Kultivierung von Mikroorganismen - dlwt.boku.ac.at · Das Mikroskop Bast, 2001 Strahlengang eines Lichtmikroskops Brock, 2001 Aufbau des Mikroskops Optischer Teil Mechanischer Teil

8. ARBEITEN IM8. ARBEITEN IMMIKROBIOLOGISCHENMIKROBIOLOGISCHENLABOR LABOR -- TEIL 1TEIL 1

Kultivierung von MikroorganismenKultivierung von Mikroorganismen

Nährmedium - Nährsubstrat

Einteilungsmöglichkeiten:

- nach ihrer Zusammensetzung- nach ihren physikalischen Eigenschaften- nach ihrem Verwendungszweck


Nährmedium - Nährsubstrat

SynthetischeSynthetischeNNäährmedienhrmedien

KomplexeKomplexeNNäährmedienhrmedien

DefDef. chem. Zusammensetzung. chem. Zusammensetzung Mehr oder weniger exaktMehr oder weniger exaktdefinierte Bestandteiledefinierte Bestandteile

HefeextraktHefeextraktTomatenpresssaftTomatenpresssaft

PeptonPepton, ...., ....

ZusammensetzungZusammensetzung

Komplexe NKomplexe Näährbodenbestandteilehrbodenbestandteile

PeptonPepton

FleischextraktFleischextrakt

CaseinhydrolysatCaseinhydrolysat

MalzextraktMalzextrakt

HefeextraktHefeextrakt

EiweiEiweißßspaltprodukte, spaltprodukte, hergesthergest. durch . durch enyzmatischeenyzmatischeVerdauung tierischer u. pflanzlicher ProteineVerdauung tierischer u. pflanzlicher Proteine

WWäässriger Extrakt von ssriger Extrakt von enzymatischenzymatisch vorverdautemvorverdautemFleischFleisch

Salzsaures Salzsaures HydrolysatHydrolysat aus Milcheiweiaus Milcheiweißß ohne niederohne nieder--molekulare Spaltprodukte, liefert freie Aminosmolekulare Spaltprodukte, liefert freie Aminosääurenuren

WWäässriger Extrakt von Malz, spezieller Bestandteil ssriger Extrakt von Malz, spezieller Bestandteil von Pilzvon Pilz--NNäährmedienhrmedien

WWäässriger Extrakt aus ssriger Extrakt aus autolysierteautolysierte Hefe, liefert vielHefe, liefert vielC und NC und N

Lieferanten fLieferanten füür C, N, Aminosr C, N, Aminosääuren, Vitamine,uren, Vitamine,Mineralstoffe, SpurenelementeMineralstoffe, Spurenelemente

Nährmedium - NährsubstratPhysikalPhysikal. Eigenschaften. Eigenschaften


FESTFEST FLFLÜÜSSIGSSIGWEICHWEICHVerfestigungsmittelVerfestigungsmittel

AgarAgar--AgarAgar

1,5 1,5 -- 2 % 0,2 2 % 0,2 -- 0,8%0,8%

GelatineGelatine10 10 -- 15 %15 %

(CMC, 1,5 %)(CMC, 1,5 %)

AgarAgar--AgarAgar

-- Verfestigungsmittel aus Verfestigungsmittel aus marinenmarinen RotalgenRotalgen-- hoher hoher PolysaccharidanteilPolysaccharidanteil (ca. 70%)(ca. 70%)-- AgaroseAgarose und und AgaropektinAgaropektin-- bedeutende Schmelzbedeutende Schmelz-- und Erstarrungsund Erstarrungs--eigenschafteneigenschaften::

Schmelzbereich: 80 Schmelzbereich: 80 -- 90 90 °°CCErstarrungsbereich: 32 Erstarrungsbereich: 32 -- 38 38 °°CC

Nährmedium - NährsubstratVerwendungszweckVerwendungszweck


Universal/KollektivmediumUniversal/Kollektivmedium

SelektivmediumSelektivmedium

ElektivnElektivnäährmediumhrmedium

DifferentialmediumDifferentialmedium

AnreicherungsmediumAnreicherungsmedium

MangelmediumMangelmediumTransportmedium etc.Transportmedium etc.

NNäährmedienbereitunghrmedienbereitung

NNäährbodenkonzentrat (oder Komponenten) hrbodenkonzentrat (oder Komponenten) einweinwäägengen

AufschlAufschläämmung in (mmung in (destdest.) Wasser.) Wasser

Ggf. Zugabe von VerfestigungsmittelGgf. Zugabe von Verfestigungsmittel

NNäährsubstrat auflhrsubstrat auflöösen (Dampf, heizbarer sen (Dampf, heizbarer MagnetrMagnetrüührerhrer))

pHpH--Kontrolle/Kontrolle/--korrekturkorrektur

SterilisationSterilisation

SterilisationSterilisation

-- DekontaminationsmaDekontaminationsmaßßnahmenahme-- AbtAbtööten und Entfernen aller Lebewesenten und Entfernen aller Lebeweseneinschlieeinschließßlich ihrer Ruhestadienlich ihrer Ruhestadien................................vollst........vollstäändige Entkeimung (?)ndige Entkeimung (?)

