ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA … · tiplerinde DNA hasarı yanıtına katılır. Bu yüzden farklı kanser türlerine yatkınlığın belirlenmesi

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

DOKTORA TEZİ

Süleyman BAYRAM

CHEK2 GENİNDEKİ MUTASYONLAR İLE HEPATOSELÜLER KANSER VE KOLOREKTAL KANSER ARASINDAKİ İLİŞKİNİN ARAŞTIRILMASI

BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

ADANA, 2010

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ


Süleyman BAYRAM

DOKTORA TEZİ

BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

Bu Tez 31/5/2010 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/

Oyçokluğu ile Kabul Edilmiştir.

……………….................... ………………………….. ……................................ Prof.Dr.Mehmet TOPAKTAŞ Prof.Dr.Hikmet AKKIZ Prof. Dr. Salih KAFKAS

Danışman 2. Danışman Üye

...………………............... ...………………………..

Prof.Dr.Eyyüp RENCÜZOĞULLARI Prof. Dr. Gökhan CORAL

Üye Üye

Bu Tez Enstitümüz Biyoloji Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No:

Prof. Dr. İlhami YEĞİNGİL Enstitü Müdürü

Bu Çalışma Ç. Ü. Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir.

Proje No: FEF2008D4 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

I

ÖZ

DOKTORA TEZİ


Süleyman BAYRAM

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

Danışman : Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ 2. Danışman : Prof. Dr. Hikmet AKKIZ Yıl: 2010, Sayfa: 161 Jüri : Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ : Prof. Dr. Hikmet AKKIZ : Prof. Dr. Salih KAFKAS : Prof. Dr. Eyyüp RENCÜZOĞULLARI : Prof. Dr. Gökhan CORAL

Hücre döngüsü kontrol noktası kinaz 2 (CHEK2) proteini çok çeşitli hücre tiplerinde DNA hasarı yanıtına katılır. Bu yüzden farklı kanser türlerine yatkınlığın belirlenmesi için bu protein genindeki mutasyonların saptanması önemlidir. CHEK2 genindeki mutasyonlar (I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC) serin/treonin kinaz aktivitesini bozar ve bu mutasyonlar çeşitli türdeki kanserler ile ilişki gösterir. Bu çalışmada, CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının Türk populasyonunda hepatoselüler ve kolorektal kanser gelişiminde önemli bir rol oynayıp oynamadıklarının araştırılması amaçlanmıştır.

Toplam 210 kolorektal kanserli vaka, 165 hepatoselüler kanserli vaka ve 446 sağlıklı kontrolde CHEK2 gen mutasyonları PCR-RFLP ve ARMS-PCR metotları ile araştırılmıştır. Kolorektal kanserli, hepatoselüler kanserli ve sağlıklı kontrollerin hiçbirinde CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonları saptanmamıştır. Türk populasyonunda, CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonları yok veya çok seyrek olabilir ve bunun yanında hepatoselüler ve kolorektal kanser oluşumu üzerine bir katkıları olmayabilir. Sonuç olarak, bu çalışma sonuçları doğrultusunda Türk populasyonunda CHEK2 mutasyonlarının klinik olarak genotiplendirilmesinin gerekmediği ortaya çıkmıştır.

Anahtar Kelimeler: CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonları,

Hepatoselüler kanser, Kolorektal kanser, Türk populasyonu.

II

ABSTRACT

Ph. D. THESIS

INVESTIGATION ON THE RELATION OF THE MUTATIONS IN CHEK2 GENE TO HEPATOCELLULAR AND COLORECTAL CANCERS

Süleyman BAYRAM

DEPARTMENT OF BIOLOGY

INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF ÇUKUROVA

Supervisors :Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ :Prof. Dr. Hikmet AKKIZ Year: 2010, Pages: 161 Jury :Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ :Prof. Dr. Hikmet AKKIZ :Prof. Dr. Salih KAFKAS :Prof. Dr. Eyyüp RENCÜZOĞULLARI :Prof. Dr. Gökhan CORAL

The cell cycle checkpoint kinase 2 (CHEK2) protein participates in the DNA damage response in many cell types. Therefore to determine the susceptibility to various cancer types it is important to detect mutations in this protein coding gene. Germline mutations in CHEK2 (I157T, IVS2 + 1 G>A and 1100delC) impair serine/threonine kinase activity and these mutations are associated with a range of cancer types. This study aimed to investigate whether CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A and 1100delC mutations play an important role in the development of hepatocellular and colorectal carcinomas in Turkish population.

A total of 210 colorectal cancer cases, 165 hepatocellular cancer cases and 446 healthy controls were investigated for CHEK2 mutations by PCR-RFLP and ARMS-PCR methods. None of the colorectal cancer cases, hepatocellular cancer cases and healthy controls carried the CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A and 1100delC mutations. In conclusion, our results show that CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A and 1100delC mutations may be absent or be very infrequent and may not contribute to the predisposition for hepatocellular and colorectal carcinomas in Turkish population. Overall, our data suggest that genotyping of CHEK2 mutations in clinical settings in the Turkish population should not be recommended.

Key words: CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A and 1100delC mutations, Hepatocellular

cancer, Colorectal cancer, Turkish population

III

TEŞEKKÜR

Çalışmamın her aşamasında yardımlarını esirgemeyen yapıcı ve yönlendirici

fikirleri ile bana daima yol gösteren öğrencileri olmaktan mutluluk duyduğum

danışman hocalarım Prof. Dr. Mehmet TOPAKTAŞ’a ve Prof. Dr. Hikmet AKKIZ’a

sonsuz teşekkürlerimi sunarım.

Doktora Tez İzleme Komitesi üyesi Sayın Prof. Dr. Salih KAFKAS’a ve

Prof. Dr. Eyyüp RENCÜZOĞULLARI’na çalışmamın tüm aşamalarında

yönlendirici ve olumlu katkılarından dolayı teşekkür ederim. Doktora tezi jüri üyesi

Sayın Prof. Dr. Gökhan CORAL’a yapıcı ve yönlendirici fikirleriyle katkıda

bulunduğu için teşekkürlerimi sunarım.

Bütün çalışmalarımda, her konuda çok büyük yardımlarını gördüğüm Ç.Ü.

Tıp Fakültesi Dahiliye Gastroenteroloji Moleküler Biyoloji laboratuvarı sorumlusu

Sağlık Teknikeri Aynur BEKAR’a ve Kimyager Ersin AKGÖLLÜ’ye teşekkürlerimi

sunarım. Ayrıca tez çalışmalarım sırasında yardımlarını gördüğüm, Uzman Dr.

Burhan ÖZDİL, Uzman Dr. Banu KARA, Dr. Ahmet Taner SÜMBÜL ve Dr. Havva

YEŞİL’e teşekkürlerimi sunarım.

Kalıtsal CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonları bulunan ve

çalışmamızda pozitif kontrol olarak kullanılan bireylerin biyolojik materyallerini

(DNA ve periferik kan) gönderen Dr. Heli NEVANLINNA (Finlandiya), Dr. Cezary

CYBULSKI (Polonya), Dr. Natalia BOGDANOVA (Almanya), Dr. Børge G.

NORDESTGAARD (Danimarka) ve Dr. Darina V. KONSTANTINOVA’a

(Bulgaristan) en içten teşekkürlerimi sunarım.

Doktora çalışmalarım esnasında tüm bölüm olanaklarından yararlanmamı

sağlayan Ç.Ü. Tıp Fakültesi İç Hastalıkları Ana Bilim Dalı çalışanlarına ve

projemize maddi destek veren Ç.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi’ne (Proje no:

FEF2008D4) teşekkürlerimi sunarım.

Çalışmalarım sırasında bana her zaman destek olan sevgili aileme sonsuz

teşekkürlerimi sunarım.

IV

İÇİNDEKİLER SAYFA

ÖZ ...................................................................................................................... I

ABSTRACT ....................................................................................................... II

TEŞEKKÜR ....................................................................................................... III

İÇİNDEKİLER ................................................................................................... IV

ÇİZELGELER DİZİNİ ....................................................................................... XI

ŞEKİLLER DİZİNİ ............................................................................................ XII

SİMGELER VE KISALTMALAR ..................................................................... XIV

1.GİRİŞ .............................................................................................................. 1

2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR ................................................................................ 15

2.1. CHEK2 Mutasyonlarının Akciğer Kanseri Oluşumu Üzerine

Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar ..................................................... 15

2.2. CHEK2 Mutasyonlarının Beyin Kanseri Oluşumu Üzerine

Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar .................................................... 16

2.3. CHEK2 Mutasyonlarının Böbrek Kanseri Oluşumu Üzerine


2.4. CHEK2 Mutasyonlarının Kolorektal Kanser Oluşumu Üzerine


2.5. CHEK2 Mutasyonlarının Li-Fraumeni Sendromu Oluşumu Üzerine


2.6. CHEK2 Mutasyonlarının Lösemi Oluşumu Üzerine Etkileri İle

İlgili Yapılmış Çalışmalar ...................................................................... 22

2.7. CHEK2 Mutasyonlarının Meme Kanseri Oluşumu Üzerine


2.8. CHEK2 Mutasyonlarının Melanoma Oluşumu Üzerine


2.9. CHEK2 Mutasyonlarının Mesane Kanseri Oluşumu Üzerine


2.10. CHEK2 Mutasyonlarının Ovaryum Kanseri Oluşumu Üzerine

Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar ................................................... 41

V

2.11. CHEK2 Mutasyonlarının Özefagus Kanseri Oluşumu Üzerine

Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar .................................................. 42

2.12. CHEK2 Mutasyonlarının Pankreas Kanseri Oluşumu Üzerine


2.13. CHEK2 Mutasyonlarının Prostat Kanseri Oluşumu Üzerine


2.14. CHEK2 Mutasyonlarının Rahim Kanseri Oluşumu Üzerine


2.15. CHEK2 Mutasyonlarının Tiroit Kanseri Oluşumu Üzerine


2.16. CHEK2 Genindeki Mutasyonların Çeşitli Kanserlerin Oluşumuyla

İlişkisini Araştıran Çalışmalardan Elde Edilen Sonuçların

Toplu Değerlendirilmesi ....................................................................... 46

3. MATERYAL ve METOD............................................................................... 49

3.1. Hasta ve Kontrol Grubu ......................................................................... 49

3.2. Kullanılan Kimyasal Maddeler ve Deney Ekipmanları ........................... 50

3.2.1. Kullanılan Kimyasal Maddeler ...................................................... 50

3.2.1.1.Agaroz (Sigma) .................................................................. 50

3.2.1.2. Etil Alkol (Merck) ............................................................ 51

3.2.1.3. İzopropanol (Sigma) ......................................................... 51

3.2.1.4. Ksilol (Merck) .................................................................. 52

3.2.1.5. Mineral Yağ (Sigma) ........................................................ 52

3.2.1.6. Brom Fenol Mavisi (Sigma) .............................................. 53

3.2.1.7. Ksilen Siyanol FF (Sigma) ................................................ 53

3.2.1.8. Gliserol (Sigma) ................................................................ 54

3.2.1.9. Trizma-Baz (Sigma) .......................................................... 55

3.2.1.10. Etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) (Sigma) ................. 55

3.2.1.11. Borik Asit (Sigma) .......................................................... 55

3.2.1.12. Suyla Hazırlanmış % 1’lik Etidyum Bromür

Çözeltisi (Merck) ............................................................ 56

3.2.1.13. DNA Polimeraz Enzimi (Fermentas) ............................... 57

VI

3.2.1.14. Deoksiribonükleosid Trifosfat Seti (dNTP)(Promega) ...... 57

3.2.1.15. DNA Marker (Promega) .................................................. 58

3.2.1.16. CHEK2 I157T Mutasyonun Analizinde Kullanılan

Primer Çifti ...................................................................... 59

3.2.1.17. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonun Analizinde

Kullanılan Primer Çifti .................................................... 60

3.2.1.18. CHEK2 1100delC Mutasyonun Analizinde

Kullanılan Primer Çiftleri ................................................. 60

3.2.1.19. DNA İzolasyon Kiti (Roche) ............................................ 62

3.2.1.20. PstI Restriksiyon Endonükleaz (New England Biolabs) ... 63

3.2.1.21. Hyp188III Restriksiyon Endonükleaz

(New England Biolabs) ................................................... 64

3.1.2. Kullanılan Deney Ekipmanları ....................................................... 66

3.2.2.1. Santrifüjler ......................................................................... 66

3.2.2.2. Derin Dondurucular ........................................................... 66

3.2.2.3. Steril Kabin ........................................................................ 66

3.2.2.4. Polimeraz Zincir Reaksiyon Aleti (Termal Cycler) ............ 66

3.2.2.5. Vorteks Aleti ..................................................................... 67

3.2.2.6. Kuru Isıtıcı ......................................................................... 67

3.2.2.7. Hasas Terazi ...................................................................... 67

3.2.2.8. Manyetik Isıtcı ve Karıştıcı ................................................ 67

3.2.2.9. Buzdolabı .......................................................................... 68

3.2.2.10. Jel Elektroforez Sistemi ................................................... 68

3.2.2.11. Jel Görüntüleme Sistemi .................................................. 68

3.2.2.12. Jel Analiz Sistemi ............................................................ 68

3.2.2.13. Otomatik Mikropipetler.................................................... 68

3.3. DNA İzolasyonu .................................................................................... 69

3.3.1. Periferik Kandan DNA İzolasyonu ................................................ 69

3.3.2. Parafine Gömülü Kolorektal Kanser Dokusundan

DNA İzolasyonu ............................................................................ 70

3.4. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ...................................................... 72

VII

3.5. Agaroz Jel Elektroforezi ......................................................................... 75

3.5.1. % 2.5’lik Agaroz Jelin Hazırlanması.............................................. 75

3.5.2. PCR, PCR-RFLP ve ARMS-PCR Örneklerinin Jele

Konması ve Elektroforez ............................................................... 75

3.6. CHEK2 I157T Mutasyonun PCR-RFLP Yöntemi ile Belirlenmesi ......... 76

3.6.1. CHEK2 I157T Mutasyonunu Saptamak Amacıyla Bu Mutasyonun

Olabileceği DNA Bölgesinin PCR ile Çoğaltılması........................ 76

3.6.2. CHEK2 I157T Mutasyonunun Bulunabileceği Bölgenin

PCR İşlemi Sonucunda Görüntülenmesi ........................................ 79

3.6.3. CHEK2 I157T Mutasyonunun Olup Olmadığını Belirlemek

İçin RFLP Analizi. ........................................................................ 80

3.7. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonun PCR-RFLP Yöntemi

ile Belirlenmesi ..................................................................................... 84

3.7.1. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonunu Saptamak Amacıyla

Bu Mutasyonun Olabileceği DNA Bölgesinin

PCR ile Çoğaltılması ..................................................................... 84

3.7.2. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonunun Bulunabileceği

Bölgenin PCR İşlemi Sonuçunda Görüntülenmesi ......................... 87

3.7.3. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonunun Olup Olmadığını

Belirlemek İçin RFLP Analizi ....................................................... 88

3.8. CHEK2 1100delC Mutasyonun Allele Özgü Mutasyon Belirleme

Yöntemi ile Belirlenmesi ........................................................................ 91

3.8.1. CHEK2 1100delC Mutasyonu İçin PCR İşlemi.............................. 94

3.8.2. CHEK2 1100delC Mutasyonunun Analizinin Agaroz Jel

Elektrofez ile Analizi ..................................................................... 97

3.9. İstatistiksel Analizler .............................................................................. 101

4. BULGULAR .................................................................................................. 103

4.1. Çalışma Gruplarını Oluşturan Bireylerin Genel Bilgileri ........................ 103

4.1.1. Kontrol Çalışma Grubunu Oluşturan Bireylerin

Genel Bilgileri ............................................................................... 103

4.1.2. Kolorektal Kanser Çalışma Grubunu Oluşturan Bireylerin

VIII

Genel, Klinik ve Patolojik Bilgileri ................................................ 103

4.1.3. Hepatoselüler Kanser Çalışma Grubunu Oluşturan

Bireylerin Genel ve Klinik Bilgileri ............................................... 107

4.2. Kontrol, Kolorektal Kanser ve Hepatoselüler Kanser Çalışma

Gruplarında CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC Mutasyon

Sıklıklarının Dağılımları ......................................................................... 109

4.2.1. Kontrol, Kolorektal Kanser ve Hepatoselüler Kanser

Çalışma Gruplarında CHEK2 I157T Mutasyonunun

(Nokta Mutasyonu) Sıklığı ............................................................ 110

4.2.2. Kontrol, Kolorektal Kanser ve Hepatoselüler Kanser Çalışma

Gruplarında CHEK2 IVS2 + 1 G>A Mutasyonunun

(Nokta Mutasyonu) Sıklığı ............................................................ 112


Gruplarında CHEK2 1100delC Mutasyonunun (Bir Nükleotid

Delesyonu Sonucu Oluşan Çerçeve Kayması Mutasyonu)

Sıklığı ............................................................................................ 114

5. TARTIŞMA ................................................................................................... 117

5.1. CHEK2 Mutasyonlarının Türk Populasyonununda Kolorektal

Kanser Oluşumu Üzerine Etkileri ........................................................... 117

5.2. CHEK2 Mutasyonlarının Türk Populasyonununda Hepatoselüler

Kanser Oluşumu Üzerine Etkileri ........................................................... 126

6. SONUÇ ve ÖNERİLER.................................................................................. 139

KAYNAKLAR ................................................................................................... 141

ÖZGEÇMİŞ ....................................................................................................... 161

IX

ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA

Çizelge 2.1. CHEK2 Genindeki Mutasyonların Çeşitli Kanserlerle İlişkisi......... 47

Çizelge 3.1. CHEK2 Genindeki I157T Mutasyonunu Saptamak İçin

Kullanılan Primerlerin Uzunlukları, Erime sıcaklıkları,

GC Oranı ve Baz Dizisi.................................................................... 59

Çizelge 3.2. CHEK2 Genindeki IVS2 + 1G>A Mutasyonunu Saptamak İçin

Kullanılan Primerlerin Uzunlukları, Erime sıcaklıkları,

GC Oranı ve Baz Dizisi.................................................................... 60

Çizelge 3.3. CHEK2 Genindeki 1100delC Mutasyonunu Saptamak İçin

Kullanılan Primerlerin Uzunlukları, Erime Sıcaklıkları,

GC Oranları ve Baz Dizileri............................................................ 62

Çizelge 3.4. CHEK2 I157T Mutasyonunun Olabileceği Bölgenin

Çoğaltılmasında Kullanılan Primerlerin CHEK2 Geni Üzerindeki

Konumları ve Mutasyonun Meydana Geldiği Nükleotid................. 77

Çizelge 3.5. CHEK2 I157T Mutasyonunu Saptamak Amacıyla

Optimum Amplifikasyonun Gerçekleştirildiği PCR

Reaksiyon Karışımı.......................................................................... 79

Çizelge 3.6. CHEK2 I157T Mutasyonu İçin PCR Sıcaklıkları ve

Döngü Sayıları.................................................................................. 79

Çizelge 3.7. PstI Restriksiyon Enziminin Tanıma Bölgesi ve

CHEK2 I157T Mutasyonuna Neden Olan Nükleotid......................... 81 Çizelge 3.8. CHEK2 I157T Mutasyonunun Olup Olmadığını Belirlemek İçin

RFLP Reaksiyon Karışımı .............................................................. 82

Çizelge 3.9. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonunun Olabileceği

Bölgenin Çoğaltılmasında Kullanılan Primerlerin CHEK2

Geni Üzerindeki Konumları ve CHEK2 IVS2 + 1G>A

Mutasyonun Meydana Geldiği Nükleotid..........................................85

Çizelge 3.10. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonunu Saptamak Amacıyla

Optimum Amplifikasyonun Gerçekleştirildiği

PCR Reaksiyon Karışımı................................................................. 86

X

Çizelge 3.11. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonu İçin PCR Sıcaklıkları

ve Döngü Sayıları............................................................................ 87

Çizelge 3.12. Hyp188III Restriksiyon Enziminin Tanıma Bölgesi ve

IVS2 + 1G>A Mutasyonuna Neden Olan Nükleotid...................... 89

Çizelge 3.13 CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonunun Belirlenmesi

İçin RFLP Reaksiyon Karışımı........................................................ 90

Çizelge 3.14. CHEK2 1100delC Mutasyonunun Bulunmaması Durumunda

DNA Amplifikasyonu Oluşturabilecek Primerlerin CHEK2 Geni

Üzerindeki Konumları ve 1100delC Mutasyonunun Oluşmasına

Neden Olan Nükleotid.................................................................... 93

Çizelge 3.15. CHEK2 1100delC Mutasyonunun Bulunması Durumunda

DNA Amplifikasyonu Oluşturabilecek Primerlerin CHEK2 Geni

Üzerindeki Konumları..................................................................... 94

Çizelge 3.16. SLC30A9 Genine Özgü Primerlerin SLC30A9 Geni

Üzerindeki Konumları..................................................................... 94

Çizelge 3.17. CHEK2 1100delC Mutasyonunun Bulunması Durumunda

DNA Amplifikasyonu Ouşturabilecek Optimum PCR

Reaksiyonu Karışımı...................................................................... 96

Çizelge 3.18. CHEK2 1100delC Mutasyonunun Bulunmaması Durumunda

DNA Amplifikasyonu Oluşturabilecek Optimum PCR

Reaksiyonu Karışımı...................................................................... 97

Çizelge 3.19. CHEK21100delC Mutasyonu İçin PCR Sıcaklıkları

ve Döngü Sayıları........................................................................... 97

Çizelge 4.1. Kolorektal Kanser ve Kontrol Çalışma Grubundaki Bireylerin

Genel, Klinik ve Patolojik Bilgiler.................................................... 104

Çizelge 4.2. Hepatoselüler Kanser ve Kontrol Çalışma Grubundaki Bireylerin

Genel, Klinik ve Patolojik Bilgileri.................................................... 108

Çizelge 4.3. Kontrol, Kolorektal Kanser ve Hepatoselüler Kanser Çalışma

Gruplarında CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC Mutasyon

Sıklıklarının Dağılımları.................................................................... 112

XI

Çizelge 5.1. Farklı Populasyonlarda CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A

ve 1100delC Mutasyonlarının Sağlıklı Bireylerde Sıklıkları............. 120

Çizelge 5.2. Farklı Populasyonlardan Meme Kanserli ve Kontrol Bireylerinde

CHEK2 1100delC Mutasyonunun Sıklığı............................... ......... 129

XII

ŞEKİLLLER DİZİNİ SAYFA

Şekil. 1.1. DNA-Hasarı Kontrol Noktası Yolağında Sinyal İletiminin

Kavramsal Organizasyonu.................................................................... 2

Şekil 1.2. İnsan CHEK2 Proteininin Yapısı ve Aktivasyon Noktaları.................. 4

Şekil 1.3. CHEK2 Proteininin Aktivasyon Modeli.................................................4

Şekil 1.4. DNA-hasarı Kontrol Noktası Yolağının Şematik Görünümü................ 5

Şekil 1.5. CHEK2 Geninin Yapısı.......................................................................... 7

Şekil 1.6. CHEK2 Geni İçersinde Bu Güne Kadar Tanımlanmış Mutasyonlar..... 8

Şekil 1.7. CHEK2 IVS2 + 1 G>A Mutasyonu Sonucu Oluşan Anormal İlmek.....10

Şekil 3.1. CHEK2 I157T Mutasyonunun Olabileceği DNA Bölgesinin PCR

Reaksiyonu İle Çoğaltılması Sonucu Oluşan DNA Parçasının

%2.5’lik Agaroz Jeldeki Görüntüsü.......................... ........................... 80

Şekil 3.2. CHEK2 I157T Mutasyonunun RFLP Yöntemi İle

Genotiplendirilmesi Sonucu Oluşan DNA Parçalarının

% 2.5’luk Agaroz Jeldeki Görüntüsü.................................................... 84

Şekil 3.3. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonunun Olabileceği DNA Bölgesinin

PCR Reaksiyonu İle Çoğaltılması Sonucu Oluşan DNA

Parçasının %2.5’lik Agaroz Jeldeki Görüntüsü.................................... 88

Şekil 3.4. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonunun RFLP Yöntemi İle

Genotiplendirilmesi Sonucu Oluşan DNA Parçalarının

%2.5’lik Agaroz Jeldeki Görüntüsü................................................... 91

Şekil 3.5. CHEK2 1100delC Mutasyonunun ARMS-PCR Yöntemi

İle Genotiplendirilmesi Sonucu Oluşan DNA Parçalarının %2.5’lik

Agaroz Jeldeki Görüntüsü...................................................................... 100

Şekil 4.1. Kalın Bağırsağın Bölümleri.................................................................. 105

Şekil 4.2. Kontrol, Kolorektal Kanser ve Hepatoselüler Kanser

Çalışma Gruplarında CHEK2 I157T Mutasyonunun RFLP

Yöntemi İle Genotiplendirilmesi...................................................... 111

XIII


Çalışma Gruplarında CHEK2 IVS2 + 1 G>A Mutasyonunun

RFLP Yöntemi İle Genotiplendirilmesi........................................... 113


Çalışma Gruplarında CHEK2 1100delC Mutasyonunun

ARMS-PCR Yöntemi İle Genotiplendirilmesi................................ 115

Şekil 5.1. Kolorektal Kanser Gelişiminde Adenom-Karsinom Geçişine Eşlik

Eden Değişiklikler ............................................................................... 123

Şekil 5.2. Avrupa Kökenli Meme Kanserli Hastalarda CHEK2

1100delC Mutasyonunun Sıklığı.......................................................... 128

Şekil 5.3. Genetik Anormallikler Sonucu Oluşan Monogenik Ve Poligenik

Sendromlar İle Hepatoselüler Kanser Oluşumu Arasındaki İlişki. ....... 134

Şekil 5.3. Hepatoselüler Karsinogenezisin Oldukça Kompleks Ve Çok

Basamaklı Süreci ................................................................................. 135

Şekil 5.4. Hepatoselüler Karsinomaya Bireysel Yatkınlık Modeli. ...................... 138

XIV

SİMGELER ve KISALTMALAR AATF :Apoptosis antogonizing transcription factor

ARMS-PCR :Amplifikasyon Refrakter Mutasyon Sistemi-Polimeraz Zincir

Reaksiyonu

ATM :Ataxia telangiectasia mutated

ATR :Ataxia telangiectasia mutated and Rad3-related

bç :baz çifti

°C :Santigrat derece

BRCA1 :Breast cancer 1

BRCA2 :Breast cancer 2

BSA :Bovin serum albümin

CDC25A :Cell division cycle 25 homolog A

CDC25C :Cell division cycle 25 homolog C

CHEK2 :Checkpoint kinase 2

CHEK2 1100delC :CHEK2 geninin 1100. pozisyonunda bulunan sitozin

nükleotidinin delesyonu mutasyonu

CHEK2 I157T :CHEK2 proteininin FHA bölgesi içersinde bulunan 157.

kodonun belirlediği izolösin (I) aminoasitinin treonin (T)

aminoasitine dönüşümüne neden olan mutasyon

CHEK2 IVS2+1G>A :CHEK2 geninin 2. intronunun ilk nükleotidinde meydana

gelen, guanin (G) nükleotidinin adenin (A) nükleotidine

dönüşümü şeklindeki transisyon tipi nokta mutasyonu

DNA :Deoksiribonükleik asit

dNTP :Deoksiribonükleosid trifosfat

E2F1 :E2F transcription factor 1

EDTA :Etilendiamintetraasetik asit

FHA :Forkhead’e benzer bölge

FOXM1 :Forkhead box M1

gr :gram

HPLC :Yüksek performanslı sıvı kromatografisi

XV

Hyp188III :Helicobacter pylori 188 III

MDM2 :Mouse double minute 2

MgCI2 :Magnezyum klorür

MRE11 :Meiotic recombination 11

NBS1 :Nibrin

NCBI :National Center for Biotechnology Information

NLS :Nükleer lokalizasyon sinyal bölgesi

PCR : Polimeraz Zincir Reaksiyonu

PCR-RFLP :Polimeraz Zincir Reaksiyonu-Restriksiyon Fragmenti

Uzunluk Polimorfizmi

pH :Hidrojen iyonu konsantrasyonu

PML :Promyelocytic leukemia

PstI :Providencia stuartii I

RE :Restriksiyon endonükleaz

SLC30A9 :Solute Carrier Family 30 (zinc transporter), member 9

SQ/TQ :Serin:Glutamin/Treonin:Glutamin bölgesi

T (Thr) :Treonin

TBE :Tris Borik EDTA çözeltisi

Tm :Primerin erime (Melting) sıcaklığı

TP53 :Tümör protein 53

I (Ile) :İzolösin

XRCC1 :X-ray repair cross complementing protein 1

1. GİRİŞ Süleyman BAYRAM

1

1. GİRİŞ

Hücreler DNA’ya zarar veren endojen (reaktif oksijen türevleri, DNA

replikasyon hatası) ve ekzojen (genotoksik kimyasallar, ultraviyole radyasyon,

radyoterapötik ve kemoterapötik ajanlar) stresler tarafından sürekli tehdit

altındadırlar (Ahn ve ark., 2004). Bu streslere karşı DNA doğru bir şekilde

korunamaz ise DNA’da meydana gelen hasarlar genomik yapının bozulmasına ve

nesilden nesile genetik bilginin doğru bir şekilde aktarılamamasına neden olur

(Bartek ve ark., 2001). Genetik bilginin bütünlüğü, DNA’ya zarar veren bu

streslerden hücre döngüsü sırasında karmaşık protein haberleşme ağları ile korunur

(Antoni ve ark., 2007). Bu haberleşme ağları ile hücre döngüsü durdurulur ve DNA

tamir mekanizmaları aktiflenir. Eğer DNA tamiri gerçekleştirilemez ise hücre

yaşlanır veya ölür. Evrim süresi boyunca organizmalar DNA hasarına yanıt

verebilecek ve DNA hasarını tamir edebilecek çok sayıda haberleşme ağları

edinmişlerdir (Bartek ve ark., 2001). Bu haberleşme ağlarından biri olan DNA-hasarı

kontrol noktası yolağı hücrenin genomik bütünlüğünü koruyan ve organizmada

tümör gelişimini engelleyen hücresel bir denetim sistemidir (Bartek ve Lukas, 2007).

Bu kontrol noktası yolağı DNA hasarını algılayabilmekte ve hücre döngüsü

düzenleyicilerinin aktivitelerini inhibe ederek hücre döngüsünü durdurabilmektedir.

Aktiflenen DNA-hasarı kontrol noktası yolağı böylece genetik dengesizliğin

meydana gelmesini engeller veya geciktirir. Bundan dolayı bu kontrol noktası yolağı

kanser gelişmesine karşı bir bariyer olarak rol oynamaktadır (Bartkova ve ark., 2005;

Gorgoulis ve ark., 2005).

Genotoksik kimyasallar, ultraviyole ışınlar (UV) ve iyonize radyasyon gibi

çevresel mutajenlerin yanında normal hücresel metabolizma sonucu oluşan reaktif

oksijen türevleri ve replikasyon hataları DNA hasarlarına neden olmaktadırlar

(Rotman ve Shiloh, 1997; Bartek ve ark., 2001; Hoeijmakers, 2001; Antoni ve ark.,

2007). DNA-hasarı kontrol noktası yolağında DNA hasarları algılayıcı (sensör)

proteinler tarafından algılanır. Algılanmış olan bu DNA hasarı sinyali, aracı

(mediyatör) proteinler ile iletim (transdüser) proteinlerine aktarılır. İletim

proteinlerinden etkileyici (efektör) proteinlere aktarılan DNA hasar sinyali hücrede


2

Hücresel metabolizma UV ışık İyonize edici

radyasyon Kimyasallar Replikasyon hatası

DNA hasarı

İletim (transdüser) proteinler

Algılayıcı (sensör) proteinler

Etkileyici (efektör) proteinler

DNA tamiri Hücre döngüsünün durdurulması Transkripsiyon Apopitozis

DNA’da Hasara Neden Olan Etkenler

bir dizi biyokimyasal işleme neden olur. Bu işlemler sonucunda hücre döngüsünün

durdurulması, DNA tamiri veya apopitozis gerçekleşir (Şekil 1.1.) (Niida ve

Nakanishi, 2006).

Şekil. 1.1. DNA-Hasarı Kontrol Noktası Yolağında Sinyal İletiminin Kavramsal

Organizasyonu

CHEK2 geni insanın 22. kromozomunun uzun kolu üzerinde bulunmaktadır.

CHEK2 (checkpoint kinase 2=hücre döngüsü kontrol noktası kinaz 2) geninin ürünü

bir serin/treonin kinaz olup DNA-hasarı kontrol noktası yolağında bulunan merkezi

bir öneme sahip iletim (transdüser) proteinidir. Bu iletim poteini 543 aminoasitten

ibaret olup, dört farklı fonksiyonel bölgeye sahiptir:


3

1) Serin:Glutamin/Treonin:Glutamin (SQ/TQ) dizi bölgesi (19.-69. aminoasit

bölgesi): Bu bölge CHEK2 proteininin amino (NH2) uç bölgesindedir. Bu bölgede

serin-glutamin (SQ) veya treonin-glutamin (TQ) aminoasit dubletlerinin 7 tanesinin

bir araya gelmesinden oluşan bölge dikkat çekicidir (örn. SQ, TQ, SQ, TQ, SQ, TQ,

SQ veya SQ, TQ, SQ, SQ, SQ, SQ, TQ). Çünkü CHEK2 proteininin bu bölgesi ATM

(ataxia telangiectasia mutated)/ATR (ataxia telangiectasia ve Rad3 ilişkili)

proteinleri tarafından fosforile edilir. Bu yüzden CHEK2 proteininin bu bölgesi

düzenleyici fonksiyona sahip bir bölgedir (Şekil 1.2.) (Bartek ve ark., 2001).

2) Forkhead’e benzer bölge (FHA) (115.-175. aminoasit bölgesi): CHEK2

proteininin diğer bir anahtar role sahip bölgesidir. İlk defa Forkhead (çatalbaş)

transkripsiyon faktörlerinde bu Forkhead’e (çatalbaş) benzer bölgeler

kimliklendirilmiştir. Daha sonraları bu bölgelerin bir çok proteinde ve özellikle de

nükleus içindeki proteinlerde bulunduğu bildirilmiştir. Bu bölgenin fosforlanmış

treonin aminoasitlerine bağlandığı belirlenmiştir. Bu bulgular, bu bölgenin protein-

protein etkileşiminde rolü olduğunu ortaya çıkarmıştır. Bu bölge CHEK2 proteininin

substratları ile dinamik etkileşiminde görevlidir (Şekil 1.2.) (Bartek ve ark., 2001).

3) Serin/Treonin kinaz bölgesi (226.-486. aminoasit bölgesi): Bu bölge

CHEK2 proteininin karboksil (COOH) uç bölgesinin yaklaşık yarısını

oluşturmaktadır. Serin/Treonin kinaz bölgesi CHEK2 proteininin anahtar

fonksiyonlu bölgesi olup, bu fonksiyona sahip olması başka Serin/Treonin kinazlar

ile homoloji göstermesinden kaynaklanmaktadır. Bu bölge içerisinde T-ilmeği (T-

loop) bulunur (Şekil 1.2) (Bartek ve ark., 2001).

4) Nükleer Lokalizasyon Sinyal (NLS) bölgesi (515.-522. aminoasit bölgesi):

Bu bölge bir veya daha fazla sayıda pozitif yüklü lizin veya arjinin aminoasitlerini

bulunduran bölgedir. Proteinin bu bölgesi molekülün Nükleer Por Kompleks aracılığı

ile hücrenin nükleusuna taşınmasında görev alan hedef bölgedir. Çünkü Sitozolik

Nükler Transport Reseptörleri yeni sentezlenmiş CHEK2 proteinini bu sinyal

bölgesinden tanıyarak nükleusa taşır (Şekil 1.2.) (Bartek ve ark., 2001).

CHEK2 proteini hücre döngüsü süresince hücre içerisinde aktif olmayan bir

formda bulunur. Hücre içerisinde DNA hasarı meydana geldiğinde hasar sinyali

sensörler (algılayıcılar) tarafından algılandıktan sonra CHEK2 proteini, ATM/ATR


4

Kinaz bölgesi

Kinaz bölgesi

Otofosforilasyon

Kinaz bölgesi

T ilmeği

Şekil 1.2. İnsan CHEK2 Proteininin Yapısı ve Aktivasyon Noktaları. Şeklin alt kısmında görülen rakamlar CHEK2 proteininin fonksiyonel bölgelerinin aminoasit aralıklarını göstermektedir. Üst kısımda kalın yazılmış olan bölgeler CHEK2 proteininin fonksiyonunun düzenlenmesi sırasında fosforlanan aminoasitleri, diğerleri DNA hasarına yanıt sırasında fosforlanan aminoasitleri göstermektedir (Antoni ve ark., 2007).

aracılığı ile SQ/TQ dizi bölgesi içinde bulunan treonin 68 (T68) aminoasiti üzerinden

fosforile edilir. Bu fosforilasyonu sonucunda CHEK2 proteini treonin 383 (T383) ve

treonin 387 (T387) üzerinden de otofosforilasyon ile aktif forma dönüşür (Şekil 1.3.)

(Bartek ve ark., 2001). Hücresel proteinlerin fosforilasyonu, fosforlanmış bu

proteinlerin hızlı ve spesifik düzenlenmesini, diğer proteinlerle ve moleküllerle

etkileşimini ve bu proteinlerin hücre içi lokalizasyonları (yerleşimini) gibi çok yönlü

fonksiyonlarını aktifleştirir. Bir çok protein kinaz çok çeşitli hücresel sinyalleri

başlatır veya yayar. Bu protein kinaz enzimleri bu görevlerini ATP (adenozin

trifosfat)’den protein kinaz enziminin substratına fosfat gruplarını transfer ederek

substratın (=protein) modifikasyonunu (değişimini) tamamlayarak gerçekleştirirler.

Şekil 1.3. CHEK2 Proteininin Aktivasyon Modeli


5

DNA çift iplik kırığı Alkilleyici ajanlar Replikasyon stresi

DNA-hasarı sensörü

DNA-hasarı sinyalinin iletimi

DNA-hasarı sinyali effektörleri

DNA tamiri Apopitozis Apopitozis G1’de durdurulma

Yaşlanma

S ve G2’de durdurulma

G2’de durdurulma

DNA hasarının meydana gelmesi DNA hasarına spesifik protein

komplekslerinin oluşumunu başlatır. DNA çift iplik kırığının meydana gelmesi, çift

iplik kırık hasarına spesifik protein kompleksi olan MRN (MRE11(meiotic

recombination 11)-RAD50-NBS1 (nibrin)) protein kompleksinin (sensör proteinler)

oluşumuna neden olur, bu kompleks de ATM’yi aktive eder. Aktive olan ATM,

CHEK2 proteinini fosforile eder. CHEK2 proteininin fosforlanması sonucunda

hücrede bir çok CHEK2 substratı, fosforilasyon ile aktive olur. CHEK2

substratlarının fonksiyonları sonucunda, DNA hasarı meydana gelen hücrenin

yaşamının geleceği belirlenir (Şekil 1.4.) (Antoni ve ark., 2007).

Şekil 1.4. DNA-hasarı Kontrol Noktası Yolağının Şematik Görünümü. Yeşil ile

boyanan semboller CHEK2 proteinine spesifik olan substratları, mavi olanlar CHEK1 proteinine spesifik substratları göstermektedir. Kırmızı ile gösterilenler hem CHEK2 hem de CHEK1 tarafından ortak olarak kullanılan substratlardır (Antoni ve ark., 2007).


6

CHEK2, BRCA1 (breast cancer 1) proteininin serin 988 (S988) aminoasitini

fosforile ederek DNA tamirini başlatır (Şekil 1.4.). Buna ek olarak CHEK2 bir

transkripsiyon faktörü olan FOXM1 (forkhead box M1)’i fosforile ederek bu

transkripsiyon faktörünün stabilitesini artırır. FOXM1 transkripsiyon faktörü

homolog rekombinasyon DNA tamir mekanizmasında görev alan BRCA2 (breast

cancer 2) ve baz eksizyon (kesip-çıkarma) tamir mekanizmasında görev alan XRCC1

(X-ray repair cross complementing protein 1) genlerinin ekspresyonlarını artırır (Lee

ve ark., 2000; Zhang ve ark., 2004; Wang ve ark., 2006a; Wang ve ark., 2006b; Tan

ve ark., 2007).

DNA’da meydana gelen hasarın tamir edilebilmesi için hücre DNA sentezini

ve hücre döngüsünü durdurur. CHEK2 proteini, hücre döngüsünü düzenleyen anahtar

moleküllerden biri olan CDC25C (Cell division cycle 25 homolog C)’nin inhibisyon

aminoasiti olan serin 216 (S216)’yı fosforile ederek G2/M hücre döngüsü kontrol

noktasının gecikmesine ve hücrenin mitoz bölünmeye girişine engel olur (Matsuoka

ve ark., 1998; Blasina ve ark., 1999; Chaturvedi ve ark., 1999). Bununla birlikte

CHEK2 proteini, diğer bir hücre döngüsü düzenleyici proteini olan CDC25A (cell

division cycle 25 homolog A)’nın serin 123 (S123), serin 178 (S178) ve serin 292

(S292) aminoasitlerini fosforile ederek hücre döngüsünün G1 evresinin gecikmesine

ve S evresine girişini engeller. Ayrıca CHEK2 proteini, DNA’da hasar meydana

geldiğinde hücre döngüsünü G1/S ve G2/M hücre döngüsü kontrol noktalarında p53

(tumor protein p53) proteini yolu ile durdurulmasında görev yapar. CHEK2 proteini

p53 proteinini serin 20 (S20) aminoasitinden fosforile ederek p53’ün MDM2 (mouse

double minute 2 homolog) ile ilişkisini bozarak p53’ün stabilitesini artırır. DNA’da

hasarlar meydana geldiğinde bir transkripsiyon faktörü olan AATF (apoptosis-

antagonizing transcription factor), ATM ve CHEK2 tarafından fosforile edilerek

aktive edilir. AATF transkripsiyon faktörü p53 ekspresyonunu artırır. Ayrıca DNA

hasarı durumunda p53’ün serin 366 (S366) ve treonin 387 (T387) aminoasitleri

CHEK2 proteini tarafından fosforlanarak p53 proteini aktive edilir (Şekil 1.4.)

(Antoni ve ark., 2007).

Hücre tamir edemeyeceği kadar DNA hasarı ile karşılaştığı zaman apopitozisi

başlatır. Tamir edilemeyen DNA hasarına yanıt olarak CHEK2 proteini bir çok


7

substrat ile etkileşimi sonucunda apopitozisi başlatır. CHEK2 proteini tamir

edilemeyen DNA çift iplik kırık hasarlarına yanıtta bir tanskripsiyon faktörü olan

E2F1 (E2F transcription factor 1)’in serin 364 (S364) aminoasitini fosforile eder. Bu

fosforilasyon sonucunda E2F1’in stabilitesi ve transkripsiyonel aktivasyonu artar.

Bunun sonucunda p53’ten bağımsız olarak apopitozis gerçekleşir. Bundan başka

CHEK2 proteini, p53-bağımsız apopitozis’i tümör süpressör pre-myelötik lösemi

(PML= promyelocytic leukemia) proteinini, serin 117 (S117) aminoasitinden

fosforile ederek başlatır. PML bir çok pro-apopitotik yola aracılık eder (Şekil 1.4.)

(Antoni ve ark., 2007).

Hücre yaşlanması, hücre döngüsünün durdurulmasının bir formudur.

CHEK2’nin hücre yaşlanmasını indüklediği de bildirilmiştir. Sürekli replikasyon

sonucunda meydana gelen telomer erozyonu CHEK2’yi aktive eder. CHEK2 proteini

hücre yaşlanmasını p53 aracılığı ile başlatır (Antoni ve ark., 2007).

DNA-hasarı kontrol noktası yolağı evrimsel süreç boyunca mayalardan

insanlara kadar korunmuştur. İnsandaki CHEK2 geninin, Schizosaccharomyces

pompe’de bulunan Cds1 kinaz geni ve Saccharomyces cerevisia’da bulunan Rad53

kinaz geni ile homolog olduğu bulunmuştur (Allen ve ark., 1994; Murakami ve

Okayama, 1995). 1998 yılında insan CHEK2 geni klonlanmıştır (Matsuoka ve ark.,

1998). CHEK2 geni 22. kromozomun uzun kolunda bulunmaktadır (22q12.1).

