Universidad de Colima Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias Septiembre del 2006 Tecomán, Colima, México PATOGENICIDAD, VARIABILIDAD MORFOLÓGICA Y GENÉTICA DE Colletotrichum acutatum SIMMONDS DE CÍTRICOS EN MÉXICO DOCTORADO EN BIOTECNOLOGÍA MICROBIANA PRESENTA: MARIO OROZCO SANTOS TESIS QUE PRESENTA PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTOR EN BIOTECNOLOGÍA MICROBIANA ASESORES SALVADOR GUZMÁN GONZÁLEZ LAVERN W. TIMMER
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Universidad de ColimaFacultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias
Septiembre del 2006Tecomán, Colima, México
PATOGENICIDAD, VARIABILIDAD MORFOLÓGICA Y GENÉTICA DE Colletotrichum acutatum SIMMONDS DE
CÍTRICOS EN MÉXICO
DOCTORADO EN BIOTECNOLOGÍA MICROBIANA
PRESENTA:
MARIO OROZCO SANTOS
TESIS
QUE PRESENTA PARA OBTENER EL GRADO DEDOCTOR EN BIOTECNOLOGÍA MICROBIANA
ASESORES
SALVADOR GUZMÁN GONZÁLEZLAVERN W. TIMMER
Universidad de ColimaFacultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias
Septiembre del 2006Tecomán, Colima, México
PATOGENICIDAD, VARIABILIDAD MORFOLÓGICA Y GENÉTICA DE Colletotrichum acutatum SIMMONDS DE
CÍTRICOS EN MÉXICO
DOCTORADO EN BIOTECNOLOGÍA MICROBIANA
REVISORES
TESIS
DR. ELPIDIO PEÑA BELTRÁNDR. ROBERTO LEZAMA GUTIÉRREZ
DR. OSCAR REBOLLEDO DOMÍNGUEZDR. JUAN PABLO MARTÍNEZ SORIANO
DR. JOSÉ JOAQUIN VELAZQUEZ MONREAL
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CONTENIDO
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CUADROS Y FIGURAS .........................................................................................................
3.2.5. Pruebas de patogenicidad.......................................................................................
3.3. Caracterización morfológica de aislamientos de Colletotrichum spp............................
3.4. Caracterización genética de Colletotrichum spp...........................................................
3.4.1. Aislamientos de Colletotrichum spp. ..................................................................
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3.4.2. Reproducción de micelio.......................................................................................
3.4.3. Extracción del DNA.............................................................................................
3.4.4. Reacciones de PCR-RAPDs.................................................................................
3.4.5. Visualización de los productos.............................................................................
3.4.6. Análisis de patrones RAPDs.................................................................................
IV. RESULTADOS..................................................................................................................
4.1. Patogenicidad de Colletotrichum acutatum y C. gloeosporioides.................................
4.2. Caracterización morfológica de aislamientos de Colletotrichum spp...........................
4.2.1. Características en medio de cultivo papa-dextrosa-agar.......................................
4.2.2. Características de conidias y apresorios de aislamientos de Colletotrichum spp..
4.2.3. Crecimiento en medio de cultivo papa-dextrosa-agar...........................................
4.3. Caracterización genética de Colletotrichum spp...........................................................
4.3.1. Análisis genético de Colletotrichum spp en cítricos.............................................
4.3.2. Análisis genético de la raza KLA y PFD de Colletotrichum acutatum.................
4.3.3. Análisis genético de la raza KLA de Colletotrichum acutatum............................
V. DISCUSIÓN........................................................................................................................
5.1. Patogenicidad de Colletotrichum acutatum y C. gloeosporioides.................................
5.2. Caracterización morfológica de aislamientos de Colletotrichum spp............................
5.3. Caracterización genética de Colletotrichum spp...........................................................
VI. CONCLUSIONES..............................................................................................................
VII. LITERATURA CONSULTADA.......................................................................................
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CUADROS Y FIGURAS
Cuadro Página 1 2 3 4 5 6
Figuras 1 2 3 4 5
Relación de aislamientos de Colletotrichum spp colectados en tres especies de cítricos en regiones productoras de México............................................................ Secuencia de los inicadores decámeros RAPDs utilizados para la amplificación de segmentos de ADN del hongo Colletotrichum spp afectando cítricos en México . ............................................................ ..................................................... Patogenicidad de aislamientos de Colletotrichum spp de diferente origen geográfico en México, sobre flores de tres especies de cítricos ............................. Características morfológicas en medio de cultivo papa-dextrosa-agar de aislamientos de Colletotrichum spp de diferentes regiones citrícolas de México... Características morfológicas en medio de cultivo papa-dextrosa-agar de aislamientos de Colletotrichum spp colectados en cítricos en México................... Crecimiento en medio de cultivo papa dextrosa agar de aislamientos de Colletotrichum spp colectados en cítricos de diferente origen geográfico en México.................................................................................................................... Características de las colonias desarrolladas en medio de cultivo papa-dextrosa-agar de aislamientos de las razas PFD y KLA de Colletotrichum acutatum y el aislamiento de C. gloeosporioides. Las colonias son originadas de una espora de cada raza. Colonias de 14 días de edad a 27 °C...................................................... Conidios de las razas KLA y PFD de C. acutatum, y de C. gloeosporioides (C.g.), causantes de antracnosis del limón mexicano, caída de fruto pequeño y antracnosis de frutos en postcosecha, respectivamente........................................... Apresorios de las razas KLA y PFD de C. acutatum, y de C. gloeosporioides (C.g.), causantes de antracnosis del limón mexicano, caída de fruto pequeño y antracnosis de frutos en postcosecha, respectivamente.......................................... Patrón de bandas resultante del análisis genético con marcadores RAPDs de seis aislamientos del hongo Colletotrichum acutatum aislado de limón mexicano, naranja Valencia y limón Persa y un aislamiento de C. gloeosporioides (C.g.) aislado como saprofito de limón mexicano............................................................. Dendrograma derivado del análisis de agrupamiento UPMGA generado por los patrones de bandeo de marcadores RAPDs con 6 aislamientos de Colletotrichum acutatum aislado de tres hospederos de cítricos (limón mexicano, naranja
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RESUMEN
Los cítricos son afectados por el hongo Colletotrichum spp, causante del complejo de antracnosis:
del limón mexicano, caída de fruto pequeño y de frutos en postcosecha. La identificación de
especies de Colletotrichum se ha basado principalmente en sus características morfológicas,
especialización del hospedero y modo de parasitismo. La aplicación de marcadores moleculares a la
taxonomía de hongos ha clarificado relaciones entre muchas especies. Los objetivos del presente
trabajo fueron: 1) Evaluar la patogenicidad de diferentes aislamientos de Colletotrichum acutatum
colectados en México sobre tres especies citrícolas: limón mexicano, limón Persa y naranja
Valencia, y 2) Caracterizar morfológica y genéticamente las poblaciones de C. acutatum en cítricos
procedentes de las regiones productoras de la costa del Océano Pacífico y Golfo de México. Se
utilizaron aislamientos de Colletotrichum acutatum (KLA) obtenidos de hojas o flores afectadas de
limón mexicano (Citrus aurantifolia) en ocho estados productores: Colima, Michoacán, Jalisco,
Nayarit, Guerrero, Oaxaca, Tamaulipas y Veracruz. Asimismo, se colectaron aislamientos de C.
acutatum (PFD) de flores afectadas de limón Persa (C. latifolia) y naranjo Valencia (C. sinensis) en
Veracruz, Tabasco y Tamaulipas. Además, se colectó un aislamiento de C. gloeosporiodes de
ramillas muertas de limón mexicano. Los aislamientos fueron analizados genéticamente mediante la
técnica RAPDs (DNA Polimórfico Amplificado al Azar). En medio de cultivo papa dextrosa agar
(PDA), todos los aislamientos de la raza KLA produjeron colonias de color blanco grisáceo de lento
crecimiento, mientras que la raza PFD presentó colonias de color naranja de lento crecimiento. El
hongo C. gloeosporioides registró colonias de color gris de rápido crecimiento. La raza KLA fue
patogénica a flores de limón mexicano, limón persa y naranja Valencia, en cambio la raza PFD
infectó solo a limón persa y naranja Valencia. El aislamiento de C. gloeosporioides no fue
patogénico a flores de las tres especies citrícolas. El perfil de bandas de DNA en los aislamientos de
la raza KLA fueron casi similares entre ellos y diferentes al perfil de bandas en los aislamientos de
la raza PFD de naranja Valencia y limón Persa. El aislamiento de C. gloeosporioides presentó un
patrón de bandas muy diferente a los registrados por KLA y PFD. El análisis de agrupamiento
generó dos grupos: uno formado por C. gloeosporioides y otro por C. acutatum. El grupo de C.
acutatum se integró por dos subgrupos; uno correspondiente a los aislamientos de la raza KLA y el
otro a la raza PFD. El análisis filogenético de los aislamientos de la raza KLA colectados en
diferentes entidades citrícolas de México registraron una reducida variabilidad genética.
