Universidade Federal do Rio de Janeiro Programa de Pós-Graduação em Produtos Bioativos e Biociências Arielly Rodrigues Ribeiro Barreto ANÁLISE CROMATOGRÁFICA DA CHALCONA ANTILEISHMANIAL CH8 APÓS BIOTRANSFORMAÇÃO IN VITRO POR MICROSSOMAS HEPÁTICOS DE RATOS Macaé 2017
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Universidade Federal do Rio de Janeiro Programa de Pós ......durante o mestrado, por colocar pessoas maravilhosas em meus caminhos para me abençoar, por me dar força, saúde, capacidade
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Universidade Federal do Rio de Janeiro
Programa de Pós-Graduação em Produtos Bioativos e Biociências
Arielly Rodrigues Ribeiro Barreto
ANÁLISE CROMATOGRÁFICA DA CHALCONA ANTILEISHMANIAL CH8 APÓS BIOTRANSFORMAÇÃO IN VITRO POR MICROSSOMAS HEPÁTICOS DE RATOS
Macaé 2017
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Programa de Pós-Graduação em Produtos Bioativos e Biociências
Arielly Rodrigues Ribeiro Barreto
ANÁLISE CROMATOGRÁFICA DA CHALCONA ANTILEISHMANIAL CH8 APÓS BIOTRANSFORMAÇÃO IN VITRO POR MICROSSOMAS HEPÁTICOS DE RATOS
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de
Pós-graduação em Produtos Bioativos e Biociências da
Universidade Federal do Rio de Janeiro - Campus Macaé,
como parte dos requisitos necessários para a obtenção do
título de Mestre em Ciências.
Área de concentração: Produtos Bioativos e Biociências
8. ANEXO I .............................................................................................................. 76
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Leishmanioses: um problema de saúde pública mundial
As leishmanioses compõem um grupo de doenças tropicais negligenciadas
não contagiosas e que se encontram dentro do programa de prioridades da
Organização Mundial da Saúde (WHO, 2017). A transmissão dessa enfermidade
ocorre através da picada do mosquito fêmea do gênero Phlebotomus (Velho mundo)
e Lutzomyia (Novo mundo) infectado com protozoário do gênero Leishmania sp.
(ORYAN; AKBARI, 2016).
As manifestações clínicas das leishmanioses em humanos ocorrem após a
inoculação da forma promastigota (flagelar) do parasito Leishmania sp. (1). Uma vez
no tecido do hospedeiro, essa forma flagelar pode ser fagocitada por macrófagos ou
por outras células fagocíticas mononucleares (2). Após a internalização do parasito
na célula fagocítica do hospedeiro, o parasito diferencia-se na forma amastigota
(parasito intracelular) que se multiplica por divisão binária no interior da célula até
levar a lise celular (3). Após a lise da célula fagocítica, as formas amastigotas são
liberadas e prontas para infectar outras células do hospedeiro (4). Quando o
flebótomo (vetor) pica um indivíduo infectado ou hospedeiro reservatório, o mesmo
ingere macrófagos infectados com a forma amastigota ou amastigotas livres no
sangue deste indivíduo (5 e 6). Ao atingir o intestino do inseto, as amastigotas
transformam-se em promastigotas (7), que se multiplicam por divisão binária e
migram para o probóscide (prolongamento do aparelho bucal do inseto) (8). Por sua
vez, ao fazer outro repasto sanguíneo o flebótomo introduz na pele do hospedeiro a
forma promastigota (1). As oito etapas explicitadas acima estão esquematizadas na
Figura 1 (MISHRA; SAXENA; SINGH, 2007).
As mais de vinte espécies de Leishmania sp. conhecidas por infectar
humanos podem levar ao desenvolvimento de quatro tipos de leishmaniose como a
visceral ou “kala-azar” (LV) (Figura 2a), que é uma infecção visceral generalizada e
a forma mais severa da doença; a leishmaniose cutânea (LC) (Figura 2b), uma
infecção que acomete a pele causando lesões com ulcerações, sendo a forma mais
comum; a leishmaniose mucosa (LM) (Figura 2c) em que se observa ulcerações
oronasais e por fim, a leishmaniose cutânea difusa (LCD) (Figura 2d) considerada a
2
forma mais rara da doença, com lesões cutâneas não ulceradas (DESJEUX, 2004;
ZULFIQAR; SHELPER; AVERY, 2017).
Figura 1- Ciclo de vida do parasito de Leishmania sp. no vetor flebotomíneos e no homem. (Adaptado da fonte: https://www.cdc.gov/parasites/leishmaniasis/biology.html)
Figura 2- Manifestações clínicas das leishmanioses em humanos. (a) Leishmaniose visceral
Tabela 2- Alterações mais comuns na massa molecular da substância por meio das reações de fase I (Fonte adaptado: TOLONEN; TURPEINEN; PELKONEN, 2009). Biotransformação
Fase I
Mudança na fórmula molecular Mudança de massa
(Da)
Descarboxilação -CO2 -43,9898
Desidratação -H2O -18,0106
Desmetilação -CH2 -14,0157
Desidrogenação -H2 -2,0157
Hidroxilação +O +15,9949
N/S-oxidação +O +15,9949
Epoxidação +O +15,9949
Hidratação +H2O -18,0106
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1.6.3. Ressonância Magnética Nuclear (RMN)
A técnica consagrada para elucidação estrutural de moléculas orgânicas é a
espectroscopia de RMN. Pois, essa técnica oferece informações sobre número de
átomos magneticamente distintos do isótopo estudado em uma molécula. Quando o
RMN é acoplado a CLAE se torna uma ferramenta poderosa para a identificação
estrutural de metabólitos presentes em uma matriz biológica. Afinal, os metabólitos
podem ser separados ou isolados de outros metabólitos ou de interferentes
presentes na matriz biológica, e assim elucidados estruturalmente, porém necessita
de quantidades superiores de massa dos metabólitos quando comparada a EM
(SIDELMANN et al., 2001).
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2. JUSTIFICATIVA
A leishmaniose é considerada uma das doenças negligenciadas mais
importantes no Brasil. De acordo com a Organização Mundial da Saúde, no Brasil
existem mais de dois mil novos casos de pessoas acometidas por essa doença
anualmente (BRASIL, 2015). Os tratamentos farmacológicos disponíveis empregam
anfotericina B, isotionato de pentamidina, antimoniais pentavalentes, paromomicina
e miltefosina. Esses fármacos apresentam efeitos adversos, e na sua grande
maioria, empregam vias de administração parenteral, o que de maneira combinada
restringe a adesão dos pacientes ao tratamento. Apesar da miltefosina ser destinada
a administração oral, a mesma é restrita ao tratamento da leishmaniose visceral
(SUNADAR et al., 2002; BRASIL, 2005; DAVID; CRAFT, 2009).
Logo, fica evidente a necessidade da busca de um fármaco que apresente
reduzidos ou nenhum efeito colateral e que permita sua administração por via oral
para o tratamento da leishmaniose cutânea. Neste cenário, a chalcona CH8
desenvolvida pelo grupo de pesquisa da Profa. Bartira Rossi Bergmann, parceira
neste trabalho, apresenta atividade antileishmanial, a qual é 60 vezes superior ao
dos antimoniais (BOECK et al., 2006). Em etapa seguinte a comprovação da
atividade biológica é importante, durante a etapa pré-clínica, avaliar os parâmetros
farmacocinéticos, dentre os quais destaca-se o metabolismo. Visando à economia
de tempo e recursos financeiros (MONTANARI; BOLZANI, 2001).
Dessa forma, devido à ausência de método na literatura, é de grande
contribuição para o avanço dos ensaios pré-clínicos desenvolver um método
bioanalítico combinado a técnica de CLAE e a extração líquido-líquido (ELL) para
determinação da chalcona CH8 em fração microssomal. Assim como, identificar os
metabólitos formados, uma vez, que o conhecimento dos metabólitos permite a
avaliação de sua atividade biológica e toxidez.
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3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo geral
Estudar a biotransformação in vitro da chalcona CH8 utilizando microssomas
hepáticos de ratos.
3.2. Objetivos específicos
Desenvolver um método analítico por CLAE-DAD para determinação da
chalcona CH8 em meio de incubação microssomal;
Otimizar um método de extração da chalcona CH8 a partir do meio de
incubação microssomal;
Validar o método bioanalítico (separação e extração) para determinação da
chalcona CH8 em meio de incubação microssomal;
Identificar e caracterizar os possíveis metabólitos formados empregando a
CLAE acoplada a EM.
