)
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0 1 2 3 4 5 6 7
Depth
(cm
)
0
100200
300
400
Total cell count (107 cm3)0 1 2
S1
S3
S4
S5
Station 567-1
/ /
/ / /
/
ATP-Konzentrationen (ll) und Zellzahlen (¡¡) an der Sedimentoberfläche, in Sapropelen und Corg-armen Zwischenschichten
Erste Ergebnisse zur Abundanz und Aktivität
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Kultivierungseffizienz
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International Continental Scientific Drilling Program
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Mallik 2002 Gas Hydrate Research Well Program
The project focused on geophysical and geological studies, and extended production testing. On this website you can get information about the drillhole advance and the works of scientists from various fields. So have a look at the scientific data and the drilling region, north of Canada, beyond the Artic Circle.
This is the homepage of the Mallik 2002 Drilling Program, an international research project on Gas Hydrate Production in the Northwest Territories of Canada.