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ABSTRACT
The fungi Colletotrichum spp affects the citrus crop, causing the anthracnose complex: of key lime,
postbloom fruit drop and of postharvest fruit. The identification of species of Colletotrichum has
been based mainly using morphological characteristics, specialization of the host and mode of
parasitism. Application of molecular markers to fungal taxonomy has clarified relationships among
many fungi species. The objectives of the present work were: 1) evaluate the pathogenicity of
different isolations of Colletotrichum acutatum collected in citrus growing regions of Gulf of
Mexico and Pacific Ocean. The pathogeniciy was evaluated on three citrus species: Mexican lime,
Persian lime and Valencia orange, and 2) characterize morphological and genetically the populations
of C. acutatum in citrus from the citrus growing regions of the coast of the Pacific Ocean and Gulf
of Mexico. Isolations of C. acutatum (KLA) were obtained from affected tissues (leaves or flowers)
of Mexican lime (Citrus aurantifolia) in eight citrus-growing states of Mexico: Colima, Michoacan,
Jalisco, Nayarit, Guerrero, Oaxaca, Tamaulipas and Veracruz. Isolates of C. acutatum (PFD) were
obtained from affected flowers of Persian lime (C. latifolia) and Valencia orange (C. sinensis) in
Veracruz, Tabasco and Tamaulipas. One more isolate of C. gloeosporioides from dead shoots of
Mexican lime was obtained. The isolates were genetically analyzed by RAPD (Random Amplified
Polimorphic DNA). In cultures medium on potato dextrosa agar (PDA), all the isolations of the race
KLA produced colonies white grayish of slow growth, while the race PFD presented colonies
orange of slow growth. The fungi C. gloeosporioides registered colonies of gray color of fast
growth. The race KLA was pathogenic to flowers of Mexican lime, Persian lime and Valencia
orange, while the race PFD only infected Persian lime and Valencia orange. The isolation of C.
gloeosporioides was not pathogenic to flowers of the three citrus species. The profile of DNA bands
with the isolations of the race KLA was almost similar among them and different to the profile of
bands with the isolations of the race PFD. The isolation of C. gloeosporioides presented a pattern of
bands very different to the registered for KLA and PFD. The cluster analysis generated two groups:
one formed by C. gloeosporioides and another for C. acutatum. The group of C. acutatum was
integrated for two subgroups; one corresponding to the isolations of the race KLA and the other to
the race PFD. The phylogenetic analysis of the isolations of the race KLA collected in different
citrus growing states of Mexico registered a reduced genetic variability.
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I INTRODUCCION
Las plantas están expuestas al ataque de diversos patógenos que ocasionan enfermedades. La
clase de organismos que afectan a los vegetales es muy diversa e incluye virus, fitoplasmas,
bacterias, hongos, nematodos, protozoarios y plantas parásitas (Baker et al. 1997; Dangl y Jones,
2001). Las enfermedades causadas por hongos patógenos, representan uno de los factores limitantes
para la producción de los cultivos (Trigriano et al. 2004), muchas de las cuales son causadas por el
género Colletotrichum, el cual posee numerosas especies de importancia económica en regiones
agrícolas de clima tropical, subtropical y templado (Jeffries et al. 1990; Bailey y Jeger, 1992;
Freeman et al. 1998; Peres et al. 2005). Una de las especies más patogénicas de este género es
Colletotrichum acutatum J.H. Simmonds, la cual causa antracnosis en cultivos como almendra,
aguacate, durazno, zarzamora, mango, pasiflora, olivo, fresa y cítricos (Freeman et al. 1998;
Wharton et al. 2004; Peres et al. 2005).
En el caso de los cítricos, el hongo Colletotrichum spp causa las enfermedades conocidas
como antracnosis (Jeffries et al. 1990; Timmer et al. 1994). Este grupo de enfermedades lo
constituyen la caída de fruto pequeño (citrus postbloom fruit drop), antracnosis del limón mexicano
y antracnosis en postcosecha (Timmer et al. 1994). En el pasado, la causa de la caída de fruto
pequeño fue atribuída a un aislamiento del hongo C. gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc. in Penz.
que produce una colonia de color naranja de lento crecimiento en medio de cultivo (Agostini et al.
1992; Sonoda y Pelosi, 1988). En el caso de la antracnosis del limón mexicano, inicialmente se
atribuyó al hongo Gloeosporium limetticola Clausen y posteriormente fue asociada a una raza de C.
gloeosporioides (Sutton, 1980). Actualmente, se conoce que la raza de color naranja de lento
crecimiento (PFD) y la raza que produce antracnosis del limón mexicano (KLA) corresponden al
hongo C. acutatum (Brown et al. 1996) y que el hongo que produce la antracnosis de postcosecha
corresponde a C. gloeosporioides (Agostini et al. 1992). Asimismo, se sugirió que los aislamientos
de limón mexicano y caída de fruto pequeño tienen un ancestro común (Brown et al. 1996), lo cual
fue descartado en estudios recientes (Perez et al. 2003).
Inicialmente se consideró que la raza KLA que afectaba únicamente al limón mexicano.
Ahora, se conoce que también puede infectar a otras especies, como es el caso de naranja (C.
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sinensis (L) Osbeck) y limón persa (C. latifolia Tan), en las cuales ocasiona necrosis de flores y
caída de fruto pequeño. Otros cítricos, como la toronja puede ser atacada por este hongo (Agostini et
al. 1992; Timmer et al. 1994). La raza PFD de C. acutatum puede ocasionar caída de fruto pequeño
en naranja, limón persa y toronja, mientra que C. gloeosporioides produce antracnosis de frutos en
postcosecha (Timmer et al. 1994).
La raza KLA que produce la antracnosis del limón mexicano está ampliamente diseminada
en las regiones con clima trópical seco, es altamente patogénica y tiene períodos cortos de
incubación, provocando graves pérdidas año con año, las cuales se estiman hasta un 40-50% de la
producción de invierno (Garza y Medina, 1984) y su control depende de numerosas aplicaciones de
fungicidas (8 a 12 aspersiones) durante la época de lluvias, representando un riesgo de resistencia
del hongo a los fungicidas de acción sistémica.
Además, la raza KLA tiene la habilidad de infectar a un mayor número de tejidos vegetales
en comparación a la raza PFD, ya que la primera es capaz de causar síntomas en brotes, hojas, flores
y frutos en su hospedante principal, mientras que la raza PFD es patogénica únicamente a flores.
Asimismo, existen marcadas diferencias en patogenicidad a especies citrícolas y diferencias en
características culturales de las colonias. En la costa del Océano Pacífico, bajo condiciones de
campo se ha observado que la raza KLA de C. acutatum afecta solo a limón mexicano y no se han
observado síntomas en limón Persa y toronja. En cambio los aislamientos de limón mexicano de
Florida pueden afectar a limón Persa y naranjas (Agostini et al. 1992).