-- verschiedene Mverschiedene Mööglichkeiten:glichkeiten:

HitzesterilisationHitzesterilisationFiltrationFiltrationBestrahlungBestrahlungBegasungBegasungAnwendung von ChemikalienAnwendung von Chemikalien

Feuchte HitzeFeuchte HitzeTyndallisationTyndallisationTrockene HitzeTrockene Hitze

UVUVIonisierende StrahlenIonisierende Strahlen

HitzesterilisationHitzesterilisation

-- DenaturierungseffektDenaturierungseffekt-- AbgetAbgetöötete Keime verbleiben im Sterilisierguttete Keime verbleiben im Sterilisiergut-- AutoklavierungAutoklavierung ((ÜÜberdruck)berdruck)

-- Diskontinuierliche/fraktionierte SterilisationDiskontinuierliche/fraktionierte Sterilisation((TyndallisationTyndallisation))

121 121 °°C / 20 min.C / 20 min.

100 100 °°C / 30 min.C / 30 min.30 30 °°C / 12 C / 12 -- 24 h24 h100 100 °°C / 30 min.C / 30 min.

Aufbau eines Aufbau eines AutoklavenAutoklaven

Autoklav um 1950Autoklav um 1950

DiverseDiverseAutoklavenAutoklaven--modellemodelle

TischautoklavTischautoklav

Zyklus einer Zyklus einer AutoklavierungsprozedurAutoklavierungsprozedur

Brock, 2001Brock, 2001

Temperatur und Dampfdruck Temperatur und Dampfdruck von gesvon gesäättigtem Wasserdampfttigtem Wasserdampf

100100105,3105,3109,7109,7115,2115,2120,6120,6133,9133,9

101101122122142142170170203203304304

1,011,011,221,221,421,421,701,702,032,033,043,04

1,001,001,201,201,401,401,681,682,002,003,003,00

TempTemp..°°CC

kPa.kPa. barbar atmatm

Sterilisierdauer richtet sich nach demSterilisierdauer richtet sich nach demSterilisiervolumen !Sterilisiervolumen !

bis 50 mlbis 50 ml20 20 -- 200 ml200 ml200 200 -- 1000 ml1000 ml1 1 -- 2 l2 l10 l10 l20 l20 l

EinzelvolumenEinzelvolumen

15 15 20202525353560 60 -- 9090120 120 -- 180180

Sterilisierzeit Sterilisierzeit bei 121 bei 121 °°CC

WWäärmermeüübergang !bergang !

Empfehlungen zur DurchfEmpfehlungen zur Durchfüührung hrung einer einer LaborLabor--AutoklavierungAutoklavierung

-- nur hitzesterilisierbares Gut sterilisierennur hitzesterilisierbares Gut sterilisieren-- GefGefäßäße nicht voll befe nicht voll befüüllen ( 1/2llen ( 1/2--voll)voll)-- DampfunduchlDampfunduchläässigessige VerschlVerschlüüsse nur losesse nur loseaufsetzenaufsetzen

-- Wattestopfen mit Pergament oder AlufolieWattestopfen mit Pergament oder Alufolieabdeckenabdecken

-- Beschriftung mit Beschriftung mit autoklavenfestemautoklavenfestem FilzstiftFilzstift-- Sterilisiergut mSterilisiergut mööglichst senkrecht platzierenglichst senkrecht platzieren-- separate Gefseparate Gefäßäße fe füür Vernichtungssterilisationr Vernichtungssterilisation

verwendenverwenden-- nach Autoklavieren langsamer Duckabfallnach Autoklavieren langsamer Duckabfall

Kontrolle der DampfsterilisationKontrolle der Dampfsterilisation

IndikatorenIndikatoren

ChemischeChemische BiologischeBiologische((„„BioindikatorenBioindikatoren““))-- Farbstreifen mit FeldernFarbstreifen mit Feldern

-- FarbumschlagsanzeigeFarbumschlagsanzeige-- einfach zu handhabeneinfach zu handhaben-- auf Sterilisiergut aufkleben auf Sterilisiergut aufkleben

-- aufwaufwäändiger als chem. Indikatorenndiger als chem. Indikatoren-- zuverlzuverläässiger als ssiger als -- ““ ---- meist Sporenprmeist Sporenprääparateparate((GeobacillusGeobacillus stearothermophilusstearothermophilus,,definierter definierter ATCCATCC--StammStamm))

-- Sporenstreifen oder TestampullenSporenstreifen oder Testampullen-- an an „„kkäältester Stelleltester Stelle““ platziertplatziert-- anschl. Bebranschl. Bebrüütungsphasetungsphase(...keine Tr(...keine Trüübung)bung)

Im EuropIm Europääischen Arzneibuch spezifizierteischen Arzneibuch spezifizierteBioindikatorBioindikator--MikroorganismenMikroorganismen