CHEK2 geni yaklaşık olarak 50 kilobaz uzunluğunda ve 14 ekzondan meydana

gelmektedir (Şekil 1.5.). CHEK2 geninin 11.-14. ekzonları ile baz sıraları yönünden

yüksek homoloji gösteren DNA bölgeleri 2., 7., 10., 13., 15., 16., X ve Y

kromozomları üzerinde bulunmaktadır (Bartek ve ark., 2001).

Şekil 1.5. CHEK2 Geninin Yapısı. Şekilde, her ekzonun hangi anlamlı nükleotid çifti aralığında bulunduğu gösterilmiştir. Genin toplam uzunluğu (ekzon+intron) 50 kb kadardır.


8

Kinaz Bölgesi

Bugüne kadar meme, kolorektal, akciğer, mesane, ovaryum kanserlerinde,

lenfomalarda [Akut Lenfoid Lösemi (ALL), non-Hodgking Lenfoma (NHL)] ve Li-

fraumeni sendromunda CHEK2 geni içerisinde bir çok mutasyon tanımlanmıştır

(Bartek ve Lukas, 2003) (Şekil 1.6). Bu mutasyonlar içerisinde en çok dikkati çeken

mutasyonlardan biri CHEK2 proteininin Serin/Treonin kinaz bölgesini oluşturan

ekzon 10’da meydana gelen CHEK2 1100delC mutasyonudur. CHEK2 1100delC

mutasyonu genin 1100. pozisyonunda bulunan tek sitozin nükleotidinin delesyonu

sonucunda ortaya çıkan çerçeve kayması (frameshift) tipi gen mutasyonudur.

Delesyonun meydana geldiği kodon, 360. kodondur. CHEK2 360. kodon ve bu

kodondan sonraki tüm kodonların aminoasit anlamları değişir ve bununla birlikte

380. kodon bir stop (durdurucu) kodona dönüşür. Bu mutasyon sonucunda yarım

(=kesik, truncated) protein oluşur ve bu protein, serin/treonin kinaz fonksiyonuna

sahip değildir (Wu ve ark., 2001).

Şekil 1.6. CHEK2 Geni İçersinde Bu Güne Kadar Tanımlanmış Mutasyonlar.

CHEK2 geninde belirlenen diğer bir mutasyon I157T mutasyonudur. Bu

mutasyon CHEK2 proteininin FHA bölgesi içersinde bulunan 157. kodonun

belirlediği izolösin aminoasitinin treonin aminoasitine dönüşümüne neden olur

(yanlış anlamlı =missense). Bu mutasyon 470. nükleotid olan Timin’in (T) Sitozin’e

(C) dönüşmesi şeklindeki transisyon tipi nokta mutasyonudur. Bu mutasyon I157T

[İzolösin (ATT) 157 à Treonin (ACT)] şeklinde gösterilmektedir. Yapılan

çalışmalar I157T mutasyonuna sahip CHEK2 proteininin bozulmamış ve normal bir


9

şekilde aktive olduğunu göstermiştir. Fakat aynı çalışmalarda, CHEK2 I157T

mutasyonunun CHEK2 proteini ile CHEK2’nin substratları olan p53, BRCA1 ve

CDC25A proteinleri arasındaki etkileşimi bozduğu gösterilmiştir. CHEK2 I157T

mutant proteini doğal-tip CHEK2’i proteini ve CHEK2 I157T mutant proteini ile

dimer teşkil edebilmektedir. CHEK2 I157T mutasyonunu heterozigot olarak

bulunduran bireylerde aynı hücre içerisinde mutasyona uğramış allelin oluşturduğu

protein ile yabani tip allelin meydana getirdiği proteinin dimer oluşturarak CHEK2

proteininin inaktivasyonuna neden olduğu ve bu mutant proteinin hücrede bu şekilde

dominant negatif etki gösterdiği saptanmıştır. Bununla birlikte CHEK2 I157T mutant

proteininin bozulmuş oligomerizasyonu CHEK2 I157T mutant proteinlerinde

otofosforilasyonu azaltmaktadır. CHEK2 I157T mutant proteinindeki bu değişim bu

proteinin fonksiyonlarını azaltmaktadır (Falck ve ark., 2001a; Falck ve ark., 2001b;

Li ve ark., 2002; Schwarz ve ark., 2003).

Bir diğer mutasyon ise CHEK2 geninin 2. intronunun [intervening sequence

(IVS) intragenic region] ilk nükleotidinde meydana gelen, Guanin (G) nükleotidinin

Adenin (A) nükleotidine dönüşümü şeklindeki transisyon tipi nokta mutasyonudur ve

IVS2 + 1G>A şeklinde gösterilmektedir. CHEK2 IVS2 + 1G>A mutasyonu mRNA

modifikasyonu yapılırken 2. intronun kesip-çıkarma (splicing) işleminin yapıldığı

tanınma bölgesindedir. Bu mutasyon anormal bir ilmek olayına neden olur. Anormal

ilmek olayının gerçekleşmesi sonucunda pre-mRNA’nın yanlış işlenmesi meydana

gelir. Böyle işlenmiş olgun mRNA’nın 3. ekzonunun 5’ tarafına 4 nükleotidin

girmesi gerçekleşmiş olur (Şekil 1.7). 4 nükleotidin ekzon 3 içerisine bu girişi

sonucunda bu noktadan sonra tüm kodonların aminoasit belirleyen anlamları değişir

ve ayrıca CHEK2 geninin 3. ekzon bölgesinde anlamsız (stop) kodon oluşur. Bu

mutasyonu taşıyan CHEK2 geninden sentezlenen CHEK2 proteininin FHA ve

serin/treonin kinaz bölgeleri yoktur. Western blot analizleri IVS2 + 1G>A

mutasyonunu taşıyan hücre hatlarında CHEK2 protein düzeyinin yok denecek kadar

az olduğunu göstermiştir (Dong ve ark., 2003)


10

Ekzon-3Ekzon-2

Normal ilmek

Anormal ilmek

CHEK2 IVS2 + 1G>A

İntron-2

Şekil 1.7. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonu Sonucu Oluşan Anormal İlmek

İşte hücrenin DNA-hasarı kontrol noktası yolağında bulunan CHEK2 geninde

yukarda belirttiğimiz mutasyonların meydana gelmesi sonucu hücrenin DNA-hasarı

kontrol noktası yolağı bozulmuş olur ve böyle bireylerin tümörleşmeye karşı doğal

korunma mekanizmalarını kaybettikleri, hücre transformasyonuna ve kansere

yatkınlıklarının arttığı düşünülmektedir. Kontrol noktası yolağı hasarlı hücrelerde

DNA hasarlarınında fazla olduğunun bulunması, kanser biyolojisi çalışan

araştırmacıların bu kontrol noktası yolağı üzerindeki ilgilerini artırmıştır (Zhou ve

Elledge, 2000; Bradbury ve Jackson, 2003; Thompson ve Schild, 2002; Zhou ve ark.,

2003). Genin işlevini veya ifadesini bozan ve böylece kansere yakalanma riskini

artıran bu tip mutasyonların belirlenmesi ve populasyonlarda sıklıklarının

araştırılması kanserin mekanizmalarının anlaşılması ve tedavi yöntemlerinin

geliştirilmesi açısından oldukça önemlidir. CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve

1100delC mutasyonlarının bazı kanser türlerinin oluşumu üzerine etkilerini araştıran

bazı çalışmalar şunlardır:

CHEK2 1100delC mutasyonu ve meme kanseri oluşumu arasındaki ilişki

sağlıklı bireylerden oluşan kontrol grubu, BRCA1 ve BRCA2 mutasyonları

belirlenmemiş ve ailesel meme kanseri hikayesi mevcut olan meme kanserli hastalar

ile yapılan çalışma ile araştırılmıştır (Meijers-Heijboer ve ark., 2002). Kontrol grubu


11

ile meme kanserli grup karşılaştırıldığında CHEK2 1100delC mutasyonunun meme

kanseri oluşumunu 2 kat artırdığı ve bu artışın istatistiksel olarak önemli olduğu

bildirilmiştir.

Vahteristo ve ark. (2002), tarafından CHEK2 1100delC mutasyonunun frekansı

mini baz sırası saptama yöntemi ile Finlandiya kökenli sağlıklı bireylerde, meme

kanserli hastalarda ayrıca BRCA1 ve BRCA2 mutasyonları saptanmayan ve ailesel

meme kanseri öyküsü bulunan meme kanserli hastalarda araştırılmıştır. Bu

araştırmada meme kanserli hasta grubu ile kontrol grubu arasındaki farkın

istatistiksel olarak önemsiz olduğu, fakat ailesel meme kanserli hasta grubu ile

kontrol grubu arasındaki farkın istatistiksel olarak anlamlı olduğu ve CHEK2

1100delC mutasyonunun meme kanseri oluşumunu 4.2 kat artırdığı saptanmıştır

(p=0.0002).

Kilpivaara ve ark. (2004), tarafından yapılan çalışmada, meme kanserli

hastalarda ve sağlıklı kontrolde I157T mutasyonunun frekansı mini baz sırası

saptama, direk baz sırası saptama ve değişime hassas jel elektroforez yöntemleri ile

araştırmıştır. I157T mutasyonunun meme kanseri oluşumunu 1.43 kat artırdığı

saptanmıştır (p=0.021).

Bogdanova ve ark. (2005), tarafından CHEK2 I157T ve IVS2 + 1G>A

mutasyonlarının meme kanseri ile ilişkisi iki farklı populasyondan oluşturulmuş iki

farklı grupta polimeraz zincir reaksiyonu-restriksiyon fragmenti uzunluk

polimorfizmi (PCR-RFLP) yöntemi ile araştırılmıştır. İlk grup alman kökenli meme

kanserli hastadan ve sağlıklı bireyden meydana gelen kontrol grubundan

oluşturulmuştur. Diğer grup Beyaz Rusya kökenli meme kanserli hasta ve sağlıklı

bireyden oluşan kontrol grubundan meydana getirilmiştir. I157T mutasyonunun

meme kanser oluşumunu Alman kökenli meme kanserli hastalarda 3.6 kat (p=0.044)

Beyaz Rusya kökenli meme kanserli hastalarda 4.5 kat artırdığı belirlenmiştir

(p=0.005). IVS2 + 1G>A mutasyonunun meme kanseri oluşumu artırmadığını

belirlenmiştir. Araştırıcılar, CHEK2 I157T mutasyonunun ailesel meme kanseri

yatkınlığına katkıda bulunan bir mutasyon olduğu sonuçuna varılmışlardır.

Seppälä ve ark. (2003), tarafından yapılan çalışmada, Finlandiya

populasyonundan prostat kanserli hastalarda CHEK2 1100delC ve I157T


12

mutasyonlarının frekansları ve bu mutasyonların prostat kanseri oluşumu ile ilişkileri

tek zincir konformasyon polimorfizmi ve mini baz sırası saptama yöntemleri ile

araştırılmıştır. Çalışmanın hasta populasyonunda ailesel prostat kanseri öyküsü

bulunan prostat kanserli hastalar ve ailesel kanser öyküsü bulunmayan prostat

kanserli hastalar bulunmaktadır. Ayrıca çalışmaya sağlıklı 480 bireyden oluşturulan

kontrol grubu da dahil edilmiştir. Yapılan analizler sonucunda, CHEK2 1100delC ve

I157T mutasyonlarının oranlarının ailesel prostat kanserli grup ile kontrol grubu

arasında istatistiksel olarak anlamlı derecede farklılık gösterdiği [p=0.02 (1100delC)

ve p=0.04 (I157T)] fakat kontrol grubu ile ailesel olmayan prostat kanserli grup

arasında bu iki mutasyon yönünden istatistiksel olarak önemli bir farklılığın olmadığı

saptanmıştır.

Cybulski ve ark. (2004a), Polanyalı prostat kanserli ve sağlıklı bireylerde

CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının frekanslarını PCR-

RFLP ve allele spesifik oligonükleotid-PCR yöntemleri ile araştırmışlardır. Bu

mutasyonlar prostat kanser riskini 3.4 kat artırmıştır (p=0.004). Araştırıcılar bu

mutasyonların ailesel prostat kanser riskini 9 kat artırdığını (p=0.0002)

belirtmişlerdir. I157T yanlış anlamlı mutasyonu prostat kanser riskini 1.7 kat

artırmıştır (p=0.03). Aynı zamanda I157T mutasyonu ailesel prostat kanserli

hastalarda %16 oranında bulunmuş ve ailesel prostat kanserli hastalarda prostat

kanseri riskini 3.8 kat artırdığı bildirilmiştir (p=0.00002).

Cybulski ve ark. (2004b), tarafından 4008 kanserli (mesane, meme, kolon,

böbrek, larinks, akciğer, melanoma, Non-Hodgking lenfoma, ovaryum, pankreas,

prostat, mide, tirod) hastada ve 4000 sağlıklı kontrol grubunda I157T, IVS2 + 1 G>A

ve1100delC mutasyonlarının frekansı PCR-RFLP ve allele spesifik oligonükleotid-

PCR yöntemleri ile araştırılmıştır. Bu araştırmada, 1100delC ve IVS2 + 1 G>A

mutasyonlarının tiroit kanseri oluşumunu 4.9 kat (p=0.0006), meme kanser

oluşumunu 2.2 kat (p=0.02) ve prostat kanseri oluşumunu 2.2 kat (p=0.04) artırdığı

saptanmıştır. I157T mutasyonunun meme kanseri oluşumunu 1.4 kat (p=0.02), kolon

kanser oluşumunu 2 kat (p=0.001), böbrek kanseri oluşumunu 2.1 kat (p=0.0006),

prostat kanseri oluşumunu 1.7 kat (p=0.002) ve tiroit kanseri oluşumunu 1.9 kat

(p=0.04) artırdığı belirlenmiştir.


13

Bartsch ve ark. (2006), tarafından yapılan araştırmada CHEK2 I157T, IVS2 +

1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının ailesel pankreas kanseri ile ilişkileri

araştırılmıştır. Araştırıcılar pankreas kanseri ile CHEK2 mutasyonları arasındaki

ilişkinin önemli olmadığını bildirmişlerdir.

Brennan ve ark. (2007), tarafından CHEK2 I157T mutasyonu ile akciğer,

skuamöz (yassı hücre) üst solunum yolu ve böbrek kanseri oluşumu arasındaki ilişki

araştırılmıştır. CHEK2 I157T mutasyonunun akciğer kanseri ile skuamöz üst

solunum yolu kanserinin oluşumunu azalttığı bildirilmiştir.

Zlowocka ve ark. (2008), tarafından yapılan araştırmada CHEK2 I157T, IVS2

+ 1 G>A, 1100delC ve del5395 mutasyonlarının mesane kanseri oluşumu ile

ilişkileri Polonya kökenli ve mesane kanserli hastalar ile kontrol grubunda

araştırılmıştır. Yapılan analizler CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A, 1100delC ve

del5395 mutasyonlarının mesane kanseri oluşumunu kontrol grubuna kıyasla 1.9 kat

artırdığı ve bu artışın istatistiksel olarak anlamlı olduğu bildirilmiştir (p=0.0003).

Araştırıcılar, CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A, 1100delC ve del5395 mutasyonlarının

Polonya populasyonunda mesane kanseri oluşumunu artırdığını bildirmişlerdir.

Suspitsin ve ark. (2009), tarafından Rus populasyonunda CHEK2 1100delC ve

IVS2 + 1 G>A mutasyonların ovaryum kanseri oluşumu üzerine etkileri

araştırılmıştır. Araştırıcılar CHEK2 geninin ovaryum kanserinin oluşumuna

katkısının olmadığını bildirmişlerdir.

Bugüne kadar CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının

hepatoselüler kanser oluşumu üzerine etkileri araştırılmamıştır. Bunun yanında Türk

populasyonunda kolorektal kanserli fertlerde CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve

1100delC mutasyonlarının sıklıkları ve kolorektal kanser ile ilişkileri de

araştırılmamıştır. İşte bu çalışmanın amacı CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve

1100delC mutasyonları ile hepatoselüler kanser arasında bir ilişkinin olup olmadığını

ve kolorektal kanserli Türk bireylerde ve herhangi bir kanser tanısı konmamış

sağlıklı bireylerden oluşan kontrol grubunda söz konusu mutasyonların frekanslarını

Polimeraz Zincir Reaksiyonu-Restriksiyon Fragmenti Uzunluk Polimorfizmi (PCR-

RFLP) ve Amplifikasyon Refrakter Mutasyon Sistemi-Polimeraz Zincir Reaksiyonu

(ARMS-PCR) yöntemleri ile araştırmaktır.


14

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Süleyman BAYRAM

15

2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR

CHEK2 geni içerisinde bir çok kalıtsal mutasyon tanımlanmıştır. Fonksiyonel

olmayan CHEK2 proteininin meydana gelmesine neden olan CHEK2 I157T, IVS2 +

1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının birçok kanserin oluşumu üzerine etkileriyle

ilgili yapılan çalışmalar şu şekilde özetlenebilir.

2.1. CHEK2 Mutasyonlarının Akciğer Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle

İlgili Yapılmış Çalışmalar

Brennan ve ark. (2007), tarafından CHEK2 I157T mutasyonu ile akciğer ve

skuamöz (yassı hücre) üst solunum yolu kanseri oluşumu arasındaki ilişki 3061

kanserli hasta ve 4000 sağlıklı bireyden oluşan kontrol grubunda araştırılmıştır.

Çalışmadaki hasta grubu 2250 akciğer kanserli ve 811 skuamöz üst solunum yolu

kanserli (yassı hücreli karsinom) bireylerden oluşturulmuştur. CHEK2 I157T

mutasyonlu fertlerde akciğer kanseri ile skuamöz üst solunum yolu kanserinin

mutasyon olmayan fertlerdekine nazaran daha az oranda meydana geldiğini

belirtmişlerdir.

CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A, 1100delC ve del5395 mutasyonlarının akciğer

ve gırtlak kanser ile ilişkileri Polonya populasyonunda araştırılmıştır (Cybulski ve

ark., 2008). Araştırma 895 akciğer kanserli hasta ve 430 gırtlak kanserli hasta ve

6391 sağlıklı bireyden oluşturulan kontrol grubu ile yapılmıştır. Akciğer kanserli

grup içerisinde bu mutasyonları bulunduranların oranı %1.8 (16/895), gırtlak kanseri

gelişen hastalarda %3.5 (15/430) ve sağlıklı kontrol grubunda %5.8 (370/6391)

oranında saptanmıştır. Yapılan analizler CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A, 1100delC ve

del5395 mutasyonlarının akciğer ve gırtlak kanserine yakalanma riskini Polonya

populasyonunda kontrol grubu ile kıyaslandığında azalttığı ve her iki kanser türü için

bu mutasyonların koruyucu etkisi olduğunu ve bu etkinin istatistiksel olarak anlamlı

olduğunu göstermiştir. Araştırıcılar bu mutasyonlar nedeniyle hücre ölümünün

azaldığını ve bu yüzden hücre bölünmesinin daha az meydana geldiği, sigara gibi


16

oldukça tehlikeli bir çevresel etmenin fazla olduğu bu tip kanserlerde kanser

oluşumunun azalabileceği görüşünü ileri sürmüşlerdir.

2.2. CHEK2 Mutasyonlarının Beyin Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili

Yapılmış Çalışmalar

El Hallani ve ark. (2009), tarafından yapılan araştırmada en yaygın beyin

tümörü olan glioma ile CHEK2 1100delC mutasyonu arasındaki ilişki araştırılmıştır.

Araştırmaya ailesel glioma hikayesi olan 79 glioma tanısı almış hasta katılmıştır. 79

hastanın hiçbirinde CHEK2 1100delC mutasyonu saptanmamıştır. Araştırıcılar,

CHEK2 1100delC mutasyonunun ailesel gliomaya yatkınlık için bir risk faktörü

olmadığını ve bu mutasyonun bu tür kanserde bir rolünün olmadığını bildirmişlerdir.

2.3. CHEK2 Mutasyonlarının Böbrek Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle


Cybulski ve ark. (2004b), 4008 kanserli (mesane, meme, kolon, böbrek, larinks,

akciğer, melanoma, Non-Hodgking lenfoma, ovaryum, pankreas, prostat, mide, tirod)

hastada ve 4000 sağlıklı kontrol grubunda 1100delC, IVS2 + 1 G>A ve I157T

mutasyonlarının frekanslarını PCR-RFLP (restriksiyon fragmenti uzunluk

polimorfizmi) ve allele spesifik oligonükleotid-PCR yöntemleri ile araştırmışlardır.

Çalışılan mutasyonlar içerisinde sadece I157T mutasyonunun böbrek kanseri

oluşumunu 2.1 kat (p=0.0006) arttırdığı saptanmıştır.

Brennan ve ark. (2007), tarafından CHEK2 I157T mutasyonu ile böbrek

kanseri oluşumu arasındaki ilişki 954 böbrek kanserli hasta ve 4000 sağlıklı bireyden

oluşan kontrol grubunda araştırılmıştır. Araştırıcılar, CHEK2 I157T mutasyonunun

böbrek kanseri oluşumunu zayıfta olsa artırdığını bildirmişlerdir.

2.4. CHEK2 Mutasyonlarının Kolorektal Kanser Oluşumu Üzerine Etkileri İle



17

CHEK2 1100delC mutasyonunun frekansı ailesel kolorektal kanser geçmişi

olan 149, ailesel kolorektal kanser hikayesi olmayan 513 kolorektal kanserli hastada

ve toplam olarak 662 kolorektal kanserli hastada araştırılmıştır (Kilpivaara ve ark.,

2003). Bu çalışmada, mutasyon sıklığı 662 kolorektal kanserli hastada %2.6 (17/662)

oranında, ailesel kolorektal kanser öyküsü bulunan hasta grubunda %1.3 (2/149) ve

ailesel olmayan 513 vakada %2.9 (15/513) oranında tespit edilmiştir. Vahteristo ve

ark. (2002), tarafından yapılan araştırmada Finlandiya kökenli 1885 sağlıklı

kontrolde CHEK2 1100delC mutasyonunun frekansının %1.4 olduğu bildirilmişti.

Bu araştırmada, % 1.4 oranındaki 1100delC mutasyon sıklığı ve Finlandiyanın diğer

bölgelerinden gelen sağlıklı populasyonun mutasyon frekansları düzenlenip CHEK2

1100delC mutasyonunun frekansı %1.9 olarak kabul edilerek istatistiksel analizler

yapılmıştır. Finlandiya kökenli sağlıklı populasyonun düzenlenmiş mutasyon sıklığı

ile ailesel olan veya olmayan kolorektal kanserli gruplar ayrı ayrı veya tüm

kolorektal kanserli hastalar bir bütün olarak analiz edildiklerinde hiçbir istatistiksel

farklılığın gözlemlenmediği saptanmıştır. Araştırıcılar, CHEK2 1100delC

mutasyonunun kolorektal kansere yatkınlık alleli olmadığını, fakat bu mutasyonun

kolorektal kanser üzerinde oldukça düşük düzeyde bir etkisinin olduğunun göz ardı

edilmemesi gerektiğini bildirmişlerdir.

Lipton ve ark. (2003), çok sayıda kolorektal adenoması bulunan ve aralarında

kolorektal kanser gelişmiş 149 hastada CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı

DNA dizi analizi yöntemi ile belirlenmiştir. CHEK2 1100delC mutasyonunun

frekansının %2 (3/149) oranında olduğu saptanmıştır. Araştırıcılar, kendi bulmuş

oldukları sonuçları CHEK2 1100delC mutasyonunun %1.1’lik populasyon frekansı

(Meijers-Heijboer ve ark., 2002) ile karşılaştırarak, CHEK2 1100delC mutasyonunun

kolorektal kanser oluşumunu artırmadığını bildirmişlerdir (p=0.26).

Meijers-Heijboer ve ark. (2003), tarafından yapılan çalışmada CHEK2

1100delC mutasyonunun sıklığı ve ailesel kolorektal kanser ile ilişkisi, ailesel

kolorektal kanserli 329 aileden oluşan hasta grubunda araştırılmıştır. Çalışmaya

katılan ailesel kolorektal kanserli aileler kolorektal kanserin türüne göre ailesel

adenomatöz polipozis (kolon ve rektumda oluşan 100-1000’lerce adenom polipler)

(95 aile) ve ailesel nonpolipozis kolorektal kanser (kolonda çok sayıda polip


18

oluşumu) (234 aile) olarak iki farklı grup şeklinde gruplandırılmıştır. Araştırmada

kontrol grubu olarak, Meijers-Heijboer ve ark. (2002)’nın sağlıklı populasyondaki

%1.1 (18/1620) oranındaki CHEK2 1100delC mutasyon frekansı kullanılmıştır.

Ailesel adenomatöz polipozis grubunda CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı %0

(0/95) oranında iken ailesel nonpolipozis kolorektal kanserli grupta %2.6 (6/234)

olarak saptanmıştır. Kontrol grubu ile ailesel nonpolipozis kolorektal kanserli grup

CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı bakımından karşılaştırıldığında aradaki

farkın istatistiksel olarak anlamlı olmadığı gösterilmiştir (p=0.07).

Cybulski ve ark. (2004b), tarafından yapılan çalışmada 4008 kanserli (mesane,

meme, kolon, böbrek, larinks, akciğer, melanoma, Non-Hodgking lenfoma, ovaryum,

pankreas, prostat, mide, tiroit) hastada ve 4000 sağlıklı kontrol grubunda 1100delC,

IVS2 + 1 G>A ve I157T mutasyonlarının frekansları PCR-RFLP ve allele spesifik

oligonükleotid-PCR yöntemleri ile araştırılmıştır. Sıklıkları araştırılan mutasyonlar

içerisinde sadece I157T mutasyonunun kolon kanseri oluşumunu 2 kat (p=0.001)

arttırdığı diğer CHEK2 mutasyonlarının kolon kanseri oluşumu üzerine etkilerinin

olmadığı bildirilmiştir.

İspanyol kökenli kalıtsal nonpolipozis kolorektal kanser öyküsü bulunan 148

aileden ayrıca ailesel meme ve/veya ovaryum kanseri öyküsü bulunan 34 aileden

toplam 442 kanserli bireyde CHEK2 1100delC mutasyonunun frekansı araştırılmıştır

(Sánchez de Abajo ve ark., 2005). 442 bireyin hiçbirinde 1100delC mutasyonu

belirlenmemiştir. Araştırıcılar, İspanyol populasyonunda ailesel olarak görülen bu iki

tip kanserin CHEK2 1100delC mutasyonu ile bir ilişkilerinin olmadığı şeklinde bir

yorum yapmışlardır.

de Jong ve ark. (2005a), tarafından yapılan araştırmada 629 kolorektal kanserli

hastada, 50 yaşından önce kolorektal kanser tanısı alan 105 hastada ve 230 bireyden

meydana gelen kontrol grubunda CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı

araştırılmıştır. CHEK2 1100delC mutasyonunun oranı 629 kolorektal kanserli

hastada %1.6 (10/629), 50 yaşından önce kolorektal kanser tanısı konmuş kolorektal

kanserli hasta grubunda %0.9 (1/105) ve kontrol grubunda ise %0.4 (1/230) oranında

belirlenmiştir. İstatistiksel analizler sonucunda her iki kolorektal kanserli grup ile

kontrol grubu arasında istatistiksel olarak önemli bir farklılık görülmemiştir. Fakat


19

629 kolorektal kanserli hasta grubu kendi içerisinde ailesel kanser hikayesi olup ve

erken yaşta kolorektal kansere yakalananlar ve ailesel hikayeleri olmayıp geç yaşta

kolorektal kansere yakalananlar olarak tekrardan gruplandırıldığında CHEK2

1100delC mutasyonunun ailesel kanser öyküsü olan ve erken yaşta kolorektal

kansere yakalananlarda istatistiksel olarak anlamlı derecede fazla olduğu

saptanmıştır (p=0.014). Araştırıcılar araştırmanın sonucunun daha önceki bulgular ile

uyumlu olduğunu ve CHEK2 1100delC mutasyonunun kolorektal kanser oluşumunu

1.5-2 kat gibi bir artırıcı etkisinin olduğunu bildirmişlerdir.

Djureinovic ve ark. (2006), tarafından CHEK2 1100delC mutasyonu ile

kolorektal kanser arasındaki ilişki İsveç populasyonunda araştırılmıştır. Araştırmaya

174 ailesel kolorektal kanser öyküsü olan kolorektal kanser hastası, 644 sporadik

(ailede kalıtsal bir kanser olmayan) kolorektal kanser hastası ve 760 sağlıklı bireyden

oluşan kontrol grubu dahil edilmiştir. Ailesel kolorektal kanser öyküsü olan hasta

grubunda CHEK2 1100delC mutasyonunun oranı %1.15 (2/174), sporadik kolorektal

kanser grubunda %0.93 (6/644) ve kontrol grubunda ise %0.66 (5/760) olarak

belirlenmiştir. Kontrol grubu ile kolorektal kanser grupları arasında istatistiksel

olarak anlamlı farklılıkların olmadığı saptanmıştır. İsveç populasyonunda CHEK2

1100delC mutasyonunun kolorektal kanser oluşumunu artırmadığı fakat hasta ve

kontrol gruplarındaki birey sayılarının daha fazla olduğu çalışmalara gerek

duyulduğu araştırıcılar tarafından belirtilmiştir.

Isinger ve ark. (2006), Güney İsveç popuplasyonunda birincil olarak meme

veya kolorektal kanser gelişiminden sonra ikincil herhangi bir kanser geliştiren 75

kanser hastasında ve 300 sağlıklı bireyde CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığını

araştırmışlardır. Kanserli grupta CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı %2.7

(2/75) kontrol grubunda ise %1 (3/300) oranında belirlenmiştir. İki grup arasındaki

farkın istatistiksel olarak önemli olmadığı saptanmıştır (p=0.26). Araştırıcılar, İsveç

populasyonunda CHEK2 1100delC mutasyonunun birincil meme ve kolorektal

kanser için temel bir risk faktörü olmadığını ve rutin olarak bu mutasyonun klinikte

taranmasının bir yararının olmayacağı şeklinde bir fikir ileri sürmüşlerdir.

Kilpivaara ve ark. (2006), CHEK2 I157T mutasyonunun frekansını ailesel ve

sporadik kolorektal kanserli hastalarda PCR-RFLP yöntemi ile araştırmışlardır.


20

Çalışmada, 972 Finlandiya kökenli kolorektal kanserli hastanın ve 1885 sağlıklı

bireyin I157T mutasyon frekansı belirlenmiştir. Kolorektal kanserli hastalarda (%7.8,

76/972) I157T mutasyonunun sıklığı sağlıklı kontrol grubundan (%5.3, 100/1885)

daha yüksek oranda bulunmuştur. CHEK2 I157T mutasyonu kolorektal kanser

oluşumunu 1.5 kat artırmıştır (p=0.008). Araştırıcılar bu çalışmadan elde edilen

sonuçların, CHEK2 I157T mutasyonunun çok sayıda kanser türü için yatkınlık alleli

olduğu görüşünü desteklediğini bildirmişlerdir.

Weischer ve ark. (2007), tarafından yapılan araştırmada CHEK2 1100delC

mutasyonunun Danimarka populasyonunda meme, prostat ve kolorektal kanser

oluşumu üzerine etkisi araştırılmıştır. Çalışmaya Danimarka populasyonundan 9231

birey katılmıştır. Araştırmacılar, CHEK2 1100delC mutasyonunun kolorektal kanser

oluşumunu 1.6 kat artırdığını bildirmişlerdir.

Kleibl ve ark. (2009), tarafından Çek Cumhuriyeti populasyonunda CHEK2

1100delC, I157T, del5395 ve IVS2 + 1 G>A mutasyonlarının kolorektal kanser

oluşumu ile ilişkileri araştırılmıştır. Araştırmaya 631 kolorektal kanserli hasta ve 683

sağlıklı birey katılmıştır. Kolorektal kanser gelişmiş olan grupta tüm CHEK2

mutasyonlarının frekansı %6.2 (39/631) oranında bulunmuş iken kontrol grubunda

bu oran %2.8 (19/683) olarak bulunmuştur (p=0.003). CHEK2 I157T mutasyonunun

sıklığı kolorektal kanser ve kontrol grubunda sırasıyla %4.8 (30/631) ve %2.5

(17/683) olarak saptanmıştır. Yapılan istatistiksel analiz I157T mutasyonunun

kolorektal kanser oluşumunu 2 kat artırdığını ve bu artışın istatistiksel olarak anlamlı

olduğunu göstermiştir. CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı kolorektal kanserli

grupta %0.63 (4/631) iken kontrol grubunda ise %0.27 (2/730) olarak belirlenmiştir.

İki grup arasında 1100delC mutasyonu yönünden anlamlı bir farklılığın olmadığını

saptanmıştır. Kolorektal kanserli grupta CHEK2 del5395 mutasyonu hiç

bulunmamıştır. Kolorektal kanser gelişen hastalar ailesel kolorektal kanser öyküsü

olanlar ve olmayan olarak iki farklı gruba ayrılıp, her iki grup mutasyon sıklıkları

yönünden kontrol grubu ile karşılaştırıldıklarında bu mutasyonların ailesel kolorektal

kanser grubu ile kontrol grubu arasında anlamlı bir farklılığın olmadığı bildirilmiştir.

Araştırıcılar I157T mutasyonunun Çek Cumhuriyeti populasyonunda sporadik

kolorektal kanser için yatkınlık alleli olduğunu, fakat aynı durumun ailesel kolorektal


21

kanser öyküsü olan grup için söz konusu olmadığı araştırıcılar tarafından

bildirilmiştir.

Suchy ve ark. (2009), tarafından Polonya populasyonunda CHEK2 1100delC,

I157T, del5395 ve IVS2 + 1 G>A mutasyonlarının kalıtsal nonpolipozis kolorektal

kanser ve kalıtsal nonpolipozis kolorektal kanser ile ilişkili ailelerde kolorektal

kanser oluşumunu artırıp artırmadığı araştırılmıştır. Çalışmaya 463 kalıtsal

nonpolipozis kolorektal kanserli hasta ve 5496 sağlıklı bireyden oluşan kontrol grubu

katılmıştır. CHEK2 IVS2 + 1 G>A, 1100delC, del5395 ve I157T mutasyonlarının

sıklığı sırası ile %0.2 (1/463), %0.4 (2/463), %0.4 (2/463) ve %7.8 (36/463) olarak

saptanmıştır. Kontrol grubunda CHEK2 IVS2 + 1 G>A %0.4 (22/5496), 1100delC

%0.2 (12/5496), del5395 %0.4 (24/5496) oranlarında belirlenmiştir. Kolorektal

kanserli grupta tüm mutasyonların oranı %8.8 (41/463) olarak bulunmuş iken kontrol

grubunda %5.8 (322/5496) oranında tespit edilmiştir (p=0.01). Mutasyonlar ayrı ayrı

analiz edildiğinde kalıtsal nonpolipozis kolorektal oluşumunu CHEK2 I157T

mutasyonunun 1.7 kat artırdığı ve bu artışın istatistiksel olarak anlamlı olduğu

saptanmıştır. Diğer CHEK2 mutasyonlarının kalıtsal nonpolipozis kolorektal kanser

oluşumunu artırmadığı bildirilmiştir.

2.5. CHEK2 Mutasyonlarının Li-Fraumeni Sendromu Oluşumu Üzerine

Etkileri İle İlgili Yapılmış Çalışmalar

Siddiqui ve ark. (2005), tarafından CHEK2 1100delC mutasyonunun frekansı

p53 gen mutasyonu bulunmayan 15 Li-Fraumeni sendromlu (otozomal dominant

geçişli kalıtsal bir hastalık) hastada araştırılmıştır. CHEK2 1100delC mutasyonu

hiçbir hastada saptanmamıştır. Araştırıcılar CHEK2 1100delC mutasyonunun p53

gen mutasyonu bulunmayan Li-Fraumeni sendromunda bir risk faktörü olmadığını

bildirmişlerdir.

Ruijs ve ark. (2009), tarafından Hollanda populasyonunda p53 mutasyonu

olmayan 65 Li-Fraumeni sendromlu hastada CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı

ve Li-Fraumeni sendromu ile ilişkisi araştırılmıştır. CHEK2 1100delC mutasyonunun

sıklığı %6.2 (4/65) olarak belirlenmiştir. Araştırıcılar, Hollanda populasyonunda


22

CHEK2 1100delC mutasyonunun Li-Fraumeni sendromu için temel yatkınlık alleli

olmadığını bildirmişlerdir. Bununla birlikte çalışmanın sonuçlarından, 1100delC

mutasyonun TP53 mutasyonu olmayan kansere eğilimli ailelerde tümör gelişimine

katkıda bulunabilecek bir faktör olduğu şeklinde yorumlanmıştır.

2.6. CHEK2 Mutasyonlarının Lösemi Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili


Sellick ve ark. (2006), tarafından yapılan çalışmada kronik lenfositik lösemi

(lenfositlerin kan ve kemik iliği başta olmak üzere vücutta aşırı birikmesi) ile

CHEK2 1100delC mutasyonu arasındaki ilişki araştırılmıştır. Araştırmada, 973

kronik lenfositik lösemili hastada CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı

belirlenmiştir. 973 hasta, kronik lenfositik lösemi geçmişi olan 121 hasta ve ailesel

geçmişinde bu hastalık görülmeyen 852 hasta şeklinde iki farklı gruba ayrılmıştır.

CHEK2 1100delC mutasyonunun genel sıklığı %0.8 (8/973) olarak belirlenmiştir.

Ailesel olan (%0.8, 1/121) ve olmayan (%0.8 7/852) iki farklı grupta da mutasyon

sıklıklarının aynı olduğu saptanmıştır. Kronik lenfositik lösemili hastalardaki

CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı sağlıklı İngiliz populasyonundan elde edilen

mutasyon oranı ile karşılaştırıldığında aradaki farkın istatistiksel olarak önemli

olmadığı saptanmıştır (p=0.47). Ayrıca CHEK2 1100delC mutasyonu ile ailesel olan

veya olmayan kronik lenfositik lösemi arasında bir ilişkinin bulunmadığı, bununla

birlikte bu mutasyonun kronik lenfositik lösemi oluşumunu zayıfta olsa bir miktar

artırmış olabileceği bildirilmiştir.

2.7. CHEK2 Mutasyonlarının Meme Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili


Allinen ve ark. (2001), BRCA1, BRCA2 ve p53 gen mutasyonları bulunmayan

ve ailesel meme kanseri öyküsü olan Finlandiya populasyonundan 79 aileden 89

meme kanserli hastanın, 259 sporadik meme kanseri gelişen meme kanserli hastanın

ve 200 sağlıklı bireyin CHEK2 geninde mutasyon analizi çalışması yapmışlardır. Üç


23

farklı grup içerisinde sadece CHEK2 I157T mutasyonuna rastlanmıştır. Ailesel

meme kanserli 79 aileden 7’sinde (%8.9) CHEK2 I157T mutasyonu belirlenmiştir.

Sporadik meme kanserli grupta CHEK2 I157T mutasyonunun sıklığı %3.9 (10/259)

oranında iken sağlıklı bireylerde %6.5 (13/200) oranında belirlenmiştir. Araştırıcılara

göre, Finlandiya kökenli bireylerde CHEK2 I157T mutasyonu ailesel meme

kanserine yatkınlığı artırmamaktadır.

CHEK2 1100delC mutasyonu ve meme kanseri oluşumu arasındaki ilişki 1620

sağlıklı bireyden oluşan kontrol grubu ve BRCA1 ve BRCA2 mutasyonları

belirlenmemiş ve ailesel meme kanseri hikayesi mevcut olan 718 aileden 1071 meme

kanserli hasta ile yapılan çalışma ile araştırılmıştır (Meijers-Heijboer ve ark., 2002).

Sağlıklı bireylerden oluşan kontrol grubunda CHEK2 1100delC mutasyonunun

sıklığı %1.1 (18/1620) oranında iken BRCA1 ve BRCA2 mutasyonları olmayan ve

ailesel meme kanserli hasta grubunda %5.1 (55/1071) oranında belirlenmiştir.

Kontrol grubu ile meme kanserli grup karşılaştırıldığında CHEK2 1100delC

mutasyonunun meme kanseri oluşumunu 2 kat artırdığı ve bu artışın istatistiksel

olarak önemli olduğu bildirilmiştir. Bununla birlikte BRCA1 ve BRCA2

mutasyonları belirlenmeyen ailesel meme kanserli hastalardan 52’sinin erkek meme

kanserli hastalar olduğu ve 52 hastada CHEK2 1100delC mutasyonun %13.5 (7/52)

oranında bulunduğu saptanmıştır. Kontrol grubu ile yapılan karşılaştırmadan CHEK2

1100delC mutasyonunun ailesel erkek meme kanserli hastalarda meme kanseri

oluşumunu 10 kat artırdığı gösterilmiştir.

Sodha ve ark. (2002), tarafından yapılan çalışmada CHEK2 1100delC

mutasyonunun sıklığı, ailesel meme kanseri hikayesi bulunan 68 meme kanserli

hastada ve 300 sağlıklı bireyden oluşturulmuş kontrol grubunda araştırılmıştır.

CHEK2 1100delC mutasyonunun ailesel meme kanseri hikayesi olan grupta %4.4

(3/68) oranında bulunduğu bunun yanında 300 sağlıklı bireyin hiçbirinde CHEK2

1100delC mutasyonunun olmadığı saptanmıştır. Araştırıcılara göre, CHEK2

1100delC mutasyonu ailesel meme kanseri oluşumunu artırmaktadır.

Vahteristo ve ark. (2002), tarafından CHEK2 1100delC mutasyonunun frekansı

mini baz sırası saptama yöntemi ile Finlandiya kökenli 1885 sağlıklı bireyde, 1035

meme kanserli hastada ayrıca BRCA1 ve BRCA2 mutasyonları saptanmayan ve


24

ailesel meme kanseri öyküsü bulunan 507 meme kanserli hastada araştırılmıştır.

CHEK2 1100delC mutasyonunun frekansı sağlıklı bireylerden oluşturulmuş kontrol

grubunda %1.4 (26/1885) oranında, meme kanserli hasta grubunda %2 (21/1035),

bununla birlikte BRCA1 ve BRCA2 mutasyonları saptanmayan ailesel meme

kanserli hasta grubunda ise %5.5 (28/507) olarak bildirilmiştir. Meme kanserli hasta

grubu ile kontrol grubu arasındaki farkın istatistiksel olarak önemsiz olduğu

görülmüştür. Fakat meme kanserli hasta grubu ailesel meme kanseri hikayesi olanlar

ve olmayanlar olarak gruplandırıldığında, ailesel meme kanseri olan 358 hastada

CHEK2 1100delC mutasyon frekansının %3.1 (11/358) olduğu saptanmıştır. %3.1

oranındaki CHEK2 1100delC mutasyon frekansı kontrol grubu ile karşılaştırıldığında

aradaki farkın istatistiksel olarak önemli olduğu bildirilmiştir (p=0.021). Aynı

şekilde ailesel meme kanserli hasta grubu ile kontrol grubu arasındaki farkında

istatistiksel olarak anlamlı olduğu ve CHEK2 1100delC mutasyonunun meme

kanseri oluşumunu 4.2 kat artırdığı gösterilmiştir (p=0.0002). Ayrıca her iki memede

de kanser gelişen hastalarda CHEK2 1100delC mutasyon sıklığının tek memede

kanser gelişen hasta grubundan 6 kat daha fazla olduğu ve bu durumun istatistiksel

olarak önemli olduğu bildirilmiştir.