Existen pocos estudios comparativos en morfología, patogenicidad y genética de poblaciones
del hongo C. acutatum en cítricos. Agostini et al. (1992) estudiaron caracteristicas morfologicas y
patogénicas de algunos aislamientos de las razas KLA y PFD de C. acutatum y de C.
gloeosporioides. Ellos describieron información morfológica sobre conidios (área, perímetro y
forma), apresorios (longitud y ancho) y setas (presentes en medio de cultivo y tejido hospedante), así
como el efecto de la temperatura sobre el desarrollo de las colonias y la patogenicidad de
aislamientos sobre tres especies de cítricos. Sin embargo, únicamente trabajaron con cinco
aislamientos de la raza KLA y no incluyeron estudios genéticos. Además, las características de las
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colonias fueron descritas con pocos parámetros. Por otra parte, se han reportado algunos avances
preliminares en genética de poblaciones entre las razas KLA y PFD (Peres et al. 2003).
En México, la raza PFD es epidémica en naranja, toronja y limón Persa en la región trópico
húmeda de los estados de Veracruz y Tabasco, en cambio la raza KLA es importante en limón
mexicano en las áreas de trópico seco en Jalisco, Colima, Michoacán, Guerrero y Oaxaca. En base a
la información presentada, son evidentes las diferencias en patogenicidad y morfología entre ambas
razas, lo que hace suponer una constitución genética diferente. Sin embargo, hasta el momento no
existen estudios que asocien estos parámetros con la estructura genética de las poblaciones de las
razas KLA y PFD de C. acutatum. Los estudios de variabilidad genética en poblaciones de C.
acutatum permitiran inferir aspectos sobre su biología (tipo de reproducción), capacidad evolutiva y
puede ser un indicativo de la coevolución con su hospedante. Asimismo, puede ayudar a predecir los
riesgos de resistencia a fungicidas y a explicar las diferencias en patogenicida y características
morfológicas entre las dos razas y las dos especies de hongos.
Con base a lo anterior se plantea la hipotesis de que existe variación morfológica, patogénica
y genética entre las poblaciones de las razas KLA y PFD del hongo C. acutatum procedentes de la
región productora de limón mexicano de la costa del Océano Pacífico y la región productora de
naranja y limón Persa de la costa del Golfo de México.
Para dar respuesta a la hipotesis propuesta se plantearon los objetivos siguientes:
1. Evaluar la patogenicidad de aislamientos de la raza KLA y PFD del hongo C. acutatum
colectados en cítricos de los estados productores del Golfo de México y Océano Pacífico, sobre
tres especies citrícolas: limón mexicano, limón Persa y naranja Valencia.
2. Caracterizar morfológicamente las poblaciones de la raza KLA y PFD de C. acutatum en cítricos
procedentes de las regiones citrícolas de la costa del Océano Pacífico y Golfo de México.
3. Determinar la variabilidad genética de poblaciones de la raza KLA y PFD de C. acutatum
procedentes de las regiones citrícolas de la costa del Océano Pacífico y Golfo de México
mediante la técnica RAPDs (ADN Polimórfico Amplificado al Azar).
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II REVISIÓN DE LITERATURA
2.1 Importancia de los cítricos en México
México ocupa el sexto lugar como productor de cítricos en el ámbito mundial con una
superficie cultivada de aproximadamente 490,000 hectáreas y un volumen de producción de 4.98
millones de toneladas de fruta. La naranja es la especie citrícola más importante con 73 % de la
superficie cultivada a escala nacional, seguida por los limones (limón mexicano, persa y verdadero)
con 26 % y la mandarina y toronja con 1.5 y 1.4 %, respectivamente. Las principales regiones
citrícolas de México se localizan en el noreste del país, costas del Golfo de México, península de
Yucatán y en la vertiente del Pacífico en la planicie costera del noroeste (Sonora) y en las costas de
Jalisco, Colima, Michoacán, Guerrero y Oaxaca, así como en el Valle de Apatzingán, Mich.
(SAGARPA, 2004).
En el caso de limón mexicano [Citrus aurantifolia Christm. (Swingle)], México es el primer
productor en el mundo. Para el año 2004 se registró una superficie de 95,511 hectáreas con una
producción cercana a las 1.25 millones de toneladas anuales y un valor de la producción de 2,053
millones de pesos (SAGARPA. 2004). Las principales áreas productoras de limón mexicano se
localizan en la región costera de los estados de Jalisco, Colima, Michoacán, Guerrero y Oaxaca. Este
cítrico se adapta ampliamente a las áreas que presentan características de clima tropical seco, en
donde predomina un amplio período de secas (7 a 8 meses) y una época lluviosa corta (4 a 5 meses).
La precipitación ocurre principalmente en el verano y fluctúa entre 700 a 1,200 mm anuales,
temperatura media anual de 26 a 28 ºC y de 0 a 400 metros sobre el nivel del mar. La agroindustria
del limón mexicano es una fuente valiosa de riqueza para los estados dedicados a su cultivo, ya que
alrededor de ella existe una importante infraestructura en empaques, plantas industrializadoras,
empresas de servicios e insumos y talleres de armado de cajas para el empaque de fruta (Medina et
al. 2001). Existen aproximadamente 9,700 productores en el ámbito nacional y se estima que genera
18 millones de jornales/año, dando empleos para más de 25 mil familias en la atención a huertos,
empaques, industrias y en la comercialización de la fruta fresca (Conalim, 2006).
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2.2 Colletotrichum spp
2.2.1 Importancia
Colletotrichum es un género importante de hongos que está conformado por 39 especies
(Sutton, 1992) que causan antracnosis o tizones en una amplia gama de cultivos agrícolas y plantas
ornamentales (Bailey y Jeger, 1992; Latunde-Dada, 2001). Estas enfermedades se encuentran
distribuídas a escala mundial y ocasionan pérdidas económicas en pre y postcosecha en regiones
tropicales, subtropicales y de clima templado (Jeffries et al. 1990; Bailey y Jeger, 1992; Dodd et al.
1992; Freeman et al. 1998; Latunde-Dada, 2001; Wharton y Diéguez-Uribeondo, 2004; Peres et al.
2005). Sus hospedantes incluyen una gran diversidad de cultivos anuales como leguminosas (fríjol,
soya, chícharo y leguminosas forrajeras) (Lenné, 1992), gramíneas (maíz y sorgo) (Nicholson, 1992;
Casela y Frederiksen, 1993; Bergstrom y Nicholson, 1999), solanáceas (tomate, chile y papa)
(Dillard, 1992), cucurbitáceas (melón, sandía y pepino) (Sitterly y Keinath, 1996) y rosáceas (Fresa)
(Freeman et al. 1998; Denoyes-Rothan et al. 2005). Asimismo, diversas especies de Colletotrichum
se han reportado afectando un gran número de cultivos perennes como aguacate, plátano, cítricos,
Marabasco, Manzanillo, Colima Caleras, Tecomàn, Colima Santiago, Manzanillo, Colima Tecomán, Tecomàn, Colima Madrid, Tecomàn, Colima Armería, Armería, Colima La Caja, Comala, Colima Ixtlahuacán, Ixtlahuacán, Colima Cerro de Ortega, Tecomàn, Colima Los Asmoles, Colima, Colima Loma de Juárez, Colima, Colima El Naranjo, Manzanillo, Colima El Tizate, Santiago Ixcuintla, Nayarit Miguel Hidalgo, La Huerta, Jalisco Cihuatlán, Cihuatlán, Jalisco Miguel Hidalgo, La Huerta, Jalisco San Vicente, Coahuayana, Michoacán San Vicente, Coahuayana, Michoacán El Ranchito, Coahuayana, Michoacán Apatzingán, Apatzingán, Michoacán Apatzingán, Apatzingán, Michoacán Las Vigas, San Marcos, Guerrero B. del Ejido, Coyuca de Benítez, Guerrero Localidad del 30, Acapulco, Guerrero Valle del Río, Coyuca de Benítez, Guerrero Valle del Río, Coyuca de Benítez, Guerrero Las Vigas, San Marcos, Guerrero San Juan del Progreso, Oaxaca San Juan del Progreso, Oaxaca Campo Experimental, Oaxaca Tuxtepec, Tuxtepec, Oaxaca Campo Experimental Güemez, Tamaulipas Campo Experimental Güemez, Tamaulipas Campo Experimental Güemez, Tamaulipas Llera, Tamaulipas Campo Experimental Güemez, Tamaulipas Campo Experimental Güemez, Tamaulipas Campo Experimental Güemez, Tamaulipas Martínez de la Torre, Veracruz
Huimanguillo, Tabasco Huimanguillo, Tabasco Huimanguillo, Tabasco Huimanguillo, Tabasco Martínez de la Torre, Veracruz Padilla, Tamaulipas Cd. Victoria, Tamaulipas Martínez de la Torre, Veracruz Martínez de la Torre, Veracruz Martínez de la Torre, Veracruz
El inóculo de cada aislamiento se aplicó con una botella atomizadora de 0.5 l de capacidad y
posteriormente fueron cubiertas con bolsas de plástico (cámara húmeda) durante 48 horas y se
asperjó agua destilada estéril a las flores de manera constante con el fin de conservar humeda su
superficie (Brown et al. 1996). Las plantas fueron mantenidas los primeros tres días a una
temperatura de 27 °C 4 y posteriormente se llevaron a una casa de malla a temperatura ambiente
(19 a 33 °C) (Agostini et al. 1992).