StaphStaph. . aureusaureus ATCC 6538ATCC 6538BacillusBacillus subtilissubtilis ATCC 6633ATCC 6633PseudomonasPseudomonas aeruginosaaeruginosa ATCC 9027ATCC 9027ClostridiumClostridium sporogenessporogenes ATCC 19404ATCC 19404CandidaCandida albicansalbicans ATCC 10231ATCC 10231AspergillusAspergillus nigerniger ATCC 16404ATCC 16404

Sterilisationseffekt Sterilisationseffekt AbtAbtöötung durch trockene Heitung durch trockene Heißßluft:luft:Erhitzungsdauer in min. bei 120 Erhitzungsdauer in min. bei 120 °°CC

SalmonellaSalmonella typhityphi 2020E. E. colicoli 3030StaphylococcusStaphylococcus aureusaureus 3030

EndosporenEndosporen vonvon::ClostridiumClostridium botulinumbotulinum 120120BacillusBacillus anthracisanthracis 120120

mod. n. mod. n. WallhWallhääusserusser, 1995, 1995

Kinetik der HitzeinaktivierungKinetik der Hitzeinaktivierung


DD--WertWertDezimale ReduktionszeitDezimale Reduktionszeit

Zeit in Minuten, die bei vorgegebener Temperatur Zeit in Minuten, die bei vorgegebener Temperatur notwendig ist, um die Keimzahl um 90 % (= auf einnotwendig ist, um die Keimzahl um 90 % (= auf ein

Zehntel) zu reduzierenZehntel) zu reduzieren

EinflussgrEinflussgrößößen auf den Den auf den D--WertWert::-- „„NaturNatur““/Empfindlichkeit des Mikroorganismus/Empfindlichkeit des Mikroorganismus-- Bestimmung des DBestimmung des D--Werts aufwWerts aufwäändigndig(mehrere KZ(mehrere KZ--BestimmungsansBestimmungsansäätze)tze)

-- ........Abt........Abtöötungskurve nicht immer eine Geradetungskurve nicht immer eine Gerade

22

44

66

88

1010

--22 ZeitZeit

log KZlog KZ

DD--WertWert

1 Z / 100 ml1 Z / 100 ml

HitzeinaktivierungskinetikHitzeinaktivierungskinetik

Thermische AbtThermische Abtöötungszeittungszeit

Jene Jene ZeitdauerZeitdauer, die erforderlich ist, um bei, die erforderlich ist, um beivorgegebener Temperatur vorgegebener Temperatur alle (?) alle (?) Zellen abzutZellen abzutöötenten

-- wesentliche Einflussgrwesentliche Einflussgrößöße: Dichte/Keimzahl der e: Dichte/Keimzahl der betrachteten Keimsuspension bzw. Probe betrachteten Keimsuspension bzw. Probe

VorgangsweiseVorgangsweise::Proben (Proben (defdef. Zellsuspensionen) f. Zellsuspensionen) füür unterschiedlicher unterschiedlicheZeitspannen erhitzen, dann Zeitspannen erhitzen, dann inkubiereninkubieren und auf und auf Wachstum kontrollierenWachstum kontrollieren

Sterilisation von NSterilisation von Näährmedienhrmedien

HitzesterilisationHitzesterilisation

SterilfiltrationSterilfiltration

AutoklavierenAutoklavieren

tyndallisierentyndallisieren

schonend schonend „„aufkochenaufkochen““

1x Filter1x Filter1x1x--FilteraufsFilteraufsäätzetzeMembranfiltrationMembranfiltration

Andere thermische EntkeimungsverfahrenAndere thermische Entkeimungsverfahren

-- PasteurisierungPasteurisierung

-- UHTUHT--ErhitzungErhitzung

-- nur Teilentkeimungnur Teilentkeimung-- Pathogene abgetPathogene abgetöötettet-- Verderbskeime reduziertVerderbskeime reduziert-- vorwiegend bei Lebensmittelnvorwiegend bei Lebensmitteln-- HaltbarkeitsverlHaltbarkeitsverläängerungngerung-- Verderb verzVerderb verzöögertgert

-- Erhitzung auf 130 bis 150 Erhitzung auf 130 bis 150 °°CCffüür wenige Sekundenr wenige Sekunden

-- SterilisationseffektSterilisationseffekt-- vorwiegend bei Lebensmittelnvorwiegend bei Lebensmitteln(z.B. (z.B. HH--Milch....Milch....““UHTUHT““))

MembranfiltrationsMembranfiltrations--SterilisationSterilisation

-- „„mechanische Sterilisationmechanische Sterilisation““-- Mikrofilter mit definierter PorenweiteMikrofilter mit definierter Porenweite

0,22 0,22 µµmm0,45 0,45 µµmm

-- Celluloseacetat, CellulosenitratCelluloseacetat, Cellulosenitrat-- ggf. Vorfilter vor eigentlicher Sterilfiltrationggf. Vorfilter vor eigentlicher Sterilfiltration