Meijers-Heijboer ve ark. (2003), tarafından BRCA1 ve BRCA2 mutasyonları

olmayan ve ailesel meme kanseri öyküsü bulunan 435 aileye ait hasta grubunda

CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı ve ailesel meme kanseri oluşumu arasındaki

ilişki araştırılmıştır. Araştırmaya katılan, BRCA1 ve BRCA2 mutasyonları olmayan

435 ailesel meme kanser öyküsü bulunan hastalar, meme kanseri ile birlikte

kolorektal kanser gelişenler ve meme kanseri ile birlikte kolorektal kanser

gelişmeyen olarak iki farklı gruba ayrılmıştır. Çalışmada kontrol grubu olarak,

Meijers-Heijboer ve ark. (2002)’nın sağlıklı populasyondaki %1.1 (18/1620)

oranındaki CHEK2 1100delC mutasyon frekansı kullanılmıştır. Meme kanseri ile

birlikte kolorektal kanser gelişen 55 ailesel meme kanserli grupta CHEK2 1100delC

mutasyonunun frekansı %18.2 (10/55), meme kanseri ile birlikte kolorektal kanser

gelişmeyen 380 meme kanserli grupta mutasyon oranı %4 (15/380) olarak

bulunmuştur. Ailesel meme kanserli grupların arasındaki bu farklılığın istatistiksel

olarak önemli olduğu gösterilmiştir (p<0.001). Araştırıcılar yeni tanımladıkları meme


25

kanseri ile birlikte kolorektal kanser oluşmuş bireylerde CHEK2 1100delC

mutasyonunun genetik bir faktör olabileceğini fakat bu fenotipteki kanserde

1100delC mutasyonunun temel yatkınlık alleli olmadığını ve henüz belirlenemeyen

yatkınlık geni veya genleri ile birlikte sinerjitik bir etkileşiminin olabileceğini

bildirmişlerdir.

Offit ve ark., (2003), yaptıkları çalışmada New York’lu 1665 sağlıklı gönüllü,

192 ailesel meme kanseri öyküsü olan meme kanserli hasta ve sporadik olarak meme

kanseri gelişen 108 hasta olmak üzere toplam 300 meme kanserli vakada CHEK2

1100delC mutasyonunun sıklığı belirlenmiştir. Sporadik meme kanserli gruptaki 46

hastanın her iki memesinde meme kanseri gelişmiş olduğu, bununla birlikte 16

hastanın da erkek meme kanserli hasta olduğu bildirilmiştir. CHEK2 1100delC

mutasyonunun frekansı meme kanseri grupta %1 (3/300) oranında iken sağlıklı

gönüllülerde %0.3 (5/1665) oranında saptanmıştır. Yapılan istatistiksel analiz

kanserli grup ile sağlıklı bireyler arasında CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığını

yönünden anlamlı bir farklılığın olmadığını göstermiştir (p=0.1). Araştırıcılar meme

kanseri oluşumuna göreceli olarak düşük bir katkısı bulunan, ayrıca düşük

populasyon frekansına sahip CHEK2 1100delC allelinin gelecekte Kuzey Amerika’lı

hastalarda klinikte rutin genetik bir test olarak uygulanabilirliğinin sınırlı bir şekilde

olabileceğini söylemişlerdir.

Oldenburg ve ark. (2003), tarafından BRCA1 ve BRCA2 mutasyonları

saptanmamış ve ailesel meme kanseri öyküsü olan 71 aileden 237 meme kanserli

hastada ve yine 71 ailenin 331 sağlıklı bireyinde CHEK2 1100delC mutasyonunun

frekansı araştırılmıştır. Meme kanserli hastalarda CHEK2 1100delC mutasyonunun

sıklığı %11.4 (27/237) oranında iken 331 sağlıklı hasta yakınında ise %4.2 (14/331)

olarak saptanmıştır. Meme kanserli hastalar ile bu hastaların yakınları olan sağlıklı

kontrol bireyleri arasında CHEK2 1100delC mutasyon sıklığının istatistiksel olarak

önemli derecede farklılık gösterdiği bildirilmiştir (p<0.001). 71 aile içerisinde en az

bir tane CHEK2 1100delC mutasyonunu taşıyan bireyin bulunduğu aile sayısının 15

(%21.1) olduğu bulunmuştur. Ayrıca CHEK2 1100delC mutasyonunu taşıyan

bireylerin meme kanserine yakalanma yaşının, bu mutasyonu taşımayan meme

kanserli hastalardan daha küçük olduğu bildirilmiştir.


26

Rajkumar ve ark. (2003), tarafından Güney Hindistan populasyonundan 35

yaşından küçük ve ailesel kanser geçmişi olan meme ve/veya ovaryum kanserli 22

hastada CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı denatüre edici yüksek performanslı

likit kromatografisi (dHPLC) yöntemi ile araştırmışlardır. Hastaların hiçbirinde

CHEK2 1100delC mutasyonunun bulunmadığı saptanmıştır.

Schutte ve ark. (2003), tarafından yapılan araştırmada CHEK2 I157T

mutasyonunun meme kanseri ile ilişkisi BRCA1 ve BRCA2 mutasyonları

bulunmayan ve ailesel meme kanseri hikayesi olan 605 aileden 737 meme kanserli

birey, BRCA1 ve BRCA2 mutasyonları belirlenmiş ve ailesel meme kanseri öyküsü

olan 335 aileden 459 meme kanserli hasta ve İngiltere, Hollanda ayrıca Kuzey

Amerika’dan toplam 723 sağlıklı bireyden oluşturulmuş kontrol grubu ile

araştırılmıştır. I157T mutasyonunun iki farklı ailesel meme kanseri hikayesi olan

grupta meme kanseri oluşumunu kontrol grubu ile karşılaştırıldığında artırmadığı

gösterilmiştir. Araştırıcılar, CHEK2 geninde tanımlanmış kalıtsal mutasyonlardan

sadece CHEK2 1100delC mutasyonunun meme kanserine yatkınlığa katkıda

bulunabileceğine işaret etmişlerdir.

Broeks ve ark. (2004), tarafından yapılan çalışmada birinci memede meme

kanseri geliştikten sonra ikinci memede de meme kanseri gelişen meme kanserli 233

hastada CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı belirlenmiştir. Bu çalışmada kontrol

grubu olarak sadece tek memede kanser gelişen ve kanser geliştikten sonra en az 5

yıl herhangi bir tür kanser gelişmeyen 191 birey kontrol grubu olarak kabul

edilmiştir. İkinci memede de kanser gelişen grupta CHEK2 1100delC mutasyonunun

oranı %6.4 (15/233) iken kontrol grubunda bu oran %1 (2/191) oranında

saptanmıştır. CHEK2 1100delC mutasyonunu bulunduran meme kanserli hastalarda

ikinci memede de meme kanseri gelişme riskinin 6.5 kat artığı bulunmuştur. İkinci

memede de kanser gelişen grup, birincil meme kanseri sonrasında radyoterapi

tedavisi alanlar (X-ışını, 1-10 gray) ve almayanlar olarak tekrar gruplandırılıp

CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı araştırıldığında radyoterapi alan grupta

(%7.7 13/169) 1100delC mutasyonunun oranının radyoterapi almayan gruptan (%3.1

2/64) daha fazla olduğu gözlemlenmiştir. Araştırıcılar, CHEK2 1100delC mutasyonu


27

taşıyan meme kanserli hastalarda radyoterapi tedavisinin ikinci memede de meme

kanseri gelişiminde klinik bir öneminin olabileceğini bildirmişlerdir.

Caligo ve ark. (2004), tarafından CHEK2 1100delC mutasyonunun İtalyan

populasyonunda meme kanseri ile ilişkisi araştırılmıştır. Araştırmaya toplam olarak

1273 birey katılmıştır. Bu bireylerin 939 meme kanseri tanısı konan hastalardan, 334

tanesi de sağlıklı kişilerden oluşturulmuştur. 939 meme kanserli hastada CHEK2

1100delC mutasyonunun sıklığı %0.11 (1/939) oranında iken sağlıklı bireylerde ise

%0 (0/334) oranında saptanmıştır. Mutasyon tespit edilen bireyin ailesinde CHEK2

1100delC mutasyonu tarandığında aile bireyleri içerisinde bu mutasyonu

bulunduranlarda her iki memede meme kanseri, pankreas kanseri ve akciğer kanseri

gelişen bireylerin olduğu bildirilmiştir. Araştırıcılar, CHEK2 1100delC

mutasyonunun meme kanseri oluşumu üzerine etkisinin populasyonlar arasında

sınırlı olduğunu ve bu mutasyonun muhtemelen sadece Kuzey Avrupa

populasyonunda meme kanseri oluşumu artırdığı şeklinde bir yorumda

bulunmuşlardır.

CHEK2 Meme Kanseri Vaka-Kontrol Konsorsiyumu (2004), tarafından yapılan

çalışmada CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı 10860 meme kanseri hastasında

ve 9065 bireyden oluşturulan kontrol grubunda araştırılmıştır. CHEK2 1100delC

mutasyonunun frekansının meme kanseri grubunda %1.9 (201/10860) oranında

kontrol grubunda ise %0.7 (64/9065) sıklığında olduğu bildirilmiştir. Yapılan

istatistiksel analizler sonucunda 1100delC mutasyonunun meme kanseri oluşumunu

2.3 kat arttırdığı ve bu artışın istatistiksel olarak anlamlı olduğu saptanmıştır

(p<0.001). Araştırıcılar çalışmanın sonuçlarından yola çıkarak, CHEK2 1100delC

mutasyonunun, meme kanseri oluşumunu arttıran diğer yatkınlık allellerinin meme

kanseri oluşumu üzerine etkilerini artırdığı yönündeki hipoteze uygunluk gösterdiği

şeklinde bir yorumda bulunmuşlardır.


akciğer, melanoma, Non-Hodgking lenfoma, ovaryum, pankreas, prostat, mide,

tiroit) hastada ve 4000 sağlıklı kontrol grubunda 1100delC, IVS2 + 1 G>A ve I157T

mutasyonlarının frekanslarını PCR-RFLP ve allele spesifik oligonükleotid-PCR

yöntemleri ile araştırmışlardır. Bu araştırmada, 1100delC ve IVS2 + 1 G>A


28

mutasyonlarının meme kanser oluşumunu 2.2 kat (p=0.02) artırdığı bildirilmiştir.

Bununla birlikte I157T mutasyonunun meme kanseri oluşumunu 1.4 kat (p=0.02)

arttırdığı saptanmıştır.

de Bock ve ark. (2004), tarafından kalıtsal olarak CHEK2 1100delC

mutasyonunu taşıyan meme kanserli hastalarda tümörün karakteristik özelliklerini ve

hastalığın gidişi araştırılmıştır. Çalışma 34 CHEK2 1100delC mutasyonu bulunan

meme kanserli hasta ve 1100delC mutasyonu olmayan 102 meme kanserli hasta ile

yapılmıştır. CHEK2 1100delC mutasyonunu taşıyan hasta grubunda steroid reseptör

pozitifliği, mutasyon taşımayan hasta grubundan daha sık bulunmuştur (p=0.04).

Mutasyon taşıyanların birinci veya ikinci derece bayan yakınlarında meme kanseri

gelişme sıklığının, mutasyon taşımayanlardan daha fazla olduğu gözlenmiştir

(p=0.03). İkinci memede de meme kanseri gelişme riskinin CHEK2 1100delC

mutasyonunu taşıyan hasta grubunda mutasyon taşımayan gruba göre 5.74 kat artış

gösterdiği saptanmıştır. Araştırıcılar CHEK2 1100delC mutasyonunun meme kanseri

hastalığının gidişini olumsuz şekilde etkileyen bir faktör olduğunu bildirmişlerdir.

Dufault ve ark. (2004), tarafından BRCA1 ve BRCA2 mutasyonları

bulunmayan ve ailesel meme kanseri hikayeleri olan 516 aileden meme kanseri

gelişen hastalarda CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının

Alman populasyonunda önemi araştırılmıştır. Araştırma 516 ailesel meme kanserli

hasta ve meme kanserli hastalar ile eşleştirilmiş 500 sağlıklı bayandan meydana

getirilmiş kontrol grubu ile yapılmıştır. Bununla birlikte CHEK2 1100delC

mutasyonunun sıklığı rasgele seçilmiş 1315 bayan bireyde araştırılmıştır. CHEK2

1100delC mutasyonunun sıklığı meme kanserli grupta %1.5 (8/516) oranında iken

rasgele seçilmiş bayanlardan oluşan kontrol grubunda ise %0.45 (6/1315) olarak

belirlenmiştir (p=0.016). Daha önce Beyaz ırka mensup ailesel meme kanserli

hastalardan (%1.6) ve kontrol gruplarından (%0.5) elde edilen CHEK2 1100delC

mutasyon sıklığının bu çalışmada elde edilen mutasyon sıklığından istatistiksel

olarak anlamlı düzeyde farklı olduğu belirlenmiştir. I157T ve IVS2 + 1G>A

mutasyonlarının oranları sırasıyla kanserli grupta %1.93 (10/516) ve %0.39 (2/516)

olarak belirlenmiştir. Kontrol grubunda ise I157T mutasyon sıklığı %1.6 (8/500)

oranında iken IVS2 + 1G>A %0.4 (2/500) olarak saptanmıştır. Her iki mutasyonun


29

sıklıkları meme kanserli grup ile kontrol grubu arasında karşılaştırıldığında aradaki

farkın istatistiksel olarak önemli olmadığı gösterilmiştir. Araştırıcılar, CHEK2

genindeki bu mutasyonların klinikte rutin olarak meme kanseri için genetik bir test

olarak taranmalarının bir öneminin olmayacağını bildirmişlerdir.

Friedrichsen ve ark. (2004), batı Washington’dan genç yaştaki meme kanserli

hastalar ile yapılan vaka-kontrol çalışması ile CHEK2 1100delC ve I157T

mutasyonlarının meme kanseri oluşumu üzerine etkileri araştırılmıştır. Çalışmaya

meme kanserli 506 hasta ve kontrol grubu olarak 459 sağlıklı birey dahil edilmiştir.

Meme kanserli hastalarda CHEK2 1100delC ve I157T mutasyonlarının sıklıkları

sırasıyla %1.2 (6/506) ve %0.4 (2/506) oranlarında saptanmıştır. Kontrol grubunda

mutasyon oranları 1100delC %0.4 (2/459) ve I157T %0.9 (4/459) olarak

belirlenmiştir. Meme kanserli grup ile kontrol grubu her iki mutasyon sıklığı

yönünden karşılaştırıldığında aralarında istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık

gözlenmemiştir. Araştırıcılar elde ettikleri bulgulardan, CHEK2 genindeki bu

mutasyonların batı Washington populasyonunda çok az bir sıklıkta olduğunu, bu

mutasyonların meme kanseri yatkınlığında temel mutasyonlar olmadıklarını ve bu

yüzden bu mutasyonların Amerika Birleşik Devletlerinde kanser koruma programı

çerçevesinde taranmalarının bir yararının olmayacağı sonuçunu çıkarmışlardır.

Huang ve ark. (2004), tarafından meme kanseri ile birlikte en az bir başka

herhangi bir tür birincil kanser gelişen 161 kadın hasta ve 153 sağlıklı bireyden

oluşan kontrol grubunda CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı araştırılmıştır.

Hasta grubunda mutasyon frekansı %1.9 (3/161) oranında iken kontrol grubunda ise

%0.7 (1/153) olarak saptanmıştır. Hasta ile kontrol grubu arasında istatistiksel olarak

önemli bir farklılık görülmemiştir (p=0.623). Araştırıcılar, CHEK2 1100delC

mutasyonunun çok sayıda birincil kanser gelişiminde temel yatkınlık alleli

olmadığını bildirmişlerdir.

Kilpivaara ve ark. (2004), tarafından yapılan çalışmada meme kanserli 1035

hasta ve 1885 sağlıklı bireylerden oluşturulan kontrol grubunda I157T mutasyonunun

frekansı mini baz sırası saptama, direk baz sırası saptama ve değişime hassas jel

elektroforez yöntemleri ile araştırılmıştır. Araştırıcılar meme kanserli hasta grubunda

I157T mutasyonunun %7.4 (77/1035) kontrol grubunda ise %5.3 (100/1885)


30

oranında olduğunu bildirmişlerdir. I157T mutasyonunun meme kanseri oluşumunu

1.43 kat artırdığı saptanmıştır (p=0.021). Meme kanserli hastalar ailesel meme

kanseri öyküsü olanlar ve olmayan şeklinde gruplandırıldığında, 507 ailesel meme

kanseri öyküsü olan hasta grubunda I157T mutasyonunun %5.5 (28/507) oranında

bulunduğu belirlenmiştir. Ailesel meme kanseri öyküsü olan grubun mutasyon oranı

kontrol grubu ile kıyaslandığında aradaki farkın istatistiksel olarak önemsiz olduğu

bulunmuştur. Araştırıcılar, CHEK2 I157T mutasyonunun meme kanseri oluşumunu

artırdığını fakat bu artışının CHEK2 1100delC mutasyonu ile yapılan çalışmalardan

elde edilen veriler ile kıyasladığında daha az olduğunu bildirmişlerdir.

Neuhausen ve ark. (2004), tarafından yapılan çalışmada CHEK2 1100delC

mutasyonunun erkek meme kanseri ile ilişkisi Amerikan ve İngiliz populasyonundan

erkek meme kanserli hastalarda araştırılmıştır. Amerikan populasyonundan 109

erkek meme kanserli hasta ve bu hastaların kontrol grubu olarak 138 sağlıklı erkek

birey çalışmaya dahil edilmiştir. İngiliz populasyon grubundan ise 79 erkek meme

kanseri gelişen hasta ile 3749 birey kontrol grubu olarak alınmıştır. Amerikan

populasyonundaki meme kanserli hastalarda CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı

%0 (0/109) iken kontrol grubunda %0.72 (1/138) olarak saptanmıştır. CHEK2

1100delC mutasyonunun frekansı İngiliz populasyonundan erkek meme kanserli

bireylerde %0 (0/79) oranında iken kontrol grubunda %0.56 (21/3749) olarak

saptanmıştır. Araştırıcılar yapmış oldukları araştırmada, daha önceki çalışmalardan

farklı olarak CHEK2 1100delC mutasyonunun erkek bireylerde meme kanseri

oluşumunu artırmamış olduğunu bildirmişlerdir.

İsrail populasyonunda meme kanseri gelişen 54 erkek meme kanserli hastada,

219 BRCA1 ve BRCA2 mutasyonları bulunan kadın meme kanserli hastada ve 146

sağlıklı bireyde CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı denatüre edici yüksek

performanslı likit kromatografisi (dHPLC) yöntemi ile araştırılmıştır (Ohayon ve

ark., 2004). CHEK2 1100delC mutasyonunun oranı erkek meme kanserli hastalarda

%0 (0/54), BRCA1 ve BRCA2 mutasyonları bulunan kadın hastalarda %0.5 (1/219)

ve kontrol grubunda ise %0 (0/146) olarak belirlenmiştir. Araştırıcılar CHEK2

1100delC mutasyonunun İsrail populasyonunda çok düşük bir sıklıkta bulunduğunu

bildirmişlerdir.


31

Osorio ve ark. (2004), İspanyol kökenli ailesel meme kanseri öyküsü bulanan

456 meme kanseri hastasında ve 400 sağlıklı bireyde CHEK2 1100delC

mutasyonunun sıklığı araştırılmıştır. Her iki grupta da CHEK2 1100delC mutasyonu

belirlenmemiştir. CHEK2 1100delC mutasyonunun İspanyol populasyonunda

bulunmadığı veya çok düşük bir sıklıkta bulunduğu ve bu populasyonda CHEK2

1100delC mutasyonunun rutin olarak taranmasının bir öneminin olmadığı

araştırıcılar tarafından önerilmiştir.

Mateus Pereira ve ark. (2004), tarafından yapılan çalışmada Amerikan

populasyonundan 829 meme kanserli hastada ve 859 sağlıklı bireyden oluşturulan

kontrol grubunda CHEK2 1100delC mutasyonu ile meme kanseri oluşumu

arasındaki ilişki araştırılmıştır. Meme kanseri grubunda mutasyon oranı %1.1 (9/829)

iken kontrol grubunda %0.5 (4/859) olarak saptanmıştır. CHEK2 1100delC

mutasyonunun meme kanseri oluşumunu 2.3 kat artırdığı fakat bu artışın istatistiksel

olarak anlamlı olmadığı belirlenmiştir (p=0.16).

Sodha ve ark. (2004), tarafından ailesel olarak erkek bireylerde meme kanseri

hikayesi bulunan 26 meme kanserli hastada CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı

araştırılmıştır. Hastaların 16 tanesi erkek meme kanserli birey, diğer 10 tanesi bayan

meme kanserli hastadan oluşturulmuştur. Fakat bu 10 bayan hastanın aileleri

içerisinde en az 1 erkek meme kanserli hastanın mevcut olduğu bildirilmiştir.

Hastaların hiçbirinde BRCA1 ve BRCA2 mutasyonlarının bulunmadığı saptanmıştır.

CHEK2 1100delC mutasyonu sadece 1 hastada belirlenmiştir. Bu sonuç, sağlıklı

populasyondan elde edilen %1.4 oranındaki CHEK2 1100delC mutasyonu sıklığı ile

karşılaştırıldığında iki grup arasındaki farkın istatistiksel olarak anlamlı olmadığını

ortaya koymuştur.

Syrjäkoski ve ark. (2004), yapmış oldukları çalışma ile Finlandiya

populasyonundan erkeklerde gelişen meme kanseri ile CHEK2 1100delC mutasyonu

arasındaki ilişkiyi araştırmışlardır. 114 meme kanseri gelişen erkek hastada CHEK2

1100delC mutasyonunun sıklığı araştırılmıştır. CHEK2 1100delC mutasyonunun

oranı %1.8 (2/114) olarak saptanmıştır. %1.8’lik CHEK2 1100delC mutasyon oranı

Finlandiya kökenli sağlıklı bireylerden elde edilen %1.4 (26/1885) oranındaki

CHEK2 1100delC mutasyonu ile karşılaştırıldığı zaman aradaki farkın istatistiksel


32

olarak anlamlı olmadığı bulunmuştur. Çalışmanın sonuçlarından, CHEK2 1100delC

mutasyonunun erkeklerde meme kanseri oluşumunu Finlandiya populasyonunda

artırmadığı sonucuna varılmıştır.

Bogdanova ve ark. (2005), tarafından CHEK2 I157T ve IVS2 + 1 G>A

mutasyonlarının meme kanseri ile ilişkisi iki farklı populasyondan oluşturulmuş iki

farklı grupta PCR-RFLP yöntemi ile araştırılmıştır. İlk grup alman kökenli 996

meme kanserli hastadan ve 486 sağlıklı bireyden meydana gelen kontrol grubundan

oluşturulmuştur. Diğer grup Beyaz Rusya kökenli 424 meme kanserli hasta ve 307

sağlıklı bireyden oluşan kontrol grubundan meydana getirilmiştir. I157T mutasyonu

alman kökenli meme kanserli hasta grubunda %2.2 (22/996) sağlıklı kontrol

grubunda ise %0.6 (3/486) oranlarında bulunmuştur. I157T mutasyonunun alman

kökenli meme kanserli hastalarda meme kanser oluşumunu 3.6 kat artırdığı

saptanmıştır (p=0.044). I157T mutasyonu Beyaz Rusya kökenli meme kanseri

hastalarında %5.7 (24/424) oranında iken sağlıklı bireylerden oluşan kontrol

grubunda %1.3 (4/307) oranında bulunmuştur. I157T mutasyonunun Beyaz Rusya

populasyonunda meme kanseri oluşumunu 4.5 kat artırdığı belirlenmiştir (p=0.005).

IVS2 + 1 G>A mutasyonu alman kökenli meme kanserli hastalarda %0.3 (3/996),

Beyaz Rusya kökenli hasta grubunda %0.9 (4/424), Alman kökenli kontrol grubunda

%0.2 (1/486) ve Beyaz Rusya kökenli kontrol grubunda %0 (0/307) oranlarında

bulunmuştur. Araştırıcılar, CHEK2 I157T mutasyonunun ailesel meme kanseri

yatkınlığına katkıda bulunan bir mutasyon olduğu sonuçuna varmışlardır.

de Jong ve ark. (2005b), CHEK2 1100delC mutasyonu ve meme kanseri

oluşumu arasındaki ilişki 962 meme kanserli hasta ve 367 bireyden oluşturulmuş

kontrol grubu ile yapılan çalışma ile araştırılmıştır. Mutasyon sıklığı kanserli grupta

%2.9 (28/962) oranında iken kontrol grubunda %0.82 (3/367) oranında tespit

edilmiştir. İki grup arasında 1100delC mutasyon sıklığı yönünden istatistiksel bir

farkın olmadığı bildirilmiştir.

Górski ve ark. (2005), tarafından Polanya populasyonunda 2012 meme kanserli

hastada ve 4000 kişiden oluşan kontrol grubu ile CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve

1100delC mutasyonlarının meme kanseri oluşumu üzerine etkileri araştırılmıştır.

CHEK2 1100delC, IVS2 + 1 G>A ve I157T mutasyonlarının meme kanseri


33

grubunda sıklıkları sırası ile %0.55 (11/2012), %0.94 (19/2012) ve %6.6 (132/2012)

iken kontrol grubunda ise 1100delC %0.25 (10/4000), IVS2 + 1 G>A %0.48

(19/4000) ve I157T %4.8 (193/4000) olarak belirlenmiştir. Yapılan istatistiksel

analizler sonucunda IVS2 + 1 G>A ve I157T mutasyonlarının meme kanserine

yakalanma riskini kanserli grup ile kontrol grubu karşılaştırıldığında anlamlı düzeyde

arttırdıkları fakat aynı anlamlılığın CHEK2 1100delC mutasyonu için gözlenmediği

bildirilmiştir.

Huzarski ve ark. (2005), tarafından yapılan araştırmada Polonya kökenli 482

meme kanserli hastada CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının

frekansları çalışılmıştır. Her üç mutasyonunda bu çalışma populasyonunda meme

kanseri oluşumunu artırmadıkları fakat I157T mutasyonunun meme kanseri tiplere

göre gruplandırıldığında lobular (küçük loblardan oluşan) tip meme kanseri

oluşumunu 6.6 kat artırdığı ve bu artışın istatistiksel olarak anlamlı olduğu

bildirilmiştir (p<0.001).

Jekimovs ve ark. (2005), Avusturalya kökenli ailesel meme kanseri hikayesi

olan meme kanserli hastalarda CHEK2 1100delC mutasyonunun meme kanseri ile

ilişkisini araştırmışlardır. Araştırmada, çok sayıdaki aile bireyinde meme kanseri

görülen 300 aileden 300 meme kanserli hastada CHEK2 1100delC mutasyon sıklığı

araştırılmıştır. 300 meme kanserli hastanın tümünde, kalıtsal BRCA1 ve BRCA2

mutasyonları taranmış ve %95’inde bu mutasyonlara rastlanmamıştır. CHEK2

1100delC mutasyonu %0.66 (2/300) oranında belirlenmiştir. Mutasyon belirlenen 2

ailenin ulaşılan tüm fertlerinde de CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı

araştırılmıştır. Araştırıcılar elde edilen verileri göz önünde bulundurduklarında

CHEK2 1100delC mutasyonu ile meme kanserinin oluşması arasında herhangi bir

korelasyonun olmadığı sonucuna varmışlardır.

Çek Cumhuriyetinden 1046 meme kanserli hastada ve 730 sağlıklı bireyde

CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı araştırılmıştır (Kleibl ve ark., 2005). Meme

kanserli hastaların 688’i sporadik olarak meme kanseri gelişen hastalardan 358’i

ailesel meme kanseri öyküsü olan ve erken yaşta meme kanserine yakalanan

bireylerden oluşturulmuştur. CHEK2 1100delC mutasyonu 688 sporadik meme

kanserli hastanın 3’ünde, 358 ailesel meme kanseri hikayesi olan hastanın 1’inde ve


34

kontrol grubundan 2 kişide belirlenmiştir. Kontrol grubu ile meme kanserli gruplar

arasında CHEK2 1100delC mutasyonu yönünden istatistiksel olarak önemli bir

farklılığın olmadığı saptanmıştır. Araştırıcılar, Çek Cumhuriyeti populasyonunda

CHEK2 1100delC mutasyonunu klinikte rutin bir test şeklinde taranmasını

önermemektedirler.

Chekmariova ve ark. (2006), tarafından Rus populasyonundan sadece bir

memede meme kanseri gelişen 660 meme kanserli hastada, her iki memede meme

kanseri gelişen 155 meme kanserli hastada ve kontrol grubu olarak da 448 orta yaşlı

kadın ile 373 ileri yaşlı kadında CHEK2 1100delC mutasyonu ile meme kanseri

arasındaki ilişki araştırılmıştır. CHEK2 1100delC mutasyon oranı tek memede meme

kanseri gelişen grupta %2.1 (14/660), her iki memede meme kanseri gelişen grupta

%5.2 (8/155), kontrol grubunun orta yaşlı bayanlar grubunda %0.2 (1/448) ve ileri

yaştaki bayanlar grubunda ise %0 (0/373) olarak saptanmıştır. Yapılan istatistiksel

analizler CHEK2 1100delC mutasyonunun Rus populasyonunda meme kanseri

oluşumunu istatistiksel olarak önemli derece artırdığı belirlenmiştir. Araştırıcılar,

elde edilen sonuçlardan Rus kökenli kadınlarda CHEK2 1100delC mutasyonunun

klinikte test edilmesinin faydalı olabileceğini ve bunun yanında aynı etnik kökenli ve

benzer coğrafyadan özellikle Ukrayna, Belarus ve Baltık ülkelerinde benzer

çalışmalara ihtiyaç olduğunu bildirmişlerdir.

Cybulski ve ark. (2006a), tarafından CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve

1100delC mutasyonları ile meme kanserine erken yaşta yakalanma riski arasındaki

ilişki PCR-RFLP ve allele spesifik oligonükleotid-PCR yöntemleri ile araştırılmıştır.

Bu araştırma 51 yaşının altındaki 3228 meme kanserli hasta ve 5496 sağlıklı

bireyden oluşturulan kontrol grubu ile gerçekleştirilmiştir. 1100delC ve IVS2 + 1

G>A mutasyonları meme kanserli grupta %1.45 (47/3228) oranında kontrol

grubunda ise %0.62 (34/5496) oranında belirlenmiştir. Bu iki mutasyonun meme

kanseri oluşumunu 2.4 kat arttırdığı gösterilmiştir (p=0.0001). I157T mutasyonu

meme kanserli grupta %6.41 (207/3228) oranında, sağlıklı kontrol grubunda ise %4.8

(264/5496) oranında bulunmuş ve bu mutasyonun meme kanseri oluşumunu 1.4 kat

artırdığı bildirilmiştir (p=0.002). Araştırıcılar elde edilen sonuçlardan, Polonya


35

kökenli bireylerde CHEK2 genindeki bu üç mutasyonun meme kanserine erken yaşta

yakalanmaya katkılarının olduğunu bildirmişlerdir.

de Bock ve ark. (2006), tarafından CHEK2 1100delC mutasyonu ile meme

kanserinde östrojen reseptör pozitifliği arasındaki ilişki araştırılmıştır. Çalışma 1084

meme kanserli hasta ve 988 sağlıklı bireyden oluşan kontrol grubu ile yapılmıştır.

CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı meme kanserli hastalarda %3.1 (34/1084)

kontrol grubunda ise %0.9 (9/988) oranlarında saptanmıştır. İki grup arasında

1100delC mutasyon frekansı yönünden istatistiksel olarak önemli bir farklılığın

olduğu bulunmuştur (p<0.001). Östrojen reseptörü pozitif olan meme kanserli

hastalarda 1100delC mutasyonunun sıklığının (%4.2 20/477) östrojen reseptörü

negatif (%1 2/193) olanlardan anlamlı derecede farklı olduğu görülmüştür (p=0.03).

Araştırıcılar bu bulguların, daha çok sayıda hasta ile yapılan çalışmalardan elde

edilen bulgularla doğrulanması gerektiğini bildirmişlerdir.

Bell ve ark. (2007), CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı 1646 sporadik

meme kanserli hastada, erken yaşta meme kanserine yakalanan 400 hastada, 302

ailesel meme kanseri hikayesi olan meme kanserli hastada ve kontrol grubu olarak da

birçok etnik kökenden 2105 bireyde araştırılmıştır. Mutasyon sıklığı sporadik meme

kanserli grupta %0.5 (8/1.646), erken yaşta meme kanserine yakalanan grupta %0.5

(2/400), ailesel meme kanserli grupta %0.3 (1/302) ve kontrol grubunda ise %0

(0/2105) olarak belirlenmiştir. Araştırıcılar, CHEK2 1100delC mutasyonunun meme

kanseri oluşumunu belirlemede sınırlı bir öneminin olduğunu fakat bu mutasyonun

klinikte rutin bir test olarak taranmasının fenotipik ve coğrafik olarak seçilmiş

populasyonlarda değerinin olabileceğine işaret etmişlerdir.

CHEK2 geninde 5395 baz çiftinin delesyonu sonucunda CHEK2 geninin 9. ve

10. ekzonunun kaybolmasına neden olan mutasyonun Belarus ve Alman

populasyonunda meme kanseri oluşumunu arttırıp artırmadığı araştırılmıştır

(Bogdanova ve ark., 2007). Belarus populasyonunda meme kanserli hastalarda

delesyon mutasyonunun oranı %0.9 (13/1440) kontrol grubunda ise %0 (0/881)

olarak belirlenmiştir. Alman populasyonundaki meme kanserli hastalarda CHEK2

del5395 mutasyon oranı %0.5 (5/990) iken sağlıklı bireylerde ise %0.1 (1/1014)

olarak saptanmıştır. CHEK2 genindeki bu delesyon şeklindeki mutasyonun Belarus


36

populasyonunda meme kanseri oluşumunu önemli derece artırdığı bulunmuştur

(p=0.01). Araştırıcılar, daha çok sayıda hasta ile yapılacak çalışmaların sonuçlarına

ihtiyaç duyulduğunu bildirmişlerdir.

Cybulski ve ark. (2007), tarafından Polonya kökenli meme kanserli hastalarda

ve sağlıklı bireylerden oluşan kontrol grubunda CHEK2 del5395 mutasyonunun

frekansı araştırılmıştır. CHEK2 del5395 mutasyonu kontrol grubunda %0.4

(24/5496), meme kanseri için herhangi bir risk faktörü yönünden seçilmemiş meme

kanseri grubunda %1 (19/1978) ve meme kanserine erken yaşta yakalanmış olan

grupta %0.9 (28/3228) olarak saptanmıştır. Yapılan istatistiksel analizler, CHEK2

del5395 mutasyonunun her iki meme kanseri grubunda meme kanseri oluşumunu

kontrol grubuna nazaran önemli oranda artırdığını ortaya koymuştur (p=0.01).

Margolin ve ark. (2007), tarafından yapılan çalışmada İsveç’in Stokholm şehri

ve civarında CHEK2 1100delC mutasyonunun meme kanseri oluşumu ile ilişkisi 763

meme kanserli hasta ve 760 bireyden oluşan kontrol grubu ile araştırılmıştır. 763

meme kanserli hastanın 450’sinin ailesel meme kanseri öyküsünün bulunduğu

belirlenmişti. CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığının ailesel meme kanseri

öyküsü bulunan grupta %2.2 (10/450), 313 sporadik meme kanserli hastada

grubunda %0.3 (1/313) ve kontrol grubunda ise %0.7 (5/760) oranlarında

saptanmıştır. CHEK2 1100delC mutasyonunun erken yaşta meme kanserine

yakalanan ailesel meme kanseri öyküsü bulunan grupta daha sık olduğu bulunmuştur

(p=0.003). Kontrol grubu ile meme kanserli gruplar karşılaştırıldıklarında ailesel

meme kanseri öyküsü bulunan meme kanseri grubunda CHEK2 1100delC

mutasyonunun meme kanseri oluşumunu istatistiksel olarak anlamlı düzeyde artırdığı

fakat aynı durumun sporadik meme kanserli grupta gözlenmediği gösterilmiştir.

Araştırıcılar, CHEK2 1100delC mutasyonunun İsveç populasyonunda bulunduğunu

ve sıklığının ailesel meme kanseri öyküsü bulunan meme kanserli hastalarda artış

gösterdiğini ve meme kanserine erken yakalanma ile ilişkisinin olduğunu

bildirmişlerdir.

Martínez-Bouzas ve ark. (2007), tarafından İspanya’nın Bask bölgesinden 214

meme kanserli hastada ve 120 sağlıklı bayan bireyde CHEK2 1100delC

mutasyonunun sıklığı araştırılmıştır. Meme kanserli grupta mutasyon oranı %0.93


37

(2/214) kontrol grubunda ise %0 (0/120) olarak saptanmıştır. Mutasyon bulunan 1.

hastanın meme kanserine yakalanma yaşı 31 idi. Bununla birlikte hastanın annesine

daha önce meme kanseri tanısı konmuştu. İkinci hastanın meme kanserine 40 yaşında

yakalandığı ve ailesinde çok sayıda her iki memede de meme kanseri gelişen

bireylerin bulunduğu bildirilmiştir. Araştırıcılar kendi çalışmalarının ve diğer

araştırıcıların sonuçlarından yola çıkarak CHEK2 1100delC mutasyonunun her iki

memede de meme kanseri gelişen, erken yaşta meme kanserine yakalanan ve ailesel

meme kanseri öyküsü bulunan ve Kuzey Avrupa populasyonundan meme kanserli

hastalar gibi seçilen populasyonlarda araştırılması gerektiğini bildirmişlerdir.

Schmidt ve ark. (2007), CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığını premenopoz

döneminde meme kanserine yakalanmış 1479 meme kanserli hastada direk baz sırası

belirleme yöntemi ile araştırmışlardır. Mutasyon sıklığı %3.7 (54/1479) olarak

saptanmıştır. Bu çalışmada, CHEK2 1100delC mutasyonunun diğer memede de

meme kanseri oluşumunu 2.1 kat artırdığı belirlenmiştir (p=0.049).

Sokolenko ve ark. (2007), tarafından Rusya’nın Saint Petersburg şehrinden

ailesel meme kanseri hikayesi olan ve erken yaşta meme kanserine yakalanan 302

meme kanserli hastada CHEK2 1100delC ve IVS2 + 1 G>A mutasyonlarının sıklığı

araştırılmıştır. CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı %3 (9/302) oranında iken

IVS2 + 1 G>A mutasyonunun oranı %0.7 (2/302) olarak saptanmıştır.

Weischer ve ark. (2007), tarafından yapılan araştırmada, CHEK2 1100delC



birey katılmıştır. Ayrıca bu çalışma içinde 1101 meme kanserli ve 4665 kontrol

bireyden oluşan vaka-kontrol çalışması da yapılmıştır. Araştırıcılar, CHEK2

1100delC mutasyonunun meme kanserini 3.2 kat artırdığını bildirmişlerdir.

Populasyon içerisinde heterozigot olarak CHEK2 1100delC mutasyonunu taşıyan

bayanların meme kanserine yakalanma risklerinin 3 kat fazla olduğu belirlenmiştir.

Chen ve ark. (2008), tarafından CHEK2 1100delC mutasyonunun Çin

populasyonunda meme kanseri oluşumunu artırıp artırmadığı ailesel meme kanseri

hikayesi olan 74 meme kanserli hasta ve 50 sağlıklı birey ile yapılan çalışma ile

araştırılmıştır. Yapılan analizler sonunda ne meme kanserli ne de sağlıklı hiçbir Çinli


38

bireyde CHEK2 1100delC mutasyonu saptanmamıştır. CHEK2 1100delC

mutasyonunun Çin populasyonunda çok düşük bir sıklıkta bulunduğu ve ailesel

meme kanserine yatkınlığa bir katkısının olmadığı bildirilmiştir.

Choi ve ark. (2008), tarafından CHEK2 1100delC mutasyonunun Kore

populasyonunda meme kanseri oluşumu üzerine etkisi araştırılmıştır. Çalışmaya 493

Kore’li meme kanseri hastası katılmıştır. 493 hastanın 42’sinde BRCA1 ve/veya

BRCA2 delesyon mutasyonları belirlenmiştir. 493 hastanın hiçbirinde CHEK2

1100delC mutasyonu saptanmamıştır. Araştırıcılar, Kore populasyonunda CHEK2

1100delC mutasyonunun bulunmadığını veya çok düşük bir frekansta olabileceğini

bu yüzden bu mutasyonun klinik bir test olarak taranmasının bir yararının

olmayacağı şeklinde bir fikir ileri sürmüşlerdir.

Falchetti ve ark. (2008), İtalyan populasyonunda BRCA1 ve BRCA2

mutasyonları olmayan 102 erkek meme kanseri hastasında ve 263 sağlıklı erkek

bireyde CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A, 1100delC ve del5395 mutasyonlarının erkek

meme kanser oluşumunu arttırıp artırmadığını araştırmışlardır. Ne kanserli grupta ne

de sağlıklı erkek bireylerden oluşan kontrol grubunda herhangi bir CHEK2 gen

mutasyonu belirlenmiştir. Araştırıcılar, İtalyan populasyonunda CHEK2

mutasyonlarının erkek meme kanserine yatkınlıkta bir öneminin olmadığını

bildirmişlerdir.

González-Hormazábal ve ark. (2008), tarafından Güney Amerika

populasyonunda CHEK2 1100delC mutasyonu ile ailesel meme kanseri oluşumu

arasındaki ilişki araştırılmıştır. Çalışma üç farklı grup ile yapılmıştır. Birinci grup

BRCA1 ve/veya BRCA2 mutasyonları olmayan ailesel meme kanseri öyküsü

bulunan 196 meme kanserli hastadan oluşturulmuştur. İkinci grup 624 sağlıklı fakat

en az 2 tane 1. veya 2. derece yakınlarında meme kanseri gelişmiş bireyden meydana

getirilmiştir. Üçüncü grupta kendilerinde veya yakınlarında meme kanseri öyküsü

olmayan 500 sağlıklı bireyden oluşturulmuştur. Her üç grupta da CHEK2 1100delC

mutasyonu saptanmamıştır.

Mellemkjaer ve ark. (2008), CHEK2 1100delC mutasyonunun, meme kanseri

gelişen hastalarda diğer memede de meme kanseri gelişimiyle ilgili ilişkisini

araştırmışlardır. Araştırmaya meme kanseri geliştikten sonra diğer memede de meme


39

kanseri gelişen 708 meme kanserli hasta ve tek memede meme kanseri gelişmiş 1395

meme kanserli hasta dahil edilmiştir. Bu çalışmada iki memede de kanser gelişen

hastalarda CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı %1 (7/708) oranında iken tek

meme de kanser gelişmiş grupta ise mutasyon frekansının %0.72 (10/1395) olduğu

saptanmıştır. Yapılan analizler CHEK2 1100delC mutasyonunun ikinci meme de

meme kanseri oluşumunu istatistiksel olarak anlamlı düzeyde artırmadığını

göstermiştir. Araştırıcılar, ikinci memede de meme kanseri gelişim riskinin CHEK2

1100delC mutasyonu ile az bir ilişkisinin olduğunu fakat bu mutasyonun ikinci

memede de meme kanseri oluşumunun tek nedeni olamayacağını bildirmişlerdir.

Zhang ve ark. (2008), CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığını farklı

populasyonlardan meme kanseri gelişen 3882 hasta ve 8609 sağlık bireyden oluşan

kontrol grubunda araştırmışlardır. Bu çalışmada, CHEK2 1100delC mutasyonunun

Asyalı (Pakistan ve Filipinler) hastalarda bulunmadığı, Brezilyalı hastalarda %0.7

(1/155) oranında olduğu saptanmıştır. Ailesel meme kanseri öyküsü olan 825 hastada

%1.5 ve ailesel meme kanseri öyküsü olmayan 1106 hastada %0.7 ayrıca Yahudi

olan ve olmayanlarda yaklaşık %1.3 oranında olduğu bulunmuştur. Araştırıcılar

CHEK2 1100delC mutasyonunun meme kanseri oluşumunu 2.6 kat artırdığını

bildirmişlerdir.