Para cada aislamiento del hongo se utilizaron tres plantas de cada especie citrìcola. Debido a
que la floración no fue uniforme en todas las especies, las inoculaciones se realizaron en las plantas
que presentaban racimos con las primeras flores abiertas. En cada ensayo, se incluyeron plantas
testigo asperjadas únicamente con agua destilada. A los 7-10 días después de la inoculación, para
cada aislamiento del hongo se determinó el porcentaje de flores enfermas mostrando los síntomas
característicos de caída de fruto pequeño en naranja Valencia y limón Persa, así como síntomas de
antracnosis en limón mexicano.
3.3 Caracterización morfológica de aislamientos de Colletotrichum spp
La caracterizaron de los diferentes aislamientos del hongo Colletotrichum spp se basó en el
aspecto de la colonia, comportamiento en medio del cultivo, morfología de los conidios y de los
apresorios. Se usaron 39 aislamientos de la raza KLA de C. acutatum colectado en diferentes
estados productores de México. Asimismo, se incluyeron siete aislamientos de la raza PFD de C.
acutaum de naranja Valencia y otros tres aislamientos PFD de limón Persa. Cuatro aislamientos
atípicos colectados en naranja Valencia y limón Persa y un aislamiento de C. gloeosporioides fueron
incluídos (Cuadro 1). De cada aislamiento se obtuvo un cultivo monospórico y se incubó a 27 °C ±1
en la oscuridad durante 10 días. Se tomaron características generales de la colonia (color, micelio
aéreo, plano, denso o escaso), color del micelio y crecimiento a través del tiempo. De cada
aislamiento del hongo se tomaron imágenes fotográficas.
Con el propósito de determinar el crecimiento de Colletotrichum spp a través del tiempo, de
cada aislamiento se obtuvieron colonias monósporicas en medio de cultivo papa-dextrosa-agar que
fueron incubadas a 27 °C ±1 en la obscuridad. Para cada aislamiento, se utilizó una caja de petri
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como unidad experimental en un diseño de bloques al azar con tres repeticiones. A los 3, 6 y 9 días
se tomaron lecturas del diámetro polar y acuatorial de las colonias para posteriormente determinar su
área total (Agostini et al. 1992). El análisis estadístico se realizó mediante el ANOVA y para la
comparación de medias se utilizó la prueba de Tukey al 95% de probabilidad.
Para evaluar las características de conidios y apresorios, se extrajo una suspensión conidial
(1 ml) de cada aislamiento desarrollado en medio líquido jugo V8 (3.6 g de carbonato de calcio más
165 ml de jugo V8 y aforado a un litro) a los 10 días de incubación en la oscuridad, temperatura de
27 °C ±1 y agitación continua a 125 rpm. La suspensión conidial fue centrifugada a 3,000 rpm
durante dos min y lavada en tres ocasiones con agua destilada estéril para eliminar el mucílago
adherido a los conidios. Para la inducir la formación de apresorios se utilizó la metodología de
Manandhar et al. (1995). De cada aislamiento se utilizó una concentración de 5 x 105 conidios/ml,
depositando tres gotas de 10 l en un portaobjeto de cristal. Las gotas de la suspensión conidial se
dejaron secar en una campana de flujo laminar y fueron incubadas en toallas húmedas y en la
oscuridad durante 48 horas a 23 °C ±1. Después de las 48 horas se tiño con lactofenol teñido con
fuchina básica y se evaluó la forma de los apresorios con un microscopio óptico con el objetivo
40X. En otro portaobjeto de cristal se colocaron tres gotas de 10 l y posteriormente fueron tratadas
con lactofenol y observadas al microscopio con el objetivo 40X para evaluar las siguientes
características (100 conidios/gota): conidios con ambos ápices redondeados y conidios con un ápice
redondeado y el otro fusiforme (Agostini et al. 1992).
3.4 Caracterización genética de Colletotrichum spp.
Los aislamientos del hongo Colletotrichum colectados en los diferentes estados productores
de cítricos en México fueron caracterizados genéticamente mediante la técnica RAPDs (Williams et
al. 1990; Winter y Kahl, 1995).
3.4.1 Aislamientos de Colletotrichum spp
Se utilizaron aislamientos de limón mexicano, limón Persa y naranja Valencia colectados en
diferentes entidades productoras de cítricos en México (Colima, Jalisco, Michoacán, Nayarit,
Tamaulipas, Guerrero, Oaxaca, Veracruz y Tabasco). Todos los aislamientos fueron obtenidos de
42
una espora individual según la metodología de Manandhar et al. (1995), la cual se describió
previamente.
3.4.2 Reproducción de micelio
El micelio de Colletotrichum spp fue reproducido según la metodología empleada por
González et al. (1998). Se utilizaron las muestras de los aislamientos conservados en glicerol al 15%
a – 80 °C 1. Los tubos con los aislamientos fueron descongelados a temperatura de laboratorio y
con una micropipeta se extrajeron 10 microlitros de cada uno de ellos, los cuales fueron depositados
en el centro de una caja de petri con medio de cultivo papa-dextrosa-agar y posteriormente
incubados a 27 °C 1. A los cinco días de desarrollo de la colonia, con un sacabocado se extrajo un
disco de 0.7 mm conteniendo micelio y medio de cultivo que fue llevado a 55 ml de una suspensión
con medió de cultivo líquido Papa Dextrosa (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) en matraces
Erlenmeyer de 250 ml de capacidad. El medio líquido se preparó utilizando 30 g de Papa Dextrosa
en un litro de agua bidestilada y esterilizado a 15 atmósferas de presión durante 15 min. Los
matraces con el medio líquido y la colonia del aislamiento se colocaron en un agitador a 125 rpm a
27 °C 1 en la oscuridad durante 15 días. Después de este tiempo, el micelio con el medio líquido
fue depositado en tubos para centrifuga y precipitado a 3,000 rpm. El sobrenadante fue desechado y
el micelio fue lavado con agua bidestilada y precipitado nuevamente. El micelio fue depositado en
frascos de cristal y posteriormente liofilizado durante 96 horas a –49 °C 1 y 47 x 10-3 mbares de
vacío con una liofilizadora digital (Lyph-Lock, Labconco, Inc). El micelio liofilizado fue
conservado a – 80 °C 1 hasta utilizarlo para la extracción de ADN.