Struktur einesStruktur einesCelluloseacetatCelluloseacetat--FiltersFilters

1x1x--FilterFilterMembranfiltrationsvorrichtungMembranfiltrationsvorrichtung


Schema FiltrationsaufsatzSchema Filtrationsaufsatz


Vorrichtung zur Membranfiltration unter DruckVorrichtung zur Membranfiltration unter Druck

Bast, 2001Bast, 2001

Filtrieranordnung des Filtrieranordnung des MicrofilMicrofil--SytemsSytems

MilliflexMilliflex--SystemSystem ((MilliporeMillipore))

Anwendung von Miniaturfiltern Anwendung von Miniaturfiltern ffüür Entkeimungszwecker Entkeimungszwecke

Block, 1991Block, 1991

Spezialisiertes Filtrationssystem Spezialisiertes Filtrationssystem ffüür kritische Anwendungenr kritische Anwendungen


Beispiele fBeispiele füür die Anwendung der r die Anwendung der MikrofiltrationsMikrofiltrations--SterilisationSterilisation

-- AntibioticaAntibiotica-- VakzineVakzine-- IntravenIntravenööse Lse Löösungensungen-- AllergenextrakteAllergenextrakte-- SteroideSteroide-- OphthalmologOphthalmolog. Produkte. Produkte-- OrgankonservierungslOrgankonservierungslöösungensungen

Anwendung von trockener HitzeAnwendung von trockener Hitze

-- Hitzesterilisation von (trockenen) GlasgerHitzesterilisation von (trockenen) Glasgeräätenten(Pipetten, Kolben, R(Pipetten, Kolben, Rööhrchen, Petrihrchen, Petri--schalen etc.)schalen etc.)

-- HeiHeißßluftsterilisatorluftsterilisator, gute Luftzirkulation, gute Luftzirkulation-- Sterilisiergut nicht zu dicht packenSterilisiergut nicht zu dicht packen-- Check mittels IndikatorbCheck mittels Indikatorbäändern oderndern oderBioindikatorenBioindikatoren

-- Vorsicht bei GummiVorsicht bei Gummi-- u. Kunststoffstopfenu. Kunststoffstopfen-- nur trockenes Gut sterilisierennur trockenes Gut sterilisieren

Kenndaten der HeiKenndaten der Heißßluftsterilisationluftsterilisation

160 160 °°CC

170 170 °°CC

180 180 °°CC

180 min.180 min.

120 min.120 min.

30 min30 min

TempTemp. Zeit. Zeit

HeiHeißßluftsterilisatorenluftsterilisatoren

AusglAusglüühen von hen von ImpfImpföösensen und und --nadelnnadeln


BunsenbrennerBunsenbrenner

Sterilisation durch BestrahlungSterilisation durch Bestrahlung

-- UVUV--StrahlungStrahlung

-- Ionisierende StrahlungIonisierende Strahlung

-- NucleinsNucleinsääureure--SchSchäädigungdigung-- Raumluft , OberflRaumluft , Oberfläächen, Trinkwasserchen, Trinkwasser-- geringe Eindringtiefegeringe Eindringtiefe-- UVUV--CC--Bereich am wirksamstenBereich am wirksamsten(200 (200 -- 280 nm)280 nm)

-- QuecksilberQuecksilber--NiederdruckstrahlerNiederdruckstrahler(253,7 nm)(253,7 nm)

-- Ozon !Ozon !-- in unbenutzten Rin unbenutzten Rääumenumen

-- Sterilisation von Einwegmaterialien, Sterilisation von Einwegmaterialien, Gewebsersatz u. Gewebsersatz u. AntibioticaAntibiotica

-- GammaGamma--StrahlenStrahlen-- produzieren Elektronen, Radikaleproduzieren Elektronen, Radikale-- SchSchäädigung der DNAdigung der DNA-- Bestrahlungsdosis in Bestrahlungsdosis in Gray (Gy)Gray (Gy)

Chemische SterilisationChemische Sterilisation

-- EthylenoxidbegasungEthylenoxidbegasung

-- FormalinbehandlungFormalinbehandlung

-- PeressigsPeressigsääureure

--Ethanol Ethanol

--((ßß--PropiolactonPropiolacton))

Achtung explosiv !Achtung explosiv !

Hohe ToxizitHohe Toxizitäät, sterile t, sterile NachbelNachbelüüftungftung

Raumluftdesinfektion,Raumluftdesinfektion,kanzerogen, kanzerogen, Anw.KonzAnw.Konz. 1. 1-- 3.5%3.5%

Nicht mehr gebrNicht mehr gebrääuchlich,uchlich,kanzerogenkanzerogen

ArbeitsflArbeitsfläächendesinfektion,chendesinfektion,70%iger ,verg70%iger ,vergäällter Alkohol,llter Alkohol,60%iger 60%iger IsopropanolIsopropanol

Schematische Darstellung einer Schematische Darstellung einer EthylenoxidEthylenoxid--SterilisationsSterilisations--AnlageAnlage