Cybulski ve ark. (2009), tarafından Polonya populasyonunda meme kanserine

erken yaşta yakalanan ve meme kanseri için herhangi bir risk faktörü yönünden

seçilmemiş 4441 meme kanserli hastada ve 51 yaşından küçük 7217 bireyden oluşan

kontrol grubunda CHEK2 IVS2 + 1 G>A, 1100delC ve del5395 mutasyonları ile

östrojen reseptörü arasındaki ilişki araştırılmıştır. Östrojen reseptör durumu, CHEK2

mutasyonları pozitif olanlar ile olmayanlar arasında karşılaştırılmıştır. CHEK2 IVS2

+ 1 G>A, 1100delC ve del5395 mutasyonları meme kanseri grubunda %3.15

(140/4441) oranında kontrol grubunda ise %1 (70/7217) sıklığında saptanmıştır

(p<0.0001). CHEK2 mutasyonu bulunan 140 meme kanserli hastanın 92 tanesinin,

CHEK2 mutasyonu saptanmayan 4301 hastanın 3001 tanesinin östrojen reseptör

durumları belirlenebilmiştir. CHEK2 mutasyonu olan ve östojen reseptörü pozitif

meme kanserli hasta oranı %67.4 (62/92) iken CHEK2 mutasyonu olmayan ve

östrojen reseptörü pozitif olan hasta oranı %58 (1742/3001) olarak saptanmıştır


40

(p=0.01). Araştırıcılar CHEK2 mutasyonu bulunan meme kanserli hastalarda

östrojen reseptör pozitifliğinin kanser oluşumunu 4 kat artırdığını ve bu hastaların

tamoksifen kemoterapisi için aday olabileceklerini bildirmişlerdir.

İrlanda populasyonunda CHEK2 1100delC mutasyonunun meme kanseri

oluşumu üzerine etkisi 903 meme kanserli hasta ve 1016 sağlıklı birey ile yapılan

çalışma ile araştırılmıştır (McInerney ve ark., 2009). CHEK2 1100delC

mutasyonunun sıklığı meme kanserli hasta grubunda %0.55 (5/903) kontrol

grubunda ise %0.1 (1/1016) oranında saptanmıştır. Yapılan istatistiksel analizler

CHEK2 1100delC mutasyonunun İrlanda populasyonunda meme kanseri oluşumunu

önemli oranda artırmadığını göstermiştir.

Skasko ve ark. (2009), tarafından her iki memede de meme kanseri gelişen 170

meme kanserli hastada CHEK2 1100delC ve I157T mutasyonlarının sıklığı ve bu

mutasyonların kansere yakalanma yaşı ile ilişkileri araştırılmıştır. Toplam mutasyon

sıklığının %7 (12/170) olduğu saptanmıştır. CHEK2 1100delC mutasyonu 2 kişide,

I157T ise toplam 10 kişide belirlenmiştir. Bu çalışmada, CHEK2 mutasyonunu

bulunduran meme kanserli hastaların meme kanserine yakalanma yaşlarının

mutasyon bulundurmayan hastalardan 2.1-3.8 yıl daha önce olduğu belirlenmiştir.

CHEK2 1100delC mutasyonunun meme kanseri ile ilişkisi Malezya

populasyonundan Çinli, Hindistanlı ve Malezyalı 668 meme kanseri hastası ile

yapılan çalışma ile araştırılmıştır (Thirthagiri ve ark., 2009). CHEK2 1100delC

mutasyonu meme kanserli hastalarda belirlenmemiştir. Araştırıcılar çalışmanın

sonuçlarının, CHEK2 1100delC mutasyonunun Malezya populasyonunda bulunan üç

farklı etnik grup içinde çok az veya hiç olmadığını ve bu gruplar için bu mutasyonun

meme kanserine yatkınlıkta önemli bir rolünün bulunmadığını ve rutin olarak bu

mutasyonun taranmasının gerekli olmadığını bildirmişlerdir.

2.8. CHEK2 Mutasyonlarının Melanoma Oluşumu Üzerine Etkileri İle İlgili


Debniak ve ark. (2008), tarafından CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A, 1100delC

ve del5395 mutasyonlarının kötü huylu melanom ile ilişkileri Polonya


41

populasyonundan 627 kötü huylu melanomlu hastada ve 4621 kontrol bireyde

araştırılmıştır. Kötü huylu melanom gelişen hastalarda CHEK2 I157T mutasyon

oranı %5.9 (37/627) iken kontrol grubunda ise %4.9 (224/4621), CHEK2 IVS2 + 1

G>A mutasyon oranı melanoma gelişen grupta %0.9 (4/427) iken kontrol grubunda

ise %0.4 (19/4621), kanserli grupta CHEK2 1100delC %0.3 (2/627) oranında iken

sağlıklı kontrol grubunda %0.2 (8/4621) sıklığında ve CHEK2 del5395 mutasyonu

kötü huylu melanomlu hastalarda %0.15 (1/627) iken kontrol grubunda ise %0.5

(23/4621) oranında saptanmıştır. Yapılan istatistiksel analizler CHEK2 genindeki

kalıtsal 4 mutasyondan hiçbirinin kontrol grubu ile kıyaslandığında kötü huylu

melanom oluşumunu artırmadığını göstermiştir.

2.9. CHEK2 Mutasyonlarının Mesane Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle


Zlowocka ve ark. (2008), tarafından yapılan araştırmada CHEK2 I157T, IVS2

+ 1 G>A, 1100delC ve del5395 mutasyonlarının mesane kanseri oluşumu ile

ilişkileri Polonya kökenli ve mesane kanseri için herhangi bir risk faktörü yönünden

seçilmemiş 416 mesane kanserli hasta ile 3313 sağlıklı bireyden oluşan kontrol

grubunda araştırılmıştır. Mesane kanserli hastalarda 4 mutasyonun toplam olarak

oranı %10.6 (44/416) iken kontrol grubunda %5.9 (195/3313) olarak saptanmıştır.

Yapılan analizler CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A, 1100delC ve del5395

mutasyonlarının mesane kanseri oluşumunu kontrol grubuna kıyasla 1.9 kat artırdığı

ve bu artışın istatistiksel olarak anlamlı olduğu bildirilmiştir (p=0.0003).

Araştırıcılar, CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A, 1100delC ve del5395 mutasyonlarının

Polonya populasyonunda mesane kanseri oluşumunu artırdığını bildirmişlerdir.

2.10. CHEK2 Mutasyonlarının Ovaryum Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle


Szymanska-Pasternak ve ark. (2006), CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve

1100delC mutasyonlarının frekanslarını Polanya kökenli ovaryum kanserli hastada


42

PCR-RFLP ve allele spesifik oligonükleotid-PCR yöntemleri ile araştırmışlardır. Bu

çalışmada 1108 ovaryum tümörlü (539 benign ovaryum kistadenomalı hasta,

ovaryum malignesisi sınırında 122 hasta ve 447 invaziv ovaryum kanserli hasta)

hastada ve 4000 sağlıklı bireyden oluşan kontrol grubunda bu mutasyonların

sıklıkları araştırılmıştır. I157T mutasyonu, benign ovaryum kistadenoma oluşumunu

1.7 kat (p=0.005), ovaryum malignesisine yakın oluşumu 2.6 kat (p=0.002), düşük

derecedeki invaziv ovaryum kanseri oluşumunu 2.1 kat (p=0.04) artırmıştır. Yüksek

derecedeki invaziv ovaryum kanseriyle I157T mutasyonu arasında istatistiksel bir

ilişki bulunmamıştır. Bu çalışmanın doğrulanması Rus kökenli ovaryum malignesisi

riskindeki bireyler ile yapılmış ve I157T mutasyonun bu kanser oluşumunu 2.7 kat

artırmış olduğu saptanmıştır (p=0.06). Çalışmanın sonuçları, CHEK2

mutasyonlarının çok düşük kötü huylu kanser potansiyeline sahip ovaryum

tümörlerine yatkınlığı artırabileceği, fakat aynı durumun yayılımcı ovaryum

kanserleri için olmadığını göstermiştir.

Suspitsin ve ark. (2009), tarafından Rus populasyonunda CHEK2 1100delC ve

IVS2 + 1 G>A mutasyonların ovaryum kanseri oluşumu üzerine etkileri

araştırılmıştır. Araştırmaya toplam 354 ovaryum kanseri tanısı olan hasta dahil

edilmiştir. CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı %0.6 (2/354), IVS2 + 1 G>A

mutasyonunun frekansı ise %0 (0/354) olarak saptanmıştır. Araştırıcılar CHEK2

geninin ovaryum kanserinin oluşumuna katkısının olmadığını bildirmişlerdir.

2.11. CHEK2 Mutasyonlarının Özefagus Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle


Koppert ve ark. (2004), tarafından skuamöz hücreli özefagus kanserli 190,

özafagus adenokarsinomlu 196, metaplazik Barrett özefagus gelişen 99, bunun

yanında displazik Barrett özefagus gelişen 66 hastada CHEK2 1100delC

mutasyonunun sıklığı araştırılmıştır. Ayrıca çalışmaya 644 sağlıklı birey kontrol

grubu olarak dahil edilmiştir. CHEK2 1100delC mutasyonunun oranları skuamöz

hücreli özefagus kanserinde %0.5 (1/190), özafagus adenokarsinomunda %1.5

(3/196), metaplazik Barrett’te %3 (3/99), displazik Barrett’te %1.5 (1/66) ve kontrol


43

grubunda ise %1.4 (9/644) olarak bildirilmiştir. İstatistiksel analizler sonucunda

kontrol grubu ile yapılan karşılaştırmalarda anlamlı düzeyde farklılıklar

saptanmamıştır. Bu sonuçların ışığında, araştırıcılar CHEK2 1100delC

mutasyonunun özefagus kanserine temel bir katkısının olmadığını bildirmişlerdir.

2.12. CHEK2 Mutasyonlarının Pankreas Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle


Bartsch ve ark. (2006), tarafından yapılan araştırmada CHEK2 1100delC, IVS2

+ 1 G>A ve I157T mutasyonlarının ailesel pankreas kanseri ile ilişkileri

araştırılmıştır. Alman kökenli ailesel pankreas kanser öyküsü olan 35 aileden 81

pankreas kanserli hastada CHEK2 mutasyonlarının sıklığı belirlenmiştir. 35 ailenin

sadece 1’inde (%3) CHEK2 1100delC mutasyonu belirlenmiştir. Bu oran Avrupa

populasyonu için beklenen %1.4 oranındaki CHEK2 1100delC mutasyon sıklığı ile

karşılaştırıldığında pankreas kanseri ile CHEK2 1100delC mutasyonu arasındaki

ilişkinin önemli olmadığını göstermiştir.

2.13. CHEK2 Mutasyonlarının Prostat Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle


Seppälä ve ark. (2003), tarafından yapılan çalışmada Finlandiya

populasyonundan prostat kanserli hastalarda CHEK2 1100delC ve I157T

mutasyonlarının frekansları ve bu mutasyonların prostat kanseri oluşumu ile ilişkileri

tek zincir konformasyon polimorfizmi ve mini baz sırası saptama yöntemleri ile

araştırılmıştır. Çalışmanın hasta populasyonunda ailesel prostat kanseri öyküsü

bulunan 120 prostat kanserli hasta ve ailesel kanser öyküsü bulunmayan 537 prostat

kanserli hasta bulunmaktadır. Ayrıca çalışmaya sağlıklı 480 bireyden oluşturulan

kontrol grubu da dahil edilmiştir. Ailesel kanser öyküsü bulunan hastalarda CHEK2

1100delC mutasyonunun frekansı %3.3 (4/120) bunun yanında I157T mutasyonunun

sıklığı %10.8 (13/120) oranında saptanmıştır. Ailesel kanser öyküsü olmayan prostat

kanserli grupta 1100delC mutasyonunun oranı %1.3 (7/537), I157T mutasyonunun


44

frekansı %7.8 (42/537) olarak belirlenmiştir. Sağlıklı bireylerden oluşan kontrol

grubunda 1100delC mutasyonunun sıklığı %0.4 (2/480), I157T mutasyonunun oranı

%5.4 (26/480) olarak bulunmuştur. Yapılan analizler sonucunda, CHEK2 1100delC

ve I157T mutasyonlarının oranlarının ailesel prostat kanserli grup ile kontrol grubu

arasında istatistiksel olarak anlamlı derecede farklılık gösterdiği (p=0.02 ve p=0.04)

fakat kontrol grubu ile ailesel olmayan prostat kanserli grup arasında bu iki mutasyon

yönünden istatistiksel olarak önemli bir farklılığın olmadığı saptanmıştır (p=0.15 ve

p=0.13).



tiroit) hastada ve 4000 sağlıklı kontrol grubunda I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC



mutasyonlarının prostat kanseri oluşumunu 2.2 kat (p=0.04) artırdığı bildirilmiştir.

Bununla birlikte I157T mutasyonunun prostat kanser oluşumunu 1.7 kat (p=0.002)

arttırdığı saptanmıştır.

Cybulski ve ark. (2004a), tarafından Polonyalı 690 prostat kanserli ve 1921

sağlıklı bireyden oluşan kontrol grubunda CHEK2 1100delC ve IVS2 + 1G>A

mutasyonlarının frekansları PCR-RFLP ve allele spesifik oligonükleotid-PCR

yöntemleri ile araştırılmıştır. Araştırıcılar kontrol grubunda bu mutasyonların %0.5

(9/1921) oranında olduğunu prostat kanserli hasta grubunda ise %1.6 (11/690)

oranında olduğunu bildirmişlerdir. Bu mutasyonlar prostat kanseri oluşumunu 3.4 kat

artırmıştır (p=0.004). Aynı çalışma içerisinde ailesel prostat kanseri öyküsü olan

prostat kanserli bireylerin 98’inin 4’ünde bu mutasyonlar saptanmıştır. Araştırıcılar

bu mutasyonların ailesel prostat kanseri oluşumunu 9 kat artırdığını (p=0.0002)

belirtmişlerdir. Yine aynı çalışma içerisinde CHEK2 I157T mutasyonunun sıklığı da

araştırılmıştır. Prostat kanserli hastalarda bu mutasyonun oranı %7.8 iken kontrol

grubunda ise %4.8 oranında tespit edilmiştir. CHEK2 I157T mutasyonu prostat

kanseri oluşumunu 1.7 kat artırmıştır (p=0.03). I157T mutasyonunun ailesel prostat

kanseri öyküsü olan prostat kanserli hastalarda %16 oranında bulunduğu ve bu

mutasyonun ailesel prostat kanseri oluşumunu 3.8 kat artırdığı bildirilmiştir


45

(p=0.00002). Araştırıcılar elde edilen sonuçlardan bu iki mutasyonun Polonya

kökenli erkek fertlerde prostat kanseri oluşumunu orta derecede artırdığı yorumuna

varmışlardır.

Prostat kanseri ile CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A, 1100delC ve del5395

mutasyonları arasındaki ilişkiyi prostat kanseri için herhangi bir risk faktörü göz

önünde bulundurmadan seçilmiş 1864 prostat kanserli hasta, 249 ailesel prostat

kanseri öyküsü bulunan prostat kanserli hasta ve 5496 kontrol grubu ile yapılan

çalışmada araştırılmıştır (Cybulski ve ark., 2006b). Herhangi bir risk faktörü

gözetmeden seçilmiş prostat kanserli hasta grubunda del5395, 1100delC, IVS2 + 1

G>A ve I157T mutasyonlarının oranları sırası ile %0.8 (15/1864), %0.8 (14/1864),

%0.8 (15/1864) ve %7.6 (142/1864) olarak belirlenmiştir. Ayrıca bu çalışmada

ailesel prostat kanseri öyküsü bulunan prostat kanserli hasta grubunda del5395

mutasyonu %1.6 (4/249), 1100delC mutasyonu %1.2 (3/249), IVS2 + 1 G>A

mutasyonu %2 (5/249) ve I157T mutasyonu %12 (30/249) oranlarında saptanmıştır.

Sağlıklı bireylerden oluşturulmuş kontrol grubunda del5395, 1100delC, IVS2 + 1

G>A, ve I157T mutasyonlarının oranları sırası ile %0.4 (24/5496), %0.2 (12/5496),

%0.4 (22/5496) ve %4.8 (264/5496) olarak belirlenmiştir. Yapılan istatistiksel

analizler sonucunda CHEK2 geninde araştırılan mutasyonlarının kontrol grubu ile

kıyaslandığında hem ailesel hikayesi olan hem de herhangi bir risk faktörü

gözetmeden seçilmiş prostat kanserli gruplarda prostat kanseri oluşumu istatistiksel

olarak önemli oranlarda artırmışlardır. Araştırıcılar bu mutasyonların diğer Slav

populasyonlarda özellikle Ukrayna, Belarus, Rusya, Baltık ve Balkan ülkelerinde de

bulunabileceğini ve bu mutasyonların prostat kanserine yatkınlığa ne kadar

katkılarının olduğunun ortaya çıkarılmasının önemli bir sonuç olabileceği

bildirilmiştir.

Weischer ve ark. (2007), tarafından yapılan araştırmada CHEK2 1100delC



birey katılmıştır. Ayrıca bu çalışma içinde 1101 meme kanserli ve 4665 kontrol

bireyden oluşan vaka-kontrol çalışması da yapılmıştır. Araştırıcılar, CHEK2


46

1100delC mutasyonunun prostat kanseri oluşumunu 2.3 kat artırdığını

bildirmişlerdir.

2.14. CHEK2 Mutasyonlarının Rahim Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle


Konstantinova ve ark. (2008), tarafından rahim kanseri ile CHEK2 I157T

mutasyonu arasındaki ilişki Bulgaristan populasyonundan 268 rahim kanseri tanısı

konmuş hasta ve 449 sağlıklı bireyle yapılan çalışma ile araştırılmıştır. CHEK2

I157T mutasyonunun sıklığı rahim kanserli hastalarda %1.86 (5/268) oranında iken

sağlıklı bireylerde %2.45 (11/449) oranında saptanmıştır. İki grup arasındaki

farklılığın istatistiksel bir öneminin olmadığı yapılan istatistiksel analizler ile

gösterilmiştir. Araştırıcılar rahim kanseri ile ilgili ilk araştırma olmasında dolayı bu

tip çalışmaların daha geniş ve farklı etnik kökenden hastalarla yapılması gerektiği

şeklinde bir öneride bulunmuşlardır.

2.15. CHEK2 Mutasyonlarının Tiroit Kanseri Oluşumu Üzerine Etkileri İle




tiroit) hastada ve 4000 sağlıklı kontrol grubunda 1100delC, IVS2 + 1 G>A ve I157T



mutasyonlarının tiroit kanseri oluşumunu 4.9 kat (p=0.0006) artırdığı bildirilmiştir.

Bununla birlikte I157T mutasyonunun tiroit kanseri oluşumunu 1.9 kat (p=0.04)

artırdığı saptanmıştır.

2.16. CHEK2 Genindeki Mutasyonların Çeşitli Kanserlerin Oluşumuyla

İlişkisini Araştıran Çalışmalardan Elde Edilen Sonuçların Toplu

Değerlendirilmesi


47

CHEK2 genindeki 1100delC, IVS2 + 1 G>A, I157T ve del5395

mutasyonlarının 17 farklı kanser türünün oluşumu üzerine etkileri ile ilgili yapılmış

çalışmalardan elde edilen sonuçlar toplu olarak Çizelge 2.1’de gösterilmiştir. Ayrıca

Çizelge 2.1 aynı kanser türü ile ilgili kaç çalışma yapıldığı ve her mutasyonun ayrı

ayrı kanser oluşumu ile ilişkisi bulunan çalışma sayısı ve herhangi bir ilişkinin

bulunmadığı çalışma sayıları belirtilmiştir.

Çizelge 2.1. CHEK2 Genindeki Mutasyonların Çeşitli Kanserlerle İlişkisi.

Kanser Türü

(Yapılan Çalışma Sayısı)

CHEK2 Mutasyon Tipi 1100del

C IVS2 + 1

G>A I157T del5395

(+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-) Akciğer Kanseri (2) -- 1 -- 1 -- 2 -- 1 Beyin Kanseri (1) -- 1 -- -- -- -- -- -- Böbrek Kanseri (2) -- 1 -- 1 2 -- -- -- Gırtlak Kanseri (1) -- 1 -- 1 -- 1 -- 1 Kolorektal Kanser (13) 1 9 -- 2 4 -- -- 2 Li-Fraumeni Sendromu (2) 1 1 -- -- -- -- -- -- Lösemi (1) -- 1 -- -- -- -- -- -- Meme Kanseri (51) 16 26 4 4 6 5 3 2 Melanoma (1) -- 1 -- 1 -- 1 -- 1 Mesane Kanseri (1) 1 -- 1 -- 1 -- 1 -- Ovaryum Kanseri (2) -- 2 -- 2 1 -- -- -- Özefagus Kanseri (1) -- 1 -- -- -- -- -- -- Pankreas Kanseri (1) -- 1 -- 1 -- 1 -- -- Prostat Kanseri (5) 5 -- 3 -- 4 -- 1 -- Rahim Kanseri (1) -- -- -- -- -- 1 -- -- Tiroit Kanseri (1) 1 -- 1 -- 1 -- -- -- Üst solunum Yolu Kanseri (1) -- -- -- -- -- 1 -- --

(+) : Mutasyon ile kanser türü arasında pozitif ilişki bulunan çalışma sayısı (-) : Mutasyon ile kanser türü arasında pozitif ilişki bulunmayan çalışma sayısı -- : Veri yok


48

3. MATERYAL ve METOD Süleyman BAYRAM

49

3. MATERYAL ve METOD

Bu çalışmada, Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Balcalı Hastanesine

başvuran 821 bireyden (kolorektal kanserli, hepatoselüler kanserli ve sağlıklı kontrol

bireyler) toplanan dokular (periferik kan ve kolorektal doku) materyal olarak

kullanılmıştır.

3.1. Hasta ve Kontrol Grubu

Çalışmada, kolorektal kanserli hasta grubu, hepatoselüler kanserli hasta grubu

ve herhangi bir kanser tanısı konulmamış sağlıklı bireylerden oluşan kontrol grubu

olmak üzere üç farklı deney grubu oluşturulmuştur. Kolorektal ve hepatoselüler

kanser grupları 2002-2009 yılları arasında Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi,

Gastroenteroloji Bilim Dalı’na başvurup, klinik olarak hepatoselüler veya kolorektal

kanser tanısı konulan hastaların dokularından meydana getirilmiştir. Araştırmamıza

hepatoselüler kanser tanısı alan 165 hasta ve kolorektal kanser teşhisi konulan 210

hasta dahil edilmiştir. 165 hepatoselüler ve 78 kolorektal kanser tanılı hastadan 0.5

molar (M) etilendiamintetraasetik asit (EDTA) (5.4 mg) içeren vakumlu tüplere (BD

Vacutainer®, İngiltere) 2 ml periferik kan alınmıştır. Hasta ve kontrol grubu

bireylerinden alınan periferik kanlar DNA izolasyonu yapılana kadar +4 oC’de

saklanmıştır. Periferik kandan genomik DNA izolasyonu kan alındıktan sonraki iki

gün içinde yapılarak, izole edilen DNA’lar -80 ºC’de çalışma gününe kadar

muhafaza edilmiştir. Ayrıca, çalışmamızdaki kolorektal kanser tanısı konmuş 132

hastanın parafine gömülü kolorektal kanser doku örnekleri Çukurova Üniversitesi

Tıp Fakültesi Patoloji Bilim Dalın’dan elde edilmiştir.

2004-2009 yılları arasında Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Balcalı

Hastanesine kontrol amaçlı başvuran, kendisinde herhangi bir kanser saptanmamış

446 bireyden EDTA içeren vakumlu tüplere 2 ml periferik kan alınarak araştırmanın

kontrol grubu oluşturulmuştur. Kontrol bireyler belirlenirken, hasta grubunun yaş

ortalamasına yakın olmasına özen gösterilmiştir.


50

Araştırmaya katılan çalışma ve kontrol grubu bireylerinin kanları gönüllülük

esasına dayanarak etik kurallar çerçevesinde toplanmıştır. Hem hasta hem de kontrol

grubundaki gönüllüler, çalışmaya katılmadan önce çalışmanın amacı ve içeriği

hakkında açık bir dille bilgilendirilmiştir. Araştırmamıza dahil ettiğimiz kanserli

olguların ve kontrol grubuna ait bireylerin tüm bilgileri Çukurova Üniversitesi Tıp

Fakültesi Balcalı Hastanesinin Arşiv bölümündeki hasta dosyalarından uzman

doktorlar ile birlikte toplanmıştır.

Bu çalışmada kolorektal ve hepatoselüler kanserli hastalarda ve herhangi bir

kanser saptanmamış sağlıklı bireylerde CHEK2 geninde I157T, IVS2+1G>A ve

1100delC mutasyonlarının olup olmadığı araştırılmıştır.

Çalışma Çukurova Üniversitesi, Tıp Fakültesi, İç Hastalıkları Gastroenteroloji

Bilim Dalı, Moleküler Biyoloji ve Genetik laboratuvarında gerçekleştirilmiştir.

3.2. Kullanılan Kimyasal Maddeler ve Deney Ekipmanları

3.2.1. Kullanılan Kimyasal Maddeler

3.2.1.1. Agaroz (Sigma)

Agaroz, kırmızı alg cinsleri olan Gelidium ve Gracilaria’dan izole edilen

doğrusal bir polisakkarittir. Agaroz sıcak suda çözündürülüp soğutulduğu zaman,

polimerizasyon ile karşılıklı hidrojen bağlarının oluşumu sonucunda jel yapısına

dönüşür. Bu oluşum geri dönüşümlüdür. Kullanılacak jelin büyüklüğüne ve

konsantrasyonuna göre tartılan agaroz, Tris Borik EDTA (TBE) tamponu içerisinde

kaynatma yolu ile çözündürüldü. Agaroz jel, Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR),

Polimeraz Zincir Reaksiyonu-Restriksiyon Fragmenti Uzunluk Polimorfizmi (PCR-

RFLP) ve Amplifikasyon Refrakter Mutasyon Sistemi-Polimeraz Zincir Reaksiyonu

(ARMS-PCR) sonuçlarını görüntüleme amacıyla kullanılmıştır. Hazırlanan agaroz

jele yüklenen örnekler elektriksel alanda belirli bir süre boyunca boyutlarına ve

moleküler ağırlıklarına göre ayrıştırılmıştır. Agaroza ait özellikler aşağıda

verilmiştir.


51

Formu: Toz

Toplam katkı: ≤ %10 nem

Kül: ≤ % 1

Renk: Beyaz-Kirli Beyaz

Geçiş sıcaklığı: 36°C ±1.5°C (Jel Noktası)

Sulfat (SO4-2) anyon kalıntısı: ≤%0.15

Dış aktiviteler: DNaz ve RNaz aktivitesi belirlenmemiştir

CAS No: 9012-36-6

Sigma No: A5093-100G

Lot No: 039K003

3.2.1.2. Etil Alkol (Merck)

Parafine gömülü kolorektal kanserli dokulardan DNA izolasyonu yapılırken

dokulardaki suyun ve ksilolün uzaklaştırılması işleminde farklı yüzde oranlarında

(%100, %80, %60 %40) etil alkol serileri kullanılmıştır. Etil alkole ait özellikler

aşağıda verilmiştir.

Kimyasal adı: Ethyl alcohol

Kapalı formülü: C2H6O

Molekül ağırlığı: 46.07 g/mol

Kaynama noktası: 78.4°C

Donma noktası:-114.3°C

CAS No: 64-17-5

Merck No: 1.00986.2500

3.2.1.3. İzopropanol (Sigma)

Parafine gömülü kolorektal kanserli dokulardan ve periferik kandan DNA

izolasyonu işlemlerinde izopropanol DNA’nın çökelmesinde (presipitasyonunda)

kullanıldı. İzopropanole ait özellikler aşağıda verilmiştir.


52

Kimyasal adı: Isopropyl alcohol

Kapalı formülü: (CH3)2CHOH


Kaynama noktası: 82°C

Donma noktası: −89.5°C

CAS No: 67-63-0

Sigma No: I9516

Lot No: 51K3485

3.2.1.4. Ksilol (Merck)

Parafine gömülü kolorektal kanserli dokulardan DNA izolasyonu işleminden

önce, dokunun gömülü olduğu parafinin uzaklaştırılmasında ksilol kullanılmıştır.

Ksilole ait özellikler aşağıda verilmiştir.

Kimyasal adı: Dimethylbenzene

Kapalı formülü: C6H4(CH3)2


Kaynama noktası: 137-143°C

Donma noktası: >-34°C

CAS No: 1330-20-7

Merk No: 1.08685.2500

Lot No: K33776585 441

3.2.1.5. Mineral Yağ (Sigma)

RFLP işlemleri sırasında reaksiyon içeriklerinin ısı etkisiyle uçmasını ve

yanlış pozitiflik veya yanlış negatifliğin oluşmasını engellemek amacıyla reaksiyon

içeriklerinin üzeri mineral yağ ile kaplanarak RFLP işlemi mineral yağ altında

yapılmıştır. Mineral yağa ait özellikler aşağıda verilmiştir.


53

Rengi: Beyaz

Yoğunluğu: 0.84 g/mL (25°C)

Formu: Hafif yağ

CAS No: 8042-47-5

Sigma No: M5904-500ML

3.2.1.6. Brom Fenol Mavisi (Sigma)

Brom fenol mavisi agaroz jel elektroforez işlemleri sırasında PCR, PCR-

RFLP ve ARMS-PCR ürünlerinin agaroz jelde ne kadar bir mesafe aldıklarını

gözlemek amacı ile jel yükleme tamponunda kullanılmıştır. Brom fenol mavisi 0.5X

konsantrasyonundaki TBE tamponunda yaklaşık olarak 300 baz çiftlik (bç) DNA

fragmenti ile aynı anda hareket eder. Brom fenol mavisine ait özellikler aşağıda

verilmiştir.

Kimyasal adı: 3′,3′′,5′,5′′-Tetrabromophenolsulfophthalein sodium salt

Kapalı formülü: C19H9Br4NaO5S

Molekül ağırlığı: 691.94

CAS No: 34725-61-6

Sigma No: B5525-25G

3.2.1.7. Ksilen Siyanol FF (Sigma)

Ksilen Siyanol FF agaroz jel elektroforez işlemleri sırasında PCR, PCR-

RFLP ve ARMS-PCR ürünlerinin agaroz jelde ne kadar bir mesafe aldıklarını

gözlemek amacı ile jel yükleme tamponunda kullanılmıştır. Ksilen Siyanol FF 0.5X

konsantrasyonundaki TBE tamponunda yaklaşık olarak 4 kilobaz çiftlik DNA

fragmenti ile aynı anda hareket eder. Ksilen Siyanol FF’e ait özellikler aşağıda

verilmiştir.

Kimyasal adı: Xylene Cyanol FF


54

Kapalı formülü: C25H27N2NaO6S2


CAS No: 2650-17-1

Sigma No: X4126-10G

3.2.1.8. Gliserol (Sigma)

Gliserol agaroz jel elektroforez işlemleri sırasında PCR, PCR-RFLP ve

ARMS-PCR ürünlerinin jel kuyucuklarının içine çökmesini sağlamak amacıyla jel

yükleme tamponunda kullanılmıştır. Gliserol örneklerin yoğunluklarını arttırarak

agaroz jelde oluşturulan kuyucukların içine çökmesini sağlamaktadır. Gliserole ait

özellikler aşağıda verilmiştir.

Kimyasal adı: Glycerol, 1,2,3-Propanetriol, Glycerin

Kapalı formülü: HOCH2CH(OH)CH2OH


Kaynama noktası: 182 °C

Donma noktası: 20 °C

Yoğunluğu: 1.25 g/mL

CAS No: 56-81-5

Sigma No: G8773

Lot No: 58H0056

Jel Yükleme Tamponunun (Jel-loading buffer) Hazırlanışı:

% 0.25 (m/v) Brom fenol mavisi

% 0.25 (m/v) Ksilen Siyanol FF

% 0.30 (v/v) Gliserol

0.25 gr brom fenol mavisi, 0.25 gr ksilen siyanol FF tartıldı ve 30 ml gliserol

eklendi son hacim 100 ml olacak şekilde 70 ml distile su ilave edilerek karıştırıldı.

Çözünmeleri için ısıtıldı. +4 oC sıcaklığında saklandı.


55

3.2.1.9. Trizma-Baz (Sigma)

Trizma-Baz, TBE tamponunda kullanılmıştır. TBE tamponu agaroz jel

hazırlanmasında ve elektroforez işlemlerinde kullanılmıştır. Trizma-Baza ait

özellikler aşağıda verilmiştir.

Kimyasal adı: 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol

Kapalı formülü: C4H11NO3


Kaynama noktası: 219-220 °C

Erime noktası: 167-172 °C

CAS No: 77-86-1

Sigma No: T6066

3.2.1.10. Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) (Sigma)

Etilendiamintetraasetik asit, TBE tamponunda kullanılmıştır. TBE tamponu

agaroz jel hazırlanmasında ve elektroforez işlemlerinde kullanılmıştır.

Etilendiamintetraasetik asite ait özellikler aşağıda verilmiştir.

Kimyasal adı: Disodium ethylenediaminetetraacetate dihydrate

Kapalı formülü: C10H14N2Na2O8 · 2H2O



CAS No: 9012-36-6

Sigma No: E5134

3.2.1.11. Borik Asit (Sigma)

Borik asit, TBE tamponunda kullanılmıştır. TBE tamponu agaroz jelde ve

elektroforez işlemlerinde kullanılmıştır. Borik asite ait özellikler aşağıda verilmiştir.


56

Kimyasal adı: Boric acid

Kapalı formülü: H3BO3



CAS No: 10043-35-3

Sigma No: B6768

Tris-Borik asit-EDTA (TBE) Tamponunun Hazırlanışı:

Moleküler biyolojide TBE tamponu elektroforezde kullanılan en yaygın

tamponlardan biridir. Bu tampon DNA molekülünün proton almasını önler ve DNA

molekülünü suda çözünür durumda tutar. EDTA özellikle magnezyum (Mg+2) gibi

divalent katyonların bir şelatörüdür (şelant, çelatör, çelant, kıskaçlayıcı, iyon tutucu).

Şelatörler; üzerlerinde bulunan reseptörleri aracılığı ile elementleri ve diğer etkileşim

yapacağı maddeleri bağlayıp çözünmeyen bir kompleks oluştururlar. Bu tamponda

EDTA nükleik asitlerin enzimatik parçalanmasını önlemektedir.

TBE Tamponu (10X): Trizma bazdan 108 gr, borik asitten 55 gr, EDTA’dan 9.3 gr

tartıldı. Son hacim 1 litre olacak şekilde steril distile su ilave edildi. Tüm bileşenlerin

steril su içerisinde çözünmesi sağlandı (pH:8.3). Oda sıcaklığında saklandı.

TBE Tamponu (1X): 100 ml TBE tamponunun (10X) üzerine 900 ml steril distile

su ilave edildi. Oda sıcaklığında saklandı.

3.2.1.12. Suyla Hazırlanmış % 1’lik Etidyum Bromür Çözeltisi (Merck)

Etidyum bromür PCR, PCR-RFLP ve ARMS-PCR ürünlerinin agaroz jelde

görünür hale gelmesi amacıyla kullanıldı. Etidyum bromür DNA bağları arasına

bağlanarak 300 veya 360 nm’deki ışığı absorblaması sonucu fluoresan etki

göstermesi ile DNA’yı agaroz jelde görünür hale getirir. Etidyum bromür çözeltisi

karanlık ortamda ve +4 oC’de saklandı. Etidyum bromüre ait özellikler aşağıda

verilmiştir.

Kimyasal adı: 3,8-Diamino-5-etil-6-fenilfenantridinium bromür


57

Kapalı formülü: C21H20BrN3


Erime noktası: 238-240 °C

Yoğunluk: 1.00 g/cm3

CAS No: 1239-45-8

Merck No: 1116080030

3.2.1.13. DNA Polimeraz Enzimi (Fermentas)

DNA polimeraz enzimleri, kalıp ipliğe tamamlayıcı bir DNA ipliği meydana

getirmek üzere, orijinal kalıp iplikteki baz bilgisini kullanarak dört çeşit

deoksiribonükleosid trifosfattan uzun polinükleotid zincir sentezini kataliz eder. Bu

enzimler, sentezi başlatmak için kalıp moleküldeki tamamlayıcı diziye bağlanan kısa

DNA parçalarına (primerlere) gerek duyarlar. Sentezin yönü 5’ uçtan 3’ uca doğru

olup, primerin serbest 3’ hidroksil ucuna ortamdaki deoksiribonükleosid

trifosfat’ların nükleofilik etki yapmalarıyla, fosfodiester bağlarının katalizi ve yeni

DNA ipliğinin polimerizasyonu sağlanır. Bu çalışmada Fermentas Life Sciences

firmasının ürettiği Taq DNA polimeraz (Cat No. EP0402) (Lot No: 00030644)

kullanılmıştır. Kullanılan Taq DNA polimeraz enziminin konsantrasyonu 5U/μl’dir.

PCR tamponu olarak10X konsantrasyonda MgCI2 içermeyen 500mM KCI, 100mM

Tris-HCI (pH:8.8) ve %0.8 Nonidet P40 içeren tampon kullanıldı.

3.2.1.14. Deoksiribonükleosid Trifosfat (dNTP) Seti (Promega)

PCR reaksiyonunda kullanılmak üzere dATP, dCTP, dGTP ve dTTP’i içeren

dNTP seti Promega firmasından (Cat. No. U1420) (Lot. No. 252313) satın alınmıştır.

dNTP seti aşağıdaki bileşikleri belirtilen miktarlarda içermektedir.

1. Kimyasal adı :dATP (2’deoxyadenosine 5’triphosphate, sodyum tuzu)

Kapalı formülü :C10H12N5O12P3Na4

Molekül ağırlığı :579.2

Konsantrasyonu :100mM (pH:7.5)


58

Miktarı:100μl

2. Kimyasal adı:dCTP (2’ deoxycytidine 5’ triphosphate, sodyum tuzu)

Kapalı formülü:C10H12N3O13P3Na4

Molekül ağırlığı:555.1

Konsantrasyonu:100mM (pH:7.5)

Miktarı:100μl

3. Kimyasal adı:dGTP (2’deoxyguanosine 5’triphosphate, sodyum tuzu)




Miktarı:100μl

4. Kimyasal adı:dTTP (2’deoxythymidine 5’triphosphate, sodyum tuzu)




Miktarı:100μl

10 mM dNTP Karışımının Hazırlanışı:

Amplifikasyon esnasında denatüre edilen zincirin tamamlanmasında

kullanılacak olan deoksiribonükleosid trifosfatlar eşit oranda dATP, dCTP, dGTP ve

dTTP’lerden oluşur. 100 mM’lık dATP, dCTP, dGTP, dTTP nükleotid stok

çözeltilerinden 10’ar μl alınarak üzerlerine 60 μl steril distile su ilave edilerek toplam

hacimi 100 μl olan 10 mM konsantrasyonda dNTP karışımı hazırlandı. Santrifüjle

karıştırılıp -20 oC’de saklandı.

3.2.1.15. DNA Marker (Promega)

PCR, PCR-RFLP ve ARMS-PCR ürünlerinin kaç baz çifti uzunluğunda

olduklarının doğrulanması amacıyla Promega firmasının üretmiş olduğu “50 bp DNA

Step Ladder” (Cat No. G4521) (Lot No. 226076) DNA marker’ı (DNA belirteçi)

kullanılmıştır. DNA marker’ı etidyum bromür ile boyanmış % 2’lik agaroz jelde 80

voltajda 2-3 saat elektroforez edildiğinde en küçüğü 50 baz çifti en büyüğü 800 baz


59

çifti büyüklüğünde olan ve her biri 50 baz çiftlik artış gösteren 16 DNA parçasından

oluşmaktadır.

Üretici firmanın önerileri doğrultusunda agaroz jele 5 μl DNA marker’ı ve 1

μl mavi/turuncu 6X yükleme boyası [(Cat No. G190A) (% 15 Ficoll® , % 0.03

bromfenol mavisi, % 0.03 ksilen siyanol FF, % 0.4 turuncu G, 10mM Tris-HCI

(pH:7.5), 50mM EDTA] şeklinde yüklenmiştir.

3.2.1.16. CHEK2 I157T Mutasyonun Analizinde Kullanılan Primer Çifti

CHEK2 genindeki I157T mutasyonunu saptamak için seçilen primer çifti ile

CHEK2 I157T mutasyonunun oluşmasına neden olan nükleotidin de içinde

bulunduğu 155 baz çiftlik (bç) bir DNA fragmenti amplifiye edilmiştir. Kullanılan

primerlerin uzunlukları, erime sıcaklıkları (Tm), guanin-sitozin (GC) baz oranı ve

baz dizisi Çizelge 3.1.’de gösterilmiştir. Primerler, liyofilize halde, 0.2 µmol sentez

skalasında sentezlenmiş ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile

saflaştırılmış ticari olarak (Ella Biotech GmbH Am Klopferspitz 1982152

Martinsried/Germany) satın alınan CHEK2 I157T İleri primeri 100 pmol/µl hacimde

olacak şekilde üretici firmanın önerisi olan 533 µl aynı şekilde CHEK2 I157T Geri

primeri de 100 pmol/µl hacimde olacak şekilde 528 µl PCR için uygun saflıktaki

steril distile su ilave edilerek çözüldü ve -20 oC’de saklanmıştır.

Çizelge 3.1. CHEK2 Genindeki I157T Mutasyonunu Saptamak İçin Kullanılan Primerlerin Uzunlukları, Erime sıcaklıkları, GC Oranı ve Baz Dizisi.

Primer

Uzunluk

(bç)

Tm

(oC)

GC

(%) Baz dizisi

CHEK2 I157T

İleri 22 60.3 50.0

5’-ACC CAT GTA TCT AGG AGA GCT

G-3’

CHEK2 I157T

Geri 24 61.0 45.8

5’-CCA CTG TGA TCT TCT ATG TCT

GCA-3’


60

3.2.1.17. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonun Analizinde Kullanılan Primer Çifti

CHEK2 genindeki IVS2 + 1G>A mutasyonunu saptamak için seçilen primer

çifti ile CHEK2 IVS2 + 1G>A mutasyonunun oluşmasına neden olan nükleotidin de

içinde bulunduğu 491 baz çiftlik (bç) bir DNA fragmenti amplifiye edilmiştir.

Kullanılan primerlerin uzunlukları, erime sıcaklıkları (Tm), guanin-sitozin (GC)

oranları ve baz dizisi Çizelge 3.2.’de gösterilmiştir. Primerler, liyofilize halde 0.2

µmol sentez skalasında sentezlenmiş ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi

(HPLC) ile saflaştırılmış ticari olarak (Ella Biotech GmbH Am Klopferspitz 1982152

Martinsried/Germany) satın alınan CHEK2 IVS2 + 1G>A İleri primeri 100 pmol/µl

hacimde olacak şekilde üretici firmanın önerisi olan 502 µl aynı şekilde CHEK2

IVS2 + 1G>A Geri primeri de 100 pmol/µl hacimde olacak şekilde 572 µl PCR için

uygun saflıktaki steril distile su eklenerek çözüldü ve –20 oC’de saklanmıştır.

Çizelge 3.2. CHEK2 Genindeki IVS2 + 1G>A Mutasyonunu Saptamak İçin Kullanılan Primerlerin Uzunlukları, Erime Sıcaklıkları, GC Oranı ve Baz Dizisi.

Primer

Uzunluk

(bç)

Tm

(oC)

GC

(%) Baz dizisi

CHEK2 IVS2

+ 1G>A İleri 22 49.1 22.7

5’-ATT TAT GAG CAA TTT TTA AAC

G-3’

CHEK2 IVS2

+ 1G>A Geri 28 56.3 25.0

5’-TCC AGT AAC CAT AAG ATA ATA

ATA TTA C-3’

3.2.1.18. CHEK2 1100delC Mutasyonun Analizinde Kullanılan Primer Çiftleri

CHEK2 genindeki 1100delC mutasyonunu saptamak için kullanılan ARMS-

PCR yönteminde CHEK2 geninde meydana gelen 1100delC mutasyonunun

bulunması durumunda DNA amplifikasyonu oluşturabilen ve 1100delC

mutasyonunun bulunmaması durumunda DNA amplifikasyonu oluşturabilen iki ayrı

özgün primer çiftleri kullanıldı. 1100delC mutasyonunun bulunması durumunda

DNA amplifikasyonu oluşturabilecek özgün primerler ile 183 baz çiftlik (bç) bir


61

DNA fragmenti amplifiye edildi. CHEK2 1100delC mutasyonunun bulunmaması

durumunda DNA amplifikasyonu oluşturabilecek özgün primer çiftleri ile 184 baz

çiftlik (bç) bir DNA fragmenti çoğaltıldı. Hem CHEK2 1100delC mutasyonunun

bulunmasına özgü hem de bu mutasyonun bulunmamasına özgü yapılan ayrı ayrı iki

farklı reaksiyonda PCR reaksiyonun doğru çalışıp çalışmadığını kontrol amaçlı

seçilen bir primer çifti ile solute carrier family 30 (zinc transporter), member 9

(SLC30A9) genine ait 309 baz çiftlik (bç) bir DNA fragmenti amplifiye edildi.