3.4.3 Extracción del ADN
Se tomaron 100 g de micelio seco de cada uno de los aislamientos del hongo
Colletotrichum spp para la extracción del ADN, basado en el método descrito por Raeder y Broda,
(1985) y Weising y Kahl et al. (1997). El micelio liofilizado fue molido en presencia de nitrógeno
líquido con un mortero estéril hasta la obtención de un polvo fino. El polvo del micelio se transfirió
a un tubo Eppendorf estéril de 2 ml de capacidad que contenía 1 ml de una solución amortiguadora
de extracción (200 mM Tris-HCl pH 8.0, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, PVP 1% y 0.5% de sulfato
dodecyl de sodio) más 15 l de mercanoeptanol. La mezcla fue agitada vigorosamente e incubada
a baño María (65 °C) durante 30 min y con agitaciones constantes. Después de la incubación, se le
43
agregó un volumen igual de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (25:24:1), se agitó y la mezcla fue
centrifugada a 12,000 g durante 20 min a 4 °C. Se extrajo el sobrenadante y a éste se le agregó un
volumen igual de cloroformo, se agitó suavemente y posteriormente fue centrifugado a 12,000 g por
10 min a 4 °C para separar las fases. El sobrenadante fue desechado, se precipitó con 0.6 vol de
isopropanol y se agitó suavemente. Para ayudar a la precipitación de ADN, a la fase acuosa
colectada se le agregó 0.1 vol de acetato de Sodio 3.0 M, pH 5.2. Los tubos fueron centrifugados a
4,000 g por 2 min a temperatura de laboratorio para la formación de la pastilla de ADN. La pastilla
fue lavada con Etanol al 70% (500 l), se precipitó y el sobrenadante se deshechó. Posteriormente,
fue secada al vacío durante 11 min en un equipo de secado (HetoDry Gel, Heto Lab Equipment).
Las pastillas de ADN se hidrataron con 200 l de agua destilada estéril y se resuspendieron a 45 °C
durante 15 min. Se agregaron 2 l de Rnasa en una concentración de 10 mg/ml para eliminar
posibles residuos contaminantes de ARN. La mezcla resultante fue incubada por una hora a 37 °C,
se agregó un volumen de fenol, se llevó a centrifugación a 12 000 g por 20 min a 4 °C y fue extraído
el sobrenadante. Se precipitó con dos volúmenes de etanol y 0.1 volumen de acetato de sodio.
Finalmente se peletizó a 4,000 g por 2 min, fue lavado tres veces con etanol al 70%, se secó al vacío
y finalmente fue resuspendido con 50 l de TE (Tris.EDTA).
3.4.4 Reacciones de PCR-RAPDs
Las reacciones de amplificación fueron realizadas en un Termociclador programable (Robo
cycler gradient 40, Stratagene) en el Laboratorio de Biotecnología de la FCBA. Cada mezcla de
reacción se realizó en un volumen final de 25 l conteniendo 50 ng de ADN templado, 2.5 mM
MgCl2, 1X de amortiguador de reacción para PCR, 200 M dNTP´s (Gibco BRL, Gaithersburg,
MD), 0.5 M de cada uno de los iniciadores y 0.5 U de Taq DNA polimerasa (Gibco BRL,
Gaithersburg, MD) y dos gotas de aceite mineral (Sigma BioScience, St. Louis, MO) para evitar la
evaporación de la mezcla de reacción (Sambrook et al. 1989). Para el análisis de Colletotrichum spp
se utilizaron seis combinaciones de pares de iniciadores decámeros al azar con 60-70% de CG
(Cuadro 2); estas fueron: A que consistió en la combinación M04/M07; B, M04/H06; C, M04/A01;
D, M04/P13; E, A01/M07; F, P13/M07. En el caso de las dos razas de C. acutatum (KLA y SGO) y
la especie de C. gloeosporioides se utilizaron cinco combinaciones de pares de iniciadores para la
amplificación de segmentos de su ADN: A, B, C, D, y E. Por otra parte, para el análisis de los
aislamientos del hongo C. acutatum (raza SGO y KLA) colectado en diferentes entidades
44
productoras de México se usaron los siguientes combinaciones: B y F. Finalmente, los aislamientos
de la raza KLA de C. acutatum fueron también analizados con las combinaciones de iniciadores B y
F. P13/M07 y M04/H06. La secuencia de cada iniciador se presenta en el Cuadro 2. Las condiciones
de PCR consistieron en la desnaturalización inicial de 94 °C por 3 min, seguido por una
amplificación exponencial de 40 ciclos de 1 minuto a 94 °C (desnaturalización), 2 min a 35 °C
(acople), 1 minuto a 72 °C (extensión) y un ciclo final de amplificación de 1 min a 72°C. Esta
reacción fue utilizada con cada juego de iniciadores y para cada muestra de ADN correspondiente a
los aislamientos del hongo (Arnheim y Erlich, 1992; Williams et al. 1990; Winter y Kahl, 1995;
Rosewich y McDonald, 1994).
Cuadro 2. Secuencia de los iniciadores decámeros RAPDs utilizados para la amplificación de segmentos de ADN del hongo Colletotrichum spp afectando cítricos en México.
Codigo del inicador Secuencia
A01
H06
M04
M07
P13
5’- CAGGCCCTTC –3’
5’- ACGCATCGCA –3’
5’- GGCGGTTGTC –3’
5’- CCGTGACTCA –3’
5’- GGAGTGCCTC –3’
Fuente: Gene LinkTM. 140 Old Saw Mill River Road, Hawthorne, NY 10532, USA
3.4.5 Visualización de los productos
Los productos de amplificación y el marcador de peso molecular de 1 kb (Gibco BRL,
Gaithersburg, MD) fueron separados por electroforesis en geles de agarosa (Ultrapure Agarose,
Gibco BRL, Gaithersburg, MD) al 1.2% preparados con una solución amortiguadora TAE (Tris 1M,
ácido acético, EDTA 0.5 M, pH 8.0) y corridos a 90V por 120 min. Los geles fueron teñidos por 15
min con una solución de bromuro de etidio (0.5 g/ml) según Sambroks et al. (1989). Las bandas de
los fragmentos de ADN en el gel fueron visualizadas bajo iluminación ultravioleta con un
transiluminador de rayos UV y fotografiado con un sistema de análisis de imágenes Eagle Eye I
(Stratagene).
45
3.4.6 Análisis de patrones RAPDs
Los geles de agarosa fueron fotografiados con el sistema Eagle eye I (Stratagene) y las
imágenes se almacenaron en un equipo de computo para su posterior uso. Las posiciones de las
bandas fueron visualizadas a simple vista y los parámetros de los fragmentos se transformaron
dentro de una matriz de carácter binario (1 por la presencia, 0 por la ausencia de una banda en una
posición en particular de la fotografía) y con la ayuda de la formula descrita por Nei y Li (1979): Sxy
= 2nxy /(n x + n y) se construyeron las matrices mediante el método de apareamiento simple. Donde:
nxy es el numero de fragmentos compartidos, y n x + n y son el numero de fragmentos en los aislados
x y y.,. Las distancias de matrices fueron utilizadas para elaborar dendrogramas con el programa S-
Plus 2000 utilizando el método del promedio vecino cercano y vecino lejano y el coeficiente de
confianza Felsenstein (bootstrap) con 3000 repeticiones.
46
IV. RESULTADOS
4.1 Patogenicidad de Colletotrichum acutatum y C. gloeosporioides
Los resultados de las pruebas de patogenicidad de once aislamientos de C. acutatum (ocho de
limón mexicano, dos de naranja Valencia y uno de limón Persa) y uno de C. gloeosporioides sobre
tres especies de cítricos se presentan en el Cuadro 3. Todos los aislamientos de la raza KLA de C.
acutatum colectados en Colima (A56LMCOL), Michoacán (A35LMMIC), Jalisco (A13LMJAL),
z = + con síntomas de la enfermedad; - sin síntomas de la enfermedad.
Todos los aislamientos de C. acutatum colectados en limón mexicano en los estados de
Colima, Jalisco, Nayarit, Michoacán, Guerrero, Oaxaca, Tamaulipas y Veracruz presentaron
características morfológicas similares en medio de cultivo papa-dextrosa-agar. Las colonias del
hongo presentaron micelio algodonoso, compacto, de aspecto polvoriento y color blanco grisáceo.
Su aspecto general fue de color naranja ligero y en el centro se observaron masas conidiales
dispersas de color naranja a salmón (Cuadro 4). Estas características corresponden a la raza KLA de
C. acutatum que causa antracnosis del limón mexicano.
Los aislamientos de C. acutatum que causan caída de fruto pequeño y colectados en naranja
Valencia y limón Persa en Tamaulipas, Veracruz y Tabasco presentaron micelio escaso, ligeramente
algodonoso, distribuido de manera uniforme, en ocasiones de aspecto polvoriento y de color blanco.