LaborsicherheitLaborsicherheit

Eingeschleppte KeimeEingeschleppte Keime(Mensch, Luft, unsterile(Mensch, Luft, unsterile

GerGerääte)te)

RaumluftRaumluft(ca. 500 (ca. 500 -- 2000 K/m )2000 K/m )33

Wichtige Regeln fWichtige Regeln füür das mikrobiologische Arbeitenr das mikrobiologische Arbeiten

-- Alle GegenstAlle Gegenstäände sind so zu behandeln, als ob siende sind so zu behandeln, als ob siepathogenes Material (Mikroorganismen pathogenes Material (Mikroorganismen u.ou.o. deren. derenStoffwechselprodukte) enthielten Stoffwechselprodukte) enthielten

-- Tragen von SchutzkleidungTragen von Schutzkleidung-- SchmuckverbotSchmuckverbot-- Essen, Trinken, Rauchen im Labor Essen, Trinken, Rauchen im Labor vebotenveboten-- Beschriften von BehBeschriften von Behäältnissenltnissen-- Kontaminierte GegenstKontaminierte Gegenstäände dekontaminierennde dekontaminieren-- Achtung auf Luftkontamination / AerosolbildungAchtung auf Luftkontamination / Aerosolbildung

Historische Darstellung Historische Darstellung eines Pestweines Pestwäächterschtersum 1720um 1720

PersonenPersonen-- und Produktschutz im Laborund Produktschutz im Labor

Umgang mit MikroorganismenUmgang mit Mikroorganismen

-- Schutz von Personal und UmweltSchutz von Personal und Umwelt

-- Genehmigung der BehGenehmigung der Behöörde frde füür Arbeiten mitr Arbeiten mithumanhuman-- u. u. tierpathogenentierpathogenen ErregernErregern

-- Einstufung der Einstufung der „„biologbiolog. Arbeitsstoffe. Arbeitsstoffe““in Risikoklassen (1 in Risikoklassen (1 -- 4)4)

Gruppierung nach RisikoklassenGruppierung nach Risikoklassen

Gruppe 1Gruppe 1: kein oder sehr geringes Risiko f: kein oder sehr geringes Risiko füürrMensch und Wirbeltiere, als KrankheitsMensch und Wirbeltiere, als Krankheits--erregererreger ffüür Gesunde ohne Bedeutungr Gesunde ohne Bedeutung

Gruppe 2Gruppe 2: Geringes bis m: Geringes bis mäßäßiges Risiko figes Risiko füür Mensch r Mensch und Wirbeltiere, potenzielle Krankheitserregerund Wirbeltiere, potenzielle Krankheitserregerbeim Menschen, wirksame Vorbeugung und beim Menschen, wirksame Vorbeugung und Behandlung normalerweise mBehandlung normalerweise mööglichglich

Gruppe 3Gruppe 3: M: Mäßäßiges bis hohes Risiko figes bis hohes Risiko füür Mensch undr Mensch undWirbeltiere, Erreger schwerer Erkrankungen,Wirbeltiere, Erreger schwerer Erkrankungen,wirksame Vorbeugung oder Behandlung wirksame Vorbeugung oder Behandlung normalerweise mnormalerweise mööglichglich

Gruppe 4Gruppe 4: Hohes Risiko f: Hohes Risiko füür Mensch und Wirbeltierer Mensch und Wirbeltiere(best. Viren)(best. Viren)

Beispiele fBeispiele füür die einzelnen Risikoklassenr die einzelnen Risikoklassen

Gruppe 1:Gruppe 1:

Gruppe 2:Gruppe 2:

Gruppe 3:Gruppe 3:

Gruppe 4:Gruppe 4:

AcetobacterAcetobacter, die meisten , die meisten LactobacillenLactobacillen,,die meisten die meisten E.coliE.coli, , SaccharomycesSaccharomyces

Pathogene Pathogene E.coliE.coli, , ShigellaShigella dysenteriaedysenteriae,,ClostridiumClostridium tetanitetani, , KlebsiellaKlebsiella pneumoniaepneumoniae

ChlamydiaChlamydia psittacipsittaci, , SalmonellaSalmonella typhityphi,,YersiniaYersinia pestispestis, , FrancisellaFrancisella tularensistularensis

nur bestimmte Viren (nur bestimmte Viren (EbolaEbola,....),....)

RRääumliche Voraussetzungenumliche Voraussetzungen

-- Lage des Labors (....nicht ErdgeschoLage des Labors (....nicht Erdgeschoßß))-- VorrVorrääume ume -- ArbeitsflArbeitsfläächen und Fuchen und Fußßbböödenden-- wenig Mobiliarwenig Mobiliar-- Fenster und TFenster und Tüüren geschlossenren geschlossen-- DesinfektionsmDesinfektionsmööglichkeit fglichkeit füür Raumluftr Raumluft-- RegelmRegelmäßäßige Kontrolle auf Ungezieferige Kontrolle auf Ungeziefer-- Keine Verwechslungen von GerKeine Verwechslungen von Geräätschaftentschaften-- Vermeidung von Verletzungen (Nadeln etc.)Vermeidung von Verletzungen (Nadeln etc.)