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4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Materiais
4.1.1. Solventes e reagentes
A água ultrapura utilizada para o preparo das fases móveis e soluções
reagentes foi obtida a partir do sistema purificador Elga Veolia, modelo Labwater
Purelab® Classic (Paris, França). A acetonitrila, ácido acético glacial, usados no
preparo das fases móveis, enquanto o éter metil terc-butílico e o acetato de etila,
usados na otimização da extração líquido-líquido foram adquiridos, todos, em grau
HPLC da Tedia® (Fairfield, OH, EUA). Os demais reagentes, fosfato de potássio
monobásico, ácido clorídrico, hidróxido de potássio, tris (hidroximetil) aminometano,
cloreto de potássio foram adquiridos da VETEC (Duque de Caxias, RJ, Brasil). O
tensoativo macrogol glicerol ricinoleato (Cremophor®) e os componentes do sistema
de regeneração de NADPH, enzima glicose-6-fosfato desidrogenase, fosfato de
dinucleotídeo de β-nicotinamida e adenina (NADP) e glicose-6-fosfato foram
comercialmente obtidos da empresa Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, EUA).
4.1.2. Equipamentos em geral
Para pesagem das substâncias foi empregada balança analítica, modelo
CP225D da marca Sartorius (Goettingen, Alemanha). Para incubação das amostras
foi empregado um banho metabólico do tipo Dubnoff, modelo NT232, da marca Nova
técnica (Piracicaba, SP, Brasil). Na etapa de preparação das amostras foram usados
um agitador de tubos tipo Vórtex e uma centrífuga de bancada modelo 80-2B ambos
da marca Edutec (São Paulo, SP, Brasil). Para a aferição do pH das soluções
tampão foi empregado um potenciômetro modelo PHS3BW, da marca BEL
Engineering (Monza, Itália).
4.1.3. Soluções de referência e reagentes
A chalcona CH8, 3-nitro-2’-hidroxi-4’,6’-dimetoxichalcona (Figura 5A), peso
molecular de 329,3 g/mol, foi sintetizada e gentilmente cedida pelo grupo de
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pesquisa da Profa. Bartira Rossi Bergmann enquanto que o padrão interno (1,3-
diaril-2-propen-1-onas) foi adquirido da Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, EUA). A
solução estoque de chalcona CH8 foi preparada em acetonitrila (ACN) na
concentração de 200 µg/mL e a partir dessa solução estoque foram preparadas por
diluição em balão volumétrico mais 11 soluções nas concentrações de 2; 5; 10; 15;
30; 50; 70; 100; 130; 160 e 180 µg/mL, usando como solvente a ACN. No entanto,
apenas seis das doze soluções foram empregadas na validação do método
bioanalítico entre elas estão as de 2; 5; 30; 100; 160 e 200 µg/mL que equivalem,
respectivamente, as concentrações de 0,15; 0,38; 2,28; 7,59; 12,15 e 15,18 µM no
meio microssomal. O padrão interno (PI) (Figura 5B) testado foi a chalcona não
substituída e a solução estoque foi preparada por diluição em balão volumétrico
apenas na concentração de 200 µg/mL.
Figura 5- Estrutura química da chalcona CH8 (A) e do PI (B).
4.2. Métodos
4.2.1. Análise por CLAE-DAD
Para a realização das análises cromatográficas foi empregado o equipamento
de CLAE, modelo Prominence, da marca Shimadzu® (Kioto, Japão), composto de
uma bomba de gradiente quaternário LC-20AT, forno CTO-20A, degaseificador
DGU-20A5, sistema controlador CBM-20A, injetor automático SIL-20A e DAD SPD-
M20A. No desenvolvimento do método utilizou-se a coluna cromatográfica Ascentis®
Express C18 (100 x 4,6 mm; 2,7 µm), da Sigma-Aldrich® (Bellefonte, EUA). A eluição
foi conduzida no modo isocrático, sendo utilizado o sistema de solventes acetonitrila:
solução de ácido acético 0,1%, na proporção de 65:35 (v/v) A vazão empregada foi
de 1 mL/min, temperatura de análise de 35 °C e o volume de injeção das amostras
foi de 4 µL. A chalcona CH8 e os seus metabólitos foram monitorados para detecção
29
no comprimento de onda de 338 nm. Os dados foram analisados utilizando o
software LC solution® versão 1.25 SP1.
4.2.2. Avaliação da solubilidade da chalcona CH8 no meio de incubação
microssomal
A solubilidade da chalcona CH8 foi avaliada no meio de incubação
microssomal que é composto basicamente por soluções aquosas como tampão
fosfato de potássio, tampão TRIS (empregado para preparar as soluções dos
cofatores) e água ultrapura. Esse procedimento foi aplicado com a finalidade de
garantir que a concentração da CH8 adicionada no meio microssomal fosse solúvel
no mesmo e, portanto, disponível para a biotransformação enzimática para CYP450,
utilizando o modelo de microssomas hepáticos.
Nesse sentido, o experimento foi realizado em replicatas (n= 3), utilizando
tubos cônicos e a solubilidade da chalcona CH8 foi avaliada nas concentrações de
50 e 100 µg/mL (3,79 e 7,59 µM, no meio de incubação, respectivamente). Dessa
forma, foram adicionados nos tubos cônicos 25 µL da solução estoque da chalcona
CH8 preparada em ACN (50 e 100 µg/mL) e 975 µL da solução tampão fosfato de
potássio (pH 7,4; 0,1 M). Além disso, a solubilidade do analito foi testada no meio
contendo 25 µL do analito, 200 µL da solução tampão fosfato de potássio 0,5 M pH
7,4 (resultando em uma concentração final de 0,1 M), um volume (µL) do tensoativo
cremophor® que resultasse nas concentrações de 0,1; 0,2 e 0,25% (m/v) no meio e
(µL) água ultrapura para completar o volume final de 1 mL. Após a adição das
soluções em tubos, as amostras foram centrifugadas, durante 5 minutos a 3000 rpm,
e os sobrenadantes transferidos para os vials para serem analisados por CLAE-
DAD. Além disso, outras amostras foram processadas contendo 25 µL da chalcona
CH8 nas mesmas concentrações (50 e 100 µg/mL) e 975 µL de ACN onde a CH8 é
100% solúvel. O percentual de solubilidade da chalcona CH8 foi obtido a partir dos
resultados da área relativa dos picos da chalcona CH8.
30
4.2.3. Otimização do método de preparo de amostras por extração líquido-
líquido (ELL)
A chalcona CH8 foi extraída, por ELL, a partir do meio de incubação
microssomal composto pela seguinte mistura: 200 µL de solução tampão fosfato de
potássio 0,5 M (pH 7,4); 250 µL de tampão Tris-HCl 0,05 M (pH 7,4) com 0,15 M de
KCl (em substituição aos cofatores preparados neste tampão) e um volume (µL) de
fração microssomal que resulte em uma concentração final no meio microssomal de
1 mg/mL e um volume (µL) de água ultrapura a fim de se obter uma concentração
final de tampão fosfato de potássio equivalente a 0,1 M.
Após a adição de 25 µL da chalcona CH8 (100 µg/mL), resultando na
concentração de 7,59 µM no meio de incubação, e do meio de incubação
microssomal em tubos de fundo redondo com tampa esmerilhada totalizando um
volume final de meio de incubação de 1 mL, as amostras foram homogeneizadas em
vórtex durante 10 s. Posteriormente, foram adicionados 4 mL dos solventes
extratores testados (éter metil terc-butílico e acetato de etila).
As amostras foram agitadas por 1 minuto em vórtex e então centrifugadas
durante 5 min a 3000 rpm. Logo em seguida, 3 mL de fase orgânica foram
transferidos para tubos cônicos de vidro de 10 mL. A partir disso, o solvente foi
evaporado sobre fluxo de ar comprimido e os resíduos foram redissolvidos em 300
µL de fase móvel e agitados em vórtex durante 10 s. Por fim, as alíquotas foram
transferidas para os vials e submetidas à análise cromatográfica. Controles foram
realizados sem a adição da chalcona.
4.2.4. Validação do método por CLAE-DAD
O método bioanalítico foi validado usando a RDC nº 27, de 17 de maio de
2012 da ANVISA. Com isso, para a validação da metodologia foram avaliados os
parâmetros de seletividade, linearidade, limite inferior de quantificação (LIQ),
precisão/exatidão intracorrida e intercorrida, estabilidade, bem como, o efeito matriz
e efeito residual.