Membran taşıma proteinlerinin çözünen molekülleri taşıyan, çözünen taşıyıcı (SLC)

grubu (solute carrier, SLC) içindeki 300 üye gen 47 gen ailesi içerisinde

toplanmıştır. Çeşitli SLC grupları tarafından taşınan çözünen moleküller oldukça

çeşitlidir. Bunlar yüklü ve yüksüz organik moleküller ile inorganik iyonlardır. Bizim

çalışmamızda kontrol geni olarak kullanılan SLC30A9 geni tarafından sentezlenen

protein hücre içi çinko düzenlenmesinde görev alan çözünen molekülleri taşıyan

membran taşıma protenidir. Bu proteini kodlayan gen 4. kromozomun kısa kolunda

bulunmaktadır (4p13-p12). Çalışmada kontrol olarak SLC30A9 geninde 309 baz çifti

amplifikasyona neden olan primer çiftinin kullanılmasının sebebi hem CHEK2

1100delC mutasyonunun bulunması durumunda DNA amplifikasyonu

oluşturabilecek hem de bulunmaması durumunda DNA amplifikasyonu

oluşturabilecek özgün primerlerin Tm değerlerinin bu kontrol primer çiftinin Tm

değerine çok yakın olmalarıdır. Böylece hem CHEK2 1100delC mutasyonunun

bulunmasına hem de bulunmamasına özgü yapılacak iki farklı reaksiyonda da PCR

reaksiyonunun doğru çalışıp çalışmadığı SLC30A9 geninde 309 baz çiftinin

amplifikasyonu ile kontrol edildi. Kullanılan primerlerin uzunlukları, erime

sıcaklıkları (Tm), GC oranları ve baz dizileri Çizelge 3.3.’de gösterilmiştir.

Primerler, liyofilize halde 0.2 µmol sentez skalasında sentezlenmiş ve yüksek

performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile saflaştırılmış ticari olarak (Sigma, Life

Science) satın alınan CHEK2 M-CHEK2del1100C İleri primeri 100 pmol/µl

hacimde olacak şekilde üretici firmanın önerisi olan 836 µl, CHEK2 M-

CHEK2del1100C Geri primeri 100 pmol/µl hacimde olacak şekilde 1076 µl, W-

CHEK21100delC İleri primeri 100 pmol/µl hacimde olacak şekilde 836 µl; W-

CHEK21100delC Geri primeri 100 pmol/µl hacimde olacak şekilde 1169µl;


62

SLC30A9-Kontrol İleri primeri 100 pmol/µl hacimde olacak şekilde 1246 µl;

SLC30A9-Kontrol Geri primeri ise 100 pmol/µl hacimde olacak şekilde 1284 µl

PCR için uygun saflıktaki steril distile su eklenerek çözüldü ve –20 oC’de saklandı.

Çizelge 3.3. CHEK2 Genindeki 1100delC Mutasyonunu Saptamak İçin Kullanılan Primerlerin Uzunlukları, Erime Sıcaklıkları, GC Oranları ve Baz Dizileri.

Primer

Uzunluk

(bç)

Tm

(oC)

GC

(%) DNA dizisi

M-CHEK2del1100C

İleri 24 60.6 37.5

5'-GCA AAG ACA TGA ATC

TGT AAA GTC-3'

M-CHEK2del1100C

Geri 24 64.3 33.3

5'-AAA TCT TGG AGT GCC

CAA AAT AAT-3'

W-CHEK21100delC

İleri 24 60.6 37.5

5'-GCA AAG ACA TGA ATC

TGTA AAG TC-3'

W-CHEK21100delC

Geri 24 67.8 41.6

5'-AAA TCT TGG AGT GCC

CAA AAT CAG-3'

SLC30A9-Kontrol

İleri 21 60.6 47.6

5'-GTC AAA GCC ACC AGT

TAC AGT-3'

SLC30A9-Kontrol

Geri 20 61.4 50

5'-TTC CCC ACC ACT TTA

CTG AC-3'

3.2.1.19. DNA İzolasyon Kiti (Roche)

Roche firmasının ürettiği yüksek saflıkta PCR için kalıp DNA hazırlama kiti

(High Pure PCR Template Preparation Kit) (Cat. No. 11 796 828 001) periferik

kandan ve parafine gömülü kolorektal kanserli dokulardan genomik DNA izolasyonu

için kullanılmıştır. Yüksek saflıkta PCR için kalıp DNA hazırlama kitinin içerisinde

aşağıdaki bileşikler ve tüpler bulunmaktadır.


63

Yüksek saflıkta PCR için kalıp DNA hazırlama kitinin içeriği:

1.Doku Parçalama Çözeltisi (Tissue Lysis Buffer)………….......………………20 ml

(4M üre, 200mM NaCI, 200mM EDTA, pH: 7.4, 25 oC)

2.Bağlanma çözeltisi (Binding Buffer)…….……………………………………20 ml

(6M guanidine-HCI, 10mM üre, 10 mM Tris-HCI, % 20 Triton X-100

(v/v),pH:4.4, 25 oC)

3.Proteinaz K (recombinant PCR grade, Liyofilize)

(4.5 ml distile su ilave edildikten sonra kullanıldı)

4.İnhibitör Uzaklaştırıcı Çözelti (Inhibitor Remal Buffer)………………………33 ml

(5M guanidine-HCI, 20mM Tris-HCI, pH:6.6, 25 oC) (20 ml etanol ilave edildikten

sonra kullanıldı)

5.Yıkama çözeltisi (Wash Buffer)….....................................................................20 ml

(20mM NaCI, 2mM Tris-HCI, pH:7.5) (80 ml etanol ilave edildikten sonra

kullanıldı)

6.Çözdürme Çözeltisi (Elution Buffer)..................................................................40 ml

(10mM Tris, pH:8.5, 25 oC)

7.Filtreli tüpler (High Pure Filter Tubes).........................................................100 Adet

(Polypropylen)

8.Toplama Tüpleri (Collection Tubes).............................................................400 Adet

3.2.1.20. PstI Restriksiyon Endonükleaz (New England Biolabs)

CHEK2 I157T mutasyonu bu çalışmada PCR-RFLP yöntemi ile

belirlenmiştir. I157T mutasyonu New England Biolabs firmasının ürettiği PstI

restriksiyon endonükleaz enzimi ile belirlenmiştir. Providencia stuartii 164 (ATCC

49762) bakterisine ait PstI genini taşıyan Escherichia coli suşundan PstI restiriksiyon

endonükleaz enzimi üretilmiştir. Bu enzim restriksiyon etkisini yapışkan uç

oluşturarak gösterir. PstI restriksiyon endonükleaz enzimine ait özellikler aşağıda

verilmiştir.


64

PstI Enziminin Miktarı (katkı) :10.000 U

(200 mM NaCI, 10 mM Tris-HCI

(pH:7.4), 0.1 mM EDTA, 1 mM

Dithiothreitol (DTT), % 0.15 Triton X-

100, 200 μg/ml bovine serum albumin

(BSA), % 50 gliserol)

Ünite Tanımlılığı :50µl reaksiyon eriyiği içerisinde 1 µgr

λ DNA’sını 37 oC’de 1 saat içinde

parçalayan enzim miktarına 1 ünite denir

PstI Enziminin Konsantrasyonu :20.000 U/ml

(1 µgr substrat DNA’nın kesimi için

gerekli olan minimum enzim miktarı 16

saatte 0.25 ünitedir)

PstI Tanıma Bölgesi : 5’...C TGCA ↓ G...3’

3’...G ↑ ACGT C...5’

Enzim için Optimum Buffer :NEBuffer3

(100 mM NaCI, 50 mM Tris-HCI, 10

mM MgCI2, 1 mM DTT, pH:7.9)

Optimum İnkübasyon Sıcaklığı :37 oC

Sıcaklıkla İnaktivasyonu :80 oC/20 dakika

Saklanma Sıcaklığı :-20 oC

Lot No :0410905

New England Biolabs No :R0140S

3.2.1.21. Hyp188III Restriksiyon Endonükleaz (New England Biolabs)

CHEK2 IVS2 + 1G>A mutasyonu bu çalışmada PCR-RFLP yöntemi ile

araştırılmıştır. IVS2 + 1G>A mutasyonu New England Biolabs firmasının ürettiği

Hyp188III restriksiyon endonükleazı enzimi ile belirlenmiştir. Helicobacter pylori

188 (S.A. Thompson) bakterisine ait Hpy188III genini taşıyan Escherichia coli

suşundan Hpy188III restriksiyon endonükleaz enzimi üretilmiştir. Bu enzim


65

restriksiyon etkisini yapışkan uç oluşturarak gösterir. Hpy188III restriksiyon

endonükleaz enzimine ait özellikler aşağıda verilmiştir.

Hpy188III Enziminin Miktarı (katkı) :2.500 U

(250 mM NaCI, 10 mM Tris-HCI

(pH:7.5), 0.1 mM EDTA, 1 mM

dithiothreitol, 200 μg/ml BSA, %

50 gliserol)

Ünite Tanımlılığı :50µl reaksiyon eriyiği içerisinde

1 µgr pUC19 DNA’sını 37 oC’de

1 saat içinde parçalayan enzim

miktarına 1 ünite denir

Hpy188III Enziminin Konsantrasyonu :5.000 U/ml

(1 µgr substrat DNA’nın kesimi

için gerekli olan minimum enzim

miktarı 16 saatte 0.25 ünitedir)

Hpy188III Tanıma Bölgesi : 5’...TC ↓ NN GA...3’

3’...AG NN ↑ CT ...5’

(N = Herhangi bir nükleotid)

Enzim için Optimum Buffer :NEBuffer 4

(50 mM potassium acetate, 20

mM Tris-acetate, 10 mM

magnesium acetate, 1 mM

dithiothreitol, pH:7.9)

Optimum İnkübasyon sıcaklığı :37 oC

Sıcaklıkla inaktivasyonu :65 oC / 20 dakika

Saklanma Sıcaklığı :-20 oC

Lot No :0050801

New England Biolabs No :R0622L


66

3.2.2. Kullanılan Deney Ekipmanları

3.2.2.1. Santrifüjler

DNA izolasyonu çalışmalarında dakikada 18.000 devir yapabilen, -20 oC ile

+40 oC sıcaklıkları arasında ayarlanabilen, 278 x 333 x 620 mm boyutlarında olan

1.5 ve 2.0 ml eppendorf tüplerine uyumlu ve 12 adet tüp kapasiteli MIKRO 22R

model HETTICH marka soğutmalı santrifüj kullanılmıştır.

PCR, PCR-RFLP ve ARMS-PCR işlemlerinde reaksiyon reaktiflerini deney

tüpünün dibine toplamak amacıyla dakikada 13.000 devir yapabilen 0.2 ve 0.5 ml

eppendorf tüplerine uyumlu ve 16 adet tüp kapasiteli FORCE 13 model TECHNE

CAMBRIDGE marka masaüstü mikrosantrifüj kullanılmıştır.

3.2.2.2. Derin Dondurucular

Çalışmamızda kullanılan saf malzemelerin saklanmasında -20 oC sıcaklığa

inebilen ETUP 514 SL model ARISTON marka derin dondurucu kullanılmıştır.

İzole edilen DNA’ların saklanmasında -80 oC’ye inebilen MDF-192 model

SANYO marka derin dondurucu kullanılmıştır.

3.2.2.3. Steril Kabin

PCR, PCR-RFLP ve ARMS-PCR işlemlerinin yapılmasında HEPA filtreli

37500-02 Model Labconco Purifier PCR Enclosures marka steril kabin

kullanılmıştır.

3.2.2.4. Polimeraz Zincir Reaksiyon Aleti (Termal Cycler)

PCR işleminde GeneAmpR PCR System 9700 model Applied Biosystems

(Applied Biosystems, Singapore) marka termal cycler kullanılmıştır. Termal cycler

cihazı 0.2 ml eppendorf deney tüpüne uyumlu ve 96 adet mikrotüp kapasitelidir.


67

3.2.2.5. Vorteks Aleti

Saf malzemeleri reaksiyonlardan önce homojen hale getirmek ve deney

tüpüne eklenen çözeltilerin homojen karışmasını sağlamak için MS2 model IKA

(IKA-WORKS, INC. USA) marka vorteks cihazı kullanılmıştır. Vorteks cihazı

dakikada 200-2500 devir/dakika (rpm) yapabilme, 4.5 mm yörüngesi bulunan ve

maksimum 0.1 kg yük kaldırabilme özelliklerine sahiptir.

3.2.2.6. Kuru Isıtıcı

Isı ile inkübasyon gerektiren, dondurulmuş sarf malzemlerin çözülmesi ve

PCR-RFLP gibi işlemler FALC (FALC INSTRUMENTS s.r.l. ITALY) marka kuru

ısıtıcı ile yapılmıştır. Kuru ısıtıcı cihazının 0.5, 1.5 ve 2.0 ml eppendorf tüplerine

uyumlu alimünyumdan yapılmış blokları bulunmaktadır. Kuru ısıtıcı cihazı 0-100 oC

sıcaklıklar arasında elektronik olarak ayarlanabilmektedir.

3.2.2.7. Hasas Terazi

Hava akımlarına karşı özel cam paravanlarla korunan SBA 41 model

SCALTEC (Scaltec Instruments GmbH Deutschland/Germany) marka hasas terazi

kimyasalların tartılmasında kullanılmıştır.

3.2.2.8. Manyetik Isıtcı ve Karıştıcı

Kimyasal çözeltilerin karıştırılması ve ısıtılması işlemleri, özellikle agaroz

jelin hazırlanması IKAMAG® RCT basic model IKA LABORTECHNIK (IKA®-

WERKE GMBH&CO.KG STAUFEN/GERMANY) marka manyetik ısıtıcı ve

karıştırıcı ile yapılmıştır.


68

3.2.2.9. Buzdolabı

Çalışmada PCR, PCR-RFLP ve ARMS-PCR gibi reaksiyonlar sonucu oluşan

ürünler, ayrıca buzdolabında saklanması gereken sarf kimyasalların saklanmasında

BK 9512 NF model BEKO (BEKO Ticaret A.Ş. İstanbul/Türkiye) marka buzdolabı

kullanılmıştır.

3.2.2.10. Jel Elektroforez Sistemi

PCR, PCR-RFLP ve ARMS-PCR ürünlerinin agaroz jel ile elektroforezinde

yatay jel tankı ve düzeneği olarak Elektrophoretic Gel System Midicell Primo EC330

model Thermo EC marka jel elektroforez sistemi kullanılmıştır. Elektroforez güç

kaynağı olarak EC 105 model E-C Apparatus Corporation (Florida, USA) marka güç

kaynağı kullanılmıştır.

3.2.2.11. Jel Görüntüleme Sistemi

Elektroforez sonuçları BioDoc IITM Biometra marka görüntüleme sistemi ile

görüntülenmiştir. Görüntüleme sisteminde beyaz ve UV ışık yayabilen iki farklı

lamba ve bilgisayara bağlı kamera bulunmaktadır.

3.2.2.12. Jel Analiz Sistemi

Jel görüntüleme sistemindeki kamera ile alınan görüntüler BioDocAnalyze

1.0 BDA U-90 Biometra (Göttingen, Germany) programı ile analiz edilmiştir. Analiz

edilen görüntüler bu program altında bilgisayara kayıt edilmiştir.

3.2.2.13. Otomatik Mikropipetler

DNA izolasyonu, PCR, PCR-RFLP, ARMS-PCR ve agaroz jel gibi bir çok

işlemde ayarlanabilen ve belirli aralıktaki hacimlerde sıvı alma kapasitesi bulunan


69

GILSON (72 rue Gambetta, B.P. 45, 95400 Villiers-le-Bel, FRANCE) marka

Pipetman P2 model (0.1-2μl arası hacimlerde sıvı çekebilen), Pipetman P10 model

(0.5-10μl arası hacimlerde sıvı çekebilen), Pipetman P20 model (2-20μl arası

hacimlerde sıvı çekebilen), Pipetman P100 model (20-100μl arası hacimlerde sıvı

çekebilen), Pipetman P200 model (30-200μl arası hacimlerde sıvı çekebilen) ve

Pipetman P1000 model (0.2-1 ml arası hacimlerde sıvı çekebilen) otomatik pipetler

kullanılmıştır.

3.3. DNA İzolasyonu

3.3.1. Periferik Kandan DNA İzolasyonu

CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının

belirlenmesindeki ilk aşama, periferik kandan cam lifli filtreye nükleik asit bağlama

metoduna göre gerçekleştirilen DNA izolasyonudur. Çalışmalar, ticari olarak satılan

DNA izolasyonu kitinin (Yüksek saflıkta PCR için kalıp DNA hazırlama kiti)

protokolüne göre gerçekleştirildi.

Protokol aşağıdaki basamaklardan oluşmaktadır.

1. EDTA’lı tüplere alınan periferik kandan 200 µl alınıp 2ml kapasiteli eppendorf

tüpüne aktarıldıktan sonra bunun üzerine 200 µl bağlanma çözeltisi ve 40 µl

Proteinaz K ilave edildi; pipetle resüspanse edilerek homojenizasyon sağlandı.

2. Tüpler, önceden 70 oC’ye ayarlanan kuru ısı bloğunda 10 dakika inkübasyona

bırakıldı.

3. İnkübasyon sonunda, karışımın üzerine 100 µl izopropanol eklendi ve pipet ile

iyice karıştırıldı.

4. Eppendorf tüpü içinde bulunan örneğin tamamı toplama tüpü içine yerleştirilmiş

filtreli tüpün içine pipet ile aktarıldı.

5. 8000 devir/dakikada 1 dakika santrifüj yapıldı.

6. Santrifüj sonrasında filtreli tüp yeni bir toplama tüpüne aktarıldı.

7. Filtreli tüpün üzerine 500 µl inhibitör uzaklaştırıcı çözeltisi eklendi.

8. 8000 devir/dakikada 1 dakika santrifüj edildi.


70

9. Santrifüj sonrasında filtreli tüp yeni bir toplama tüpüne aktarıldı.

10. Filtreli tüpün üzerine 500 µl yıkama çözeltisi eklendi ve 8000 devir/dakikada 1

dakika santrifüj yapıldı.

11. Santrifüj sonrasında filtreli tüp yeni bir toplama tüpüne aktarıldı. Filtreli tüpün

üzerine ikinci kez 500 µl yıkama çözeltisi eklendi. Böylece yıkama işlemi iki

defa tekrar edilmiş oldu. 8000 devir/dakikada 1 dakika santrifüj yapıldı.

12. Santrifüj bittikten sonra, toplama tüplerinin alt kısmında biriken sıvı

uzaklaştırıldı ve 13000 devir/dakikada 10 saniye santrifüj edildi.

13. Filtreli tüpler, temiz birer eppendorf tüpünün içine yerleştirildi ve 70 oC’ye

ayarlanmış kuru ısı bloğunda ısıtılmış olan çözdürme çözeltisinden 200 µl ilave

edilerek 8000 devir/dakikada 1 dakika santrifüj yapıldı.

14. Santrifüj sonrasında filtreli tüp atıldı. Eppendorf tüpünde geri kalan çözelti

pürifiye edilmiş genomik DNA’dır. Bu aşamadan sonra çözünmüş DNA’lar -80 oC’de polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirilinceye kadar saklandı.

3.3.2 Parafine Gömülü Kolorektal Kanser Dokusundan DNA İzolasyonu

Bu araştırmada, Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı

arşivlerinden bulunan, kolorektal kanser tanısı konmuş olgulara ait 132 adet parafine

gömülü kolorektal kanser doku örneği kullanılmıştır. Çalışmada, parafine gömülü

tümör doku örneklerinden, ticari olarak satılan DNA izolasyon kiti (Yüksek saflıkta

PCR için kalıp DNA hazırlama kiti) kullanılarak genomik DNA izole edildi.

Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalında kolorektal

kanser tanısı alan parafine gömülü dokular mikrotom ile 5 μm kalınlığında

kesilmiştir. Parafine gömülü doku örneklerinden kesit alabilmek için mikrotomun

temiz olmasına dikkat edildi. Kesit alınırken mikrotom bıçağı her kullanımda

değiştirilip, alkolle temizlendi. 5 μm kalınlığında alınan 10-15 adet (25-50 mg) kesit

steril eppendorf tüplere konuldu. Çalışmalar, ticari olarak satılan DNA izolasyonu

kitinin (Yüksek saflıkta PCR için kalıp DNA hazırlama kiti) protokolüne göre

gerçekleştirildi.


71

Protokol aşağıdaki basamaklardan oluşmaktadır.

1. Kesitlerin bulunduğu 2 ml’lik tüplerin içine 1500 μl ksilol (parafini çözmek ve

uzaklaştırmak için) eklendi. Tüp hafifçe 2-3 dakika alt üst edildi ve 37 oC’de 30

dakika süre ile kuru ısı bloğunda tutularak parafinin çözülmesi sağlandı. 1 dakika

20 oC’de 8000 devir/dakikada santrifüj yapıldı. Pastör pipeti ile süpernatant

uzaklaştırıldı.

2. Parafinin tamamen uzaklaştırılması için bu işlem 3 kez tekrarlandı.

3. Kesitlerin bulunduğu 2 ml’lik tüplerin içine 1500 μl %99’lık etanol (dokulardaki

suyu ve ksilolü uzaklaştırmak için) eklendi. 1 dakika süre ile 20 oC’de 8000

devir/dakikada santrifüj yapıldı. Pastör pipeti ile süpernatant uzaklaştırıldı.

4. Kesitlerin bulunduğu 2 ml’lik tüplerin içine 1500 μl %80’lık etanol eklendi. 1

dakika süre ile 20 oC’de 8000 devir/dakikada santrifüj yapıldı. Pastör pipeti ile

süpernatant uzaklaştırıldı.







7. Kesitlerin bulunduğu 2 ml’lik tüplerin içine 1500 μl steril çift distile su eklendi

(etanolu uzaklaştırmak için). 1 dakika süre ile 20 oC’de 8000 devir/dakikada

santrifüj yapıldı. Pastör pipeti ile süpernatant uzaklaştırıldı.

8. Kesitlerin bulunduğu 2 ml’lik tüplerin içine dokuların parçalanması için 200 μl

doku parçalama çözeltisi ve hücresel proteinlerin uzaklaştırılması amacıyla 40 μl

Proteinaz K eklendi. Örnekler kuru ısı bloğunda 37 oC’de bir gece inkübasyona

bırakıldı.

9. Bir gece inkübasyonun ardından 2 ml’lik tüplerin içine ilaveten 20 μl Proteinaz K

eklenerek kuru ısı bloğunda 55 oC’de 4 saat inkübasyon yapıldı.

10. Örneklerin üzerine 200µl bağlanma çözeltisi ilave edildi ve karışım vorteks ile

homojen hale getirildi. Örnekler kuru ısı bloğunda 70 oC’de 10 dakika süreyle

inkübe edildi.


72

11. 100 µl izopropanol (açığa çıkan DNA’ların toplanması için) ilave edildi ve

vorteks ile iyi bir şekilde homojen edildi. Eppendorf tüpü içinde bulunan örneğin

tamamı toplama tüpü içine yerleştirilmiş filtreli tüpün içine pipet ile aktarıldı

8000 devir/dakikada 1 dakika santrifüj yapıldı.


üzerine 500µl inhibitör uzaklaştırıcı çözeltisi eklendi ve 8000 devir/dakikada 1

dakika santrifüj yapıldı


üzerine 500 µl yıkama çözeltisi (DNA’nın yıkanarak temizlenmesi için) eklendi

ve 8000 devir/dakikada 1 dakika santrifüj yapıldı.


üzerine ikinci kez 500 µl yıkama çözeltisi eklendi. Böylece yıkama işlemi iki

defa tekrar edilmiş oldu. 8000 devir/dakikada 1 dakika santrifüj yapıldı.

15. Santrifüj bittikten sonra, toplama tüplerinin alt kısmında biriken sıvı

uzaklaştırıldı ve 13 000 devir/dakikada 10 saniye santrifüj edildi.

16. Filtreli tüpler, temiz birer eppendorf tüpün içine yerleştirildi ve 70 oC’ye

ayarlanmış kuru ısı bloğunda ısıtılmış olan çözdürme çözeltisinden 200 µl ilave

edilerek 8000 rpm’de 1 dakika santrifüj yapıldı.

17. Santrifüj sonrasında filtreli tüp atıldı. Eppendorf tüpünde geri kalan çözelti

saflaştırılmış genomik DNA’dır. Bu aşama sonra çözünmüş DNA’lar -80 oC’de

polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirilinceye kadar saklandı.

3.4. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)

Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR), herhangi bir organizmaya ait genomik

DNA’da dizisi bilinen belirli bir bölgenin çoğaltılmasına (amplifikasyon) olanak

veren in vitro DNA sentez yöntemidir. PCR, 3 ana basamaktan oluşur.

1. Amplifiye edilecek çift iplikli DNA’nın yüksek sıcaklıkta denatürasyonu

(denaturation=denatürasyon).


73

2. Primerlerin özgül hibridizasyonuna olanak sağlayacak sıcaklıkta [Tm (erime

sıcaklığı) değerinin 3-5 oC altındaki sıcaklık] hedef bölgelere bağlanmaları

(annealing=bağlanma).

3. Taq DNA polimeraz enziminin en yüksek aktivite gösterdiği 72 oC sıcaklıkta,

primerlerden itibaren DNA zincirlerinin (ipliklerinin) sentezlenmesi

(extension=uzama).

PCR reaksiyonunda bu üç aşamanın döngü sayısı, başlangıçta kalıp olarak

kullanılan DNA konsantrasyonuna bağlıdır. Tek DNA sarmalı ile başlandığında en

fazla 40 döngü, çok sayıda DNA sarmalı ile başlandığında ise ideal döngü sayısı 30

olmalıdır. Çok döngü, hatalara yol açarak spesifik olmayan ürünler oluşturmaktadır.

Bunun sebebi; substrat kullanımının azalması, enzimin kararsız hale gelmesi, son

ürün inhibisyonu, spesifik olmayan ürün veya primer-dimer yapışması ve ürünün tam

olarak denatüre olmamasıdır.

PCR reaksiyonunun gerçekleşebilmesi için gerekli temel bileşenler aşağıdaki

gibidir.

Kalıp DNA: Saflaştırılan DNA, amplifiye edilecek DNA parçalarına kalıp

görevi yapar. Nükleotidlerin heterosiklik halkaları 260 nm dalga boyunda maksimum

absorbsiyon özelliği gösterir. Bu nedenle 260 nm’de ölçülen absorbsiyon değerleri

(A260) oldukça saf olarak izole edilen nükleik asitlerin μgr düzeyinde miktarlarının

belirlenmesinde kullanılır. Bunun yanı sıra proteinlerde 280 nm’de maksimum

absorbsiyon özelliği gösterirler, bu nedenle 280 nm’de ölçülen bir değerdeki artış

A260/A280 oranında düşmeye neden olur. Saflaştırılmış kalıp DNA için A260/A280 oranı

1.75-1.8’in üzerinde olmalıdır.

Primerler (oligonükleotidler): Kullanılacak primerler yalnızca amplifiye

edilecek bölgeye özel olmalıdır. Tipik primerler yaklaşık % 50 G+C bazlarına sahip

18-28 nükleotid uzunluğunda, sentetik olarak sentez edilmiş tek zincirli

oligonükleotidlerdir. Denatürasyonun ardından primerlerin bağlanma aşamasındaki

Tm (erime derecesi) değerinin saptanması, PCR reaksiyonunun gerçekleşmesi

açısından büyük öneme sahiptir ve yandaki formül ile kolayca hesaplanır: Tm= 4 oC

x (G+C) sayısı + 2 oC x (A+T) sayısı.


74

DNA polimeraz: Termostabil karakterde DNA polimerazlardan PCR’de en

yaygın kullanılanı Thermus aquaticus’dan elde edilen Taq DNA polimerazdır. Taq

DNA polimeraz’ın polimerizasyon oranı (nükleotid/saniye) enzim için en uygun

sıcaklık olan 70-80 oC’da 35-100’dür. 50 µl’lik bir reaksiyon hacmi için önerilen

miktar 1.25 ünitedir (U). Bununla beraber amplifikasyon bölgesine göre bu miktar

değişebilir. Yüksek konsantrasyonlarda enzim kullanımı spesifik olmayan ürünlerin

oluşmasına, düşük konsantrasyonda ise yetersiz ürün oluşmasına sebep olabilir.

MgCI2: Mg+2 iyonları dNTP'ler ile çözünebilir kompleksler oluştururlar,

polimeraz aktivitesini stimüle ederler ve çift iplikli DNA’nın Tm değerini artırırlar,

ayrıca primer/kalıp etkileşimini sağlarlar. Bu nedenle MgCI2’ün PCR’nin özgüllüğü

ve ürün verimi üzerinde çok önemli bir etkisi vardır. Genellikle optimum MgCI2

konsantrasyonu olarak 1.0-2.5 mM’lık değer tercih edilir. Düşük Mg+2

konsantrasyonu, ürün oluşumunda azalmaya, yüksek Mg+2 konsantrasyonu ise

spesifik olmayan ürün birikimine yol açar.

PCR tamponu: PCR için uygun tampon 10-50 mM arasında değişen Tris-

HCI’dir. Tamponun pH'sı ise 8.3-8.8 arasında değişir. Bu tampona son

konsantrasyonu 50 mM kadar KCI çözeltisi eklenmesi primerin kalıp DNA’ya

yapışmasını kolaylaştırır. Ancak 50 mM’ın üzerindeki KCI ve NaCI çözeltilerinin

eklenmesi polimeraz aktivitesini düşürür. % 10 ve daha az derişimdeki

dimetilsülfoksit (DMSO) derişimi de yararlıdır. Jelatin, bovin serum albümin (BSA),

Tween-20 ve Laureth-12 gibi iyonik olmayan maddelerin enzim kararlılığına etkisi

vardır, fakat mutlak zorunlu değildir. PCR tamponları çoğunlukla satın alınan

enzimle birlikte 10X konsantrasyonda sağlanmaktadır. Bu tampon 1X

konsantrasyonunda kullanılmaktadır.

dNTP Karışımı: Taq DNA polimeraz düşük dNTP konsantrasyonlarında

kalıba uygun doğru bazları seçmede daha başarılı olmakla birlikte, normal koşullarda

PCR 200 µM dNTP konsantrasyonu ile gerçekleştirilir. Optimal dNTP

konsantrasyonu; (1) MgCI2 konsantrasyonuna, (2) reaksiyon koşullarına, (3) primer

konsantrasyonuna, (4) çoğaltılacak ürünün boyuna, (5) PCR döngü sayısına bağlıdır.


75

3.5. Agaroz Jel Elektroforezi

PCR işleminden sonra amplifikasyonun gerçekleşip gerçekleşmediğini, PCR-

RFLP ve ARMS-PCR sonucunda mutasyon bulunup bulunmadığı agaroz jel

elektroforezi ile belirlenmiştir.

3.5.1. % 2.5’lik Agaroz Jelin Hazırlanması

1. % 2.5’lik agaroz jel için 2.5 gram tartılan agaroz 500 ml’lik bir erlene konuldu.

Bunun üzerine 100 ml 1X TBE çözeltisi eklendi.

2. Bu karışım manyetik ısıtıcı ve karıştırıcı üzerine konularak eritildi. Karışım

tamamen berraklaştıktan sonra çeker ocak altında soğumaya bırakıldı.

3. El yakmayacak kadar soğuyuncaya dek beklendi (50-55 oC). Daha sonra 0.5

μg/ml etidyum bromür olacak şekilde etidyum bromür eklendi. Etidyum

bromür’ün homojen bir şekilde dağılması için jel iyi bir şekilde karıştırıldı.

4. Jel hazırlama tepsisinin “stoper” ları takılarak tarak uygun pozisyona yerleştirildi.

Bunun üzerine ılımış olan sıvı agaroz yavaşça boşatıldı. Bunu yaparken hava

kabarcığı oluşmaması için azami dikkat gösterildi. Yine de oluşan hava

kabarcıkları bir pipet ucu yardımıyla tepsinin bir köşesine itildi.

5. Oda sıcaklığında jelin iyice soğuyarak tamamen polimerize olması beklendi.

6. “stoper” lar çıkarıldıktan sonra jel tepsisi elektroforez tankına yerleştirildi. Jelin

üzerine jelin üst yüzeyini aşacak şekilde 1X TBE eriyiği dolduruldu. Ardından

taraklar dikkatle ve çok yavaş hareketlerle jelin içinden çıkarıldı.Böylece jelin

kuyucukları oluşturuldu.

3.5.2. PCR, PCR-RFLP ve ARMS-PCR Örneklerinin Jele Konması ve

Elektroforez

PCR’da DNA amplifikasyonun başarılı bir şekilde gerçekleşip

gerçekleşmediğini, amplifiye edilen ürünlerin restriksiyon endonükleazlar ile kesilip

kesilmediğini ve ARMS-PCR sonucunda hangi allelerin çoğalıp çoğalmadığını


76

kontrol etmek amacı ile örnekler, işlemlerin bitiminden sonra % 2.5’lik agaroz jellere

yüklendi. Agaroz jele örneklerin tatbiki aşağıdaki sıra ile gerçekleştirilmiştir.

1. Jelin birinci kuyucuğuna, oluşan ürünlerin büyüklüğünü ölçebilmek için gerekli

olan DNA marker (DNA işaretçisi) (5 µl DNA marker’i ve 1 μl mavi/turuncu 6X

yükleme tamponu) kondu.

2. Örnekler jel yükleme tamponu ile karıştırılıp (5 µl PCR ürünü ve 1 µl 6X jel

yükleme tamponu) jeldeki kuyulara çok dikkatli bir şekilde konuldu.

3. Elektroforez tankının kapağı kapatıldı, elektrotlar kırmızı ve siyah renkler

birbirini tutacak şekilde güç kaynağına bağlandı.

4. Voltaj, 1-5 V/cm (anot ve katot arasındaki mesafe ölçülerek) ilerleme

sağlayabilmek için yaklaşık 90-120 Volt olarak ayarlandı. Güç kaynağı

çalıştırıldı.

5. Jel Yükleme tamponunun açık mavi fraksiyonu jelin 2/3’üne ulaştığında

elektroforez durduruldu. Kapak açılıp jel tepsisi elektroforez tankından çıkarıldı.

6. Yürütme sonrasına jel, BioDoc IITM Biometra jel görüntüleme sistemi ile

görüntülendi. Görüntü bilgisayara bağlı kamera yardımıyla bilgisayara

kaydedildi.

3.6. CHEK2 I157T Mutasyonun PCR-RFLP Yöntemi ile Belirlenmesi

3.6.1. CHEK2 I157T Mutasyonunu Saptamak Amacıyla Bu Mutasyonun

Olabileceği DNA Bölgesinin PCR ile Çoğaltılması

CHEK2 I157T mutasyonu, CHEK2 proteininin Forkhead-ilişkili bölgesi

(FHA) (115.-175. aminoasitleri arasındaki bölge) içerisindeki yanlış anlamlı

(=missense) bir mutasyondur. Bu mutasyon 470. nükleotid olan Timin’in Sitozin’e

(470 T>C) dönüşmesi sonucu meydana gelir. Bu mutasyon [İzolösin (ATT) 157 à

Treonin (ACT)] transisyon tipi nokta mutasyonudur. CHEK2 I157T mutasyonunun

olup olmadığı Cybulski ve ark. (2004b)’nın kullanmış oldukları PCR-RFLP yöntemi

ile belirlenmiştir. İçerisinde CHEK2 I157T mutasyonunun meydana gelebileceği 155

baz çiftlik (bç) genomik insan DNA’sının polimeraz zincir reaksiyonu ile


77

amplifikasyonu için CHEK2 I157T İleri: 5’- ACC CAT GTA TCT AGG AGA GCT

G -3’ ve CHEK2 I157T Geri: 5’- CCA CTG TGA TCT TCT ATG TCT GCA -3’

primerleri kullanılmıştır. National Center for Biotechnology Information (NCBI)

nükleotid veri tabanından alınan AY800241 rapor numaralı insan DNA sırası

kullanılmış ve primerlerin uygunluğunun testi için online Primer3

(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) programından yararlanılmıştır. Çizelge 3.4’te

kullanılan primerlerin CHEK2 geni üzerindeki konumları (altı çizili ve kırmızı renkli

nükleotidler) ve I157T mutasyonun bulunduğu bölge (büyük harf ve mavi renkli

nükleotid) gösterilmiştir.

Çizelge 3.4. CHEK2 I157T Mutasyonunun Olabileceği Bölgenin Çoğaltılmasında Kullanılan Primerlerin CHEK2 Geni Üzerindeki Konumları ve Mutasyonun Meydana Geldiği Nükleotid.

DNA izolasyonu ile izole edilen DNA örneklerinden CHEK2 I157T

mutasyonunun olup olmadığını belirlemek amacıyla, mutasyonun olabileceği 155

bç.’lik bir gen bölgesi PCR ile çoğaltıldı. Aynı zamanda her çalışma için pozitif

kontrol reaksiyonu gerçekleştirildi. Pozitif kontrol reaksiyonunda kullanılan CHEK2

I157T mutasyonunu homozigot ve heterozigot olarak bulunduran DNA örnekleri Dr.

Heli Nevanlinna (Department of Obstetrics and Gynecology Helsinki University

Central Hospital Biomedicum Helsinki 4th floor P.O. BOX 700 00029 HUS

Finland), Dr. Cezary Cybulski (International Hereditary Cancer Center, Department

of Genetics and Pathology, Pomeranian Medical University, Szczecin, Poland), Dr.

Natalia Bogdanova (Hannover Medical School Frauenklinik (OE6411) Carl-

Neuberg-Str.1 30625 Hannover Germany), Dr. Børge G. Nordestgaard (Department

of Clinical Biochemistry, Herlev University Hospital, Herlev Ringvej 75, DK-2730

Herlev, Denmark.) ve Dr. Darina V. Konstantinova (Department of Chemistry and

20821 5’ctttcggatt ttcagggtag gtaatgaata cccatgtatc taggagagct ggtaatttgg

20881 tcattgtttt tagatatttt cccactataa atctctgcta ttcaaagtct gaaacaaaat

20941 gttctctatt ttaggaagtg ggtcctaaaa actcttacaT tgcagacata gaagatcaca

21001 gtggcaatgg aacctttgta aatacagagc ttgtagggaa aggaaaacgc cgtcctttga 3’

http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)


78

Biochemistry Medical Faculty Medical University—Sofia 2 Zdrave St. 1431 Sofia

Bulgaria)’dan sağlanmıştır. Her bir örnek için, daha önce otoklavda sterilize edilen

0.2 ml’lik PCR tüpünde 25 μl’lik bir PCR reaksiyonu hazırlandı. PCR protokolü

aşağıdaki basamaklardan oluşmaktadır.

1. Tüm PCR eriyiklerinin bir araya konulduğu ana karışım 1.5 veya 2 ml’lik steril

eppendorf tüpleri içerisinde hazırlandı. Tüplere pipetaj sırasındaki kayıplar göz

önünde bulundurularak çoğaltılacak örnek sayısından 3-5 örnek kadar fazla

olacak şekilde PCR karışımı hazırlandı. Çizelge 3.5’te ana karışımın hazırlanışı

ve PCR eriyiklerinden 25 μl’lik bir PCR reaksiyonu için ne kadar alınması

gerektiği ve eriyiklerin reaksiyondaki son konsantrasyonları gösterilmiştir.

2. Ana karışım vorteks ile karıştırıldıktan sonra çeperlere yapışan damlacıklardan da

yararlanmak için çok kısa bir santrifüj (spin) (8000 devir/dakikada 10 saniye) ile

tüm sıvı bir araya toplandı.

3. 0.2 μl’lik steril PCR tüpleri etiketlendikten sonra PCR ana karışımından bunların

her birine 17.5 μl konuldu.

4. Her etiketli PCR tüpüne aynı etikete sahip DNA tüplerinden 7.5’er μl DNA

eklenerek her tüpün içinde 25 μl’lik PCR karışımı oluşturuldu. Negatif (su) ve

pozitif (CHEK2 I157T mutasyonunu homozigot ve heterozigot olarak

bulunduran DNA) kontrollerde aynı şekilde etiketlendi.

5. Bütün tüpler GeneAmpR PCR System 9700 (Applied Biosystems) PCR cihazına

yerleştirildi. Çizelge 3.6’daki PCR protokolü programlanarak PCR cihazı

çalıştırıldı.

6. Ardından PCR cihazından çıkarılan örnekler agaroz jel elektroforez ile analiz

edilinceye kadar 4 oC’de saklandı.


79

Çizelge 3.5. CHEK2 I157T Mutasyonunu Saptamak Amacıyla Optimum Amplifikasyonun Gerçekleştirildiği PCR Reaksiyon Karışımı.

Malzeme Stok

Konsantrasyon

Son Konsantrasyon

(25μl’de)

Alınan Miktar

(μl)

PCR tamponu 10X 1X 2.5 μl

MgCI2 25 mM 1,5 mM 1.5 μl

dNTP karışımı 10 mM 200 μM 0.5 μl

CHEK2 I157T

İleri Primer

50 pmol/μl 12.5 pmol/μl 0.25 μl

CHEK2 I157T

Geri Primer

50 pmol/μl 12.5 pmol/μl 0.25 μl

Taq DNA

polimeraz

5 U/μl 3 U 0.6 μl

DNA 15-30 ng/μl 112.5-225 ng 7.5 μl

ddH2O -- -- 11.9 μl

Çizelge 3.6. CHEK2 I157T Mutasyonu İçin PCR Sıcaklıkları ve Döngü Sayıları.

Reaksiyon Aşaması Sıcaklık

(ºC)

Süre Döngü sayısı

İlk denatürasyon 94 3 dakika 1

Denatürasyon 94 30 saniye

30 Bağlanma (Annealing) 56 40 saniye

Uzama (Extension) 72 30 saniye

Son Uzama 72 5 dakika 1

Soğutma 4 -- --

3.6.2. CHEK2 I157T Mutasyonunun Bulunabileceği Bölgenin PCR İşlemi

Sonucunda Görüntülenmesi

CHEK2 I157T mutasyonunun bulunabileceği bölgenin PCR reaksiyonu ile

çoğaltılması sonucunda bu bölgenin çoğaltılıp çoğaltılamadığı %2.5’luk agaroz jel


80

elektroforez ile kontrol edildi. Birinci kuyucuğa DNA marker diğer kuyulara PCR

ürünleri yüklendi. Jel 90 voltta 30 dakika elektroforeze tabi tutuldu. BioDoc IITM

Biometra jel görüntüleme sistemi ile DNA bantları incelendi. CHEK2 I157T

mutasyonunun olabileceği bölge için 155 bç’lik 1 adet bant gözlenir (Şekil 3.1.).

Şekil 3.1. CHEK2 I157T Mutasyonunun Olabileceği DNA Bölgesinin PCR

Reaksiyonu İle Çoğaltılması Sonucu Oluşan DNA Parçasının %2.5’lik Agaroz Jeldeki Görüntüsü. M: DNA marker, 1-6: CHEK2 I157T mutasyonunun olabileceği 155 bç’lik DNA fragmenti.

3.6.3. CHEK2 I157T Mutasyonunun Olup Olmadığını Belirlemek İçin RFLP

Analizi Restriksiyon endonükleazlar (RE) çift iplikli DNA’yı kesen enzimlerdir. RE

DNA diziliminde iki yönlü simetri oluşturan palindromik (her iki yönden de aynı

biçimden okunan) bölgelerdeki baz dizilerini tanırlar ve bu dizilerden her iki DNA

zincirini keserler. Bu enzimler bakterilerden izole edilir ve bakteriye giren viral

DNA’yı parçalayarak bakteriyi virüs enfeksiyonundan korurlar. Restriksiyon

enzimlerinin bilimsel adlandırılması izole edildiği bakterinin üç harfli kısaltmasını

50 bç

150 bç

100 bç

200 bç 250 bç

155 bç

M 1 2 3 4 5 6


81

takip eden suş tanımlamasıyla beraber bulundukları sıraya göre romen rakamıyla

yapılır.