Allgemein:Allgemein:

Arbeiten unter Arbeiten unter Schutzstufe 2Schutzstufe 2

-- Arbeitsraum mit Arbeitsraum mit LabelLabel kennzeichnenkennzeichnen-- ttäägliche Desinfektion der Flgliche Desinfektion der Fläächenchen-- Schutzkleidung nie auSchutzkleidung nie außßerhalb tragenerhalb tragen-- Verwendung von starken LatexhandschuhenVerwendung von starken Latexhandschuhen-- Arbeiten in SicherheitswerkbArbeiten in Sicherheitswerkbäänkennken-- Bunsenbrenner mit SpritzschutzglockeBunsenbrenner mit Spritzschutzglocke-- Verwenden von EinwegartikelnVerwenden von Einwegartikeln-- Kontaminierte GerKontaminierte Gerääte in Desinfektionsbad einlegente in Desinfektionsbad einlegen-- Sofern Kontamination eintritt, Bereich sperren u. desinfizierenSofern Kontamination eintritt, Bereich sperren u. desinfizieren-- Abfallsammlung und Abfallsammlung und --entsorgung (Dekontamination)entsorgung (Dekontamination)

Arbeiten mit einer ReinraumwerkbankArbeiten mit einer Reinraumwerkbank

-- DurchfDurchfüührung aller aseptischen Arbeitsschrittehrung aller aseptischen Arbeitsschritte-- Schutz der Schutz der UmgebungUmgebung, Schutz des , Schutz des ExperimentatorExperimentatorss-- UVUV--Bestrahlung im Inneren der WerkbankBestrahlung im Inneren der Werkbank-- Umluftsystem mit Umluftsystem mit HOSCHHOSCH--FilternFiltern (engl.: HEPA (engl.: HEPA filtersfilters))

-- 3 Arten von Werkb3 Arten von Werkbäänkennken::1. Schutz des Arbeitenden und der Umgebung (Kl. 1)1. Schutz des Arbeitenden und der Umgebung (Kl. 1)

2. Schutz der Arbeitsobjekte und 2. Schutz der Arbeitsobjekte und --prozesseprozesse

3. Schutz des Arbeitenden und der Prozesse (Kl. 2 u. 3)3. Schutz des Arbeitenden und der Prozesse (Kl. 2 u. 3)

„„LaminarLaminar FlowFlow““

High High EfficiencyEfficiency ParticulateParticulate Air FilterAir Filtermit definierten mit definierten AbscheidegradenAbscheidegraden

Schematische Darstellung einer ReinraumwerkbankSchematische Darstellung einer ReinraumwerkbankBast, 2001Bast, 2001

SterilwerkbSterilwerkbäänkenke

GerGerääte und Utensilien te und Utensilien ffüür das mikrobiologische Arbeitenr das mikrobiologische Arbeiten


LaborausstattungLaborausstattung

-- BunsenbrennerBunsenbrenner-- WasserbWasserbääderder-- InkubationsschrInkubationsschräänkenke-- ThermometerThermometer-- AutoklavAutoklav-- HeiHeißßluftsterilisatorluftsterilisator-- DampfschrankDampfschrank-- MarkierungsstiftMarkierungsstift-- SchSchüüttelinkubatorttelinkubator-- AnaerobiertopfAnaerobiertopf-- Div. EinmalgerDiv. Einmalgeräätete

aerobaerob

anaerobanaerob

LaborausstattungLaborausstattung

-- PetrischalenPetrischalen-- PipettenPipetten-- PipettierhilfePipettierhilfe-- RRööhrchen/Eprouvettenhrchen/Eprouvetten-- EprouvettenverschlEprouvettenverschlüüssesse-- ImpfImpföösensen-- ImpfnadelImpfnadel-- DrigalskispatelnDrigalskispateln-- Schere, StanleymesserSchere, Stanleymesser----

ImpfImpföösese n. Bast, 2001n. Bast, 2001

Das MikroskopDas Mikroskop


Strahlengang Strahlengang eineseines

LichtmikroskopsLichtmikroskops


Aufbau des MikroskopsAufbau des Mikroskops

Optischer TeilOptischer Teil

Mechanischer TeilMechanischer Teil

BeleuchtungBeleuchtung

OkulareOkulareObjektiveObjektiveKondensorKondensorIrisblendeIrisblende(Filter)(Filter)

ObjekttischObjekttischTubusTubusGrobGrob--/Feintrieb/FeintriebStativStativ

LampeLampe(Spiegel)(Spiegel)BeleuchtungsstBeleuchtungsstäärkerke--reglerregler

Erstes serienreifesErstes serienreifesZeissZeiss--MikroskopMikroskop

QualitQualitäätskriterien ftskriterien füür Mikroskoper Mikroskope

VergrVergrößößerungsvermerungsvermöögengen

AuflAuflöösungsvermsungsvermöögengen

ZeichnungsvermZeichnungsvermöögengen

GesamtvergrGesamtvergrößößerung:erung:OkularvergrOkularvergrößößerung x Objektivvergrerung x Objektivvergrößößerungerung