Para construção da curva de calibração e validação do método bioanalítico
foram selecionadas as concentrações 2; 5; 30; 100; 160 e 200 µg/mL da chalcona
CH8, que equivalem, respectivamente, a 0,15; 0,38; 2,28; 7,59; 12,15 e 15,18 µM
31
no meio de incubação microssomal. Para avaliação dos parâmetros descritos é
necessário utilizar a menor concentração capaz de ser quantificada com precisão e
exatidão, denominado como LIQ; a concentração baixa (CB), que é até três vezes o
LIQ; a concentração média (CM) que é a média do LSQ (limite superior de
quantificação); e a concentração alta (CA), que se encontra entre 75 e 85% da maior
concentração da curva. Com base nessas especificações e nas concentrações da
chalcona CH8 preparadas determinou-se que o LIQ equivale a 0,15 µM; CB: 0,38
µM; CM: 7,59 µM; CA: 12,15 µM; LSQ: 15,18 µM.
As amostras foram compostas por 25 µL da solução da chalcona CH8 e do
meio de incubação microssomal descrito na seção 4.2.3. A partir dessa alíquota de 1
mL as amostras foram extraídas (exceto as amostras de estabilidade avaliadas em
condições de incubação que foram incubadas e depois extraídas) e posteriormente,
analisadas por CLAE-DAD, conforme descrito na seção 4.2.5.
4.2.4.1. Seletividade
A seletividade refere-se à habilidade de um método em determinar um analito
específico em uma mistura, sem a interferência de outros componentes presentes.
Os resultados devem ser comparados com aqueles obtidos nas amostras
processadas do limite de quantificação (LIQ), equivalente a 0,15 µM no meio de
incubação microssomal, e as respostas de picos interferentes próximo ao tempo de
retenção do analito devem ser inferiores a respectivamente 20% e 5% da resposta
do analito nas amostras do LIQ. Com a finalidade de avaliar a capacidade do
procedimento de preparo de amostra em eliminar interferentes, foram analisados
alíquotas de 1 mL do meio de incubação microsssomal na presença e ausência de
Cremophor® e brancos na presença e ausência do tensoativo livres do analito (n= 3).
4.2.4.2. Linearidade
A linearidade refere-se à capacidade de um método fornece resultados
diretamente proporcionais, dentro de uma faixa de concentração do analito na
amostra (INMETRO, 2003). A linearidade do método foi avaliada através da
construção de curvas analíticas na ausência de Cremophor® (n= 5) e presença de
Cremophor® (n= 6), as quais foram obtidas pela preparação de 1 mL do meio de
32
incubação microssomal. As concentrações da solução estoque da chalcona CH8
foram de 2; 5; 30; 100; 160 e 200 µg/mL, que equivalem em concentrações no meio
de incubação microssomal de 0,15; 0,38; 2,28; 7,59; 12,15 e 15,18 µM,
respectivamente. A análise estatística dos dados foi realizada usando a análise de
variância (ANOVA) Lack of fit pelo programa estatístico MINITAB Realease versão
14.1 (State College, PA, EUA). Valores de p maiores que o nível de significância (α=
0,05) indicam que não houve desvio de linearidade.
4.2.4.3. Limite inferior de quantificação (LIQ)
A detectabilidade do método foi avaliada pela determinação do LIQ, definido
como a menor concentração do analito que pode ser quantificada com exatidão,
expresso pelo erro padrão relativo (EPR, %) e precisão, expresso pelo desvio
padrão relativo (DPR, %), os quais não se admitem valores maiores ou iguais a 20%
para DPR (%) e fora da faixa de ± 20% para o EPR (%). Para esta determinação
alíquotas de 1 mL do meio de incubação microssomal foram preparadas na
concentração de 0,15 µM do analito na presença (n= 6) e ausência de Cremophor®
(n= 5), e posteriormente, analisadas com base em uma curva analítica preparada
simultaneamente.
4.2.4.4. Exatidão intracorrida e intercorrida
A exatidão se refere ao grau de concordância entre os resultados individuais
encontrados em um determinado ensaio e um valor de referência (INMETRO, 2003).
Dessa forma, a exatidão foi determinada em uma mesma corrida analítica (exatidão
intracorrida) e em três corridas diferentes (exatidão intercorrida). Os ensaios de
exatidão intercorrida e intracorrida foram realizados na presença de Cremophor® (n=
6) e ausência de Cremophor® (n= 5) utilizando 1 mL do meio de incubação
microssomal contendo concentrações do analito no meio de incubação microssomal
de 0,15 µM (LIQ); 0,38 µM (CB); 7,59 µM (CM); 12,15 µM (CA). A exatidão foi
expressa pelo EPR (%), não se admitindo valores fora da faixa de ± 15% do valor
nominal, exceto para o LIQ, para o qual não se admitem valores fora da faixa de ±
20% do valor nominal. Os cálculos para avaliar a exatidão intracorrida e intercorrida
33
foram baseados em curvas analíticas, processadas diariamente da mesma forma
que as amostras e os resultados foram obtidos a partir da Equação 1.
(Equação 1)
4.2.4.5. Precisão intracorrida e intercorrida
A precisão representa a dispersão de resultados obtidos a partir de ensaios
independentes repetidos de uma mesma amostra (INMETRO, 2003). Dessa forma, a
precisão foi determinada em uma mesma corrida (precisão intracorrida) e em três
corridas diferentes (precisão intercorrida). Os ensaios de precisão intercorrida e
intracorrida foram realizados na presença de Cremophor® (n= 6) e ausência de
Cremophor® (n= 5) utilizando 1 mL do meio de incubação microssomal contendo
concentrações do analito no meio de incubação microssomal de 0,15 µM (LIQ); 0,38
µM (CB); 7,59 µM (CM); 12,15 µM (CA). A precisão foi expressa pelo DPR (%) e
para o cálculo foi empregado a Equação 2. Para este parâmetro não são admitidos
valores superiores 15% do valor nominal, exceto para o LIQ, para o qual não se
admite valores superiores a 20%.
(Equação 2)
Em que, S representa o desvio padrão absoluto e M refere-se a média
aritmética dos valores obtidos das replicatas para cada concentração.
4.2.4.6. Estabilidade
Este parâmetro visa avaliar a estabilidade das amostras quanto às condições
de armazenamento, preparo e análise das amostras. Com isso, as mesmas foram
avaliadas nas condições de bancada, de incubação e de auto-injetor nas
concentrações do analito no meio de incubação microssomal de 0,38 µM (CB) e
12,15 µM (CA). Essas amostras foram quantificadas empregando uma curva
analítica preparada no dia de análise e os resultados obtidos foram expressos como
34
EPR (%) e DPR (%). Todos os experimentos foram realizados em quintuplicata para
cada concentração avaliada.
Para avaliar a estabilidade de bancada, as amostras contendo o meio de
incubação microssomal foram mantidas a temperatura ambiente (25 °C ± 2 °C)
durante 6 horas, para posteriormente dar prosseguimento a extração líquido-líquido
e análise via CLAE-DAD. A estabilidade do analito submetidas as condições de
incubação foi avaliada utilizando amostras incubadas a 37 °C, sob agitação (200
rpm), durante 90 minutos em meio de incubação microssomal e ao fim procedendo-
se com a extração e análise. Para estabilidade de auto-injetor, as amostras foram
preparadas concomitantemente à curva analítica, mantidas dentro do amostrador e
injetadas após 7 h.
4.2.4.7. Efeito matriz
É o efeito na resposta do analito proveniente pela eluição de componentes da
matriz biológica no mesmo tempo de retenção do analito de interesse. Para avaliar o
efeito matriz foram preparadas em triplicatas alíquotas de 1 mL do meio de
incubação contendo a concentração de 0,38 µM (CB) e 12,15 µM. Posteriormente,
as amostras foram extraídas e injetadas em cromotográfo.
Os cálculos para avaliar o efeito matriz foi feito por meio do Fator de Matriz
Normalizado, segundo a fórmula a seguir:
FMN= área do analito em matriz / média das áreas do analito em solução
O critério de avaliação é que o coeficiente de variação (CV) dos FMNs
relativos as amostras avaliadas devem ser inferiores a 15%.
4.2.4.8. Efeito residual
O efeito residual refere-se ao efeito gerado pelo aparecimento ou aumento do
sinal do analito causado pela contaminação proveniente de amostras analisadas
anteriormente. Para a avaliação do efeito residual foi utilizado uma alíquota de 1 mL
do meio de incubação sem a adição do analito (branco) e esta foi injetada no
cromatógrafo. Por conseguinte, foram processadas três alíquotas de 1 mL do meio
35
de incubação contendo a concentração 15,2 µM (LSQ) do analito que em seguida
foram extraídas e injetadas após amostra branco, seguida de mais duas injeções da
amostra branco. As respostas de picos interferentes eluindo no tempo de retenção
do analito devem ser inferiores a 20% das respostas dos mesmos na concentração
do LIQ.