CHEK2 I157T mutasyonunu RFLP yöntemi ile saptayabilmek için PstI

restriksiyon enzimi kullanıldı. Bu enzim 5’...CTGCA ↓ G...3’ sırasına sahip 6

nükleotidlik DNA bölgesini tanır ve 3’ tarafındaki GA bazları arasında yapışkan uç

oluşturacak şekilde kesim yapar. Çizelge 3.7’de PstI restriksiyon enziminin tanıma

bölgesi (altı çizili olan 6 nükleotid) gösterilmiştir. Bu tanıma bölgesi CHEK2 I157T

mutasyonun bulunduğu nükleotidi de içine almaktadır [çizelgede büyük harfle ve

mavi renk ile gösterilen T nükleotidi (470 T>C)]. 470. nükleotid olan Timin’in (T)

Sitozin’e (470 T>C) dönüşmesi sonucu PstI restriksiyon enziminin tanıma ve kesim

bölgesi tamamlanmış olur ve bu durumda enzim 155 bç’lik DNA parçasını 136 ve 19

bç’lik iki parçaya böler.

Çizelge 3.7. PstI Restriksiyon Enziminin Tanıma Bölgesi ve CHEK2 I157T Mutasyonuna Neden Olan Nükleotid.

RFLP protokolü aşağıdaki basamaklardan oluşmaktadır.

1. RFLP reaksiyonu için gerekli ana karışım, 1.5 veya 2 ml’lik steril eppendorf tüpü

içinde hazırlandı. Deney tüplerine ana karışımın pipetle aktarılması sırasındaki

kayıplar göz önünde bulundurularak kesim yapılacak örnek sayısından 3-5 örnek

kadar fazla olacak şekilde karışım hazırlandı. Çizelge 3.8’de ana karışımın

hazırlanışı ve RFLP eriyiklerinden 20 μl’lik bir RFLP reaksiyonu için ne kadar

alınması gerektiği ve eriyiklerin reaksiyondaki son konsantrasyonları

gösterilmiştir.

2. Çizelge 3.8’de verilen kimyasallar belirtilen miktarlarda karıştırıldı. Öncelikle su,

tampon ve BSA sonrasında enzim karışıma eklendi. Ardından vorteks ile

20821 5’ a cccatgtatc taggagagct ggtaatttgg


20941 gttctctatt ttaggaagtg ggtcctaaaa actcttacaT tgca↓gacata gaagatcaca

21001 gtgg 3’


82

karıştırılıp, kısa bir spin santrifüj (8000 devir/dakikada 10 saniye) ile tüm sıvının

tüpün alt kısmında toplanması sağlandı.

3. 0.5 ml’lik steril tüpler PCR ürünleri ile eşleşecek şekilde etiketlenip, içlerine 15

μl RFLP reaksiyon karışımından konuldu. Her çalışma için yapılan pozitif

kontrollerde (CHEK2 I157T mutasyonunu homozigot ve heterozigot olarak

bulunduran PCR ürünleri) aynı şekilde etiketlendi.

4. Tüplere aynı isimli PCR ürünlerinden 5 μl eklendi.

5. Kısa bir spin santrifüj (8000 devir/dakikada 10 saniye) ile tüm damlacıklar bir

araya toplandı ve her tüpün üzerine mineral oil eklendi. Buharlaşmayı önlemek

için tüm tüplerin kapak kenarları parafilm ile sıkıca sarıldı. Sonra tüplerin

tamamı daha önceden, enzim üreticisinin tavsiyesi doğrultusunda 37 oC’ye

ısıtılan kuru ısı bloğuna yerleştirildi.

6. 37 oC’de bir gece inkübasyonun ardından (16 saat), tüpler kuru ısı bloğundan

alınarak 4 oC’de soğumaya bırakıldı. Bu arada yukarıda anlatılan yöntemler ile %

2.5’lik agaroz jel hazırlandı.

7. Tüm RFLP ürünleri ve DNA marker’ı, tek tek jel yükleme tamponu ile

karıştırılarak jele yüklendi. Yükleme esnasında pipet ile aktarma işlemi çok

dikkatli bir şekilde gerçekleştirildi. Jel 90 voltta elektroforez edildi.

8. 30-45 dakika sonra elektroforez durduruldu. Jel tepsisinden çıkarılan jel, jel

görüntüleme sistemi ile incelendi ve bilgisayara bağlı kamera yardımıyla

görüntünün fotoğrafı çekildi ve bilgisayara kaydedildi.

Çizelge 3.8. CHEK2 I157T Mutasyonunun Olup Olmadığını Belirlemek İçin RFLP

Reaksiyonu Karışımı. Malzeme Stok

Konsantrasyon

Son Konsantrasyon

(20 μl’de)

Alınan Miktar

(μl)

NEBuffer 3 10X 1X 2 μl

Bovin serum albumin 10mg/ml 100μg/ml 0.2 μl

PstI 20.000 U/ml 12 U 0.6 μl

PCR ürünü -- -- 5 μl

ddH2O -- -- 12.2 μl


83

Kesim reaksiyonu sonucu oluşan ürünler % 2.5’lik agaroz jelde yürütülüp

görüntülendikten sonra, olguların genotiplemeleri gerçekleştirildi. Kesim sonucunda

elde edilen ve olguların genotipini belirleyen bandlar aşağıda belirtilmiştir.

Görüntülü açıklamada Şekil 3.2.’de görülmektedir.

a- Mutasyon bulunmayan genotipteki olgularda 155 bç’i büyüklüğündeki tek bir

DNA fragmenti (RE tanıma bölgesi bulamadığından PCR ürünü kesilmemiştir)

görülmüştür.

b- Heterozigot mutant genotiplerde 155, 136 ve 19 bç’i büyüklüğünde üç DNA

fragmenti (RE bir mutant allel bulunduğundan dolayı bir tanıma bölgesine

sahiptir diğer allelde tanıma bölgesi olmadığından kesilmemiştir) görülmüştür.

c- Homozigot mutant genotiplerde 136 ve 19 bç’i büyüklüğünde iki DNA fragmenti

(RE iki mutant allel bulunduğundan dolayı tüm PCR ürünleri kesmiştir)

görülmüştür.

Hem heterozigot mutant genotipte hem de homozigot mutant genotipte 19

bç’lik DNA fragmenti elektroforez işlemi sırasında çok hızlı hareket ettiğinden

dolayı agaroz jelden çıktığından jel görüntüsünde bulunmamaktır.


84

Şekil 3.2. CHEK2 I157T Mutasyonunun RFLP Yöntemi İle Genotiplendirilmesi Sonucu Oluşan DNA Parçalarının % 2.5’luk Agaroz Jeldeki Görüntüsü. M: DNA marker, 1-2: CHEK2 kodon 157 homozigot mutasyon olmayan genotip (155 bç) (İzolösin/İzolösin), 3-4: CHEK2 kodon 157 heterozigot mutant genotip (155 ve 136 bç) (İzolösin/Treonin), 5-6: CHEK2 kodon 157 homozigot mutant (136 bç) (Treonin/Treonin).

3.7. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonun PCR-RFLP Yöntemi ile Belirlenmesi

3.7.1. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonunu Saptamak Amacıyla Bu Mutasyonun

Olabileceği DNA Bölgesinin PCR ile Çoğaltılması

IVS2 + 1G>A mutasyonu CHEK2 geninin 2. intronunun ilk nükleotidinde

meydana gelen, Guanin (G) nükleotidinin Adenin (A) nükleotidine dönüşümü

şeklindeki transisyon tipi nokta mutasyonudur. Bu mutasyon CHEK2 mRNA'sında

anormal ilmeğe sebep olarak 2. intronun kesip-çıkarma (splicing) işleminin doğru bir

şekilde yapılamamasına neden olur. Anormal ilmek ekzon 3 içerisine 4 nükleotidin

girişine neden olur böylece bu noktadan sonraki tüm kodonlar değişir ve durdurucu

150 bç

250 bç

200 bç

100 bç

50 bç

155 bç 136 bç

M 1 2 3 4 5 6


85

kodon oluşur ve yarım CHEK2 proteininin sentezi meydan gelir. Bu durum

CHEK2’nin fonksiyonel olmayan proteininin sentezine yol açar. CHEK2 IVS2 +

1G>A mutasyonu Cybulski ve ark. (2004b)’nın kullanmış oldukları PCR-RFLP

yöntemi ile belirlenmiştir. İçerisinde IVS2 + 1G>A mutasyonunun bulunduğu 491

bç’lik genomik insan DNA’sının polimeraz zincir reaksiyonu ile amplifikasyonu için

CHEK2 IVS2 + 1G>A İleri: 5’- ATT TAT GAG CAA TTT TTA AAC G-3’ ve

CHEK2 IVS2 + 1G>A Geri: 5’- TCC AGT AAC CAT AAG ATA ATA ATA TTA

C- 3’ primer çifti kullanılmıştır. National Center for Biotechnology Information

(NCBI) nükleotid veri tabanından alınan AY800241 rapor numaralı insan DNA

dizisi kullanılmış ve primerlerin uygunluğunun testi için online Primer3

(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) programından yararlanılmıştır. Çizelge 3.9.’da

kullanılan primerlerin CHEK2 geni üzerindeki konumları (altı çizili ve kırmızı renkli

nükleotidler) ve IVS2 + 1G>A mutasyonun bulunduğu bölge (büyük harf ve mavi

renkli nükleotid) gösterilmiştir.

Çizelge 3.9. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonunun Olabileceği Bölgenin

Çoğaltılmasında Kullanılan Primerlerin CHEK2 Geni Üzerindeki Konumları ve CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonun Meydana Geldiği Nükleotid.

PCR reaktiflerinin hazırlanması ve yapılan işlemler aynen CHEK2 I157T

mutasyonu için anlatılan şekliyle yapıldı. Bununla birlikte IVS2 + 1G>A

20581 5’ tcttgataag cagattgata attctgattg ccttcttagg ctattttcct acaattagca

20641 tttatgagca atttttaaac gtttgataca tgaaattcaa cagccctctg atgcatgctt

20701 ttatattaca gaatgtgtga atgacaacta ctggtttggg agggacaaaa gctgtgaata

20761 ttgctttgat gaaccactgc tgaaaagaac agataaatac cgaacataca gcaagaaaca

20821 ctttcggatt ttcaggGtag gtaatgaata cccatgtatc taggagagct ggtaatttgg


20941 gttctctatt ttaggaagtg ggtcctaaaa actcttacat tgcatacata gaagatcaca

21001 gtggcaatgg aacctttgta aatacagagc ttgtagggaa aggaaaacgc cgtcctttga

21061 ataacaattc tgaaattgca ctgtcactaa gcagaaataa aggtaatatt attatcttat

21121 ggttactgga attttttttt tccactctct cataggagga aaatttgtcc tgtccttaca 3’



86

mutasyonuna spesifik primerler kullanıldı. CHEK2 IVS2 + 1G>A mutasyonun

optimum amplifikasyonun gerçekleştirildiği PCR reaksiyon karışımı, PCR

sıcaklıkları ve döngü sayısı Çizelge 3.10 ve Çizelge 3.11’de verilmiştir. Pozitif

kontrol reaksiyonunda kullanılan CHEK2 IVS2 + 1G>A mutasyonunu heterozigot

olarak bulunduran DNA örnekleri Dr. Heli Nevanlinna (Department of Obstetrics

and Gynecology Helsinki University Central Hospital Biomedicum Helsinki 4th

floor P.O. BOX 700 00029 HUS Finland), Dr. Cezary Cybulski (International

Hereditary Cancer Center, Department of Genetics and Pathology, Pomeranian

Medical University, Szczecin, Poland), Dr. Natalia Bogdanova (Hannover Medical

School Frauenklinik (OE6411) Carl-Neuberg-Str.1 30625 Hannover Germany)’dan

temin edilmiştir.

Çizelge 3.10. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonunu Saptamak Amacıyla Optimum Amplifikasyonun Gerçekleştirildiği PCR Reaksiyon Karışımı.

Malzeme Stok

Konsantrasyon

Son Konsantrasyon

(μl’de)

Alınan Miktar

(μl)


MgCI2 25 mM 1,5 mM 1.5 μl


CHEK2 IVS2 +

1G>A İleri Primer 50 pmol/μl 0.5 μM 0.25 μl

CHEK2 IVS2 +

1G>A Geri Primer 50 pmol/μl 0.5 μM 0.25 μl

Taq DNA

polimeraz

5 U/μl 0.12 U 0.6 μl

DNA 15-30 ng/μl 4.5-9 ng 7.5 μl

ddH2O -- -- 11.9 μl


87

Çizelge 3.11. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonu İçin PCR Sıcaklıkları ve Döngü Sayıları.


(ºC)



Denatürasyon 94 1 dakika

35 Bağlanma (Annealing) 53 1 dakika

Uzama (Extension) 72 1 dakika

Son Uzama 72 7 dakika 1

3.7.2. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonunun Bulunabileceği Bölgenin PCR

İşlemi Sonucunda Görüntülenmesi

CHEK2 IVS2 + 1G>A mutasyonunun olabileceği bölgenin PCR reaksiyonu

ile çoğaltılması sonucunda bu bölgenin çoğaltılıp çoğaltılamadığı % 2.5’luk agaroz

jel elektroforez ile kontrol edildi. Birinci kuyucuğa DNA marker’ı diğer kuyulara

PCR ürünleri yüklendi. Jel 90 voltta 30 dakika elektroforeze tabi tutuldu. Jel

görüntüleme sistemi ile agaroz jel incelendi. CHEK2 IVS2 + 1G>A mutasyonunun

olabileceği nükleotidi içine alan 491 bç’lik 1 adet DNA fragmenti gözlendi.

(Şekil.3.3)


88

Şekil 3.3. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonunun Olabileceği DNA Bölgesinin PCR

Reaksiyonu İle Çoğaltılması Sonucu Oluşan DNA Parçasının %2.5’lik Agaroz Jeldeki Görüntüsü. M: DNA marker, 1-7 CHEK2 IVS2 + 1G>A mutasyonunun olabileceği 491 bç’lik DNA fragmenti.

3.7.3. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonunun Olup Olmadığını Belirlemek İçin

RFLP Analizi

CHEK2 IVS2 + 1G>A mutasyonunu RFLP yöntemi ile saptayabilmek için

Hyp188III restriksiyon enzimi kullanıldı. Bu enzim 5’...TC ↓ NNGA...3’ sıralarına

sahip 6 baz çiftlik DNA bölgesini tanır ve 5’ tarafından TC nükleotidlerinden sonra

kesim yaparak yapışkan uç oluşturur. Çizelge 3.12’deki büyük harfle gösterilen G

nükleotidinin A nükleotidine transisyonu sonucu enzimin tanıma bölgesinin oluşumu

tamamlanır. Çizelge 3.12.’de Hyp188III restriksiyon enziminin tanıma bölgesi (altı

çizili olan kırmızı renkli 6 nükleotid) ve IVS2 + 1G>A mutasyon noktası (büyük harf

ve mavi renkli nükleotid) gösterilmiştir. Hyp188III restriksiyon enzimi CHEK2

50 bç

100 bç

150 bç

200 bç

250 bç

300 bç 350 bç 400 bç 450 bç 500 bç 491 bç

M 1 2 3 4 5 6 7


89

IVS2 + 1G>A mutasyonu bulunan, 491 bç’lik PCR ürününü 194 ve 297 bç’lik iki

parçaya bölmektedir.

Çizelge 3. 12. Hyp188III Restriksiyon Enziminin Tanıma Bölgesi ve IVS2 + 1G>A

Mutasyonuna Neden Olan Nükleotid.

RFLP protokolü CHEK2 I157T mutasyonunun belirlenmesindeki şekliyle

uygulandı. Bununla birlikte IVS2 + 1G>A mutasyonunun belirlenmesi için

Hyp188III restriksiyon enzimi kullanıldı. Çizelge 3.13’de ana karışımın hazırlanışı

ve RFLP eriyiğinden 20 μl’lik bir RFLP reaksiyonu için ne kadar alınması gerektiği

ve reaksiyondaki son konsantrasyonları gösterilmiştir.

Çizelge 3.13. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonunun Belirlenmesi İçin RFLP

Reaksiyonu Karışımı. Malzeme Stok

Konsantrasyon

İstenen Konsantrasyon

(20 μl’de)

Alınan Miktar

(μl)

NEBuffer 4 10X 1X 2 μl

Bovin serum albumin 10mg/ml 100μg/ml 0.2 μl

Hyp188III enzimi 5.000 U/ml 12 U 2.4 μl

PCR ürünü -- -- 5 μl

ddH2O -- -- 10.4 μl

20581 5’ a

20641 tttatgagca atttttaaac gtttgataca tgaaattcaa cagccctctg atgcatgctt

20701 ttatattaca gaatgtgtga atgacaacta ctggtttggg agggacaaaa gctgtgaata

20761 ttgctttgat gaaccactgc tgaaaagaac agataaatac cgaacataca gcaagaaaca

20821 ctttcggatt ttc ↓ aggGtag gtaatgaata cccatgtatc taggagagct ggtaatttgg


20941 gttctctatt ttaggaagtg ggtcctaaaa actcttacat tgcatacata gaagatcaca

21001 gtggcaatgg aacctttgta aatacagagc ttgtagggaa aggaaaacgc cgtcctttga

21061 ataacaattc tgaaattgca ctgtcactaa gcagaaataa aggtaatatt attatcttat

21121 ggttactgga 3’


90

Kesim reaksiyonu sonucu oluşan ürünler %2.5’lik agaroz jelde yürütülüp

görüntülendikten sonra, olguların genotiplemeleri gerçekleştirildi. Kesim sonucunda

elde edilen ve olguların genotipini belirleyen bandlar Şekil 3.4’de görülmektedir.

1. Mutasyon bulunmayan genotipteki olgularda 491 bç’i büyüklüğünde tek DNA

fragmenti (RE tanıma bölgesi bulamadığından PCR ürünü kesilmemiştir)

görülmüştür (Şekil 3.4.’de 3.-5.).

2. Heterozigot mutant genotiplerde 491, 297 ve 194 bç’i büyüklüğünde üç DNA

fragmenti (RE bir mutant allel bulunduğundan dolayı bir tanıma bölgesine

sahiptir, diğer allelde tanıma bölgesi olmadığında kesilmemiştir) görülmüştür

(Şekil 3.4.’de 1.-2.).

3. Homozigot mutant genotipler olsa idi sadece 297 ve 194 bç’i büyüklüğünde iki

DNA fragmenti (RE iki mutant allel bulunduğundan dolayı tüm PCR ürünleri

kesmiştir) görülecekti. Ancak bu pozitif kontrol temin edilemediği için

kullanılamamıştır.


91

Şekil 3.4. CHEK2 IVS2 + 1G>A Mutasyonunun RFLP Yöntemi İle

Genotiplendirilmesi Sonucu Oluşan DNA Parçalarının %2.5’lik Agaroz Jeldeki Görüntüsü. M: DNA marker, 1-2 nolu bandlar CHEK2 IVS2 + 1G>A mutasyonunu heterozigot olarak taşıyan örneklerde (491, 297 ve 194 bç), 3-5 nolu bandlar CHEK2 IVS2 + 1G>A mutasyonu bulunmayan örneklerde görülmektedir (491 bç).

3.8. CHEK2 1100delC Mutasyonun Allele Özgü Mutasyon Belirleme Yöntemi

İle Belirlenmesi

CHEK2 1100delC mutasyonu CHEK2 geninin 1100. pozisyonda bulunan

Sitozin (C) nükleotidinin delesyonudur. Meydana gelen nükleotid delesyonu çerçeve

kayması (frameshift) mutasyonuna neden olur. 1100. pozisyondaki sitozin delesyonu

380. kodonda durdurucu kodon oluşumu ile sonuçlanır. Bu mutasyon sonucunda

yarım (truncated, =kesik) protein oluşmakta ve bu protein, kinaz fonksiyonuna sahip

değildir. CHEK2 1100delC mutasyonu Margolin ve ark. (2007), kullanmış oldukları

yöntem ile belirlenmiştir. Bu yöntem allele özgü nükleotidlerle mutasyon belirleme

50 bç

200 bç

300 bç

500 bç

297 bç

194 bç

491 bç

M 1 2 3 4 5


92

tekniğidir (Allele Refractory Mutation Detection System, ARMS). İki farklı allel için

aynı koşullarda iki farklı tüpte iki ayrı PCR reaksiyonu gerçekleştirildi. Böylece aynı

kişiye ait DNA örneğinden iki farklı PCR reaksiyonu yapıldı. İki farklı PCR

reaksiyonu arasındaki tek farklılık CHEK2 1100delC mutasyonunu belirlemek

amacıyla kullanılan primer çiftlerinin farklılığıdır. Bu farklı PCR reaksiyonlarından

birine CHEK2 1100delC mutasyonunun bulunması durumunda DNA amplifikasyonu

oluşturabilecek primer çifti eklendi. Eğer DNA örneğinde CHEK2 1100delC

mutasyonu bulunuyor ise 183 bç’lik DNA parçasının amplifikasyon bandı görülür.

Eğer bu DNA örneğinde 1100delC mutasyonu yok ise herhangi bir amplifikasyon

bandı görülmez. Aynı bireye ait DNA örneğinden yapılan diğer PCR reaksiyonunda

ise CHEK2 1100delC mutasyonunun bulunmaması durumunda DNA amplifikasyonu

oluşturabilecek primer çifti eklendi. Eğer DNA örneğinde CHEK2 1100delC

mutasyonu bulunmuyor ise bu 184 bç’lik DNA parçasının amplifikasyon bandı

görülür. Eğer bu DNA örneğinde 1100delC mutasyonu var ise bu durumda herhangi

bir amplifikasyon bandı görülmez. Aynı bireyin DNA örneğine ait iki farklı tüpteki

PCR reaksiyonu sonucunda amplifikasyon bandı oluşup oluşmamasına göre de

bireyin CHEK2 1100delC mutasyonuna sahip olup olmadığına varsa mutasyonlu gen

için ferdin heterozigot ya da homozigot olup olmadığına karar verilir. Ayrıca aynı

bireyin DNA örneğine ait iki farklı tüpteki PCR reaksiyonuna bir de kontrol primer

eklendi. Bu kontrol primer çifti PCR reaksiyonunun çalışıp çalışmadığını kontrol

etmek amacıyla kullanıldı. Bu primer çifti tamamen farklı bir genin dizisini

çoğaltacak olan bir çift primerdir. CHEK2 1100delC mutasyonun belirlenmesinde


oluşturabilecek M-CHEK2del1100C İleri: 5’- GCA AAG ACA TGA ATC TGT

AAA GTC -3’ ve M-CHEK2del1100C Geri: 5’- AAA TCT TGG AGT GCC CAA

AAT AAT -3’ primer çifti kullanılmıştır. Bununla birlikte 1100delC mutasyonunun

bulunmaması durumunda DNA amplifikasyonu oluşturabilecek W-CHEK21100delC

İleri: 5’- GCA AAG ACA TGA ATC TGT AAA GTC -3’ ve W-CHEK21100delC

Geri: 5’- AAA TCT TGG AGT GCC CAA AAT CAG- 3’ primer çifti ile 1100delC

mutasyonunun bulunmadığı allel (yabani tip allel) belirlenmiştir. National Center for

Biotechnology Information (NCBI) nükleotid veri tabanından alınan rapor numarası


93

olan AY800241 insan genomik sırası kullanılmış ve primerlerin uygunluğunun testi

için online Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) programından yararlanılmıştır.

Hem 1100delC mutasyonunun bulunması durumunda DNA amplifikasyonu

oluşturabilecek PCR reaksiyonunda, hem de 1100delC mutasyonunun bulunmaması

durumunda DNA amplifikasyonu oluşturabilecek PCR reaksiyonunda PCR

reaksiyonunun doğru çalışıp çalışmadığını kontrol etmek amaçlı SLC30A9 geninde

309 bç’lik DNA parçasının amplifikasyon bandını görmek için Kontrol-İleri: 5’-GTC

AAA GCC ACC AGT TAC AGT -3’ ve Kontrol-Geri: 5’-TTC CCC ACC ACT

TTA CTG AC-3’ primer çiftleri kullanılmıştır.

Çizelge 3.14.’te 1100delC mutasyonu olmayan CHEK2 gen dizisi, 1100delC

mutasyonunun bulunmaması durumunda DNA amplifikasyonu oluşturabilecek

primerlerin CHEK2 geni üzerindeki konumları (altı çizili ve kırmızı renkli ile

nükleotidler) ve 1100delC mutasyonunun oluşmasına neden olan Sitozin (büyük

harfle ve kırmızı renkli) nükleotidi gösterilmiştir.

Çizelge 3.14. CHEK2 1100delC Mutasyonunun Bulunmaması Durumunda DNA

Amplifikasyonu Oluşturabilecek Primerlerin CHEK2 Geni Üzerindeki Konumları ve 1100delC Mutasyonunun Oluşmasına Neden Olan Nükleotid.

Çizelge 3. 15’te CHEK2 1100delC mutasyonu bulunan CHEK2 gen dizisi,

CHEK2 1100delC mutasyonunun bulunması durumunda DNA amplifikasyonu

oluşturabilecek primerlerin CHEK2 geni üzerindeki konumları (altı çizili ve kırmızı

renkli nükleotidler) gösterilmiştir.

50041 5’ aattttaatt taagcaaaat taaatgtcct aacttgcaaa gacatgaatc tgtaaagtcc

50101 agattaatgg caggtgtgaa ttgtacaata gaaactgatc tagcctacgt gtcttcttgg

50161 actggcagac tatgttaatc tttttatttt atggcaagtt caacattatt cccttttgta

50221 ctgaatttta gattaCtgat tttgggcact ccaagatttt gggagagacc tctctcatga 3’



94

Çizelge 3.15. CHEK2 1100delC Mutasyonunun Bulunması Durumunda DNA Amplifikasyonu Oluşturabilecek Primerlerin CHEK2 Geni Üzerindeki Konumları.

Çizelge 3.16’da hem 1100delC mutasyonunun bulunması durumunda DNA

amplifikasyonu oluşturabilecek PCR reaksiyonlarında hem de 1100delC

mutasyonunun bulunmaması durumunda DNA amplifikasyonu oluşturabilecek PCR

reaksiyonlarında PCR reaksiyonunun doğru çalışıp çalışmadığını kontrol etmek

amaçlı kullanılan SLC30A9 geninde 309 bç’lik band amplifikasyonu meydan getiren

primerlerin SLC30A9 geni üzerindeki konumu gösterilmiştir.

Çizelge 3.16. SLC30A9 Genine Özgü Primerlerin SLC30A9 Geni Üzerindeki

Konumları.

3.8.1. CHEK2 1100delC Mutasyonu İçin PCR İşlemi

CHEK2 1100delC mutasyonunun belirlenmesi için yapılan PCR

reaksiyonlarında 1100delC mutasyonunu heterozigot olarak bulunduran bireylerin

kan örnekleri ile DNA örnekleri Dr. Heli Nevanlinna (Department of Obstetrics and

Gynecology Helsinki University Central Hospital Biomedicum Helsinki 4th floor

P.O. BOX 700 00029 HUS Finland), Dr. Cezary Cybulski (1International Hereditary

Cancer Center, Department of Genetics and Pathology, Pomeranian Medical

361 5’ aagtaaatct aattcagaag ttttgataga ggaaaatgtt ctggtctgtc aaagccacca

421 gttacagtgc ttctctgcaa aattttggag gtattaaaaa aagtttttgt ttttttacag

481 ccacgctcca gaacagcatc agtgtttttt aagggaccag gaaaagtggt gatggttgca

541 atttgcatgt aagtactgaa aaataagctt tgtgaaatag aatatattct tttaaatatg

601 tatatcctta aatatgtaaa tttattacat ggtagctagc tatagagttt gaggtttatt

661 ttgttttagg aggaaattga ataagtcttt attattgtca gtaaagtggt ggggaaagag 3’

50041 5’ aattttaatt taagcaaaat taaatgtcct aacttgcaaa gacatgaatc tgtaaagtcc

50101 agattaatgg caggtgtgaa ttgtacaata gaaactgatc tagcctacgt gtcttcttgg

50161 actggcagac tatgttaatc tttttatttt atggcaagtt caacattatt cccttttgta

50221 ctgaatttta gattattat tttgggcact ccaagatttt gggagagacc tctctcatga 3’


95

University, Szczecin, Poland), Dr. Natalia Bogdanova (Hannover Medical School

Frauenklinik (OE6411) Carl-Neuberg-Str.1 30625 Hannover Germany), ve Dr.

Børge G. Nordestgaard (Department of Clinical Biochemistry, Herlev University

Hospital, Herlev Ringvej 75, DK-2730 Herlev, Denmark) tarafından gönderilmiştir.

Bu bireylerin DNA örnekleri pozitif kontrol olarak kullanılmıştır.

PCR işlemi için gerekli hazırlıklar şu şekilde yapılmıştır:

1. Tüm PCR eriyiklerinin bir araya konulduğu ana karışım 1.5 veya 2 ml’lik steril

eppendorf tüpleri içerisinde hazırlandı. Her örnek için iki farklı ana karışım

oluşturuldu. Bu karışımların birbirlerinden farkı kullanılan primerlerden

kaynaklanmaktadır. Birinci karışımda CHEK2 1100delC mutasyonunun

bulunması durumunda DNA amplifikasyonu oluşturabilecek primer çifti

bulunmaktadır (Çizelge 3.17). İkinci karışımda ise CHEK2 1100delC

mutasyonunun bulunmaması durumunda DNA amplifikasyonu oluşturabilecek

primer çifti kullanılmıştır (Çizelge 3.18). PCR tüplerine ana karışımın pipet ile

aktarılması sırasındaki kayıplar göz önünde bulundurularak çoğaltılacak örnek

sayısından 3-5 örnek kadar daha fazlası olacak şekilde PCR ana karışımı

hazırlandı. Çizelge 3.17 ve Çizelge 3.18’de ana karışımların hazırlanışı ve PCR

eriyiklerinden 25 μl’lik bir PCR reaksiyonu için ne kadar alınması gerektiği ve

reaksiyondaki son konsantrasyonları gösterilmiştir.

2. Ana karışımlar vorteksle karıştırıldıktan sonra çeperlere yapışan damlacıklardan

da yararlanmak için çok kısa bir santrifüj (spin) (8000 devir/dakika 10 saniye) ile

tüm sıvı bir araya toplandı.

3. 0.2 μl’lik steril PCR tüpleri etiketlendikten sonra PCR ana karışımlardan bunların

her birine 17.5 μl konuldu. PCR tüpleri etiketlenirken aynı bireyin DNA örneği

için CHEK2 1100delC mutasyonunun bulunmasına ve bulunmamasına özgün

yapılacak iki farklı reaksiyon içim iki farklı PCR tüpü etiketlendi.

4. Her bir etiketli PCR tüpüne aynı etikete sahip DNA tüplerinden 7.5’er μl DNA

eklenerek her tüpün içinde 25 μl’lik PCR karışımı oluşturuldu. Böylece aynı

bireyin DNA örneğinden CHEK2 1100delC mutasyonunun bulunmasına ve

bulunmamasına özgün yapılacak iki farklı reaksiyon için iki farklı tüpün her

birine 7.5 μl DNA eklendi. Negatif (su) ve pozitif (CHEK2 1100delC


96

mutasyonunu heterozigot olarak bulunduran DNA) kontrollerde aynı şekilde

etiketlenip PCR tüplerine eklendi.

5. Bütün tüpler GeneAmpR PCR System 9700 (Applied Biosystems) PCR cihazına

yerleştirildi. Çizelge 3.19’ deki PCR protokolü programlanarak PCR cihazı

çalıştırıldı.

6. Ardından PCR cihazından çıkarılan örnekler agaroz jel elektroforez ile analiz

edilinceye kadar 4 oC’ye kaldırıldı.

Çizelge 3.17. CHEK2 1100delC Mutasyonunun Bulunması Durumunda DNA Amplifikasyonu Oluşturabilecek Optimum PCR Reaksiyonu Karışımı.

Malzeme Stok

Konsantrasyon

İstenen

Konsantrasyon

(μl’de)

Alınan

Miktar

(μl)


MgCI2 25 mM 2 mM 2 μl


M-CHEK2del1100C İleri 50 pmol/μl 0.5 μM 0.25 μl

M-CHEK2del1100C Geri 50 pmol/μl 0.5 μM 0.25 μl

Kontrol-İleri Primer 50 pmol/μl 0.5 μM 0.25 μl

Kontrol-Geri Primer 50 pmol/μl 0.5 μM 0.25 μl

Taq DNA polimeraz 5 U/μl 0.12 U 0.6 μl

DNA 15-30 ng/μl 4.5-9 ng 7.5 μl

ddH2O -- -- 10.9 μl


97

Çizelge 3.18. CHEK2 1100delC Mutasyonunun Bulunmaması Durumunda DNA Amplifikasyonu Oluşturabilecek Optimum PCR Reaksiyonu Karışımı.

Malzeme Stok

Konsantrasyon

İstenen

Konsantrasyon

(25μl’de)

Alınan

Miktar (μl)


MgCI2 25 mM 2 mM 2 μl


W-CHEK21100delC İleri 50 pmol/μl 0.5 μM 0.25 μl

W-CHEK21100delC Geri 50 pmol/μl 0.5 μM 0.25 μl

Kontrol-İleri Primer 50 pmol/μl 0.5 μM 0.25 μl

Kontrol-Geri Primer 50 pmol/μl 0.5 μM 0.25 μl

Taq DNA polimeraz 5 U/μl 0.12 U 0.6 μl

DNA 15-30 ng/μl 4.5-9 ng 7.5 μl

ddH2O -- -- 10.9 μl

Çizelge 3. 19. CHEK21100delC Mutasyonu İçin PCR Sıcaklıkları ve Döngü Sayıları.


(ºC)



Denatürasyon 95 20 saniye

40 Bağlanma (Annealing) 59 20 saniye

Uzama (Extension) 72 20 saniye

Son Uzaman 72 5 dakika 1

3.8.2. CHEK2 1100delC Mutasyonunun Agaroz Jel Elektrofez ile Analizi

Bireylerin CHEK2 1100delC mutasyonunu bulundurup bulundurmadığı

ARMS-PCR reaksiyonundan sonra %2.5’luk agaroz jel elektroforez ile belirlendi.

Agaroz jelin birinci kuyusuna DNA markeri, daha sonraki kuyulara aynı örnek için


98

yapılmış iki farklı reaksiyon ürünü de yüklendi. Tüm deneylerde ilk önce CHEK2


oluşturabilecek PCR reaksiyonunun ürünü hemen bunun yanına yine aynı bireye ait

DNA örneği ile yapılmış ve CHEK2 1100delC mutasyonunun bulunmaması

durumunda DNA amplifikasyonu oluşturabilecek PCR reaksiyonunun ürünü

yüklendi. Jel 90 voltta 30 dakika elektroforeze tabi tutuldu. Jel görüntüleme sistemi

ile agaroz jel incelendi.

ARMS-PCR reaksiyonu sonucu oluşan ürünler % 2.5’lik agaroz jelde

yürütülüp görüntülendikten sonra, olguların genotiplemeleri gerçekleştirildi. ARMS-

PCR sonucunda elde edilen ve olguların genotipini belirleyen bandların anlamı

aşağıda belirtilmiştir.

1. a: CHEK2 1100delC mutasyonunu heterozigot olarak taşıyan genotipteki

(CHEK2 geninin bir allelinin 1100. pozisyonundaki nükleotidi delesyon ile

kaybolmuş, fakat diğer allelin 1100. pozisyonunda herhangi bir delesyon söz

konusu değil) bireylerde allelin birinde 1100delC mutasyonunun bulunmasından

dolayı 1100delC mutasyonunun bulunması durumunda DNA amplifikasyonu

oluşturabilecek PCR reaksiyonunda 183 bç’i büyüklüğünde PCR ürünü ve PCR

reaksiyonunun doğru çalışıp çalışmadığını kontrol etmek amacıyla eklenen

primerin oluşturduğu 309 bç’lik kontrol bandı oluşmaktadır. Bu reaksiyonun

ürününün yüklendiği agaroz jelin kuyusundaki DNA’nın elektroforezi sonucunda

2 adet DNA amplifikasyon bandı görülmektedir (Şekil 3.5. 2. kuyu).

b: CHEK2 1100delC mutasyonunu heterozigot olarak taşıyan bireyin DNA

örneği ile yapılmış olan ve 1100delC mutasyonunun bulunmaması durumunda

DNA amplifikasyonu oluşturabilecek PCR reaksiyonunda da allelerden birinin

mutasyona uğramamış olması sebebiyle PCR reaksiyonunda 184 bç’i

büyüklüğünde PCR ürünü ve PCR reaksiyonunun doğru çalışıp çalışmadığını

kontrol etmek amacıyla eklenen primerin oluşturduğu 309 bç’lik kontrol bandı

oluşmaktadır bu reaksiyonun ürününün yüklendiği agaroz jelin kuyusundaki

DNA’nın elektroforezi sonucunda 2 adet DNA amplifikasyon bandı

görülmektedir (Şekil 3.5. 3. kuyu)


99

2. a: CHEK2 1100delC mutasyonu olmayan genotipteki bireylerde 1100delC

mutasyonunun bulunması durumunda DNA amplifikasyonu oluşturabilecek PCR

reaksiyonunda CHEK2 1100delC mutasyonu olmadığından dolayı herhangi bir

DNA amplifikasyon bandı görülmemiştir. Fakat bu reaksiyonda PCR


primerin oluşturduğu 309 bç’lik kontrol bandı oluşmaktadır bu reaksiyonun

ürününün yüklendiği agaroz jelin kuyusundaki DNA’nın elektroforezi sonunda 1

adet DNA amplifikasyon bandı görülmektedir (Şekil 3.5. 4. kuyu)

b: CHEK2 1100delC mutasyonu olmayan bireyin DNA örneği ile yapılmış olan

ve 1100delC mutasyonunun bulunmaması durumunda DNA amplifikasyonu

oluşturabilecek PCR reaksiyonunda ise allelerin her ikisinde de 1100delC

mutasyonunun olmaması nedeniyle 184 bç’i büyüklüğünde PCR ürünü ve PCR


primerin oluşturduğu 309 bç’lik kontrol bandı oluşmaktadır. Bu reaksiyonun

ürününün yüklendiği agaroz jelin kuyusunda 2 adet DNA amplifikasyon bandı

görülmektedir (Şekil 3.5. 5. kuyu).


100

Şekil 3.5. CHEK2 1100delC Mutasyonunun ARMS-PCR Yöntemi İle Genotiplendirilmesi Sonucu Oluşan DNA Parçacıklarının %2.5’lik Agaroz Jeldeki Görüntüsü. M: DNA marker, 2. kuyu: 1100delC mutasyonunu heterozigot taşıyan pozitif kontrolün CHEK2 1100delC mutasyonuna spesifik PCR reaksiyon ürününün 309 bç’lik (kontrol amplifikasyonu) ve 183 bç.’lik (mutant allelin amplifikasyonu) bandları, 3. kuyu: 1100delC mutasyonu heterozigot taşıyan pozitif kontrolün CHEK2 1100delC mutasyonunun bulunmamasına spesifik PCR reaksiyon ürününün 309 bç.’lik (kontrol amplifikasyonu) ve 184 bç.’lik (mutasyona uğramamış allelin amplifikasyonu) bandları, 4. kuyu: 1100delC mutasyonu taşımayan bireyin CHEK2 1100delC mutasyonunun bulunmasına spesifik PCR reaksiyon ürününün 309 bç.’lik sadece kontrol amplifikasyonu bandı var, 1100delC mutasyonu bulunmadığı için 183 bç’lik amplifikasyon bandı yoktur. 5. kuyu: 1100delC mutasyonu taşımayan bireyin (homozigot yabani tip) CHEK2 1100delC mutasyonunun bulunmamasına spesifik PCR reaksiyon ürününün 309 bç.’lik kontrol amplifikasyon ve 184 bç.’lik (mutasyona uğramamış allellerin amplifikasyonu) bandları.

250 bç

50 bç

100 bç

150 bç

200 bç

300 bç 350 bç 309 bç

184 bç

M 2. kuyu 3. kuyu 4. kuyu 5. kuyu


101

3.9. İstatistiksel Analizler

Kolorektal kanser ile kontrol grubu ve hepatoselüler kanser ile kontrol grubu

arasında sayısal değişkenlerin (yaş) ortalamalarının karşılaştırılmasında Student’s t-

testi, kategorik değişkenlerin (cinsiyet, alkol ve sigara kullanımı gibi) frekansları

yönünden farklılıkların karşılaştırılmasında Ki-Kare (χ2) testi kullanıldı. Kolorektal

kanser ile kontrol grubu ve hepatoselüler kanser ile kontrol grubu arasında CHEK2

1100delC, IVS2 + 1 G>A ve I157T mutasyonlarının frekansları yönünden farklılıklar

χ2 testi ile kontrol edilir. p değerinin 0.05 küçük olması istatistiksel olarak anlamlı

kabul edilir. Bütün istatistiksel yöntemler, “SPSS (Statistical Packages of Social

Sciences, SPSS for Windows, Version 15,0 Chicago, IC, USA)” istatistiksel paket

programı kullanılarak yapıldı.


102

4. BULGULAR Süleyman BAYRAM

103

4. BULGULAR

4.1. Çalışma Gruplarını Oluşturan Bireylerin Genel Bilgileri

4.1.1. Kontrol Çalışma Grubunu Oluşturan Bireylerin Genel Bilgileri

Kontrol çalışma grubu, herhangi bir kanser tanısı almamış sağlıklı 446

bireylerden oluşmuştur. Bu gruptaki bireylerin genel özellikleri Çizelge 4.1 ve 4.2’de

gösterilmiştir. Kontrol çalışma grubundaki bireylerin %52’si (231/446) erkeklerden

%48’i (214/446) kadınlardan oluşmaktadır. Bu grubun bireylerinin yaş ortalaması

50.14±12.88 olarak bulunmuştur. Kontrol grubunun %55.2’si (246/446) 50 yaş ve

üzerinde iken %44.8’i (200/446) ise 50 yaş altında idi. Kontrol grubundaki bireylerin

162 tanesi (%36.3) sigara içerken, 284 tanesi (%63.7) sigara içmemektedir. Bununla

birlikte bu grubu oluşturan 446 bireyin 135 tanesinin (%30.3) alkol kullanım öyküsü

mevcut iken 311 tanesinin (%69.7) alkol kullanım öyküsü bulunmamaktadır.

4.1.2. Kolorektal Kanser Çalışma Grubunu Oluşturan Bireylerin Genel, Klinik

ve Patolojik Bilgileri

Kolorektal çalışma grubu, raporları ve dosyaları taranan patolojik olarak

kolorektal kanser tanısı almış 210 bireyden oluşmuştur. Kolorektal kanser çalışma

grubundaki bireylerin genel, klinik ve patolojik bilgileri Çizelge 4.1’de

gösterilmiştir. Kolorektal kanser çalışma grubundaki bireylerin %54.8’i (115/210)

erkeklerden %45.2’si (95/210) kadınlardan oluşmaktadır. Cinsiyet durumu yönünden

kontrol çalışma grubu ile kolorektal kanser çalışma grubu arasında yapılan

karşılaştırma sonucunda önemli bir fark görülmedi (Çizelge 4.1). Kolorektal çalışma

grubunu oluşturan bireylerin yaş ortalaması 53.75±14.62 olarak bulundu. Kolorektal

kanser grubunu oluşturan bireylerin %66.7’si (140/210) 50 yaş ve üzerinde, %33.3’ü

(20/210) ise 50 yaş altında idi.


104

Çizelge 4.1. Kolorektal Kanser ve Kontrol Çalışma Grubundaki Bireylerin Genel, Klinik ve Patolojik Bilgiler.

a: Pearson ki-kare (χ2) testi ile belirlenmiştir. b: Student’s t-testi ile belirlenmiştir.