El aspecto general de la colonia es de color naranja ligero, acentuándose más en la parte central
48
(Cuadro 4). Estas características corresponden a las descritas para la raza PFD que causa la caída de
fruto pequeño.
Figura 1. Características de las colonias desarrolladas en medio de cultivo papa-dextrosa-agar de aislamientos de las razas PFD y KLA de Colletotrichum acutatum y el aislamiento de C. gloeosporioides. Las colonias son originadas de una espora de cada raza. Colonias de 14 días de edad a 27 °C.
El aislamiento saprofito del hongo C. gloeosporioides colectado en brotes de limón
mexicano en el estado de Colima y desarrollado en medio de cultivo papa-dextrosa-agar registró
colonias con micelio aéreo, abundante y algodonoso, de color gris a blanco grisáceo. su aspecto
general es de color gris a gris obscuro. Este aislamiento presentó un mayor crecimiento en medio de
cultivo con relación a C. acutatum (Cuadro 4). Estas características son similares a las reportadas
para C. gloeosporioides, saprofito o causante de antracnosis en frutos de cítricos en postcosecha
(Agostini et al. 1992).
Cuadro 4. Características morfológicas en medio de cultivo papa-dextrosa-agar de aislamientos de Colletotrichum spp de diferentes regiones citrícolas de México.
Vista posterior
Vista anterior
PFD KLA C. gloeosporioides
49
Especie (hospedante)/aislamiento Características de la coloniaz
Antracnosis del limón mexicano Raza KLA de C. acutatum
Micelio aéreo, algodonoso y de aspecto compacto, polvoriento y de color blanco grisáceo. El aspecto general de la colonia es de color naranja ligero y en el centro se observan masas conidiales dispersas de color naranja a salmón. En la parte posterior, el centro de la colonia es de color naranja ligero a brillante, cuya tonalidad va disminuyendo conforme se acerca a la periferia. Ocasionalmente se forman puntos de color café a café obscuro en el área naranja.
Micelio escaso, ligeramente algodonoso, distribuido de manera uniforme, en ocasiones de aspecto polvoriento y de color blanco. El aspecto general de la colonia es de color naranja ligero, acentuándose más en la parte central. Parte posterior de color naranja ligero con tonalidades café en el centro de la colonia. Se pueden formar algunos anillos concéntricos de color café.
Caída de fruto pequeño Raza KLA de C. acutatum
A40NVTAB, A43LPVER, A47NVTAM, A48NVTAM
Micelio de color blanco grisáceo, algodonoso y compacto, de aspecto polvoriento. En el centro de la colonia se observan masas conidiales dispersas de color naranja brillante distribuidas en anillos concéntricos o en forma irregular. La parte posterior es de color café ligero en el centro y con algunos puntos dispersos de color café que corresponden a las masas conidiales de la parte anterior. Es factible formarse algunos anillos concéntricos de color café. Este aislamiento es parecido morfológicamente a la raza que causa antracnosis del limón mexicano.
Antracnosis en postcosecha C. gloeosporioides
A62LMCOL
Micelio aéreo, abundante y algodonoso, de color gris a blanco grisáceo. El aspecto general de la colonia es de color gris a gris obscuro. Por el reverso, el centro de la colonia es gris obscuro con tonalidades de color rosa ligero. En los bordes la coloración es más tenue. Se observan pequeñas estructuras embebidas en el medio de cultivo, formando algunos anillos concéntricos.
z = Colonias de Colletotrichum spp de siete días de edad obtenidas de cultivos monospóricos.
50
4.2.2 Características de conidios y apresorios de aislamientos de Colletotrichum spp
Las características de los conidios y formas de los apresorios presentaron diferencias entre
los tres tipos de aislamientos de antracnosis del limón mexicano, caída de fruto pequeño y
antracnosis en postcosecha (Figura 2 y Cuadro 5).
Todos los aislamientos de la raza KLA de C. acutatum correspondientes a la antracnosis del
limón mexicano registraron conidios hialinos, unicelulares y una elevada proporción con un lado
redondeado y otro fusiforme (promedio de 77.6%) con relación a conidios con ambos lados
redondeados (promedio de 22.4%) en medio de cultivo papa-dextrosa-agar (Figura 2 y Cuadro 5).
Asimismo, los apresorios producidos fueron de forma redonda (Figura 3).
Los aislamientos de la raza PFD de C. acutatum presentaron mayor porcentaje de conidios
con un lado fusiforme y el otro redondeado (promedio 78.1%) en comparación a conidios
redondeados (promedio 21.9%) en medio de cultivo papa-dextrosa-agar (Figura 2 y Cuadro 5). Por
otra parte, al inducir germinación de conidios se formaron apresorios de forma clavada (Figura 3).
Figura 2. Conidios de las razas KLA y PFD de C. acutatum, y de C. gloeosporioides (C.g.), causantes de antracnosis del limón mexicano, caída de fruto pequeño y antracnosis de frutos en postcosecha, respectivamente. Conidios con un lado fusiforme ( ) y conidios con ambos lados redondeados ( ).
*
KLA PFD C.g.
*
* *
*
51
El aislamiento de C. gloeosporioides, causante de la antracnosis en postcosecha produjo una
alta proporción de conidios con ambos lados redondeados (Figura 2 y Cuadro 5), mientras que los
apresorios inducidos fueron de forma lobulada (Figura 3).
Figura 3. Apresorios de las razas KLA y PFD de C. acutatum, y de C. gloeosporioides (C.g.), causantes de antracnosis del limón mexicano, caída de fruto pequeño y antracnosis de frutos en postcosecha, respectivamente.
4.2.3 Crecimiento en medio de cultivo papa-dextrosa-agar
En este ensayo se comparó el crecimiento de diferentes aislamientos de Colletotrichum spp
colectados en varios hospedantes de cítricos y diferente origen geográfico (Cuadro 6). El aislamiento
A62LMCOL de C. gloeosporioides fue el que registró el mayor crecimiento a los 3, 6 y 9 días
después de la siembra. A los 9 días, presentó en promedio una colonia de 28.3 cm2, con un índice de
crecimiento diario de 3.14 cm2. El grupo de aislados de la raza PFD de C. acutatum obtenidos de
naranja Valencia y limón Persa (A39NVTAB, A40NVTAB, A48NVTAM y A43LPVER)
presentaron una ligera tendencia de mayor desarrollo que el grupo de la raza KLA de limón
mexicano. A los 9 días, su área fue de 15.8 a 18.0 cm2 y un índice de crecimiento diario de 1.76 a
2.00 cm2. Sin embargo, hubo algunos aislados de la raza PFD con un incremento similar a los de la
raza KLA (A123LPVER y A125NVVER) con un área de colonia de 15.8 a 15.9 cm2. Su índice de
crecimiento diario fue de 1.76 y 1.77 cm2, respectivamente. Los aislamientos de la raza KLA
colectados en los estados de Colima, Jalisco, Nayarit, Michoacán, Guerrero, Oaxaca, Veracruz y
Tamaulipas presentaron una ligera variación en la velocidad de desarrollo en medio de cultivo papa-
dextrosa-agar. El crecimiento en medio de cultivo a los 9 días fluctuó entre 14.8 a 17.3 cm2 con un
índice diario de 1.64 a 1.92 cm2.
KLA PFD C.g.
52
Cuadro 5. Características morfológicas en medio de cultivo papa-dextrosa-agar de aislamientos de Colletotrichum spp colectados en cítricos en México.
Especie/aislamiento
Hospedante
Forma conidial (%) Forma del apresorio Redondeadoy Fusiformez
zConidios con un lado fusiforme y otro redondeado.
53
Cuadro 6. Crecimiento en medio de cultivo papa dextrosa agar de aislamientos de Colletotrichum spp colectados en cítricos de diferente origen geográfico en México.