4.2.5. Procedimento geral de incubação para o estudo de biotransformação in
vitro e preparo de amostras
Os procedimentos e concentrações dos reagentes empregados nos ensaios
de biotransformação foram baseados no guia da BD Biosciences e no trabalho de
Messiano e colaboradores (2013). O meio de incubação microssomal foi preparado
para um volume final de 1 mL. Para os experimentos de biotransformação foram
transferidos 25 µL da solução estoque da chalcona CH8 na concentração de 100
µg/mL (que equivalem a 7,59 µM, no meio de incubação microssomal) para um tubo
de vidro de fundo redondo com tampa. Posteriormente, foram adicionados na
sequência 200 µL da solução tampão fosfato de potássio 0,5 M (pH 7,4); o sistema
de cofatores responsáveis pela regeneração de NADPH: 100 µL de NADP+ (0,25
mM), 100 µL solução de glicose-6-fosfato (5 mM) e 50 µL de glicose-6-fosfato
desidrogenase (0,5 unidades/mL); e um volume de água ultrapura (µL) a fim de se
obter um volume final de 1 mL.
Após adição das soluções, as amostras foram levadas para o banho-maria
metabólico, do tipo Dubnoff, as quais foram pré-incubadas por 5 minutos à 37 °C.
Passados os minutos, adicionou-se um volume (µL) da fração microssomal do fígado
de rato, a fim de se obter uma concentração proteica de 1 mg/mL no meio de
incubação. Logo após a adição da fração microssomal, as amostras foram
novamente incubadas a 37 °C, na rotação de 200 rpm, durante 90 minutos, em
banho-maria.
Decorrido o tempo de incubação, a reação foi encerrada ao adicionar-se 4 mL
de solvente orgânico extrator, em seguida, agitou-se utilizando o vórtex, durante 1
minuto. Após essa etapa, as amostras foram centrifugadas durante 5 minutos a 3000
rpm. Logo após a centrifugação, foram retirados 3 mL da fase orgânica e
transferidos para tubos cônicos, os quais foram colocados sob fluxo de ar
comprimido para completa secura do solvente orgânico. Por fim, os resíduos secos
36
contidos nos tubos foram redissolvidos em 300 µL de fase móvel, acetonitrila:
solução de ácido acético 0,1% (65:35, v/v), e levados para análise em HPLC-DAD.
Inicialmente, para monitorar a formação de metabólitos foram preparadas amostras
contendo a fração microssomal em replicatas (n= 10) e controles (n= 5) sem a
adição da fração microssomal e para ambos os grupos, as amostras foram
concentradas em uma única amostra. Posteriormente, para identificação e
caracterização estrutural dos metabólitos foram preparadas novas amostras
contendo a fração microssomal (n= 50) e controle (n= 6) sem a fração microssomal.
Para os experimentos de validação do método bioanalítico as amostras não
foram submetidas a etapa incubação, exceto as amostras de estabilidade
submetidas as condições de incubação.
4.2.6. Obtenção de microssomas hepáticos de ratos
Os microssomas hepáticos foram obtidos pelo método descrito por Lake
(1987). Para obtenção da fração microssomal dos fígados de ratos foram utilizados
seis ratos machos da linhagem Wistar, pesando entre 180-220 g, fornecidos pelo
Biotério Geral do Campus da USP de Ribeirão Preto. Os animais foram ambientados
a 25 °C e sacrificados pelo método de decapitação (Protocolo CEUA nº MAC041-
ANEXO I). A partir disso, o fígado fresco foi removido e colocado em um béquer
imerso em gelo com solução tampão Tris-HCl 0,05 M (pH 7,4), contendo 0,15 M de
KCl. Os fígados foram triturados e lavados três vezes com tampão Tris-HCl.
Posteriormente, estes pedaços foram homogeneizados em um homogeneizador tipo
“Potter” modelo MA 181 da marca Marconi (Piracicaba, SP, Brasil).
Após homogeneizar, o fígado foi centrifugado por 15 minutos a 4 °C na
rotação de 15.000 rpm em centrífuga modelo Himac CF16RXII da marca Hitachi,
(Tóquio, Japão). O sobrenadante foi coletado e centrifugado em ultracentrífuga a 4
°C por 60 minutos a uma velocidade de 38.000 rpm. O pellet contendo os
microssomas foi ressuspendido em solução tampão Hepes-HCl 0,05 M (pH 7,4),
contendo 0,001 M de EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético) e 20% de glicerol. O
conteúdo proteico presente na fração microssomal foi dosado pelo método de
biureto empregando o kit para dosagem de proteínas totais da marca Labtest (Lagoa
Santa, MG, Brasil). Os microssomas hepáticos foram armazenados em tubos
criogênicos e armazenados em nitrogênio líquido até o momento do uso.
37
4.2.7. Análises por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a
espectrômetro de massas por tempo de voo (CLAE-TOF-EM)
As análises para identificação dos metabólitos também foram realizadas em
equipamento de CLAE da marca Shimadzu (Kioto, Japão), composto por duas
bombas isocráticas de alta pressão modelo LC-20AD operando a uma vazão de 1
A: acetonitrila; B: Solução de ácido acético 0,1%.
Vale ressaltar que os valores referentes ao número de pratos (N) e a
resolução (Rs) foram calculados pelo próprio software cromatográfico.
A equação empregada no cálculo da resolução é dada por:
Rs= 1,18 (tR2-tR1) / WH2 + WH1 (Equação 4)
Em que, tR2 refere-se ao tempo de retenção do pico mais retido e tR1 ao pico
com menor tempo de retenção. Enquanto que WH2 e WH1, referem-se as larguras
dos picos, mais e menos retidos, medidas à meia altura.
Por sua vez, para o cálculo do número de pratos (N) o software emprega a
seguinte equação:
N= 5,54 (tR/WH)2 (Equação 5)
Em que, tR é o tempo de retenção do pico e WH é a largura a meia altura.
A Figura 6 representa o cromatograma da condição cromatográfica otimizada
onde o padrão interno e a chalcona CH8 apresentaram, respectivamente, tempos de
retenção (tR) em 2,9 min e 4,0 min e bandas máximas de absorção no ultravioleta
em 308 e 338 nm. Vale destacar que o pico com tR de 6 min refere-se a uma
impureza proveniente da síntese orgânica da chalcona CH8.
42
Figura 1- Cromatograma representativo da condição cromatográfica otimizada e os espectros de ultravioleta da chalcona CH8 e do padrão interno.
Contudo, na Tabela 4 apresenta a condição cromatográfica otimizada para
posterior aplicação nos estudos de biotransformação in vitro com microssomas
hepáticos de ratos.
Tabela 4- Condições cromatográficas de análise por HPLC.
Parâmetro Condições de análise
Coluna Ascentis® C18 (100 x 4,6 mm, 2,7 µm)
Fase móvel (FM) Acetonitrila/Sol. de ácido acético 0,1% (65:35, v/v)
Vazão 1 mL/min
Volume de injeção 4 µL
Temperatura de análise 35 °C
Detecção UV 338 nm
43
5.2. Avaliação da solubilidade da chalcona CH8 nas condições de incubação
Os ensaios de biotransformação in vitro são realizados em meio aquoso
contendo solução tampão fosfato, fração microssomal e cofatores preparados em
tampão Tris. Desta forma, com a finalidade de avaliar o solvente que seria
empregado no preparo da solução estoque da chalcona CH8 foi testada sua
solubilidade em água. Com isso, foi verificado que a CH8 apresenta baixíssima
hidrossolubilidade. Consequentemente, a chalcona CH8 não poderia ser adicionada
no meio de incubação microssomal sem antes de estabelecer um solvente para
dissolvê-la e garantir a sua solubilização no meio de incubação microssomal. Entre
os solventes que podem ser empregados na solubilização de substâncias lipofílicas
no meio de incubação microssomal estão o metanol, acetona, etanol,
dimetilsulfóxido e acetonitrila (VENKATAKRISHNAN; Von MOLTKE; GREENBLATT,
2001). Neste sentido, Li e colaboradores (2010) avaliaram o efeito inibitório destes
solventes sobre CYP1A, CYP2C, CYP2D, CYP2E e CYP3A empregando
microssomas hepáticos de ratos. Observaram que dentre os solventes testados a
acetonitrila consiste da melhor escolha. Pois, a acetonitrila não apresenta inibição
em concentrações < 1% (LI et al., 2010).