Yapılan istatistiksel analizler sonucunda kolorektal çalışma grubu ile kontrol

çalışma grubu arasında yaş yönünden istatistiksel olarak önemli bir farklılığın olduğu

saptanmıştır (Çizelge 4.1). Kolorektal çalışma grubunu oluşturan bireylerin 86

tanesinin (%41.0) sigara kullanım öyküsü bulunurken, 124 tanesinin (%59.0) sigara

Kolorektal Kanser Çalışma

Grubu (%)

Kontrol Çalışma Grubu

(%)

p

Cinsiyet 0.495a

Erkek 115 (% 54.8) 231 (% 52.0) Kadın 95 (% 45.2) 214 (% 48.0)

Yaş (yıl) 0.001a,b

Yaş Aralığı 11-86 10-84 Ortalama yaş 53.75 ± 14.62 50.14 ± 12.88 ≥50 140 (% 66.7) 246 (% 55.2) <50 70 (% 33.3) 200 (% 44.8)

Sigara 0.254a

İçen 86 (% 41.0) 162 (% 36.3) İçmeyen 124 (% 59.0) 284 (% 63.7)

Alkol 0.249a

Kullanan 73 (% 34.8) 135 (% 30.3) Kullanmayan 137 (% 65.2) 311 (% 69.7)

Tümörün Lokalizasyonu

Proksimal 80 (% 38.1) -- Distal 100 (% 47.6) -- Rektum 30 (% 14.3) --

Tümörün Farklılaşma Derecesi

İyi Derecede Farklılaşma

25 (% 11.9) --

Orta Derecede Farklılaşma

139 (% 66.2) --

Kötü Derecede Farklılaşma

46 (% 21.9) --

Tümörün Histolojik Tipi

Adenokanser 183 (%87.1) -- Müsinöz kanser 27 (% 12.9) --


105

Anal Kanal 5 cm

Rektum 15 cm

Sigmoid Kolon

50 cm

İnen Kolon

10 cm

Transvers Kolon

50 cm

Çıkan Kolon

10 cm

Çekum

10 cm

İleum

kullanım öyküsünün bulunmadığı belirlenmiştir. Kontrol çalışma grubu ile kolorektal

çalışma grubu arasında sigara kullanımı yönünden istatistiksel olarak önemli bir

farklılığın olmadığı yapılan istatistiksel analizler sonucunda saptanmıştır (Çizelge

4.1). 210 kolorektal kanserli hastanın %34.8’inin (73/210) alkol tüketimi mevcut

iken, %65.2’sinin (137/210) alkol kullanım hikayesinin bulunmadığı belirlenmiştir.

Yapılan istatistiksel analiz kontrol çalışma grubu ile kolorektal kanser çalışma grubu

arasında alkol tüketimi yönünden önemli bir farklılığın olmadığını göstermiştir

(Çizelge 4.1).

İleum, ince bağırsağın son kısmıdır ve insanlarda yaklaşık 4 metre

uzunluğundadır. İleum, ileoçekal valf (=kapakçık: organlar içindeki sıvının geri

kaçışını önleyen viseral kıvrım) ile çekumdan ayrılır. Kolon, ileoçekal valfden anüse

kadar uzanır ve yaklaşık 1.5 metre uzunluğundadır. Gastrointestinal sistemin

yaklaşık 1/5’ini oluşturur. Anatomik olarak çekum, çıkan kolon, transvers kolon,

inen kolon, sigmoid kolon ve rektum’dan oluşur (Şekil 4.1.).

Şekil 4.1. Kalın Bağırsağın Bölümleri.

Çıkan kolon, ascending kolon olarak da adlandırılmaktadır. Çıkan kolon,

kolona ince bağırsağın eklendiği yerden başlar ve kişinin üst sağ karın bölgesine


106

kadar uzanır. Transvers kolon, yatay kolon olarak da adlandırılmaktadır. Transvers

kolon, vücudu sağdan sola doğru geçen bölümdür. İnen (descending) kolon sol

tarafın altına kadar uzanır. Sigmoid kolon S biçiminden dolayı kıvrımlı kolon olarak

da adlandırılmaktadır.

Tümörün lokalizasyon yeri, patologlar tarafından proksimal (çekum, çıkan

kolon ve transvers kolon), distal (inen kolon ve sigmoid kolon) ve rektum olarak 3

farklı alt gruba ayrılmıştır. Kolorektal kanserli hastaların %38.1’inde (80/210)

tümörün proksimal bölgede olduğu belirlenmiştir. 210 kolorektal kanserli hastanın

100 (%47.6) tanesinde kanser distal bölge içerisinde gelişmiştir. Bununla birlikte

%14.3 (30/210) oranında rektum bölgesinde kanser gözlenmiştir (Çizelge 4.1).

Tümörün farklılaşması, tümör hücresinin kökenini aldığı normal hücrelerden

yapısal ve fonksiyonel olarak ne kadar farklılaştığını belirtmektedir. Kolorektal

kanserler iyi farklılaşmış formdan kötü farklılaşmış forma kadar değişen geniş

spektrum içerisinde bulunurlar. Histolojik derecelendirme henüz dünya çapında

kabul edilmiş kriterlere sahip olmasa da genellikle 3 evreye ayrılır. Birinci

derecedeki tümör hücreleri iyi farklılaşmış, ikinci derecedekiler orta derecede

farklılaşmış, üçüncü derecedekiler kötü faklılaşmış özellikteki hücrelerden ibarettir.

Kötü farklılaşmış grupta, tümör hücrelerinde belirgin morfolojik ve fonksiyonel

değişiklikler vardır. Hücreler ve çekirdekleri şekil, hacim ve boyanma özellikleri

bakımından birbirlerinden ve köken aldığı hücrelerden önemli ayrıcalıklar gösterir.

Çekirdekleri büyüktür, koyu renk boyanır ve genellikle büyük nukleoluslar içerir.

Tümörlerde farklılaşma kötüleştikçe genel olarak mitoz sayısı artar ve normalden

farklı mitoz şekilleri ortaya çıkar.

Tümörler farklılaşma özelliklerine göre patologlar tarafından analiz

edildiğinde, çalışmaya dahil edilen hastalarda gelişen tümörlerin %11.9 (25/210) iyi

derecede farklılaşmış tümör özelliğinde iken, %66.2’si (139/219) orta derecede

farklılaşmış ve %21.9’u (46/210) kötü derecede farklılaşmış tümör karakterinde

olduğu saptanmıştır (Çizelge 4.1.).

Kolorektal kanserlerin %95’ini adenokarsinomalar oluşturur. Diğer alt tipler

daha az sıklıkta görülür. Adenokarsinomada tümör hücreleri, silindirik ve goblet

hücre (salgı oluşturup kayganlık sağlayan hücreler) kombinasyonu ile nadir endokrin


107

hücreler (bağırsağın, salgı oluşturması ve hareketinin düzenlenmesinde görevli

hormonlar üreten hücreler) ve paneth hücrelerinden (sindirim enzimleri salgılayan

hücreler) oluşur. Kolorektal karsinomaların diğer bir histolojik varyantı müsinöz

karsinomadır. Müsinöz karsinoma, tümör hücre topluluklarıyla karışık geniş

ekstrasellüler müsin gölcüklerinin olduğu özel bir kolorektal karsinoma tipidir.

Müsin tümör kitlesinin en azından yarısını meydana getirir

Çalışmamızdaki hastaların tümör dokuları histolojilerine göre ayrıldığında

%87.1’i (183/210) adenokarsinoma grubunda iken %12.9’unun (27/210) müsinöz

kanser histolojik alt tipinde olduğu patologlar tarafından rapor edilmiştir (Çizelge

4.1.).

4.1.3. Hepatoselüler Kanser Hasta Grubunu Oluşturan Bireylerin Genel ve

Klinik Bilgileri

Hepatoselüler kanser çalışma grubu, raporları ve dosyaları taranan klinik,

laboratuvar, radyolojik ve patolojik bulguları ile hepatoselüler kanser tanısı konmuş

165 bireyden oluşmuştur. Hastalara, Barselona Kriterleri’ne göre karaciğer sirozu

olan vakalarda iki radyolojik veya bir radyolojik birde biyokimyasal parametre

(alfafetoprotein düzeyi) baz alınarak veya karaciğer sirozu olmayan vakalarda

patoloji sonucuna göre hepatoselüler kanser tanısı konulmuştur. Hepatoselüler kanser

çalışma grubundaki bireylerin genel ve klinik bilgileri Çizelge 4.2.’de gösterilmiştir.

Hepatoselüler kanser çalışma grubundaki bireylerin %79.4’ü (131/165) erkeklerden

%20.6’sı (34/165) kadınlardan oluşmaktadır. Cinsiyet durumu yönünden kontrol

çalışma grubu ile hepatoselüler kanser çalışma grubu arasında istatistiksel olarak

önemli bir fark görülmüştür (Çizelge 4.2). Hepatoselüler kanser çalışma grubunu

oluşturan bireylerin yaş ortalaması 59.34±11.08 olarak bulundu. Hepatoselüler

kanser grubunu oluşturan bireylerin %86.7’si (143/165) 50 yaş ve üzerinde, %13.3’ü

(22/165) ise 50 yaş altında idi. Yapılan istatistiksel analizler sonucunda hepatoselüler

kanser çalışma grubu ile kontrol çalışma grubu arasında yaş yönünden istatistiksel

olarak önemli bir farklılığın olduğu saptanmıştır (Çizelge 4.2).


108

Çizelge 4.2. Hepatoselüler Kanser ve Kontrol Çalışma Grubundaki Bireylerin Genel Klinik ve Patolojik Bilgileri

Hepatoselüler Kanser Çalışma

Grubu (%)

Kontrol Çalışma Grubu

(%)

p

Cinsiyet <0.001a

Erkek 131 (% 79.4) 232 (% 52.0) Kadın 34 (% 20.6) 214 (% 48.0)

Yaş (yıl) <0.001a,b

Yaş Aralığı 20-81 10-84 Ortalama yaş 59.34 ± 11.08 50.14 ± 12.88 <50 22 (% 13.3) 246 (% 55.2) ≥50 143 (% 86.7) 200 (% 44.8)

Sigara 0.074a

İçen 73 (% 44.2) 162 (% 36.3) İçmeyen 92 (% 55.8) 284 (% 63.7)

Alkol 0.566a

Kullanan 46 (% 27.9) 135 (% 30.3) Kullanmayan 119 (% 72.1) 311 (% 69.7)

Viral Enfeksiyon Olma ve Olmama Durumu

Hepatit B (+) 95 (% 58.8) -- Hepatit C (+) 39 (% 23.6) -- Hepatit B ve C (+) 2 (% 1.2) -- Viral Enfeksiyon Yok (Viral Marker’ları “-”)

27 (% 16.4) --

Karaciğer Sirozu Olan 133 (% 80.6) -- Olmayan 23 (% 19.4) --

Tümörün Evresi (BCLC) Erken 36 (% 21.8) -- Orta 30 (% 18.2) -- İleri 29 (% 17.6) -- Son 70 (% 42.4) --

a: Pearson ki-kare (χ2) testi ile belirlenmiştir. b: Student’s t-testi ile belirlenmiştir

Hepatoselüler kanser çalışma grubunu oluşturan bireylerin 73 tanesinin

(%44.2) sigara kullanım öyküsü bulunurken, 92 tanesinin (%55.8) sigara kullanım

öyküsünün bulunmadığı belirlenmiştir. Kontrol çalışma grubu ile hepatoselüler

kanser çalışma grubu arasında sigara kullanımı yönünden istatistiksel olarak önemli

bir farklılığın olmadığı yapılan istatistiksel analizler sonucunda saptanmıştır (Çizelge


109

4.2). 165 hepatoselüler kanserli hastanın %27.9’unun (46/165) alkol tüketimi mevcut

iken, %72.1’inin hiç alkol kullanmadığı belirlenmiştir. Yapılan istatistiksel analiz

sonucunda kontrol çalışma grubu ile hepatoselüler kanser çalışma grubu arasında

alkol tüketimi yönünden önemli bir farklılığın olmadığı saptanmıştır (Çizelge 4.2).

Hepatoselüler kanser tanısı konmuş 165 hastanın 95 tanesinde (%58.8) kronik

hepatit B enfeksiyonu, 39 tanesinde (%23.6) kronik hepatit C enfeksiyonu ve 2

tanesinde kronik hepatit B ve C koenfeksiyonu saptanmıştır. Bunun yanında

hepatoselüler kanser gelişen hastaların %16.4’ünde (27/165) herhangi bir viral

enfeksiyonun olmadığı belirlenmiştir (Çizelge 4.2).

Hepatoselüler kanser tanısı konmuş 165 hastanın %80.6’sında (133/165)

karaciğer sirozu gelişmiş iken %19.4’ünde (32/165) karaciğer sirozunun gelişmediği

saptanmıştır.

Hepatoselüler kanser’in altta yatan nedene, epidemiolojik (populasyonda

hastalığı etkileyen faktörler) zemine ve karaciğer fonksiyon bozukluğunun şiddetine

bağlı olan heterojen doğası, dünya genelinde kullanılan belirli bir evreleme (stage)

sisteminin ortaya konulmasına engel olmaktadır. Solid (sıvı özelliği olmayan; katı

doku özelliğinde) tümörler için yaygın olarak kullanılan sınıflandırma

(klasifikasyon) sistemi, altta yatan sirozun derecesini içermediği için ciddi

kısıtlamalar içermektedir. Bu nedenden dolayı diğer evreleme sistemleri olan

Barselona Kliniği Karaciğer Kanseri Klasifikasyonu (BCLC) ve Karaciğer Kanseri

İtalya Skorlaması geliştirilmiştir. Bu araştırmada hepatoselüler kanser Barselona

Kliniği Karaciğer Kanseri Klasifikasyonu (BCLC) ile evrelendirilmiştir. Bu

evrelendirme sisteminde hepatoselüler kanser erken, orta, ileri ve son dönem olmak

üzere 4 farklı alt gruba ayrılmıştır. Çalışma grubu hastalarının tümör evreleri Çizelge

4.2.’de görülmektedir.

4.2. Kontrol, Kolorektal Kanser ve Hepatoselüler Kanser Çalışma Gruplarında

CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC Mutasyon Sıklıklarının

Dağılımları


110


Gruplarında CHEK2 I157T Mutasyonunun (Nokta Mutasyonu) Sıklığı

CHEK2 genine özgü primerler ile belirtilen koşullarda söz konusu mutasyonu

belirlemek amacıyla 155 bç’lik DNA bölgesi PCR işlemiyle çoğaltıldı. Bu

çoğaltılmış DNA fragmentleri CHEK2 I157T mutasyonunu saptamak amacıyla PstI

(5’ C TGCA ↓ G 3’) restriksiyon endonükleaz enzimiyle muamele edilmesini

takiben RFLP’yi belirlemek amacıyla agaroz jelde elektroforeze tabi tutuldu.

Elektroforez sonrası çekilen jel fotoğrafının incelenmesi sonucunda CHEK2 I157T

mutasyonunun araştırıldığı DNA bölgesinin PCR ürününün RE ile muamele

edilmeden önce 155 bç. uzunluğunda olduğu saptandı. RE ile muameleyi takiben

mutasyonu heterozigot (birinci pozitif kontrol) ve homozigot olarak taşıyan (ikinci

pozitif kontrol) ayrıca mutasyonu taşımayan fertlerin DNA’larının elektroforezi

sonucunda şu durum saptandı (Şekil 4.2.):

1. Mutasyonu heterozigot olarak taşıyan I/T genotipli bireyde (birinci pozitif

kontrol) 155 bç’lik, 136 bç’lik ve 19 bç’lik üç DNA fragmenti gözlendi (Şekil

4.2’de 2. kuyu). Burada 19 bç’lik parça jelde görülmemektedir. Çünkü

elektroforez işlemi sırasında 19 bç’lik parça hızlı göç ettiği için jelden dışarı

çıkmıştır.

2. Mutasyonu homozigot halde taşıyan T/T genotipli fertlerde (2. pozitif kontrol)

sadece 136 bç’lik ve 19 bç’lik iki DNA fragmenti gözlendi (Şekil 4.2’de 3. kuyu)

3. Mutasyonu taşımayan I/I genotipli fertlerde ise sadece 155 bç’lik bir DNA

fragmenti gözlendi (Şekil 4.2’de 4-8. kuyular). Bunlar deneydeki kolorektal ve

hepatoselüler kanserli hastalar ile kontrol grubu bireylerinden örneklerdir.

Kontrol çalışma grubunda 446 birey, kolorektal çalışma grubunda 210 ve

hepatoselüler kanser grubunda 165 bireyde olmak üzere toplam 821 bireyde CHEK2

I157T mutasyonunun bulunup bulunmadığı araştırılmıştır. Çalışma grubunun hiçbir

bireyinde CHEK2 I157T mutasyonu belirlenmemiştir (Çizelge 4.3).


111

Şekil 4.2. Kontrol, Kolorektal Kanser ve Hepatoselüler Kanser Çalışma Gruplarında

CHEK2 I157T Mutasyonunun RFLP Yöntemi İle Genotiplendirilmesi. 1. kuyu: DNA marker, 2. kuyu: Birinci pozitif kontrol (CHEK2 I/T heterozigot genotipi), 3. kuyu: İkinci pozitif kontrol (CHEK2 T/T homozigot genotipi), 4-5. kuyular mutasyon bulunmayan genotip (kolorektal kanserli hastalar), 6-7. kuyular: mutasyon bulunmayan genotip (hepatoselüler kanserli hastalar), 8. kuyu: mutasyon bulunmayan genotip (kontrol grubu bireyi).

100 bç

50 bç

150 bç

200 bç 250 bç

1. kuyu 2. kuyu 3. kuyu 4. kuyu 5. kuyu 6. kuyu 7. kuyu 8. kuyu

155 bç

136 bç


112

Çizelge 4.3. Kontrol, Kolorektal Kanser ve Hepatoselüler Kanser Çalışma Gruplarında CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC Mutasyon Sıklıklarının Dağılımları

Çalışma

Grupları

CHEK2 Mutasyonun Sıklıkları

I157T

n (%)

IVS +1G>A

n (%)

1100delC

n (%)

Kontrol

Çalışma Grubu

(n=446)

0/446 (% 0) 0/446 (% 0) 0/446 (% 0)

Kolorektal

Kanser Çalışma

Grubu (n=210)

0/210 (% 0) 0/210 (% 0) 0/210 (% 0)

Hepatoselüler

Kanser Çalışma

Grubu (n=165)

0/165 (% 0) 0/165 (% 0) 0/165 (% 0)

Toplam

(n=821) 0/821 (%0) 0/821 (%0) 0/821 (%0)


Gruplarında CHEK2 IVS2 + 1 G>A Mutasyonunun (Nokta Mutasyonu)

Sıklığı

CHEK2 genine özgü primerler ile belirtilen koşullarda CHEK2 IVS2 + 1

G>A nokta mutasyonunu belirlemek amacıyla 491 bç’lik DNA bölgesi PCR

işlemiyle çoğaltıldı. Bu çoğaltılmış DNA fragmentleri CHEK2 IVS2 + 1 G>A

mutasyonunu saptamak amacıyla Hyp188III (5’ TC ↓NNGA 3’) RE enzimiyle

muamele edilmesini takiben RFLP’yi belirlemek amacıyla agaroz jelde elektroforeze

tabi tutuldu. Elektroforez sonrası çekilen jel fotoğrafının incelenmesi sonucunda

CHEK2 IVS2 + 1 G>A mutasyonunun araştırıldığı DNA bölgesinin PCR ürününün

RE ile muamele edilmeden 491 bç uzunluğunda olduğu saptandı. RE ile muameleyi

takiben mutasyonu heterozigot halde taşıyan (pozitif kontrol) ve mutasyon taşımayan

bireylerin DNA’larının elektroforezi sonucunda şu durum saptandı (Şekil 4.3.):


113

1. Mutasyonu heterozigot halde taşıyan bireyde (pozitif kontrol) 491 bç’lik, 297

bç’lik ve 194 bç’lik üç DNA fragmenti gözlendi (Şekil 4.3.’de 2. kuyu)

2. Mutasyon taşımayan kolorektal ve hepatoselüler kanserli hastalar ile kontrol

grubu bireylerinde sadece 491 bç’lik tek bir DNA fragmenti saptandı (Şekil

4.3.’de 3-10. kuyular)

Toplam olarak Türk populasyonundan 821 bireyde bu mutasyonun sıklığı

araştırılmıştır. Çalışma gruplarının hiçbir bireyinde CHEK2 IVS2 + 1 G>A

mutasyonu belirlenmemiştir (Çizelge 4.3).

Şekil 4.3. Kontrol, Kolorektal Kanser ve Hepatoselüler Kanser Çalışma Gruplarında CHEK2 IVS2 + 1 G>A Mutasyonunun RFLP Yöntemi İle Genotiplendirilmesi 1. kuyu: DNA marker, 2. kuyu: pozitif kontrol (CHEK2 IVS2 + 1 G>A mutasyonu hetorozigot genotipli birey), 3-5. kuyular: mutasyon bulunmayan genotip (kolorektal kanserli hastalar), 6-8. kuyular: mutasyon bulunmayan genotip (hepatoselüler kanserli hastalar), 8-10. kuyular: mutasyon bulunmayan genotip (kontrol grubu bireyleri).

50 bç

200 bç

300 bç

500 bç

1. kuyu 2. kuyu 3. kuyu 4. kuyu 5. kuyu 6. kuyu 7. kuyu 8. kuyu 9. kuyu 10. kuyu

297 bç

194 bç

491 bç


114


Gruplarında CHEK2 1100delC Mutasyonunun (Bir Nükleotid

Delesyonu Sonucu Oluşan Çerçeve Kayması Mutasyonu) Sıklığı

CHEK2 1100delC mutasyonuna özgü primerler ile belirtilen koşullarda

gerçekleştirilen ARMS-PCR’yi takiben PCR ürünü agaroz jelde yürütüldü.

Elektroforez sonrası çekilen jel fotoğrafının incelenmesi sonucunda CHEK2

1100delC mutasyonunun bulunup bulunmadığı belirlendi. Her örnek için

mutasyonun bulunmasına ve mutasyonun bulunmamasına özgü iki ARMS-PCR

yapıldı. Her iki tip ARMS-PCR sonucunda 309 bç.’lik kontrol PCR ürünü görüldü

(Şekil 4.4.). Mutasyona özgü ARMS-PCR’da eğer örnek CHEK2 1100delC

mutasyonunu bulunduruyorsa 183 bç’lik mutasyon bandı görüldü. Mutasyonun

bulunmamasına özgü yapılan ARMS-PCR’da eğer örnek mutasyon bulundurmuyor

ise 184 bç’lik yabani tip allelin çoğaldığı görüldü (Şekil 4.4.). Kontrol çalışma

grubunda 446 birey, kolorektal çalışma grubunda 210 ve hepatoselüler kanser

grubunda 165 bireyde CHEK2 1100delC mutasyonunun bulunup bulunmadığı 1642

adet PCR reaksiyonu ile belirlenmiştir. Toplam olarak Türk populasyonundan 821

bireyde bu mutasyonun sıklığı araştırılmıştır. Hiçbir çalışma grubu bireyinde CHEK2

1100delC mutasyonu belirlenmemiştir (Çizelge 4.3).

Şekil 4.4.’de CHEK2 1100delC mutasyonun ARMS-PCR ile analizi

gösterilmiştir. Her ARMS-PCR işleminde pozitif kontrol olarak heterozigot CHEK2

1100delC mutasyonlu örnekler kullanılmıştır. Her örnek için 2 adet ARMS-PCR

yapılmıştır. Bu örnekler agaroz jelde yan yana yüklenmiştir. Daima 1. kuyuya

mutasyona özgü gerçekleştirilen reaksiyon ürünü 2. kuyuya mutasyon

bulunmamasına özgü yapılan reaksiyonun ürünü yüklenmiştir. Böylece 1. kuyuda ve

2. kuyudaki DNA’nın elektroforezi sonucunda 183 bç ve 184 bç’lik. bandların

görülmesi heterozigot mutant olarak tanımlanmıştır (Şekil 4.4.). Sadece 2. kuyudaki

DNA’nın elektroforezi sonucunda 184 bç’lik bandın görülmesi bu bireyin CHEK2

1100delC mutasyonunu bulundurmadığını göstermiştir (Şekil 4.4.). Tüm CHEK2

1100delC ARMS-PCR analizlerinde heterozigot (ilk 1. 2. kuyu) mutant örnekler

pozitif kontrol olarak kullanıldı. Şekil 4.4.’de ilk 1. ve 2. kuyular dışındaki 1. ve 2.


115

kuyular (4 örnek) mutasyon bulunmayan örneklerdir. Bunların yanındaki ilk kuyuda

DNA markerı görülmektedir.

Şekil 4.4. Kontrol, Kolorektal Kanser ve Hepatoselüler Kanser Çalışma Gruplarında CHEK2 1100delC Mutasyonunun ARMS-PCR Yöntemi İle Genotiplendirilmesi. Marker: DNA marker, Pozitif Kontrol: CHEK2 1100delC mutasyonunu hetorozigot olarak bulunduran örnek, 1. -2. Örnek: CHEK2 1100delC mutasyonu bulunmayan genotip (kolorektal kanserli hastalar), 3. Örnek: CHEK2 1100delC mutasyonu bulunmayan genotip (hepatoselüler kanserli hasta), 4. Örnek: CHEK2 1100delC mutasyonu bulunmayan genotip (kontrol grubu bireyi).

50 bç

100 bç

150 bç

200 bç

250 bç

300 bç

1. kuyu 2. kuyu 1. kuyu 2. kuyu 1. kuyu 2. kuyu 1. kuyu 2. kuyu 1. kuyu 2. kuyu Marker

Pozitif Kontrol 1. Örnek 2. Örnek 3. Örnek 4. Örnek

309 bç.’lik kontrol PCR ürünü

183 bç 184 bç


116

5. TARTIŞMA Süleyman BAYRAM

117

5. TARTIŞMA

Bu çalışma, DNA-hasarı kontrol noktası yolağında yer alan merkezi bir

öneme sahip CHEK2 geninde daha önce belirlenen kalıtsal I157T, IVS2 + 1 G>A ve

1100delC mutasyonlarının Türk populasyonunda kolorektal ve hepatoselüler kanser

oluşumu üzerine etkilerinin olup olmadığını PCR-RFLP ve ARMS-PCR yöntemleri

ile araştırmak amacıyla yapılmıştır. Bu çalışmada Türk populasyonundan kolorektal

kanserli hastalar, hepatoselüler kanserli hastalar ve herhangi bir kanser tanısı

konulmamış sağlıklı bireylerden oluşan kontrol grubunda CHEK2 I157T, IVS2 + 1

G>A ve 1100delC mutasyonlarının sıklıkları araştırılmış ve çalışmadan elde edilen

sonuçlar diğer populasyonlardan elde edilen CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve

1100delC mutasyonlarının sıklıkları ile karşılaştırılmıştır.

5.1. CHEK2 Mutasyonlarının Türk Populasyonununda Kolorektal Kanser

Oluşumu Üzerine Etkileri

Kolorektal kanserler, özellikle gelişmiş batı ülkelerinin önemli bir sağlık

sorunudur. Kolorektal kanser insidansı (belirli bir nüfusta belirli bir zaman dilimi

içerisinde belirli bir hastalık için yeni olguların sayısı) tarama programlarına rağmen

yaşam tarzı ve beslenme alışkanlıkları açısından benzerlikler taşıyan Kuzey Amerika

ve Avrupa’da giderek artmaktadır (Parkin ve ark., 2005; Center ve ark., 2009a;

Center ve ark., 2009b). Endüstrileşmiş ülkelerdeki insidans gelişmekte olan ülkelere

göre daha yüksektir. Gelişmiş ülkelerde kolorektal kanser insidansı ve kolorektal

kanser kaynaklı ölümler ikinci sırada yer alırken, gelişmekte olan ülkelerde beşinci

sıradadır (Parkin ve ark., 2005; Center ve ark., 2009; Center ve ark., 2009b).

Kolorektal kanser insidansı coğrafik bölgeler ve etnik gruplar arasında önemli

farklılıklar gösterir. Amerika Birleşik Devletleri, Kanada, Avustralya, Yeni Zelanda

ve Orta Avrupa yüksek indisans bölgeleridir. Bunun yanında Asya, Güney Amerika

ve Sub-Saharan Afrika düşük insidans bölgeleridir. Türkiye’de kolorektal kanser

kadın cinsiyette en sık görülen 2. kanser türü iken erkek cinsiyette 4. sıradadır.

Kolorektal kanser insidansının ülkelere göre farklı olması çevresel ve bölgesel


118

faktörlere kanserojenlere ve beslenmeye bağlanmaktadır (Parkin ve ark., 2005;

Center ve ark., 2009a; Center ve ark., 2009b). Düşük kolorektal kanser insidansına

sahip bölgelerden (örneğin Asya) batı ülkelerine göç eden insanlarda kolorektal

kanser riskinin artması, yaşam biçimi ile ilgili faktörlerin ve bölgesel beslenme

alışkanlıklarının önemli bir risk faktörü olabileceğini desteklemektedir (Marchand,

1999).

Kolorektal karsinogenezis sürecinde hücrelerin genomunun sürekli DNA’ya

zarar veren ajanlar ile karşılaştığı ve hücrenin genomik bütünlüğünün bozularak

kolorektal karsinogenezisin geliştiği gösterilmiştir (de la Chapelle, 2004; Markowitz

ve Bertagnolli, 2009; Akkız, 2009b). Bununla birlikte kolorektal karsinogenezis

sürecinde DNA onarım mekanizmalarının ve bu mekanizmalarda görev alan

genlerdeki kalıtsal mutasyonların önemleri yapılan çalışmalar ile gösterilmiştir (de la

Chapelle, 2004; Markowitz ve Bertagnolli, 2009; Akkız, 2009b). Kolorektal

kanserlerin gelişiminde rol alan genetik mekanizmaların ortaya konması gerek erken

tanının konması ve gerekse ileri dönemlerde prognozun (kanserin seyrinin)

belirlenmesi ve buna uygun ilave tedavilerin uygulanmasında moleküler birer

belirteç olarak kullanılmasını sağlayacaktır. Bu sebeplerden dolayı DNA-hasarı

kontrol noktası yolağının ve bu yolakta bulunan genlerde meydana gelen kalıtsal

(örneğin CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonları) veya somatik

mutasyonların belirlenmesinin önemi bu karsinogenezis sürecinde artmaktadır.

Bu çalışmada patolojik olarak kolorektal kanser tanısı almış 210 hastanın hiç

birinde CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonları saptanmamıştır.

Aynı şekilde herhangi bir kanser tanısı almamış sağlıklı 446 bireyde de bu kalıtsal

mutasyonlar bulunmamıştır. Bugüne kadar birçok araştırıcı tarafından CHEK2

I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının kolorektal kanser oluşumu

üzerine etkileri farklı populasyonlarda araştırılmıştır (Kilpivaara ve ark., 2003;

Lipton ve ark., 2003; Meijers-Heijboer ve ark., 2003; Cybulski ve ark., 2004b;

Sánchez de Abajo ve ark., 2005; de Jong ve ark., 2005a; Djureinovic ve ark., 2006;

Isinger ve ark., 2006; Kilpivaara ve ark., 2006; Weischer ve ark. 2007; Kleibl ve ark.,

2009; Suchy ve ark., 2009). CHEK2 1100delC mutasyonunun kolorektal kanser

üzerine bir etkisinin olmadığı yapılan araştırmaların büyük bir çoğunluğunda


119

görülmüştür (Kilpivaara ve ark., 2003; Lipton ve ark., 2003; Meijers-Heijboer ve

ark., 2003; Cybulski ve ark., 2004; Sánchez de Abajo ve ark., 2005; Djureinovic ve

ark., 2005; Isinger ve ark., 2006; Kilpivaara ve ark., 2006; Kleibl ve ark., 2009;

Suchy ve ark., 2009). Fakat bir çalışmada CHEK2 1100delC mutasyonunun

Danimarka populasyonunda kolorektal kanser oluşumunu artırdığı saptanmıştır

(Weischer ve ark., 2007). Yine bir başka çalışmada ailesel kolorektal kanser geçmişi

mevcut ve erken yaşta kolorektal kansere yakalanan hastalarda CHEK2 1100delC

mutasyonunun kolorektal kanser oluşumunu arttırdığı saptanmıştır (de Jong ve ark.,

2005a). Bizde çalışmamızda kolorektal kanserli hastalarda CHEK2 1100delC

mutasyonunu saptayamadık. Bu bulgularımız, kolorektal kanserli hastalarda CHEK2

1100delC mutasyonu saptayamayan önceki araştırıcıların sonuçları tarafından

desteklenmektedir.

CHEK2 I157T mutasyonunun kolorektal kanser oluşumu üzerindeki etkisini

araştıran tüm çalışmalarda I157T mutasyonunun kolorektal kanser oluşumunu

istatistiksel olarak anlamlı düzeyde artırdığı saptanmıştır (Cybulski ve ark., 2004b;

Kilpivaara ve ark., 2006; Kleibl ve ark., 2009; Suchy ve ark., 2009). Bizim

çalışmamızda kolorektal kanserli hastalarda CHEK2 I157T mutasyonu

saptayamadık. Bizim sonuçlarla bu araştırıcıların sonuçları arasındaki fark

populasyon farklılığından kaynaklanmaktadır. Ayrıca, bizim çalışmamızdaki

hastalarda kolorektal kanserin gelişmesinin başka nedenlere dayandığı görüşündeyiz.

Bunun yanında CHEK2 IVS2 + 1 G>A mutasyonunun kolorektal kanser oluşumu

üzerine herhangi bir etkisinin olmadığı yapılan 3 farklı araştırma ile gösterilmiştir

(Cybulski ve ark., 2004b; Kleibl ve ark., 2009; Suchy ve ark., 2009). Bu

araştırmalarda bizim sonuçlarımızı destekler yöndedir. Zira bizim hastalarımızda da

CHEK2 IVS2 + 1 G>A mutasyonu saptanmamıştır.

Ayrıca CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının farklı

populasyonlarda aynı kanser türünün oluşumu üzerine etkilerinin farklı olduğu

değişik araştırıcılar tarafından saptanmıştır (Martínez-Bouzas ve ark., 2007;

Weischer ve ark., 2008). Aynı kanser türü üzerine bu kalıtsal mutasyonların

etkilerinin populasyonlar arasındaki bu tip farklılıkları, bu kalıtsal mutasyonların

frekanslarının populasyonlar arasında farklılık göstermesinden kaynaklanabilir


120

(Çizelge 5.1.) (Antoni ve ark., 2007). Yapmış olduğumuz çalışmada 821 Türk

bireyde bu mutasyonların saptanmamış olması bu mutasyonların Türk

populasyonununda çok az bir sıklıkta veya hiç bulmadığına işaret etmektedir. Bu

sebepler I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının Türk populasyonunda

kolorektal kanser oluşumuna katkılarının olmadığını açıklayabilir. Ayrıca bizim

çalışma grubunu oluşturan hastalarda CHEK2 geninde I157T, IVS2 + 1 G>A ve

1100delC mutasyonlarının bulunmamasına karşılık kolorektal kanser gelişmesinin

sebepleri aşağıda belirttiğimiz nedenlerden biri veya birkaçı olabilir.

Çizelge 5.1. Farklı Populasyonlarda CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC Mutasyonlarının Sağlıklı Bireylerde Sıklıkları.

--: Veri yok

Kolorektal kanserin etiyolojisinde çevresel faktörler, prekanseröz hastalıklar

(kolorektal polipler ve iltihabi barsak hastalıkları) ve genetik faktörler rol

oynamaktadır (Lin, 2009; Akkız, 2009a). Çevresel faktörler olarak özellikle yüksek

ısıda pişirilen kırmızı et, şeker ve yağ (kolesterol) oranı yönünden yüksek kalorili

beslenme alışkanlığı, lifsel içeriği olmayan beslenme alışkanlığı, kanserojenlere

temas, sigara, alkol, iyonize radyasyon, katkı maddeleri ve oksijen radikalleri

bildirilmektedir (Lin, 2009; Akkız, 2009a). Gıdalarda pişirme yöntemine bağlı olarak

oluşan heterosiklik aromatik aminler, polisiklik aromatik hidrokarbonlar ve saklama

amaçlı kullanılan nitrit, nitrat ve benzeri bileşiklerin kolorektal kanser riskini

Populasyon Mutasyon Sıklıkları (%) 1100delC I157T IVS + 1 G>A

Hollanda 1.3–1.6 -- -- Finlandiya 1.1–1.4 5.5 -- Polanya 0.2–0.25 4.8 0.3 Almanya 0.15–0.25 0.6 0-0.4 Amerika 0.3-0.4 0.9 -- Avustralya 0.14 -- -- İsveç 0.6–1.0 -- -- Beyaz Rusya -- 1.3 0.2 Çek Cumhuriyeti 0.3 -- -- İtalya 0.11 -- -- Kanada 0.2 -- --


121

arttırabileceği öne sürülmektedir (Lin, 2009; Rock, 1998; Akkız, 2009a).

Heterosiklik aromatik aminler ve polisiklik aromatik hidrokarbonlar gıdaların

kızartma, ızgara, alev ve közde pişirilmesi sırasında oluşan genotoksik kimyasallardır

(Lin, 2009; Rock, 1998). Bu tür pişirme yöntemlerini tercih edenlerin 6.5 kat daha

fazla kolorektal kanser riskine sahip oldukları bildirilmektedir. Yağdan zengin ve

düşük lifli gıdaların kolondan geçiş sürelerinin uzun olması kanserojenlerle kolon

hücrelerinin uzun süre maruz kalmalarına neden olur ve bunun sonucunda da

kolorektal kanser oluşumu gerçekleşir (Giovannucci, 2002; Lin, 2009; Akkız,

2009a). Beslenme ile alınan yağ karaciğerde kolesterol ve safra asiti sentezini

artırmaktadır. Kolonda bulunan bakteriler bu bileşikleri sekonder safra asitlerine,

kolesterol metabolitlerine ve diğer toksik metabolitlere dönüştürürler. Hem safra

asitlerinin hem de serbest yağ asitlerinin kolon mukozasında hasar yaptıkları ve

kolon epitelinin proliferasyon kapasitesini artırdıkları belirlenmiştir (Huxley, 2007;

Akkız, 2009a).

Kolorektal kanserler hem kalıtsal (~%5) hem de sporadik (~%95) olarak

meydana gelmektedir (Lynch ve ark., 1993; Burt ve ark., 1995). Kalıtsal kolorektal

kanserlerin başlıca iki tipi vardır (Burt ve ark., 1995; Jo ve Chung, 2005; Akkız,

2009b). Bunlar ailesel adenomatöz polipozis (FAP) ve kalıtsal nonpolipozis

kolorektal kanserdir (HNPCC). Ailesel adenomatöz polipozis’in çok sayıda alt tipi

(gardner sendromu, turcot sendromu, peutz-jeghers sendromu, cowden sendromu)

vardır (Burt ve ark., 1995; Jo ve Chung, 2005; Akkız, 2009b). FAP sendromu ile

birlikte izlenen kolorektal kanserlerdeki mekanizma şu şekilde gerçekleşir; 5.

kromozomun uzun kolunda (5q21) bulunan APC tümör süpresör genine ait mutant

bir allel bir ebeveynden aktarılır. Heterozigot bireyin yabani-tip allelinde de meydana

gelen kayıp (heterozigotluk kaybı=LOH) ve somatik mutasyonlar sonucunda FAP

ilişkili kolorektal kanser gelişir. APC gen mutasyonlarının büyük çoğunluğu (>%90)

yanlış anlamlı veya çerçeve kayması mutasyonlarıdır. Ailesel adenomatöz polipozis

otozomal dominant kalıtım gösterir ve hemen hemen tüm vakalarda penetransı %100

olan bir hastalıktır. Radyografik ve makroskopik olarak bağırsakta normal

mukozanın çok hafif kabarıklarından büyük kitlelere kadar değişen yüzlerce iyi

huylu poliple (kolonun iç duvarından kaynaklanan ve barsak boşluğuna doğru


122

büyüyen anormal oluşum) seyreden bir durum söz konusudur (Burt ve ark., 1995;

Chung ve Rustgi, 2003; Lynch ve de la Chapelle, 2003; Jo ve Chung, 2005). Kalıtsal

kolon kanserlerinin ikinci tipi olan kalıtsal nonpolipozis kolorektal kanserin

(HNPCC) iki alt tipi vardır (Lynch I sendromu ve Lynch II sendromu) (Chung ve

Rustgi, 2003). Otozomal dominant kalıtım gösteren HNPCC, kolorektal kanser

gelişme yaşının erken olmasına ve kanserlerin çoğunlukla çıkan kolonda (sağ solon)

gelişmesine yol açar. Hatalı eşleşme tamiri (mismatch repair=MMR) genlerindeki

mutasyonlar bu hastalığın ortaya çıkmasında rol oynar (Lynch ve de la Chapelle,

2003; Chung ve Rustgi, 2003; Jo ve Chung, 2005). HNPCC gelişen ailelerin %15-

60’ında ikinci kromozomda bulunan (2p16) hMSH2 (human MutS protein homolog

2, =insan MutS protein homologu 2) ve üçüncü kromozomda bulunan (3p21)

hMLH1 (human MutL protein homolog 1, =insan MutL protein homologu 1) hatalı

eşleşme tamiri genlerinde kalıtsal mutasyonlar saptanmıştır. HNPCC gelişen

hastalarda birçok MMR geninde [hPMS1 (human postmeiotic segregation increased

1, =insanda mayoz bölünmeden sonra ayrılmada artan 1), hPMS2 (human

postmeiotic segregation increased 2, = insanda mayoz bölünmeden sonra ayrılmada

artan 2) ve hMSH6 (human mutS homolog 6, =insan mutS homolog 6)] gibi daha az

sıklıkta bulunan kalıtsal mutasyonlar da bildirilmiştir (Lynch ve de la Chapelle,

2003; Chung ve Rustgi, 2003; Jo ve Chung, 2005; Akkız, 2009b).

Kolorektal karsinogenezis oldukça kompleks ve çok basamaklı bir süreçtir

(de la Chapelle, 2004; Markowitz ve Bertagnolli, 2009; Akkız, 2009b). Kolorektal

kanserin mekanizmasına ışık tutan en önemli özelliklerden birisi bu tümörlerin

uzunca bir premalign (kanser öncesi) aşamadan sonra adenomalardan (benign

neoplazi=iyi huylu tümör) geliştiğinin anlaşılmasıdır. Bu süreç onkogen ve tümör

süpresör genlerde meydana gelen ardışık mutasyonlar sonucu kolonik lezyondan

adenomatöz polipe ve adenomatöz polipten malign tümöre doğru bir gidişin

olduğunu gösterir ve bu durum Volgelstein’in adenoma-karsinoma dizisi olarak

bilinir (Şekil 5.1.) (Vogelstein ve ark., 1988; de la Chapelle, 2004; Markowitz ve

Bertagnolli, 2009; Akkız, 2009b;). Bununla birlikte kolorektal kanserin moleküler

genetik çalışmalarından kolorektal kanserin patogenezinin çok basamaklı bir süreç

olduğu belirlenmiştir. En az 5 genin sırasıyla dahil edilebileceği bir süreç olduğu


123

Normal adenoma

Erkenadenoma

Ortaadenoma

Metastaz

KarsinomaGeçadenoma

APC K-ras DCC/Smad4 p53

BAX IGF-IIR TGF-βRII

saptanmıştır. Başlangıçta 5. kromozomdaki (5q21) hem APC (adenomatosis

polyposis coli) hem de MCC (mutated in colorectal cancers) genlerinde mutasyonlar

gelişir ve daha sonra bunlara 12. kromozomun kısa kolunun (12p12) üzerindeki K-

ras onkogen, 18. kromozomun uzun kolunda (18q21) bulunan DCC (deleted in

colorectal carcinoma) ve 17. kromozomun kısa kolunda (17p12) lokalize olmuş p53

tümör süpressör gen mutasyonları eklenerek kolorektal karsinogenezis gelişir. Bu

mutasyonlara gen metilasyonları ile mikrosatellit instabilitesi de dahil olabilir (de la

Chapelle, 2004; Söreide ve ark., 2006; Markowitz ve Bertagnolli, 2009; Akkız,

2009b).