Días de crecimiento (cm2) z Raza/Aislamiento Especie Hospedante 3 6 9
C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum
C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum C. acutatum
18.0 b 17.6 bc 17.4 bcd 15.9 efg 17.2 bcde 17.9 bc 17.5 bcd 15.8 efg
28.3 a
z Crecimiento a partir de un conidio y desarrollado en papa-dextrosa agar a 27 °C en la obscuridad. Separación de medias según la prueba de Tukey al 95% de probabilidad.
54
4.3 Caracterización genética de Colletotrichum spp.
4.3.1 Análisis genético de Colletotrichum spp en cítricos
En la Figura 4 se presenta información del patrón de bandas del análisis genético con
marcadores RAPDs de seis aislamientos de C. acutatum aislado de limón mexicano, naranja
Valencia y limón Persa, y uno de C. gloeosporioides obtenido como saprofito en limón mexicano.
Se utilizaron cinco combinaciones de pares de iniciadores: A (M04/M07), B (M04/H06), C
(M04/A01), D (M04/P13) y E (A01/M07). El mayor número de fragmentos amplificados se obtuvo
con la combinación E con 6 a 15 bandas, seguido por la D con 10 a 12 bandas. Los pares de
iniciadores B y C registraron 7 a 8 y 5 a 8 bandas, respectivamente. Finalmente, la combinación A
produjo de 0 a 7 bandas. Los aislamientos de la raza KLA de Colima (A15LMCOL y
AL16LMCOL: carriles 2, 3, 9, 10, 16, 17, 26, 27, 33 y 34) tuvieron una buena amplificación y un
perfil RAPDs similar con cualquier juego de iniciadores; sin embargo, el mayor número de bandas
se logró con la combinación E y D. Por otra parte, los especímenes de la raza PFD de naranja
Valencia de Tabasco (A34NVTAB y A120NVTAB: carriles 4, 8, 11, 15, 18, 22, 30, 31, 37 y 38)
tuvieron un patrón y número de bandas similar (5 a 8) con cualquiera de los juegos de iniciadores
utilizados, a excepción del par de iniciadores A, con la cual se tuvieron únicamente tres bandas. Los
aislamientos de la raza PFD de limón Persa (A43LPVER y A115LPVER: carriles 5, 7, 12, 14, 19,
21, 28, 29, 35 y 36) de Veracruz produjeron de 0 a 4 bandas con la cobinación A. En cambio, con
los pares de iniciadores D y E se tuvieron 7-9 y 9-15 bandas, respectivamente. La combinación B y
C produjeron de 5 a 8 bandas. Con cualquiera de las combinaciones, se presentó un marcado
polimorfismo entre los dos especímenes (carril 5 vs. 7, 12 vs. 14, 19 vs. 21, 28 vs 29 y 35 vs 36). El
aislamiento de C. gloeosporioides (A62LMCOL: carriles 6, 13, 20, 32 y 39) presentó alrededor de
ocho bandas con cualquiera de las combinaciones de iniciadores, con excepción del D, en donde no
se produjo amplificación. El perfil RAPDs de los aislamientos de la raza KLA fue casi similar entre
ellos y diferentes al perfil de los aislamientos de la raza PFD. Por otra parte, C. gloeosporioides
presentó un patrón de bandas muy diferente a los aislamientos de PFD y KLA.
El dendrograma obtenido del análisis de ADN de los seis aislamientos del hongo C.
acutatum y uno de C. gloeosporioides, utilizando cinco combinaciones de iniciadores se presenta en
la Figura 5. El análisis de agrupamiento generó dos grupos: uno formado por el aislamiento de C.
55
gloeosporioides, causante de la antracnosis de postcosecha (grupo A) y el otro constituido por
aislamientos de las razas PFD y KLA de C. acutatum (grupo B). Entre ambas especies se registró
una disimilaridad del 68%. El grupo B se integró por dos subgrupos: raza KLA, causante de
antracnosis en limón mexicano (subgrupo C: A15LMCOL, AL16LMCOL y A43LPVER) y raza
PFD, causante de la caída de fruto pequeño en naranja Valencia (A34NVTAB y A120NVTAB) y
limón Persa (A115LPVER) (subgrupo D). La disimilaridad entre estos dos subgrupos fue del 49%.
Los dos aislamientos de la raza KLA de C. acutatum fueron genéticamente muy similares con una
disimilaridad del 5%. Los aislamientos de la raza PFD de C. acutatum congregaron como subgrupo
D y resultaron genéticamente muy similares entre el A115LPVER y A120NVTAB (H = 10%).
Asimismo, estos dos aislamientos tuvieron una disimilaridad del 23% con el aislamiento
A34NVTAB.
Sorpresivamente, un aislamiento de C. acutatum de limón persa (A43LPVER) presentó una
marcada similaridad genética (H = 12%) a los de la raza KLA de limón mexicano en el subgrupo C
y muy diferente a los aislamientos de la raza PFD clasificados en este dendrograma como subgrupo
D. Este aislamiento atípico de limón Persa presentó características morfológicas similares al grupo
de aislamientos de la forma que produce la antracnosis del limón mexicano (Cuadro 4).
4.3.2 Análisis genético de la raza KLA y PFD de Colletotrichum acutatum
El patrón de bandas resultante del análisis genético con marcadores RAPDs de aislamientos
del hongo Colletotrichum acutatum obtenidos en limón mexicano, naranja Valencia y limón Persa
se presenta en la Figura 6. La mayoría de los especímenes de la raza PFD colectados en limón Persa
y naranja Valencia (carriles 3-8, 13, 16, 19-21, 27-32, 33-40 y 43-45) tuvieron un perfil similar de
banadas de ADN con la combinación de inciadores B (M04/H06) y F (P13/M07). La excepción fue
un ejemplar de limón Persa (A34LPVER: carril 2 y 26) y dos aislamientos de naranja Valencia
(A47NVTAM y A48NVTAM: carriles 17, 18, 41 y 42) que tuvieron un patrón de bandas diferente
al registrado para el grupo de la raza PFD colectados en naranja Valencia y limón Persa y más
parecido al grupo de aislamientos de la raza KLA de limón mexicano. Los especímenes de la raza
KLA tuvieron un perfil polimórfico, ya que hubo algunos aislamientos que no amplificaron con
ambos juegos de iniciadores. Con el juego B no se logró amplificar los aislamientos de los carriles
56
11 y 15, mientras que con el juego F no se amplificó en los carriles 37 y 38. El resto de aislamientos
de este grupo tuvieron un patrón de bandas similar.
La información del dendrograma resultante del análisis de los patrones de bandas
polimorficas de ADN con los aislamientos de C. acutatum colectados en tres hospedantes (limón
mexicano, naranja Valencia y limón Persa) se presenta en la Figura 7. Los ejemplares de la raza
PFD obtenidos en limón Persa y naranja Valencia formaron un grupo bien definido (Grupo A),
mientras que los de la raza KLA, causando antracnosis del limón mexicano, junto con algunos
especímenes atípicos de limón Persa y naranjo Valencia formaron un grupo diferente (Grupo B). En
el Grupo A, algunos aislamientos de la raza PFD de limón Persa y naranjo Valencia (A114LPVER,
A115LPVER, A116LPVER, A121LPVER, A122LPVER, A123LPVER, A34NVTAB y
A39NVTAB) resultaron monomórficos (genéticamente similares). En el mismo grupo B, pero con
una dismimilaridad muy reducidas (H = 9%) se agruparon otros aislamientos de la raza PFD de
naranja Valencia (A124NVVER, A125NVTAB y A120NVTAB). En el Grupo A, los ejemplares de
la raza KLA de limón mexicano (A15LMCOL, A16LMCOL y A23LMCOL) fueron genéticamente
similares, en tanto que el aislamiento A56LMCOL tuvo una disimilaridad del 14% con los
anteriores. Los aislamientos atípicos de limón Persa colectados en Veracruz (A43LPVER) y naranja
Valencia en Tamaulipas (A47NVTAM y A48NVTAM) se agruparon en el grupo de la raza KLA
(Grupo B), registrando una disimilaridad del 4% con los aislamientos de limón mexicano.