Numerische Numerische AperturApertur

Korrektur von LinsenfehlernKorrektur von Linsenfehlern

Numerische Numerische AperturApertur

-- MaMaßß ffüür die Qualitr die Qualitäät eines Objektivst eines Objektivs-- je hje hööher desto besser/empfindlicherher desto besser/empfindlicher

A = n x A = n x sinsin uu

n....Brechungsexponentn....Brechungsexponentu....halberu....halber ÖÖffnungswinkel derffnungswinkel der

ObjektivfrontlinseObjektivfrontlinse

100 / 1,25100 / 1,25ÖÖLL

uu

Wo liegt die Grenze der AuflWo liegt die Grenze der Auflöösung ?sung ?

Bei welchem Minimalabstand zwischen zweiBei welchem Minimalabstand zwischen zweiObjekten kann ich diese beiden noch als Objekten kann ich diese beiden noch als

getrennt erkennen ?getrennt erkennen ?

AuflAuflöösungsformel nach Abbsungsformel nach Abbéé::

e = e = λλ / 2A/ 2A

.....Wellenl.....Wellenläänge der Lichtquellenge der Lichtquelle

.....Numerische .....Numerische AperturAperturλλAA

100 / 1,25100 / 1,25ÖÖLL Verwendung von Verwendung von ImmersionsImmersionsööll::

-- LichtbrechungLichtbrechung-- SchSchäärfere Abbildungrfere Abbildung-- n = 1.515n = 1.515

Trockene Objektive Trockene Objektive ÖÖlimmersionsobjektivelimmersionsobjektive

MikroskopartenMikroskoparten

LichtmikroskopLichtmikroskop

UVUV--MikroskopMikroskop

FluoreszenzmikroskopFluoreszenzmikroskop

NormalkondensorNormalkondensorDunkelfeldkondensorDunkelfeldkondensorPhasenkontrastkondensorPhasenkontrastkondensor

abhabhäängig von der gewngig von der gewäähltenhltenLichtquelleLichtquelle

UV: UV: kein direktes Betrachtenkein direktes Betrachtendes Bildes !des Bildes !

Fotografische EinrichtungenFotografische Einrichtungen

Normales HellfeldNormales Hellfeld--mikroskopmikroskop

PhasenkontrastPhasenkontrast--mikroskopmikroskop

DunkelfeldDunkelfeld--mikroskopmikroskop


SaccharomycesSaccharomyces cerevisiaecerevisiae

InterferenzphasenkontrastInterferenzphasenkontrast--MikroskopieMikroskopie

LactobacillusLactobacillus acidophilusacidophilusFluoreszenzmikroskopische AufnahmenFluoreszenzmikroskopische Aufnahmen

BacillusBacillus cereuscereus MicrococcusMicrococcus luteusluteusund und BacillusBacillus cereuscereus

BacLightBacLight Inc.Inc.

ElektronenmikroskopieElektronenmikroskopie

-- Sehr hohe AuflSehr hohe Auflöösung (bis ca. 0,1 nm)sung (bis ca. 0,1 nm)-- Untersuchung von ZellstrukturenUntersuchung von Zellstrukturenund Molekund Moleküülenlen

-- Elektronen anstelle von LichtstrahlenElektronen anstelle von Lichtstrahlen-- Magnete anstelle von LinsenMagnete anstelle von Linsen-- Arbeitet unter VakuumArbeitet unter Vakuum-- Spezielle Techniken zur VorbereitungSpezielle Techniken zur Vorbereitungder Proben (der Proben („„DDüünnschnittennschnitte““))

-- ErhErhööhung des Kontrasts durch speziellehung des Kontrasts durch spezielleFFäärbungen (rbungen (OsmiumtetroxidOsmiumtetroxid etc.)etc.)

Bauarten von ElektronenmikroskopenBauarten von Elektronenmikroskopen

TransmissionsTransmissions ––EMEM((TEMTEM))

RasterRaster-- EMEM((REMREM, auch , auch ScanningScanningElectronElectron MicrocopyMicrocopy))

Keine DKeine Düünnschnitte erforderlich,nnschnitte erforderlich,NegativfNegativfäärbung, wenigerrbung, wenigeraufwaufwäändigndig

PrPrääparat mit dparat mit düünnem Schwernnem Schwer--metallfilmmetallfilm (z.B. Gold) (z.B. Gold) üüberzogen,berzogen,Elektronenstrahl tastet OberflElektronenstrahl tastet Oberfläächecheab, reflektierte, gestreute Elektronen ab, reflektierte, gestreute Elektronen gesammelt, Bildgesammelt, Bild

System eines ElektronenmikroskopsSystem eines Elektronenmikroskops

ElektronenElektronen--mikroskopmikroskop

ElektronenmikroskopischeElektronenmikroskopischeAufnahme von FliegenkAufnahme von Fliegenkööpfenpfen