Por sua vez, neste experimento foi empregado um volume de 25 µL de
solução estoque da chalcona CH8, preparada em acetonitrila. Este volume (25 µL)
foi adicionado ao meio de incubação microssomal (volume final de 1 mL), resultando
em uma concentração de 2,5% de acetonitrila. Volumes inferiores de solução
estoque não foram usados a fim de limitar erros analíticos no meio de incubação
microssomal. Esta concentração de acetonitrila (2,5%) mantém respectivamente 75,
75, 60, 90 e 100% de atividade catalítica das enzimas CYP1A, CYP2C, CYP2D,
CYP2E e CYP3A, respectivamente. Mesmo conhecendo que algumas CYP
poderiam estar parcialmente inibidas, avaliou-se o custo-benefício, e deu-se
continuidade aos experimentos nesta concentração de ACN, já que as reações
somente se processam em solução aquosa. Sendo assim, soluções estoque da
chalcona CH8 foram preparadas em acetonitrila.
Previamente aos ensaios, avaliou-se também a solubilidade dessa solução
estoque de chalcona CH8 na presença de tampão fosfato (pH 7,4) já que as reações
enzimáticas de biotransformação in vitro ocorrem em meio aquoso contendo solução
de tampão fosfato. Com isso, verificou-se que em ambas as concentrações testadas
44
da chalcona CH8, 50 e 100 µg/mL, apresentaram baixo percentual de solubilidade (<
20%) (Figura 7).
Todavia, com a finalidade de aumentar ainda mais a solubilidade da chalcona
CH8 no meio de incubação foram preparadas soluções do tensoativo Cremophor®
nas concentrações de 0,1; 0,2 e 0,25% (p/v), as quais foram testadas e conforme
observa-se no gráfico (Figura 7), a solubilidade da chalcona CH8, em ambas as
concentrações, aumentou em função do aumento da concentração de Cremophor® e
que na maior concentração do Cremophor® (0,25%) as concentrações de chalcona
CH8 testadas apresentaram um percentual de solubilidade de quase 48% (50
µg/mL: 47,8% 100 µg/mL: 47,0%). O tensoativo Cremophor® não foi testado em
concentrações superiores a 0,25%, porque há relatos na literatura que em
concentrações superiores observa-se uma inibição considerável da atividade
catalítica da CYP3A4 (RAO et al., 2010; CHRISTIANSEN et al., 2011).
Diante dos dados apresentados, foi escolhida a concentração de 0,25% de
Cremophor® para a realização dos ensaios posteriores tendo em vista que nesta
concentração apresentou maior solubilidade da chalcona CH8 quando comparadas
as demais testadas. Enquanto que a concentração da chalcona CH8 de 100 µg/mL
foi escolhida para ser empregada nos ensaios de biotransformação porque esta
concentração encontra-se dentro da faixa de concentração a ser empregada nos
ensaios de validação do método bioanalítico.
45
0
20
40
60
80
100
Chalcona CH8
g\mL
Chalcona CH8
g\mL
Tampão 0,1 M
Cremophor 0,1%
Cremophor 0,2%
Cremophor 0,25%
% s
olu
bil
idad
e
Figura 7- Porcentagem de solubilidade da chalcona CH8 de 50 µg/mL e 100 µg/mL, em solução de tampão fosfato de potássio 0,1 M e soluções de Cremophor®.
5.3. Otimização do método de preparo de amostras por ELL
Após otimização do método cromatográfico para análise da chalcona CH8,
deu-se prosseguimento a otimização do método para extração do analito do meio de
incubação contendo a fração microssomal. Para obter-se uma recuperação eficiente
do analito pela técnica clássica de ELL é importante considerar alguns parâmetros,
por exemplo, tempo de extração, volume da amostra e do solvente extrator,
procedimentos utilizados para evaporação do solvente e a escolha do solvente
extrator (BARTH et al., 2014). Nesse sentido, a técnica de ELL empregada foi
avaliada considerando a quantidade recuperada do analito e seletividade dos
solventes extratores após a extração do analito do meio microssomal utilizando
acetato de etila (AcOEt) e éter metil terc-butílico (MTBE).
A partir dos resultados obtidos verificou-se que ambos os solventes foram
seletivos, pois não foi observada a presença de interferentes, nos tempos de
retenção dos analitos, nos cromatogramas das amostras controle e amostras
contendo os analitos (Figura 8).
46
Figura 8- Cromatograma representativo das amostras extraídas com solventes extratores na presença e ausência da chalcona CH8. (A) amostras contendo o analito extraídas com MTBE; (B) amostras contendo o analito extraídas com AcOEt; (C) amostras controle sem o analito extraídas com MTBE; e (D) amostras controle sem o analito extraídas com AcOEt.
Todavia, o éter metil terc-butílico apresentou maior recuperação quando
comparado ao acetato de etila, 90 e 83%, respectivamente. Outro fator adicional que
contribuiu para escolha do MTBE, além da seletividade e maior recuperação foi o
menor ponto de ebulição (MTBE: 55,2 °C; AcOEt: 77,1 °C, obtidos na base de dados
do SciFinder®), o que contribui para redução do tempo evaporação dos solventes e
de preparo das amostras. Outros fatores que devem ser considerados são a razão
de volumes entre o solvente orgânico, tempo de extração e velocidade de extração,
para tanto esses parâmetros foram determinados com base no trabalho realizado
por Clemente (2016) que avaliou vários parâmetros inerentes a técnica de ELL para
extração eficiente da chalcona CH8 da fase aquosa contendo plasma murino. Com
isso, as condições para a extração da chalcona CH8 foram adaptadas para extração
do mesmo analito, porém, a partir do meio de incubação contendo microssomas
hepáticos de ratos. As condições otimizadas para a extração líquido-líquido estão
apresentadas na Tabela 5.
47
Tabela 5- Condições otimizadas para o procedimento de extração líquido-líquido.
Parâmetro Condição otimizada
Solvente (volume) MTBE (4 mL)
Tempo de agitação 60 s
Rotação e tempo de centrifugação 3000 rpm/5 min
Procedimento de evaporação Fluxo de ar comprimido
Volume recuperado 3 mL
Dissolução dos resíduos (Volume) 300 µL de fase móvel – ACN:
Solução de ácido acético 0,1%
(65:35, v/v)
48
5.4. Validação do método bioanalítico para determinação da chalcona CH8 em
meio de incubação microssomal
Após otimização dos parâmetros de extração líquido-líquido, o método
analítico foi validado, a fim de garantir a confiabilidade dos resultados obtidos no
estudo de biotransformação in vitro da chalcona CH8. O procedimento de validação
foi conduzido com base na RDC nº 27, de 17 de maio de 2012, da ANVISA que
dispõem requisitos mínimos para a validação de métodos bionalíticos aplicados em
estudos de biodisponibilidade e bioequivalência, em virtude da ausência de método
específico para a condução de estudos de metabolismo. Vale destacar que o
método foi validado sem o emprego do padrão interno visto que, os parâmetros de
validação avaliados foram atendidos sem o uso de PI, e porque o mesmo não
promoveu nenhuma melhoria nos resultados. Além disso, devido à possibilidade de
inibição do metabolismo o método foi validado na presença e ausência do tensoativo
Cremophor® (RAO et al., 2010).
5.4.1. Seletividade
Esse parâmetro é o primeiro passo no desenvolvimento e validação de um
método analítico, pois, esse parâmetro visa avaliar se há presença de algum
interferente eluindo no mesmo tempo de retenção do analito. A partir dos resultados
obtidos nota-se no cromatograma que tanto as amostras preparadas na presença
quanto na ausência de Cremophor® não houve a presença de picos interferentes
eluindo no mesmo tempo de retenção da chalcona CH8 (Figura 9). Portanto,
evidencia-se que o método bioanalítico foi seletivo.
49
Figura 9- Cromatograma representativo das análises de seletividade na presença e ausência de Cremophor® (n=3). (A) amostras contendo 0,15 µM da chalcona CH8 e 0,25%
de Cremophor® no meio de incubação microssomal; (B) 0,15 µM da chalcona CH8 no meio de incubação microssomal; (C) branco, amostras preparadas na ausência de Cremophor® e CH8; e (D) branco, amostras preparadas na presença de Cremophor® e ausência da chalcona CH8.
5.4.2. Linearidade
Para avaliação da linearidade do método foram construídas três curvas de
calibração com no mínimo seis concentrações diferentes do analito e mínimo de
cinco replicatas. De acordo com as especificações, os padrões de calibração devem
apresentar DPR menor ou igual 20% em relação à concentração nominal para os
padrões do LIQ, e DPR menor ou igual a 15% em relação a concentração nominal
para os demais padrões de calibração.
Após obter os resultados, os mesmos foram submetidos a um cálculo de
ponderação (peso=1/x2) a fim de minimizar o valor do EPR (%) obtido pela relação
entre os valores nominais dos padrões estabelecidos na curva de calibração e os
valores obtidos pela equação da curva. Pois, os dados da curva de calibração
apresentaram um comportamento heteroscedástico, ou seja, é quando se observa
variâncias discrepantes no valor resultante da soma dos erros relativos, em pontos
da curva de calibração (CRIBARI-NETO; SOARES, 2003).