4.3.3 Análisis genético de la raza KLA de Colletotrichum acutatum aislado de limón mexicano
en diferentes entidades citrícolas de México
En la Figura 8 se presentan los resultados del análisis genético con marcadores RAPDs de la
raza KLA del hongo Colletotrichum acutatum, causante de la antracnosis del limón mexicano. La
mayoría de los aislamientos procedentes de Colima (carril 4 y 6-9), Jalisco (11, 12 y 14), Michoacán
(carril 15-17), Guerrero (carril 18-21), Oaxaca (carril 22 y 26-28), Veracruz (carril 29) y Tamaulipas
(carril 30-33 y 35) tuvieron un patrón similar de bandas de ADN al usarse el juego de iniciadores F,
independientemente del origen de los ejemplares del hongo. Algunos especímenes del estado de
Colima (carril 2, 3 y 5), Jalisco (carril 13) y Tamaulipas (carril 34) no amplificaron con estos
iniciadores. El aislamiento A22LPNAY procedente del estado de Nayarit registró un perfil de
bandas polimórficas totalmente diferente al resto de los aislamientos.
57
Resultados similares al gel anterior fueron obtenidos con el juego de iniciadores B. La
mayoría de aislamientos de limón mexicano tuvieron un patrón parecido de bandas RAPDs sin
importar su origen geográfico (Figura 9). Los especímenes del estado de Colima (carril 3, 4 y 6-9),
Figura 4. Patrón de bandas resultante del análisis genético con marcadores RAPDs de seis aislamientos del hongo Colletotrichumacutatum aislado de limón mexicano, naranja Valencia y limón Persa y un aislamiento de C. gloeosporioides (C.g.) aislado comosaprofito de limón mexicano. Carril 2-8, con la combinación de iniciadores M04/M07 (a); Carril 9-15, con M04/H06 (b): carril 16-22,con M04/A01 (c): carril 26-32, con M04/P13 (d): carril 33-39, con los iniciadores A01/M07 (e): carril 1, 24, 25, 40, marcador 1 kb: carril23, negativo. Carril 2, 3, 9, 10, 16, 17, 26, 27, 33, 34, aislamientos de limón mexicano en Colima; carril 4, 8, 11, 15, 18, 22, 30, 31, 37,38, aislamientos de naranja Valencia en Tabasco; carril 5, 7, 12, 14, 19, 21, 28, 29, 35, 36, aislamientos de limón Persa en Veracruz; carril6, 13, 20, 32, 39, aislamiento de C.g. de limón mexicano en Colima.
Figura 6. Patrón de bandas resultante del análisis genético con marcadores RAPDs de aislamientos del hongo Colletotrichumacutatum aislado de limón mexicano, naranja Valencia y limón Persa en diferentes entidades productoras en México. Con lacombinación de iniciadores M04/H06 (a): carril 1, 23, marcador 1 kb; carril 2-8, aislamientos de limón Persa en Veracruz;carril 9-12, 14, 15, aislamientos de limón mexicano en Colima; carril 13, 16, 21, aislamientos de naranja Valencia en Tabasco;carril 17, 18, aislamientos de naranja Valencia en Tamaulipas; carril 19, 20, aislamientos de naranja Valencia en Veracruz; carril21, aislamiento de naranja Valencia en Tabasco; Carril 22, negativo. Con la combinación de iniciadores P13/M07 (b): carril 25,47, marcador 1 kb; carril 26-32, aislamientos de limón Persa en Veracruz; carril 33-36, 38, 39, aislamientos de limón mexicanoen Colima; carril 37, 40, 45, aislamientos de naranja Valencia en Tabasco; carril 41, 42, aislamientos de naranja Valencia enTamaulipas; carril 43, 44, aislamientos de naranja Valencia en Veracruz; carril 45, aislamiento de naranja Valencia en Tabasco;Carril 46, negativo.
Figura 8. Patrón de bandas resultante del análisis genético con marcadores RAPDs de aislamientos del hongo Colletotrichum acutatumaislado de limón mexicano en diferentes entidades productoras en México. Combinación de iniciadores P13/M07. Carril 1, 24, 25, 36,marcador 1 kb; carril 2-9, aislamientos colectados en Colima; carril 10, aislamiento colectado en Nayarit; carril 11-14, aislamientoscolectados en Jalisco; carril 15-17, aislamientos colectados en Michoacán; carril 18-21, aislamientos colectados en Guerrero; carril 23,negativo; carril 22, 26-28, aislamientos colectados en Oaxaca; carril 29, aislamiento colectado en Veracruz; carril 30-35, aislamientoscolectados en Tamaulipas.
Figura 9. Patrón de bandas resultante del análisis genético con marcadores RAPDs de aislamientos del hongo Colletotrichum acutatumaislado de limón mexicano en diferentes entidades productoras en México. Combinación de iniciadores M04/H06. Carril 1, 23, 24, 36,marcador 1 kb; carril 2-9, aislamientos colectados en Colima; carril 10, aislamiento colectado en Nayarit; carril 11-14, aislamientoscolectados en Jalisco; carril 15-17, aislamientos colectados en Michoacán; carril 18-21, aislamientos colectados en Guerrero; carril 22,negativo; carril 25-28, aislamientos colectados en Oaxaca; carril 29, aislamiento colectado en Veracruz; carril 30-35, aislamientoscolectados en Tamaulipas.
A15
LMC
OL
A16
LMC
OL
A34
NV
TA
B
A43
LPV
ER
A62
LMC
OL
A11
5LP
VE
R
A12
0NV
TA
B
0.0
0.2
0.4
0.6
60
10075
100
99
Dis
imila
ridad
Figura 5. Dendrograma derivado del análisis de agrupamiento UPMGA generado por los patrones de bandeo de marcadoresRAPDs con 6 aislamientos de Colletotrichum acutatum aislado de tres hospederos de cítricos (limón mexicano, naranja Valenciay limón Persa) y un aislamiento de C. gloeosporioides de limón mexicano. El grupo A corresponde a la raza FGG de C.gloeosporioides; grupo B a C. acutatum con subgrupo C de la raza KLA y subgrupo D de la raza SGO.
A B
C D
Figura 7. Dendrograma derivado del análisis de agrupamiento UPMGA generado por los patrones de bandeo de marcadoresRAPDs con 18 aislamientos de Colletotrichum acutatum aislado de tres hospederos de cítricos (limón mexicano, naranja Valenciay limón Persa) en diferentes entidades productoras en México. El grupo A corresponde a la raza SGO y el grupo B a la raza KLA.
A43
LPV
ER
A11
4LP
VE
R
A11
5LP
VE
R
A11
6LP
VE
R
A12
1LP
VE
R
A12
2LP
VE
R
A12
3LP
VE
R
A15
LMC
OL
A16
LMC
OL
A23
LMC
OL
A34
NV
TA
B
A56
LMC
OL
A39
NV
TA
B
A47
NV
TA
M
A48
NV
TA
M
A12
4NV
VE
R
A12
4NV
VE
R
A12
0NV
TA
B
0.0
0.2
0.4
0.6
61100 100 100 100 100 100 61 61100 6190 90
76
98
98Dis
imila
ridad
A B
A15
LMC
OL
A23
LMC
OL
A56
LMC
OL
A57
LMC
OL
A22
LMN
AY
A13
LMJA
L
A17
LMJA
L
A26
LMJA
L
AL3
5LM
MIC
A36
LMM
IC
AL3
8LM
MIC
A14
LMG
RO
AL0
6LM
GR
O
A07
LMG
RO
A31
LMG
RO
A01
LMO
AX
A02
LMO
AX
A03
LMO
AX
A05
LMO
AX
A42
LMV
ER
A53
LMTA
M
A50
LMTA
M
A51
LMTA
M
A52
LMTA
M
A54
LMTA
M
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
100 3664 38 62 62 4241 41 33 42 40 4055 51 40 40
37 51
30
19 5
97
Fig. 10. Dendrograma derivado del análisis de agrupamiento UPMGA generado por los patrones de bandeo de marcadoresRAPDs con 25 aislamientos de Colletotrichum acutatum aislado de limón mexicano en diferentes entidades productoras enMéxico.