BakteriophagenBakteriophagen

Herstellung mikroskopischer PrHerstellung mikroskopischer Prääparateparate

LebendprLebendprääparateparate

FFäärbeprrbeprääparateparate

FeuchtkammerprFeuchtkammerprääparateparate

-- DeckglasprDeckglasprääparatparat-- HHäängender Tropfenngender Tropfen-- ZZäählkammerprhlkammerprääparatparat

-- Direkte FDirekte Fäärbungrbung-- Indirekte FIndirekte Fäärbungrbung-- GramfGramfäärbungrbung-- EndosporenfEndosporenfäärbungrbung-- KapselfKapselfäärbungrbung-- GeiGeißßelfelfäärbungrbung-- SSääurefestigkeitsfurefestigkeitsfäärbungrbung

-- Darstellung von Darstellung von SchimmelpilzenSchimmelpilzen

MikroskopierutensilienMikroskopierutensilien

-- MikroskopMikroskop-- ObjekttrObjektträägerger-- DeckglDeckglääserser-- PinzettenPinzetten-- ImpfImpfööse/se/--nadelnadel-- ImmersionsImmersionsööll-- WundbenzinWundbenzin-- WatteWatte-- FilterpaierFilterpaier-- bestbestäändiger Filzstiftndiger Filzstift-- VaselineVaseline-- BunsenbrennerBunsenbrenner

FFäärbelrbelöösungensungen::z.B.: z.B.: GramfGramfäärberbe--KitKit

MethylenblauMethylenblau--LLöösungsungetc.etc.

LebendprLebendprääparatparat

-- Orientierende SchnelltestOrientierende Schnelltest-- natnatüürliche Zellform, rliche Zellform, --verbverbäändende-- Beweglichkeit erkennbarBeweglichkeit erkennbar-- spezielle spezielle mikroskopmikroskop. Techniken anwendbar. Techniken anwendbar(z.B. Phasenkontrastmikroskopie)(z.B. Phasenkontrastmikroskopie)

Normales DeckglasprNormales Deckglasprääparat Hparat Häängender Tropfenngender Tropfen

HohlschliffobjekttrHohlschliffobjektträägerger

Vorbereitung: HVorbereitung: Häängender Tropfenngender Tropfen

BakteriensuspensionBakteriensuspensionauf Deckglauf Deckglääschenschen

100

Öl

Objektiv

Immersionsöl

DeckglasHÄNGENDER TROPFEN

Vaseline

Kreuztisch

Kondensor / Licht

Auge

Mikroskopieren des HMikroskopieren des Häängenden Tropfensngenden Tropfens

WK 2002WK 2002s.as.a. 3. Einheit. 3. Einheit

Skizze eines ZSkizze eines Zäählkammerprhlkammerprääparatsparats

MethylenblauMethylenblau--FFäärbeprrbeprääparatparat

-- Rasche und einfache DurchfRasche und einfache Durchfüührunghrung-- Erkennen morphologischer KriterienErkennen morphologischer Kriterien(Zellform, Zellverband)(Zellform, Zellverband)

--

---- ++

++++

++ ++ ++ ++

++

++

++

Ladung der Ladung der BakterienzelleBakterienzelleFarbstoffmolekFarbstoffmoleküülele

GramfGramfäärbungrbung

Gramfärbung

Bacillus subtilis

Pseudomonas fluorescens

Staphylococcus xylosus

Details Details s.as.a. 2. Einheit. 2. Einheit

EndosporenfEndosporenfäärbungrbung

-- Nachweis bakterieller SporenNachweis bakterieller Sporen-- Erkennen der Lage der Erkennen der Lage der EndosporeEndospore-- Beschaffenheit des Beschaffenheit des SporangiumsSporangiums-- verschiedene Rezepturenverschiedene Rezepturen

Bacillus licheniformis

EndosporenEndosporen

SSääurefestigkeitsfurefestigkeitsfäärbungrbung

-- CarbolfuchsinfCarbolfuchsinfäärbungrbung-- ZiehlZiehl--NeelsenNeelsen--FFäärbungrbung-- TBC/MycobakterienTBC/Mycobakterien--DiagnostikDiagnostik

M. M. tuberculosistuberculosis

FeuchtkammerprFeuchtkammerprääparatparat

-- Kultivierung von SchimmelpilzenKultivierung von Schimmelpilzenin feuchtem Milieuin feuchtem Milieu

PetrischalePetrischale

Befeuchtetes FilterpapierBefeuchtetes Filterpapier

ObjekttrObjektträägerger

ParaffinParaffin

Festes NFestes Näährmediumhrmedium

Wachsender SchimmelWachsender Schimmel

PenicilliumPenicillium sp.sp.

Kultivierung von Mikroorganismen - dlwt.boku.ac.at · Das Mikroskop Bast, 2001 Strahlengang eines Lichtmikroskops Brock, 2001 Aufbau des Mikroskops Optischer Teil Mechanischer Teil

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