50
O método avaliado atendeu as especificações preconizadas pelo guia
utilizado, mostrando ser linear em toda faixa da curva, com coeficiente de correlação
maior que 0,99. As equações da reta obtidas para as amostras na ausência e
presença de Cremophor® estão expressas na Tabela 6, onde y representa a área do
pico da chalcona CH8, e x refere-se a concentração da chalcona CH8. As análises
das seis concentrações da curva na ausência de Cremophor® (n=5) e na presença
de Cremophor® (n=6) apresentaram DPR inferior a 20% em relação a concentração
do LIQ (0,15 µM) e EPR situado entre ± 20%. Para as demais concentrações da
curva analítica, o DPR foi inferior a 15% e o EPR situado em ±15%. Além disso, o
teste para falta de ajuste (Lack of it) apresentou valores de F inferiores ao tabelado,
indicando que não há falta de ajuste e os valores de p superiores ao nível
significância (α= 0,05) indicam que não houve desvio de linearidade (Tabela 6).
Tabela 6- Linearidade do método na ausência (n=5) e presença de cremophor® (n=6).
Analito Faixa (µM)
Equação linear ra Lack of fitb
F p
Chalcona CH8 0,15 - 15,18
Ausência de Cremophor®
y=13808,02x - 820,25 0,998 1,780 0,193
Presença de Cremophor®
y=12007,03x - 390,12 0,996 3,74 0,062 aCoeficiente de correlação linear.
5.4.3. Limite inferior de quantificação (LIQ)
O limite inferior de quantificação representa a menor quantidade de analito
que pode ser quantificada com precisão e exatidão. Os resultados das análises com
0,15 µM de chalcona CH8 nas amostras (n=5) na ausência de Cremophor® e na
presença de Cremophor® (n=6), apresentaram valores dentro do especificado pelo
guia utilizado, sendo possível quantificar o analito nessa concentração com DPR
inferior a 20% e EPR situado entre ± 20% (Tabela 7).
51
Tabela 7- Limite de quantificação na ausência (n=5) e presença de Cremophor® (n=6).
Analito Concentração
(µM) Concentração
obtida (µM) EPR, %a DPR, %b
Chalcona CH8 0,15
Ausência de Cremophor®
0,15 2,60 4,30
Presença de Cremophor®
0,16 6,08 3,38 aEPR, erro padrão relativo;
bDPR, desvio padrão relativo.
5.4.4. Precisão e exatidão intracorrida e intercorrida
A precisão representa a dispersão de resultados obtidos a partir de ensaios
independentes repetidos de uma mesma amostra. Enquanto que a exatidão se
refere ao grau de concordância entre os resultados individuais encontrados em um
determinado ensaio e um valor de referência (INMETRO, 2003). Os ensaios de
precisão e exatidão foram realizados empregando a menor concentração capaz de
ser quantificada com precisão e exatidão (LIQ), a concentração baixa (CB),
concentração média (CM) e a concentração alta (CA) da curva de calibração. Como
podem ser observados nas Tabelas 8 e 9, todos os valores para precisão (DPR)
foram inferiores a 15%, enquanto que a exatidão situou-se entre ± 15%, de acordo
com o guia empregado.
52
Tabela 8- Precisão e exatidão intracorrida na ausência (n= 5) e presença de Cremophor®
(n= 6).
Analito Concentração
(µM) Concentração
obtida (µM) EPR, %a DPR, %b
Chalcona CH8
0,15
Ausência de Cremophor®
0,15 2,60 4,30
Presença de Cremophor®
0,16 6,08 3,38
0,38
Ausência de Cremophor®
0,35 -7,32 11,39
Presença de Cremophor®
0,32 -15,00 5,42
7,59
Ausência de Cremophor®
7,98 5,11 0,68
Presença de Cremophor®
7,51 -1,08 2,92
12,15
Ausência de Cremophor®
12,27 0,97 3,76
Presença de Cremophor®
13,29 9,39 4,09 aEPR, erro padrão relativo;
bDPR, desvio padrão relativo.
Tabela 9- Precisão e exatidão intercorrida na ausência (n= 3) e presença de Cremophor®
(n= 3).
Analito Concentração (µM)
Concentração obtida (µM)
EPR, %a DPR, %b
Chalcona
CH8
0,15
Ausência de Cremophor®
0,15 0,77 1,72
Presença de Cremophor®
0,17 11,74 10,95
0,38
Ausência de Cremophor®
0,38 0,28 6,66
Presença de Cremophor®
0,32 -13,69 8,60
7,59
Ausência de Cremophor®
7,93 4,42 7,44
Presença de Cremophor®
8,09 6,17 6,18
12,15
Ausência de Cremophor®
11,96 -1,57 6,36
Presença de Cremophor®
13,10 7,82 3,52 aEPR, erro padrão relativo;
bDPR, desvio padrão relativo.
53
5.4.5. Estabilidade
As amostras foram avaliadas quanto as condições de armazenamento,
preparo e análise das amostras. Com isso, foram avaliadas as estabilidades de
bancada, de incubação e de auto-injetor para as concentrações baixa (0,38 µM) e
alta (12,15 µM) na ausência de Cremophor®. Essas amostras foram quantificadas
empregando uma curva analítica preparada no dia da análise e os resultados foram
expressos como EPR e DPR. Todos os experimentos foram realizados em
quintuplicata para cada concentração avaliada. Conforme pode ser observado na
Tabela 10, os resultados obtidos encontram-se dentro do especificado pelo guia
utilizado.
Tabela 10- Estabilidade de bancada, condições de incubação e auto-injetor na ausência de Cremophor® (n= 5).
Analito Concentração (µM)
Concentração obtida (µM)
EPR, %a DPR, %b
Chalcona
CH8
0,38
Bancada (6 h)
0,33 -10,80 9,87
Condições de incubação (37 °C, 200 rpm, 90 min)
0,32 -13,51 12,45
Auto-injetor (7 h)
0,35 -5,87 7,04
12,15
Bancada (6 h)
11,69 -3,79 5,46
Condições de incubação (37 °C, 200 rpm, 90 min)
12,86 5,91 5,76
Auto-injetor (7 h)
12,72 4,74 4,63 aEPR, erro padrão relativo;
bDPR, desvio padrão relativo.
Além destas, também foi avaliada a estabilidade das soluções estoque, as
quais se mostraram estáveis durante o período de trinta dias de armazenamento a -
20 °C, apresentando EPR dentro da faixa de ± 15%, quando comparadas a solução
fresca, recentemente preparada e a solução analisada no último dia da validação.
Para este monitoramento foram empregadas as CB (0,38 µM) e CA (12,15 µM) em
triplicata.
54
5.4.6. Efeito matriz
Conforme pode ser observado na Tabela 11, os valores do coeficiente de
variação dos FMN calculados foram inferiores a 15% tanto para as amostras de
concentração baixa (0,38 µM) quanto alta (12,15 µM).
Tabela 11- Efeito matriz (n= 3).
Analito Concentração
(µM) CV, %a
Chalcona CH8 0,38 5,73
12,15 3,63 aCV, coeficiente de variação
5.4.7. Efeito residual
Para avaliar se o efeito residual ocorria no método, foi testada a injeção de
amostras fortificadas na maior concentração da curva analítica 15,18 µM e posterior
a injeção de amostras brancas livre do analito. Com isso, não foi observada a
presença do analito nas amostras branco injetadas posteriormente ao LSQ (Figura
10). Porém, a fim de eliminar a possibilidade de ocorrência deste efeito nas análises
posteriores a lavagem do auto-injetor foi realizada com acetonitrila no volume de
lavagem da seringa máximo permitido pelo injetor que é de 2000 µL.
Figura 10- Cromatograma representativo das análises de efeito residual. (A) refere-se as amostras processadas na concentração de 15,18 µM (LSQ); (B) amostras branco anterior a injeção do LSQ; (C) primeira amostra branco anterior a injeção do LSQ; (D) segunda
amostra branco analisada após a injeção do LSQ.
55
5.5. Identificação estrutural da chalcona CH8 e seus metabólitos
5.5.1. Análise por CLAE-DAD
Após etapas de otimização e validação do método bioanalítico, as amostras
provenientes do estudo de metabolismo e controle foram submetidas a análise
cromatográfica empregando a técnica de CLAE-DAD a fim de monitorar a formação
de metabólitos provenientes da biotransformação in vitro da chalcona CH8
empregando microssomas hepáticos de ratos.
As condições empregadas nesse estudo para promover a biotransformação
da chalcona CH8 foram tempo de incubação de 90 minutos e concentração de
proteínas microssomais de 1 mg/mL, visto que em ensaios preliminares não foi
possível observar por CLAE-DAD picos indicativos de metabólitos em concentração
e tempo inferiores a estes. Para esse experimento, foram preparadas replicatas da
amostra controle (n= 5) e amostra biotransformada (n= 10), sendo que ambos os
grupos foram, respectivamente, reunidas e concentradas em um único recipiente e
extraídas com MTBE, conforme o protocolo descrito na seção 4.2.5 e injetadas no
equipamento de CLAE-DAD.
O metabolismo da chalcona CH8 foi monitorado através da comparação entre
o perfil cromatográfico da amostra controle (amostra sem microssomas hepáticos,
portanto, não sofreram biotransformação) e biotransformada, adicionadas de
microssomas hepáticos, através da análise dos espectros de absorção no
ultravioleta (UV), bem como, pela diminuição da área da chalcona CH8
biotransformada quando comparada a da amostra controle.
Ao comparar o perfil cromatográfico notou-se a presença de picos no
cromatograma da amostra metabolizada que não foram observados na amostra
controle com tempos de retenção (tR) de 1,31; 1,76 e 1,96 minutos (Figura 11).
Dentre esses, apenas o pico com tR 1,76 min apresentou espectro de absorção no
UV (Figura 12B) semelhante ao da chalcona CH8 (Figura 12D) com observação de
duas bandas de absorção características conhecidas como, banda I (300-380 nm),
que está associada à absorção do sistema cinamoil do anel B, e a banda II (240-280
nm), ocasionada pela absorção do sistema benzoil do anel A (Figura 13) (CHAGAS
et al., 2014).
56
Apesar dos outros dois picos com tR 1,31 e 1,96 min não terem apresentado
esse espectro de absorção no UV característico não significa que essas sustâncias
não sejam produtos do metabolismo da chalcona CH8. Afinal, a baixa concentração
do produto formado e o efeito da matriz podem interferir na detecção por UV
(CASSIANO et al, 2009).
Figura 11- Cromatograma representativo das amostras preparadas com Cremophor®
submetidas à biotransformação in vitro. (A) representa a amostra controle preparadas na ausência de microssoma hepático (n= 5) e (B) amostra biotransformada preparadas na presença de microssomas hepáticos (n= 10), as quais foram analisadas por CLAE-DAD.
Condições de incubação: concentração de proteínas microssomais de 1 mg/mL e tempo de 90 minutos. Condições de análise: Coluna Ascentis C18 (100 x 4,6 mm; 2,7 µm) e fase móvel composta por acetonitrila e solução de ácido acético 0,1% (65:35, v/v); vazão de 1 mL/min; volume de injeção de 4 µL e detecção no UV em 338 nm. Solvente extrator: MTBE.
57
Figura 12- Espectro de absorção no UV de prováveis metabólitos (A: TR 1,3 min; B: TR 1,7 min; C: 1,9 min) e da chalcona CH8 (D: TR 4,0 min).
Figura 13- Estrutura básica de chalconas e suas porções que geram as bandas de
absorção características no UV.
As análises das amostras por CLAE-DAD indicaram a formação de possíveis
metabólitos da chalcona CH8 provenientes do estudo de biotransformação in vitro
com microssomas hepáticos de ratos. Desta forma, seguiu-se o estudo de
identificação dos prováveis metabólitos formados empregando CLAE-EM. Nesse
sentido, foram preparadas novas amostras controle (n= 6) e biotransformadas (n=
50) na presença e ausência de Cremophor®, e as amostras dos respectivos grupos
(quatro grupos) foram concentradas em um uma única amostra e analisadas por
CLAE-TOF-EM.
5.5.2. Análise por CLAE-TOF-EM
Ao comparar, qualitativamente, os cromatogramas obtidos após análise das
amostras, controle e biotransformada na ausência de Cremophor®, foi observada a
58
presença de cinco picos não encontrados no controle. Ao verificar a relação m/z dos
picos não encontrados no controle foi possível observar 5 picos (Figura 14) com
perda ou ganho de massas característico de reações mediadas pelo CYP (Tabela
12).
Figura 14- Cromatograma representativo das amostras preparadas na ausência de Cremophor® submetidas à biotransformação in vitro. (A) representa a amostra biotransformada (n= 50) e (B) amostra controle preparada na ausência de microssomas hepáticos (n= 6), as quais foram analisadas por CLAE-UV-TOF-EM. Condições de incubação: concentração de proteínas microssomais de 1 mg/mL e tempo de 90 minutos. Condições de análise: Coluna Ascentis C18 (100 x 4,6 mm; 2,7 µm) e fase móvel composta por acetonitrila e solução de fórmico 0,1% (gradiente 5% ACN (5 min); 5→100% (30 min)); vazão de 10 L/min; volume de injeção de 10 µL e detecção no UV em 338 nm. Solvente extrator: MTBE.
Tabela 12- Análise preliminar dos possíveis metabólitos.
Analito tR
(min) m/z Variação de
massa Possível
modificação estrutural
1 12,8 316 -14 -CH2
2 14,5 362 +32 +2O
3 16,6 346 +16 +O
4 16,8 302 -28 -2CH2
5 18,4 346 +16 +O
CH8 22,8 330 - -
tR, tempo de retenção; m/z, relação massa/carga; Variação de massa em função da chalcona CH8.
59
Após realizar a análise preliminar dos metabólitos (Tabela 12) foram
realizados cálculos do erro da massa acurada e foi observado que somente os picos
com tempo de retenção de 12,8 e 18,4 min, apresentaram massa acurada
compatível com as possíveis alterações estruturais encontradas nos metabólitos.
Devido a isso, o pico com tR 12,8 min foi codificado como M1 e o pico com tempo de
retenção em 18,4 min, codificado como M2. O cálculo do erro de massa será
abordado na sequência.
Porém, ao realizar a sobreposição dos cromatogramas das amostras
metabolizadas na ausência e presença de Cremophor® não foi observada a
presença do pico no tR de 12,8 min (M1) na amostra metabolizada contendo
Cremophor®, além disso, os picos foram menos intensos (Figura 15). Vale ressaltar
que apesar do método ter sido validado no modo isocrático, as análises foram
realizadas por CLAE-TOF-EM em modo gradiente com o objetivo de ampliar a faixa
de polaridade da fase móvel e garantir a identificação de um maior número de
metabólitos. Além disso, foi empregado o ácido fórmico para acidificar a fase aquosa
da fase móvel devido à disponibilidade deste solvente no laboratório onde foi
realizado as análises.
60
Figura 15- Cromatograma representativo das amostras preparadas na presença e ausência de Cremophor® submetidas à biotransformação in vitro. (A) amostras preparadas na ausência de Cremophor® (n= 50) e (B) amostras preparadas na presença de Cremophor® (n= 50), as quais foram analisadas por CLAE-UV-TOF-EM. Condições de incubação:
concentração de proteínas microssomais de 1 mg/mL e tempo de 90 minutos Condições de análise: Coluna Ascentis C18 (100 x 4,6 mm; 2,7 µm) e fase móvel composta por acetonitrila e solução de ácido fórmico 0,1% (gradiente 5% ACN (5 min); 5→100% (30 min)); vazão de 10 L/min; volume de injeção de 10 µL e detecção no UV em 338 nm. Solvente extrator MTBE.
Diante disso, a caracterização estrutural dos metabólitos provenientes da
biotransformação in vitro da chalcona CH8 empregando microssomas hepáticos de
ratos foi conduzida utilizando a amostra na ausência de Cremophor®.
Adicionalmente, a influência negativa do Cremophor® nas análises das amostras
contribuiu para que a validação do método bioanalítico fosse completamente
realizada na ausência de Cremophor®. Embora os resultados da validação parcial na
presença de Cremophor® tenham atendido aos requisitos mínimos dos guias
utilizados para essa finalidade, visto que a intenção preliminar era de realizar o
estudo de biotransformação na presença de Cremophor®, para assegurar que uma
parcela mais substancial da chalcona CH8 estivesse solúvel.
Portanto, conforme apresentado na Figura 14 a incubação da chalcona CH8
com microssomas hepáticos de ratos levou a formação de dois possíveis
metabólitos, codificados como M1 (tR=12,8 min) e M2 (tR=18,4 min), os quais não
foram observados na amostra controle incubada sem a adição da fração
61
microssomal. Conforme podem ser observados os dados apresentados na Tabela
13, verificou-se a transformação de 0,33 e 2,11%, para os metabólitos M1 e M2,
respectivamente, a partir da substância precursora, chalcona CH8. Após essas
observações, prosseguiu-se para análise do espectro de massas da chalcona CH8 e
seus metabólitos com o objetivo de propor a estrutura química dos produtos M1 e
M2 formados.
Tabela 13- Porcentagem de formação dos metabólitos M1 e M2.
5.5.3. Análise estrutural da chalcona CH8 por CLAE-TOF-EM e CLAE-Q-TOF-EM
Os espectros de massas da chalcona CH8 foram previamente analisados com
a finalidade de auxiliar na proposta estrutural dos metabólitos formados. A partir da
ionização da chalcona CH8 empregando-se fonte ESI verificou-se a formação do íon
molecular m/z 330 (Figura 16) e íons fragmentos m/z 181, 176 e 166 no modo
positivo, conforme demonstrado na Figura 17.
Figura 16- Espectro de massas da chalcona CH8 com tR 22,8 min e m/z 330,0973, obtido no modo positivo após análise por CLAE-TOF-EM.
62
Figura 17- Espectro de massas da chalcona CH8 obtido no modo positivo após análise por
CLAE-Q-TOF-EM, sendo íon molecular da CH8 de m/z 330,0951 e íons fragmentos de m/z 181, 176 e 166.
Os íons m/z 181, 176 e 166 obtidos nos espectros de massas da chalcona
CH8 podem ter sido formados conforme a proposta de fragmentação apresentada
na Figura 18. Todavia, ao analisar os espectros de massas dos metabólitos M1 e
M2 obtidos por CLAE-Q-TOF-EM com o objetivo de fazer a caracterização estrutural
dos mesmos a partir da proposta de fragmentação da chalcona CH8, não foi
possível obter resultados conclusivos. Sendo assim, as amostras metabolizadas na
ausência de Cremophor® também foram analisadas por CLAE-TOF-EM a fim de se
obter informações estruturais dos metabólitos através da sua massa exata.
63
Figura 18- Proposta de fragmentação da chalcona CH8 protonada, após obtenção do espectro de massa obtido por CLAE-Q-TOF-EM.
5.5.4. Análise estrutural dos metabólitos M1 e M2 por CLAE-TOF-EM
Os espectros de massa adquiridos após a ionização no modo positivo por
eletrospray dos metabólitos M1 e M2 estão demostrados nas Figuras 19 e 20. Ao
analisar os dados obtidos por CLAE-TOF-EM, notou-se que o íon molecular do
metabólito M1 (m/z 316,0814) apresentou uma perda de 14 unidades de massa,
enquanto que o metabólito M2 (m/z 346,0920) teve um acréscimo de 15 unidades de
massa quando comparados ao íon molecular da chalcona CH8 protonada com m/z
330,0972.
64
Figura 19- Espectro de massas do metabólito M1 com tR 12,8 min e m/z 316,0814, obtido no modo positivo após análise por CLAE-TOF-EM.
Figura 20- Espectro de massas do metabólito M2 com tR 18,4 min e m/z 346,0920, obtido no modo positivo após análise por CLAE-TOF-EM.
Conforme demostrado anteriormente, os cromatogramas e espectros de
massas da chalcona CH8 e seus metabólitos foram obtidos por CLAE-TOF-EM, um
instrumento que apresenta o analisador de alta resolução, o qual é capaz de
conceder a massa exata das substâncias em análise. Na Tabela 14 reúne a massa
exata observada para a chalcona CH8 e metabólitos (M1e M2).
65
Tabela 14- Dados da massa exata da chalcona CH8 e seus metabólitos empregando o CLAE-TOF-EM.
Analito Massa exata Massa acurada Erro (ppm)
Fórmula molecular
CH8 330,0973 330,0972 -0,1 C17H16NO6 +
M1 316,0814 316,0816 0,5 C16H14NO6 +
M2 346,0920 346,0921 0,3 C17H16NO7 +
A exatidão das massas medidas foi avaliada através do cálculo do erro de
acordo com a equação: [106 x (m/z acurada – m/z exata) / m/z exata], onde m/z
acurada corresponde a massa medida e a m/z exata corresponde a massa teórica.
A partir dessas informações é possível inferir que os metabólitos M1 e M2 são
provenientes de uma possível desmetilação e mono-hidroxilação da chalcona CH8,
respectivamente. Todavia, a técnica empregada não permite elucidar a estrutura
química da molécula em estudo, indicando com exatidão em quais posições houve a
desmetilação nos grupos metoxilas do anel A e a inserção da hidroxila na porção
cinamoil. Dessa forma, é possível apenas propor a estrutura química dos
metabólitos (Figura 21) e fazer algumas observações quanto as posições mais
prováveis de terem ocorrido a reação de funcionalização.
Figura 21- Estruturas químicas propostas a partir das análises por CLAE-TOF-EM dos metabólitos da chalcona CH8 após a biotransformação por microssomas hepáticos de rato. O pontilhado envolvendo a parte da molécula corresponde aos possíveis locais onde podem ter ocorrido a reação química de desmetilação e mono-hidroxilação.
66
A regiosseletividade do processo de hidroxilação aromática mediada pela
CYP depende da natureza do(s) substituintes ligado(s) ao anel aromático e da
interação substrato-enzima (BARREIRO; FRAGA, 2015). A mono-hidroxilação
aromática da chalcona CH8 mais provável de ocorrer é na posição meta ao grupo
nitro (anel B). Pois, ao investigar o mecanismo de hidroxilação aromática mediada
pela CYP e os efeitos dos substituintes na reatividade, empregando cálculos teóricos
de modelo in silico, Bathelt e colaboradores (2004) verificaram que a reação de
hidroxilação em meta é mais favorável devido a influência eletrônica do nitro, um
grupo retirador de elétrons (BATHELT et al., 2004). Outra possibilidade de mono-
hidroxilação é no carbono-3 da insaturação do sistema carbonila, pois é um grupo
bastante eletrofílico e pouco impedido estericamente para reação enzimática. A
desmetilação provável seria na metoxila ligada ao carbono na posição 4’ do anel A,
tendo em vista que nessa posição está a metoxila menos impedida estericamente
para atuação da enzima (CAREY; SUNDBERG, 2007; SOLOMONS; FRYHLE,
2012).
Ao fazer uma busca na base de dados do SciFinder® a fim de verificar
registros de chalcona mono-hidroxilada em uma das quatro posições de carbonos
(C-2;4.5;6) disponíveis no anel B e no carbono-3 insaturado do sistema carbonila,
não foi encontrado nenhuma chalcona com tais estruturas químicas propostas. E o
mesmo foi feito para avaliar as chalconas desmetiladas em um dos grupos metoxilas
(C-4’ e 6’) do anel A, sendo encontrado apenas a chalcona desmetilada na posição
para (Figura 22). De acordo com dados da literatura esse derivado sintético de
chalcona é descrito como um agente anticâncer (ZHANG et al., 2015).
Figura 22- Estrutura química de provável chalcona para-desmetilado.
67
6. CONCLUSÃO
O presente trabalho apresentou o desenvolvimento e validação de um método
analítico empregando o CLAE-DAD. A separação cromatográfica empregou uma
coluna analítica empacotada com partículas superficialmente porosas que forneceu
elevada eficiência de separação (> 11000 pratos teóricos) e tempo de análise (7
min).
Por sua vez, a extração líquido-líquido empregada no preparo das amostras,
usando como solvente extrator éter metil terc-butílico, forneceu recuperação da
chalcona CH8 de 90% livre de interferentes. Além disso, este método é o primeiro
método desenvolvido e validado para determinação da chalcona CH8 em meio
contendo matriz biológica.
O método bioanalítico foi validado e atendeu as exigências do guia de
validação bioanalítica adotado. Após a validação o método foi aplicado na
determinação da chalcona CH8 e dos seus metabólitos em meio de incubação
microssomal.
As condições de incubação empregadas no estudo de metabolismo in vitro
com microssomas hepáticos de rato da chalcona CH8, 1mg/mL de proteínas
microssomais e tempo de incubação de 90 minutos, possibilitaram a formação e
identificação de dois prováveis metabólitos. Estes metabólitos, denominados de M1
e M2, indicam tratar-se de um derivado desmetilado e mono-hidroxilado,
respectivamente. A identificação preliminar foi realizada com o auxílio da técnica
CLAE acoplada a um espectrômetro de massas com fonte de ionização eletrospray
e analisador de tempo de voo. No entanto, a técnica não permitiu a elucidação
estrutural dos metabólitos. Para esta finalidade deverão ser realizadas análises com
outros analisadores ou mesmo pela cromatografia líquida acoplada a RMN.
A identificação dos metabólitos de um candidato a fármaco constitui-se em
etapa importante do estudo da farmacocinética de uma nova substância. Permitindo
a avaliação da atividade biológica e toxidez dos metabólitos contribuindo com a
avaliação da segurança da substância candidata a fármaco.
68
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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