Şekil 5.1. Kolorektal Kanser Gelişiminde Adenom-Karsinom Geçişine Eşlik Eden

Değişiklikler. Kolorektal kanserlerdeki mekanizma şu şekilde gerçekleşir; 5. kromozomun uzun kolunda (5q21) bulunan APC geninde meydana gelen anlamsız mutasyonlar ve çerçeve kayması sonucu normal adenoma erken adenomaya ilerler. Hiperproliferatif özellikte bulunan ve DNA metilasyon kayıpları ve mikrosatellit instabilitenin (BAX, IGR-IIR, TGF-βRII) meydana geldiği erken adenomada 12. kromozomun kısa kolunda bulunan (12p12) K-ras onkogenindeki mutasyonlar erken adenomu orta adenoma ilerletir. 18. kromozomun uzun kolunda bulunan DCC (18q21) ve SMAD4 (18q21) tümör süpresör genlerdeki mutasyonlar ile geç adenoma gelişir. Geç adenomada meydana gelen p53 (17p12) mutasyonları ile kolorektal kanser gelişmiş olur (Söreide ve ark., 2006).


124

Kolorektal kanser üç farklı mekanizma ile de gelişebilir; kromozomal

instabilite mekanizması, mikrosatellit instabilite mekanizması ve epigenetik bir

mekanizma olan metilasyondur (de la Chapelle, 2004; Söreide ve ark., 2006;

Markowitz ve Bertagnolli, 2009; Akkız, 2009b;). Kolorektal kanserde genetik

değişikliklerin sıklığının oldukça yüksek olmasının en önemli nedeni kolorektal

karsinogenezisin uzun bir sürede tamamlanmasıdır.

Kromozomal instabilite kolorektal karsinogeneziste dominant mekanizmadır.

Kolorektal kanserlerin %60-%80’inde bu durum görülür ve genomda bir çok bölgede

allel kayıpları ve kazanımları, kromozomal amplifikasyonlar ve translokasyonlar ile

karakterize edilirler. Kromozomal instabilite yolağında genetik değişikliklerin en sık

gözlendiği başlıca lokuslar şunlardır: APC geninin bulunduğu 5q21; COX-2 geninin

bulunduğu 1q25; p53 geninin bulunduğu 17p12; SMAD2 (mothers against

decapentaplegic homolog 2, =decapentaplegic karşıtı anneler homolog 2), SMAD4

(mothers against decapentaplegic homolog 4, =decapentaplegic karşıtı anneler

homolog 2) ve DCC genlerinin bulunduğu 18q21; K-ras genin bulunduğu 12p21 ve

β-katenin genin bulunduğu 3q21’ir lokuslardır (de la Chapelle, 2004; Söreide ve ark.,

2006; Markowitz ve Bertagnolli, 2009; Akkız, 2009b;).

Mikrosatellit instabilitesi genomda tekrarlanan DNA dizilerinin sayılarında

artış veya azalış ile tanımlanmaktadır (Söreide ve ark., 2006; Akkız, 2009b).

Mikrosatellit DNA 1–9 baz çiftlik, ardışık olarak tekrarlanan birimlerden oluşmuş

DNA sıralarıdır. Genomda yaklaşık yarım milyon mikrosatellit lokusu

bulunmaktadır. Mikrosatellitler tüm genom boyunca dağılmışlardır, ancak genellikle

kodlanmayan bölgelerde lokalize olmuşlardır. Mikrosatellit instabilitesi, hatalı

eşleşme tamir (mismatch repair=MMR) genlerinin (hMSH2, hMLH1, hPMS2 ve

hMSH6) inaktivasyonu sonucu gelişmektedir (Söreide ve ark., 2006; Akkız, 2009b).

DNA MMR proteinleri DNA replikasyonu sırasında ortaya çıkan küçük dizilim

hatalarını tanıyarak düzeltirler. Bu genlerde meydana gelen inaktivasyon sonucunda

mikrosatellitlerin bulunduğu bölgelerde yer alan genlerde DNA sıra hataları oluşur.

Kolorektal kanserde bu sıra hataları, kritik öneme sahip büyüme ve regülasyon

genlerinde [TGFβRII (Transforming growth factor, beta receptor II, =dönüştürücü

büyüme faktörü, beta reseptör II), BAX (BCL2-associated X protein, =B hücre


125

lenfoma 2-ilişkili X protein), IGF-IIR (insulin-like growth factor 2 receptor,

=insüline-benzer büyüme faktörü 2 reseptör), hMSH6, hMSH3 ve PTEN] ortaya

çıkar ve bunun sonucunda da kolorektal kanser meydana gelir (Söreide ve ark., 2006;

Akkız, 2009b).

Kolorektal karsinogeneziste yeni tanımlanan bir epigenetik mekanizma olan

CpG nükleotid adalarının metilenmesidir (CIMP). CpG adaları memelilerdeki

genlerin promoterlerinin yaklaşık %40’ında bulunmaktadır ve yaklaşık olarak 300-

1000 baz çiftlik uzunlukta olup %50’lik bir oranda CG nükleotidlerinden meydana

gelir. CIMP, çok sayıda fonksiyonel öneme sahip genlerin promoter bölgelerinin

metilasyonu sonucu gelişir ve genlerin transkripsiyonel olarak susturulmasına yol

açar. Kolorektal karsinogeneziste CIMP ile bir çok genin [p16, THBS1

(thrombospondin 1), MGMT (O-6-methylguanine-DNA methyltransferase, =O-6-

metilguanin-DNA metiltransferaz) ve hMLH1] inaktive olduğu gösterilmiştir

(Söreide ve ark., 2006; Akkız, 2009b).

Yukarıda anlatılan genetik anormallikler sonucunda kolorektal

karsinogeneziste beş önemli hücresel iletişim yolağının [Adenomatöz Poliposis Coli

(APC)/β-katenin, DNA hatalı eşleşme tamir, Transforming Growth Faktör-β/SMAD,

Mitojen Aktivasyon Protein Kinaz (MAPK) ve p53 yolağı] bozulduğu gösterilmiştir

(Akkız, 2009b)

Yukarıda anlatıldığı gibi kolorektal karsinogeneziste çevresel ve genetiksel

risk faktörleri önemli rol oynamaktadırlar. Bizim kolorektal kanserli hastalarda

CHEK2 geninde I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonları saptanamamıştır.

Ancak kolorektal karsinogenezise katkısı bulunan APC, hMSH2 ve hMLH1 gibi

genlerde daha önce belirlenen kalıtsal mutasyonların, diğer başka aday genlerde

bulunan kalıtsal mutasyonların ve bunun yanında somatik olarak gelişen genetik ve

epigenetik anormalliklerin bizim çalıştığımız hastalarda kolorektal kanser gelişimine

neden olabileceği görüşündeyiz. Bu yüzden APC, hMSH2 ve hMLH1 genlerindeki

kalıtsal mutasyonların ve kolorektal karsinoma için fonksiyonel öneme sahip başka

aday genlerdeki kalıtsal mutasyonların, bunun yanında kolorektal karsinogenezise

katkıda bulunabilecek somatik olarak gelişen genetik ve epigenetik anormalliklerin

araştırılması gerekmektedir. Çünkü toplum içerisinde genin işlevini veya ifadesini


126

bozan böylece kansere yakalanma riskini artıran kalıtsal mutasyonların belirlenmesi

ve populasyonlarda sıklıklarının araştırılması ve kolorektal karsinogenezis ile

ilişkisinin anlaşılması tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi ve önceden önleyici

tedbirlerin alınması bakımından oldukça önemlidir.

5.2. CHEK2 Mutasyonlarının Türk Populasyonununda Hepatoselüler Kanser

Oluşumu Üzerine Etkileri

Histolojik olarak primer karaciğer kanserleri farklı alt türlere ayrılmaktadır.

Bu alt türler hepatoselüler karsinoma (HSK), intrahepatik safra yolları kanseri

(kolanjiokarsinoma), safra yolları kistadenokarsinomu ve hepatoblastomadır (Farazi

ve DePinho, 2006). HSK hepatositlerden köken alır ve primer karaciğer kanserlerinin

%85-90’ını oluşturmaktadır (El-Serag ve Rudolph, 2007; Dragani, 2010). HSK

dünya genelinde beşinci sıklıkta görülen kanser türüdür ve kanser nedenli ölümlerde

üçüncü sırayı almaktadır (El-Serag ve Rudolph, 2007). Yıllık olarak 620000’den

daha fazla sayıda bireye HSK tanısı (bir yılda yeni tanı alanların sayısı) konulmakla

birlikte, HSK yıllık olarak 600000’den fazla kişinin bu nedenle ölümüne yol açar

(Schütte ve ark., 2009). Hepatoselüler kanser gerek insidansı gerekse risk faktörleri

açısından belirgin coğrafik farklılıklar göstermektedir. HSK insidansı bakımından

dünya üç bölgeye (yüksek, orta ve düşük) ayrılmaktır (El-Serag ve Rudolph, 2007).

HSK insidansı özellikle hepatit B virüs (HBV) enfeksiyonunun endemik olduğu Sub-

Saharan Afrika (Sahara çölünün güneyinde yer alan ülkeler) ve Doğu Asya’da (Çin,

Tayvan ve Singapur) oldukça yüksektir (yıllık oran 120 olgu/ 100000 kişi). Japonya,

Yunanistan, İtalya, Güney Pasifik adaları, Batı Avrupa ve Türkiye’de HSK insidansı

orta derecededir (yıllık oran 10-20 olgu/100000 kişi). Kuzey Avrupa ve Amerika

Birleşik Devletleri düşük insidans bölgeleridir (yıllık oran 5 olgu/100000 kişi) (El-

Serag ve Rudolph, 2007).

Çevresel faktörler ile kalıtsal faktörlerin indüklediği heptoselüler

karsinogenezis sürecinde hepatosit hücresinin genomu sürekli DNA’ya zarar veren

ajanlar ile karşılaşır ve hücrenin genomik bütünlüğü bozulur sonuç olarak

hepatoselüler karsinoma gelişir (Farazi ve DePinho, 2006). Bu sebeplerden dolayı


127

DNA-hasarı kontrol noktası yolağının ve bu yolakta bulunan genlerde meydana

gelen kalıtsal (örneğin CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonları)

veya somatik mutasyonların önemi bu karsinogenezis sürecinde artmaktadır. Bu

çalışmada klinik, laboratuvar, radyolojik ve patolojik bulguları ile hepatoselüler

kanser tanısı konmuş 165 hastanın hiç birinde CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve

1100delC mutasyonları saptanmamıştır. Aynı şekilde herhangi bir kanser tanısı

konulmamış sağlıklı 446 bireyde de bu kalıtsal mutasyonlar bulunmamıştır. Şimdiye

kadar CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının hepatoselüler

kanser oluşumu üzerine etkileri araştırılmamıştır.

1998 yılında insan CHEK2 geninin klonlanması ve DNA-hasarı kontrol

noktası ile ilişkisinin belirlenmesinden sonra hem sporadik hem de ailesel

(herediter=kalıtsal) insan kanserlerinde CHEK2 mutasyonları araştırılmıştır. CHEK2

I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının etkileri farklı populasyonlarda

ve farklı kanser türlerinde (akciğer, beyin, böbrek, gırtlak, kolorektal, Li-Fraumeni,

meme, melanoma, mesane, ovaryum, özefagus, pankreas, prostat, rahim, tiroit ve üst

solumun kanseri) araştırılmıştır (Seppälä ve ark., 2003; Cybulski ve ark., 2004b;

Thompson ve ark., 2006; Brennan ve ark., 2007). Bu araştırmalarda sağlıklı bireyler

ile ailesel kanser öyküsü olan veya sporadik kanser gelişen hastalarda mutasyon

sıklıkları karşılaştırılarak kanser oluşumu üzerine etkiler belirlenmiştir. CHEK2

I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının belli bir kanser türünün

oluşumu üzerinde belirgin bir etkisi var iken farklı bir kanser türü için aynı durumun

söz konusu olmadığı saptanmıştır (Cybulski ve ark., 2004b). Buna ek olarak aynı tür

kanser oluşumu üzerine aynı CHEK2 mutasyonunun farklı populasyonlarda farklı

etkileri olduğu saptanmıştır (Martínez-Bouzas ve ark., 2007; Weischer ve ark.,

2008). CHEK2 1100delC mutasyonun meme kanseri oluşumu üzerine etkisi farklı

populasyonlarda ve bir ülkeden diğer ülkeye anlamlı farklılıklar gösterdiği yapılan

çalışmalar ile gösterilmiştir (Martinez-Bouzas ve ark., 2007; Weischer ve ark., 2008).

CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığı Kuzey ve Batı Avrupa’da ayrıca Rusya’da

en fazla, fakat Güney Avrupa, Güney Amerika ve Asya’da çok az bir sıklıkta

belirlenmiştir. Meme kanserli hastalarda 1100delC mutasyonunun sıklığı Avrupa

ülkelerinde de kuzeyden güneye gidildikçe azalmaktadır (Şekil 5.2.) Populasyon


128

Bask Bölgesi

% 0.93

% 3.1

% 2.7

% 0.21% 1.6

% 0.38

% 0.1

% 0

% 1.2% 3.6

farklılıkları, en belirgin şeklinde CHEK2 1100delC mutasyonunun meme kanseri

oluşumu üzerine etkisiyle ilgili olarak yapılan araştırmalarda görülmektedir (Çizelge

5.2.)

Şekil 5.2. Avrupa Kökenli Meme Kanserli Hastalarda CHEK2 1100delC

Mutasyonunun Sıklığı.


129

Çizelge 5.2. Farklı Populasyonlardan Meme Kanserli ve Kontrol Bireylerinde CHEK2 1100delC Mutasyonunun Sıklığı.

a Ailesel meme kanseri hikayesi olmayan meme kanserli hastalar b Ailesel meme kanseri hikayesi olan meme kanserli hastalar c BRCA1/2 mutasyonları saptanmayan meme kanserli hastalar d BRCA1/2 mutasyonları araştırılmayan meme kanserli hastalar e Her iki memede de meme kanseri gelişen meme kanserli hastalar f Meme kanserine erken yaşta yakalanan meme kanserli hastalar

CHEK2 1100delC ve I157T mutasyonlarının kansere yatkınlık açısından

ılımlı derece penetrans (bir gen ya da gen grubunun oluşturması beklenen fenotipin

bireyler arasında %0-100 arasında değişen görülme sıklığı) etkilerinin olduğu

saptanarak prostat ve meme kanseri oluşumunu artırdığı gösterilmiştir (Meijers-

Populasyon Mutasyon Sıklığı %

Kontrol (n) Bayan Meme Kanserli Hastalar (n)

Hollanda % 2.8 (212) % 11.4 (237)b, c % 1.3 (460) % 2.5 (79)b, c % 1.6 (184) % 3.8 (1706)a

Finlandiya % 1.4 (1885) % 5.5 (507)b, c % 1.1 (447) % 2.9 (464)

Danimarka % 0.5 (4643) % 1.2 (1088)a, d Rusya % 0.2 (448) % 5.2 (155)e

Almanya

-- % 4.0 (380)b, c % 0.5 (1315) % 1.6 (516)b, c % 0.7 (651) % 1.4 (71)b, c -- % 2.3 (86)f % 0.25 (401) 1.1% (985)a

Çek Cumhuriyeti % 0.3 (730) % 0.3 (358)b, c Bask Bölgesi % 0.0 (120) % 0.9 (214)a, d İspanya % 0.0 (400) % 0.0 (400)b, c İtalya % 0.0 (334) % 0.1 (939)b İngiltere % 0.0 (300) % 4.0 (68)b, d Amerika % 0.5 (859) % 1.1 (829)b, d Amerika (New York) % 0.4 (569) % 0.0 (67)b, c Amerika (Kaliforniya ) -- % 0.4 (1112)a, d Kanada % 0.2 (496) % 1.4 (1199)a, d

Avustralya -- % 0.6 (300)b, c % 0.14 (736) % 0.7 (1474)a

Aşkenazi Yahudileri % 0.3 (1096) % 3.0 (33)b, c Şili % 0.0 (1024) % 0.0 (196)b, c


130

Heijboer ve ark., 2002; Vahteristo ve ark., 2002; Oldenburg ve ark. 2003; Seppälä ve

ark., 2003; Kilpivaara ve ark., 2004; Cybulski ve ark., 2004b; Górski ve ark., 2005;

Cybulski ve ark., 2006a). Fakat birçok çalışmada da CHEK2 1100delC

mutasyonunun meme kanseri oluşumu üzerine herhangi bir etkisinin olmadığı da

belirlenmiştir (Mateus Pereira ve ark., 2004; Friedrichsen ve ark., 2004; Baeyens ve

ark., 2005; Kleibl ve ark., 2005; Rashid ve ark., 2005; Einarsdóttir ve ark., 2006).

Bununla birlikte, 1100delC ve I157T mutasyonlarının diğer genler (BRCA1, BRCA2

ve p53 gibi) veya faktörler (DNA’ya zarar veren kimyasallar ve ışınlar gibi) ile

sinerjik etkileşimleri sonucu kanser oluşumunun artış gösterdiği bildirilmiştir

(Meijers-Heijboer ve ark., 2002; Vahteristo ve ark., 2002; Oldenburg ve ark. 2003;

Friedrichsen ve ark., 2004; CHEK2 Meme Kanseri Vaka-Kontrol Konsorsiyumu,

2004). Örneğin, CHEK2 1100delC mutasyonu birinci derece akrabalarında meme

kanseri gelişen veya ailesel meme kanseri öyküsü bulunan meme kanserli hastalarda

daha fazla sıklıkta bulunmuştur. Buna ek olarak, meme kanserine yakalanma yaşının

CHEK2 1100delC mutasyonu bulunan hastalarda, bu mutasyonu bulundurmayanlara

oranla daha düşük olduğu belirlenmiştir (Vahteristo ve ark., 2002; Friedrichsen ve

ark., 2004; CHEK2 Meme Kanseri Vaka-Kontrol Konsorsiyumu, 2004; Górski ve

ark., 2005). CHEK2 1100delC mutasyonunu bulunduran meme kanserli hastalarda

ikinci memede de meme kanseri oluşumunun artış gösterdiği belirlenmiştir

(Vahteristo ve ark., 2002; Broeks ve ark., 2004; de Bock ve ark., 2004; Kilpivaara ve

ark., 2005; Schmidt ve ark., 2007). Birinci memede meme kanseri geliştikten sonra

radyasyon tedavisi alan hastalarda ikinci memede de meme kanseri gelişenlerde

CHEK2 1100delC mutasyonunun sıklığının yüksek olduğu saptanmıştır (Broeks ve

ark., 2004). Buna ek olarak CHEK2 1100delC mutasyonunu bulunduranların

mamografik olmayan X ışınına maruz kalanlarda da meme kanseri oluşumunun artış

gösterdiği bildirilmiştir (Bernstein ve ark., 2006). Bu veriler, CHEK2 1100delC

mutasyonunu bulunduran bireylerde iyonize radyasyon gibi çevresel DNA-hasarı

meydana getiren faktörlerin kanser oluşumunu artırdığına işaret etmektedir. Tüm bu

bulgular, CHEK2’nin diğer genler veya faktörler ile sinerjik etkileşim içinde

olduğunu ve çok sayıda organ kanseri için kanser yatkınlık geni olduğu hipotezi ile

uyumludur.


131

I157T mutasyonunun yumurtalık, kolorektal, böbrek, tiroit, mesane kanseri

ve lösemi oluşumunu artırdığı gösterilmiştir (Cybulski ve ark., 2004b; Szymanska-

Pasternak ve ark., 2006; Kilpivaara ve ark., 2006; Rudd ve ark., 2006; Złowocka ve

ark., 2008). Bununla birlikte CHEK2 I157T mutasyonunun gırtlak ve akciğer kanseri

oluşumunu azalttığı belirlenmiştir (Cybulski ve ark., 2008). Pankreas ve rahim

kanseri oluşumu ile CHEK2 I157T mutasyonu arasında herhangi bir ilişkinin

olmadığı saptanmıştır (Bartsch ve ark., 2006; Konstantinova ve ark., 2008).

CHEK2 IVS2 + 1G>A mutasyonunun meme, prostat ve tiroit kanseri

oluşumunu artırdığı bildirilmiştir (Dong ve ark., 2003; Cybulski ve ark., 2004a;

Cybulski ve ark., 2004b; Górski ve ark., 2005). Böbrek, kolorektal ve ovaryum

kanserlerinin oluşumu üzerine IVS2 + 1G> A mutasyonunun bir etkisinin olmadığı

gösterilmiştir (Cybulski ve ark., 2004b; Suchy ve ark., 2009; Suspitsin ve ark., 2009).

Bizim yaptığımız çalışmada hepatoselüler kanserli hiçbir hasta ve sağlıklı

bireylerden oluşan kontrol grubunda CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC

mutasyonlarının saptanmaması ve bu kalıtsal mutasyonların Türk populasyonunda

hepatoselüler kanser oluşumunu üzerine bir etkilerinin olmaması populasyon

farklılığından kaynaklanmış olabilir. Çünkü CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve

1100delC mutasyonlarının farklı populasyonlarda aynı kanser türünün oluşumu

üzerine etkilerinin farklı olduğu önceki çalışmalar ile gösterilmiştir (Weischer ve

ark., 2008; Martínez-Bouzas ve ark., 2007). Aynı kanser türü üzerine bu kalıtsal

mutasyonların etkilerinin populasyonlar arasındaki bu tip farklılıkları, bu kalıtsal

mutasyonların frekanslarının populasyonlar arasında farklılık göstermesinden

kaynaklanabilir. Çünkü farklı populasyonlardan olan sağlıklı bireylerde CHEK2

I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının sıklıklarının farklı olduğu

saptanmıştır (Çizelge 5.1.) (Antoni ve ark., 2007). Bu yüzden bu kalıtsal

mutasyonların hepatoselüler karsinogenezis üzerine etkilerinin daha net bir şekilde

belirlenmesi için bu mutasyonların frekanslarının yüksek olduğu ve/veya

hepatoselüler kanserin endemik olduğu populasyonlarda da araştırılması

gerekmektedir.

Bununla birlikte CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının

hepatoselüler karsinogenezis sürecine herhangi bir katkıları olmayabilir. Çünkü


132

CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının farklı kanser türlerinin

oluşumu üzerine etkilerinin de farklı olduğu gösterilmiştir (Cybulski ve ark., 2004b).

Örneğin CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının meme, prostat,

kolorektal kanser oluşumunu artırmış iken pankreas, rahim, özefagus kanser

türlerinin oluşumu üzerine bu mutasyonların etkilerinin olmadığı belirlenmiştir

(Cybulski ve ark., 2004b). Aynı durum hepatoselüler karsinogenezis içinde geçerli

olabilir. Ayrıca bizim çalışmamızda CHEK2 geninde I157T, IVS2 + 1 G>A ve

1100delC mutasyonlarının bulunmamasına karşılık hepatoselüler kanser gelişmesinin

sebebi aşağıda belirteceğimiz nedenlerden biri veya birkaçı olabilir.

HSK’nın patogenezinde rol oynayan major risk faktörleri olarak kronik

hepatit B, C ve D virüs enfeksiyonları, toksinler (alkol, aflatoksin B1), ilaçlar

(anabolik steroidler) ve metabolik karaciğer hastalıkları [alfa-1 antitripsin eksiliği, tip

1 glikojen depo hastalığı (Von Gierke’s hastalığı), hemokromatozis, akut intermitant

porfiria, porfiria kutanea tarda ve tip 1 tirozinemi] tanımlanmıştır (Farazi ve

DePinho, 2006; El-Serag ve Rudolph, 2007; Dragani, 2010). HSK’nın gelişmesinde

rol oynayan bir diğer major risk faktörü ise karaciğer sirozudur. HSK’ların %70-90’ı

sirotik karaciğerde gelişmektedir (Farazi ve DePinho, 2006; El-Serag ve Rudolph,

2007). Ayrıca, obezitenin epidemik hale gelmesi, tip II diyabet ve insülin direnci

insidansının artması, alkolik olmayan karaciğer yağlanmasının (NASH) giderek

yaygınlaşması HSK patogenezinde rol oynayan en önemli risk faktörlerinden biri

olan karaciğer sirozunun gelişmesine neden olarak HSK’nın oluşumunu

artırmaktadırlar (Schütte ve ark., 2009). Bizim hastaların %83.4’ünde hepatit B ve

hepatit C virüs enfeksiyonu vardır. Ayrıca %80.6’sında ise siroz gelişmiştir. Bu

durumda bizim hastalarda HSK gelişmesinin ana nedeni bu sebepler olabilir. Geriye

kalan %20’sinde ise CHEK2 mutasyonlarının dışında kalıtsal nedenler olabilir. Aynı

durum virüs enfeksiyonlu hastalar içinde söz konusu olabilir.

Alfa-1 antitripsin eksiliği otozomal resesif kalıtım özelliği gösteren bir

hastalıktır. Bu hastalığa 14. kromozomun uzun kolunda (14q32.1) bulunan

SERPINA1 [serpin peptidase inhibitor, clade A (alpha-1 antiproteinase, antitrypsin),

member 1] geninde meydana gelen çok sayıdaki mutasyonlar neden olur (Fairbanks

ve Tavill, 2008). Tip 1 glikojen depo hastalığına glukoz-6-fosfotaz enziminin


133

bozulmuş aktivitesi neden olur ve karaciğerde aşırı miktarda glikojen birikir. Bu

hastalığın iki alt tip vardır (tip Ia ve tip Ib). Her iki alt tip hastalık otozomal resesif

kalıtım özelliği gösterir. Tip Ia’da 17. kromozomda bulunan glukoz-6-fosfotaz

(G6PC) geninde meydana gelen kalıtsal mutasyonlar glukoz-6-fosfotaz enziminin

aktivitesini tamamen ortadan kaldırır. Tip Ib’de 11. kromozomda bulunan glukoz-6-

fosfotaz translokaz (SLC37A4) geninde meydana gelen kalıtsal mutasyonlar

endoplazmik retikulum membranında glukoz-6-fosfotaz translokaz enzim eksikliğine

neden olur (Janecke ve ark. 2001). Hemokromatozis otozomal resesif kalıtım

gösteren ve karaciğerde aşırı miktarda demir birikmesine neden olan bir hastalıktır.

Hemokromatozis hastalığına 6. kromozomda (6p21.3) bulunan hemokromatozis

(HFE) geninde meydana gelen kalıtsal mutasyonlar neden olur (Alexander ve

Kowdley, 2009). Hepatik porfiria hastalığı “hem” gruplarının biyosentez yolağındaki

hasarlardan meydana gelen kalıtsal bir hastalıktır. Akut intermitant porfiria hastalığı

otozomal dominant kalıtım gösterir bu hastalığa 11. kromozomda (11q23.3) bulunan

hidroksimetilbilane sentetaz (porfobilinojen deaminaz) (HMBS) genin kodlanan ve

kodlanmayan bölgelerinde meydana gelen çok sayıdaki mutasyonlar neden

olmaktadır. Porfiria kutanea tarda hastalığına 1. kromozomda (1p34) bulunan

üroporfinojen dekarboksilaz (UROD) geninde meydana gelen çok sayıdaki kalıtsal

yanlış anlamlı veya insersiyon/delesyon şeklindeki mutasyonlar neden olmaktadır.

Bu hastalık otozomal dominat kalıtım özelliği gösterir (Andant ve ark., 2000;

Aarsand ve ark., 2009). Tip 1 tirozinemi hastalığı tirozin aminoasidinin yıkımından

sorumlu fumaril asetoasetat hidrolaz enzimini kodlayan 15. kromozomda (15q23-

q25) bulunan gende meydana gelen kalıtsal mutasyonlar sonucu oluşur. Tip 1

tirozinemi hastalığı fumaril asetoasetat hidrolaz enziminin eksikliğinden dolayı

tirozin aminoasitinin katabolik reaksiyonunun ara ürünlerinin karaciğerde birikmesi

sonucunda karaciğerde hasarlar meydana getirerek akut hepatik bozukluğa, karaciğer

sirozuna ve HSK’ya neden olur (Scott, 2006).

Alfa-1 antitripsin eksiliği, tip 1 glikojen depo hastalığı (Von Gierke’s

hastalığı), hemokromatozis, akut intermitant porfiria, porfiria kutanea tarda ve aynı

zamanda tip 1 tirozinemi gibi çok az bir sıklıkta bulunan monogenik sendromlar ile

poligenik özellik gösteren birçok hastalık (otoimmün hepatit, tip 2 diyabet,


134

Siroz

Otoimmün Hepatit Tip 2 Diyabet

NASH

Porfiryalar(1p34) (11q23.3)

Alfa-1 antitripsin(14q32.1)

Tip 1 tirozinemi(15q23-q25)

Hemokromatozis(6p21.3)

HSKTümöre ilerleme

hipotiroidizm ve alkolik olmayan karaciğer yağlanması) hepatoselüler kanser

oluşumunu artırmaktadır. Monogenik veya poligenik bu hastalıkların oluşmasına gen

veya genlerde meydana gelen kalıtsal mutasyonlar neden olmakta ve sonuç olarak

karaciğer hasarı (siroz) ve hepatoselüler karsinoma gelişmektedir (Şekil 5.3.)

(Dragani, 2010).

Şekil 5.3. Genetik Anormallikler Sonucu Oluşan Monogenik ve Poligenik Sendromlar İle Hepatoselüler Kanser Oluşumu Arasındaki İlişki. Monogenik veya poligenik mutasyonlar ve/veya polimorfizmler sonucu oluşan sendromlar karaciğer hasarı ve nekrozuna (hücre ölümü) neden olarak karaciğer sirozunu meydana getirir. Karaciğer sirozu hepatositlerde somatik mutasyonların ve genetik hasarın oluşmasına ve/veya artmasına neden olarak hepatoselüler karsinoma oluşumuna katkıda bulunur (Dragani, 2010).

Hepatoselüler karsinogenezis oldukça kompleks ve çok basamaklı bir

süreçtir. Kronik hepatit B (HBV), kronik hepatit C (HCV) virüs enfeksiyonları,

kronik alkolizm ve diğer etiyolojik (hastalık etkeni) faktörler kronik hepatit ve

karaciğer sirozuna neden olan sürekli hepatosit hasarına, reaktif oksijen türlerinin

artmasına, doku inflamasyonuna (iltihap) ve rejenerasyonuna bunların sonucunda da

hücrede gelişen genetik ve epigenetik değişiklikler yoluyla hepatoselüler

karsinogenezise katkıda bulunurlar (Şekil 5.4.) (Farazi ve DePinho, 2006; Akkız,

2007; Yam ve ark., 2010). Bununla birlikte etiyolojik farktörlerin direkt etkileri de

(HBV virüsünün genoma entegrasyonu, viral onkogenler ile viral proteinlerin

onkogenik etkileri gibi) hepatoselüler karsinogenezisi tetikler (Pang ve Poon, 2007;


135

Kronik HBV/HCV İnfeksiyonu

Kronik Alkolizm

Diğer etiyolojik faktörler

Kronik hepatit ve Karaciğer sirozu

Erken evre

Displazik nodül

(pre-kanseröz lezyon)

Geç evre

Displazik nodül

(pre-kanseröz lezyon)

Genetik ve epigenetik

değişiklikler

Hepatoselüler karsinoma (HSK)

Tümörün yayılımı (metastaz)

Akkız, 2007). Etiyolojik faktörün farklılığına bağlı olarak hepatosit hücresinde

görülen genetik ve epigenetik değişikliklerin oldukça farklı olduğu gösterilmiştir

(Farazi ve DePinho, 2006; Akkız, 2007; El-Serag ve Rudolph, 2007). HSK’da

görülen genetik anormalikler şu şekilde sıralanabilir: allel kayıpları, kromozomal

değişiklikler, somatik gen mutasyonları, belirli genlerin ekspresyonlarında

değişiklikler, DNA amplifikasyonları/delesyonları ve epigenetik değişiklikler (Llovet

ve Bruix, 2008).

Şekil 5.4. Hepatoselüler Karsinogenezisin Oldukça Kompleks ve Çok Basamaklı

Süreci. HSK vakalarının büyük çoğunluğu kronik hepatit ve/veya siroz zemininde gelişmektedir. Displazik (düzensiz doku oluşumu) nodüller hepatoselüler karsinogeneziste pre-kanseröz lezyonlardır ve sirotik zeminde ortaya çıkmaktadırlar. Hepatoselüler karsinogenezis sürecinde genetik ve epigenetik değişiklikler hücrede birikmektedirler. (Yam ve ark., 2010)


136

Hepatoselüler karsinogeneziste rol oynayan bir çok aday gen belirlenmiştir.

Bu genler c-myc (8q), Siklin A2 (4q), retinoblastoma 1 (Rb1) (13q), axis inhibition

protein 1 (=eksen engelleyici protein 1) (AXIN1) (16p), p53 (17p), cyclin-dependent

kinase inhibitor 2A (=siklin-bağlımlı kinaz inhibitörü 2A) (p16) (9p), E-Cadherin

(=E-Kaderin)(16p), suppressor of cytokine signaling (=sitokin sinyal baskılayıcı)

(SOCS) (16p) ve phosphatase and tensin homolog (=fosfotaz ve tensin homolog)

(PTEN) (10q)’dur (Farazi ve DePinho, 2006; Llovet ve Bruix, 2008). Bir çok

onkogen (β-katenin, Siklin D1 gibi) ve tümör süpressör gende [p53, p16INK4a, APC

(adenomatosis polyposis coli, =adenomatöz polipozis koli), AXIN1 gibi] somatik

mutasyonlar bildirilmektedir (Farazi ve DePinho, 2006). Epigenetik bir değişiklik

olan hipermetilasyon ile bir çok genin [p16INK4a, E-Cadherin, COX-2

(cyclooxygenase-2, =siklooksijenaz 2), ASC (Caspase recruitment domain-

containing protein 5, =kaspaz toplanma bölgesi bulunduran protein 5), DLC1

(deleted in liver cancer 1, = karaciğer kanserinde silinmiş 1)] ifadesinin hepatoselüler

karsinogeneziste değişikliğe uğradığı gösterilmiştir (Farazi ve DePinho, 2006).

Bunlar ile birlikte telomer kısalması, telomeraz aktivasyonu, kromozomların mitoz

bölünme sırasında birbirlerinden ayrılması sırasında meydana gelen anormallikler ve

DNA-hasarına yanıt yolaklarında bulunan genlerdeki allel kayıplarının hepatoselüler

karsinogenezin moleküler patogenezine önemli katkılarının olduğu saptanmıştır

(Farazi ve DePinho, 2006; El-Serag ve Rudolph, 2007). Hepatoselüler karsinomada

en sık görülen kromozom mutasyonları, kromozomların kısa ve uzun kollarındaki

artışlar (1q, 6p, 8q, 11q ve 17q) ve delesyonlardır (1p, 4q, 8p, 13q ve 17p) (Farazi ve

DePinho, 2006; El-Serag ve Rudolph, 2007). Hepatoselüler karsinogeneziste 4

hücresel sinyal iletim yolağının (p53, Wnt/β-katenin, retinoblastoma, EGFR-Ras-

MAPKK) bozulduğu gösterilmiştir (Farazi ve DePinho, 2006;, Akkız, 2007; El-

Serag ve Rudolph, 2007). HSK’da genetik değişikliklerin bu denli zengin olmasının

iki nedeni olabilir. Birincisi, klinik olarak HSK tanısı konulmadan önce çok sayıda

genetik değişikliğin birikmesi gerekmektedir. Etiyolojik faktör ile ilk karşılaşma ve

HSK gelişmesi arasındaki latent periyod oldukça uzundur. İkincisi ise değişik

etiyolojik faktörler hepatosit içinde farklı genleri hedeflemekte ve değiştirmektedir.


137

Etiyolojik sebeplerle ilişkili olarak gelişen genetik heterojenite bu tümörlerin

fenotipik heterojenitesi ile sonuçlanmaktadır (Farazi ve DePinho, 2006; Akkız, 2007)

Yukarıda anlatıldığı gibi hepatoselüler karsinogenezis sürecinde çevresel ve

genetiksel risk faktörleri önemli rol oynamaktadırlar. Yapılan çalışmalar çok açık bir

şekilde göstermektedir ki aynı çevresel risk faktörlerine maruz kalan bireylerin

hepsinde hepatoselüler kanser gelişmemektedir. Bununla birlikte hepatoselüler

kanser için genetik risk faktörlerini taşıyan her bireyde de hepatoselüler kanser

oluşmamaktadır (Farazi ve DePinho, 2006). Ancak çevresel ve genetiksel risk

faktörlerin ikisine birden maruz kalan bireylerde hepatoselüler kanser oluşumunun

oldukça artmış olduğu bildirilmektedir (Şekil 5.5.) (Dragani, 2010). Bizim

sonuçlarımız, hepatoselüler karsinoma için çevresel risk faktörleri ile karşılaşan

(hepatit B, hepatit C ve alkol gibi) veya karşılaşmayan ama sonuç olarak

hepatoselüler kanser gelişen hastalarımızda hepatoselüler karsinogenezise katkıda

bulunan metabolik karaciğer hastalıkları ile ilişkili kalıtsal mutasyonların, diğer

başka aday genlerdeki kalıtsal mutasyonların, bunun yanında somatik olarak gelişen

genetik ve epigenetik anormalliklerin bizim çalışmış olduğumuz hastalarda

hepatoselüler kanser gelişimine neden olabileceğini göstermektedir. Bu yüzden

metabolik karaciğer hastalıkları ile ilişkili kalıtsal mutasyonların ve hepatoselüler

karsinoma için fonksiyonel öneme sahip başka aday genlerdeki kalıtsal

mutasyonların, bunun yanında hepatoselüler karsinogenezise katkıda bulunabilecek

somatik olarak gelişen genetik ve epigenetik anormalliklerin araştırılması

gerekmektedir. Çünkü toplum içerisinde genin işlevini veya ifadesini bozan böylece

kansere yakalanma riskini artıran kalıtsal mutasyonların belirlenmesi ve

populasyonlarda sıklıklarının araştırılması, bunların hepatoselüler karsinogenezis ile

ilişkisinin anlaşılması, tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi ve önceden önleyici

tedbirlerin alınması bakımından oldukça önemlidir.


138

Şekil 5.5. Hepatoselüler Karsinomaya Bireysel Yatkınlık Modeli. Genel

populasyonda nadir sendromları (monogenik durum) veya yatkınlık allellerini kombine (poligenik durum) olarak taşıyan bireyler HSK için yüksek genetik riske sahiptir. Farklı renkler ile gösterilen bireyler HSK için farklı genetik yatkınlığa sahip (monogenik veya poligenik) bireyleri göstermektedir. Bu durum hepatosellüller kanser için genetik heterojenite modelidir (sol taraf). Hepatoselüler kanser için genetik yatkınlığı bulunan veya bulunmayan bireyler hepatoselüler kanser için çevresel risk faktörlerine (hepatit virüs infeksiyonları, alkol tüketimi vb.) maruz kalabilirler ve bu durumda hepatoselüler karsinoma gelişir (sağ taraf).

Çevresel Faktörler

(HBV, HCV, Alkol)

HSK için yüksek genetik risk taşıyan bireylerinde bulunduğu

genel populasyon

HSK gelişen bireyler

6. SONUÇ ve ÖNERİLER Süleyman BAYRAM

139

6. SONUÇ ve ÖNERİLER

Bu çalışmada, Türk populasyonundan kolorektal kanserli, hepatoselüler

kanserli ve herhangi bir kanser tanısı almamış toplam 821 bireyin hiçbirinde CHEK2

I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonları saptanmamıştır. Bu sonuç CHEK2

I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının Türk populasyonunda

bulunmadığını veya çok az bir sıklıkta bulanabileceğini göstermektedir. Bu bilgiler

çerçevesinde CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının Türk

populasyonunda hepatoselüler kanser ve kolorektal kanser oluşum üzerine herhangi

bir etkilerinin olmadığı belirlenmiştir. Bu yüzden bu mutasyonların Türk

populasyonunda klinik bir test olarak taranmalarının bir faydasının olmayacağı

açıktır. Fakat daha kesin bir yargıya varabilmek için Türk populasyonundan daha çok

sayıda hepatoselüler kanserli, kolorektal kanserli ve sağlıklı bireyin yer aldığı ileri

çalışmalara gerek vardır.

CHEK2 I157T, IVS2 + 1 G>A ve 1100delC mutasyonlarının sıklıkları

populasyonlar arasında farklılıklar göstermektedir. Bu yüzden farklı populasyonlarda

aynı kanser türünün oluşumu üzerine bu mutasyonların etkileri farklı olabilir. Daha

önce herhangi bir populasyonda bu mutasyonların hepatoselüler kanser oluşumu

üzerine etkileri araştırılmamıştır. Bu yüzden bu kalıtsal CHEK2 I157T, IVS2 + 1

G>A ve 1100delC mutasyonlarının hepatoselüler karsinogenezis üzerine etkilerinin

daha net bir şekilde belirlenmesi için bu mutasyonların frekanslarının yüksek olduğu

Kuzey Avrupa populasyonu gibi ve/veya hepatoselüler kanserin endemik olduğu

populasyonlardan daha çok sayıda hepatoselüler kanserli hastaların katıldığı ileri

çalışmalara da gerek duyulmaktadır.

Ayrıca bizim hastalarda CHEK2 gen mutasyonu belirleyemediğimiz için bu

hastalarda hepatoselüler ve kolorektal kanser gelişmesinin başka nedenleri olduğu

görüşündeyiz. Bu sebeple daha önce kanser oluşumundan sorumlu olduğu belirlenen

kalıtsal mutasyonların ve fonksiyonel öneme sahip başka aday genlerdeki kalıtsal

mutasyonların, bunun yanında somatik olarak gelişen genetik ve epigenetik

anormalliklerin bu hastalarda kolorektal ve hepatoselüler kanser gelişimine neden

olmuş olabileceğini göstermektedir. Bu yüzden daha önce belirlenmiş kalıtsal

6. SONUÇ ve ÖNERİLER Süleyman BAYRAM

140

mutasyonların ve fonksiyonel öneme sahip başka aday genlerdeki kalıtsal

mutasyonların bunun yanında kolorektal ve hepatoselüler karsinogenezise katkıda

bulunabilecek somatik olarak gelişen genetik ve epigenetik anormalliklerin

araştırılması gerekmektedir. Çünkü toplum içerisinde genin işlevini veya ifadesini

bozan böylece kansere yakalanma riskini artıran kalıtsal mutasyonların belirlenmesi

ve populasyonlarda sıklıklarının araştırılması, kolorektal ve hepatoselüler

karsinogenezis ile ilişkilerinin anlaşılması tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi ve

önceden önleyici tedbirlerin alınması bakımından oldukça önemlidir.

141

KAYNAKLAR

AARSAND, A.K., BOMAN, H. and SANDBERG, S., 2009. Familial and sporadic

porphyria cutanea tarda: characterization and diagnostic strategies. Clin.

Chem., 55:795–803.

AHN, J., URIST, M. and PRIVES, C., 2004. The Chk2 protein kinase. DNA Repair

(Amst), 3(8-9):1039-1047.

AKKIZ, H., 2007. Hepatoselüler Karsinomanın Moleküler Patogenezi. Türkiye

Klinikleri J. Int. Med. Sci., 3(34):32-7

, 2009a. Kolorektal Kanserin Gelişmesinde Çevresel Risk Faktörleri.

Türkiye Klinikleri J. Med. Oncol-Special Topics 2(3):1-4.

, 2009b. Kolorektal Karsinomanın Moleküler Patogenezi. Türkiye

Klinikleri J. Med. Oncol-Special Topics 2(3):5-12.

ALEXANDER, J. and KOWDLEY, K.V., 2009. HFE-associated hereditary

hemochromatosis. Genet. Med., 11:307–313.

ALLEN, J. B., ZHOU, Z., SIEDE, W., FRIEDBERG, E. C. and ELLEDGE, S. J.,

1994. The SAD1/RAD53 protein kinase controls multiple checkpoints and

DNA damage-induced transcription in yeast. Genes Dev., 8: 2401–2415.

ALLINEN, M., HUUSKO, P., MÄNTYNIEMI, S., LAUNONEN, V., WINQVIST,

R., 2001. Mutation analysis of the CHK2 gene in families with hereditary

breast cancer. Br. J. Cancer, 85(2):209-12.

ANDANT, C., PUY, H., BOGARD, C., FAIVRE, J., SOULE, J.C., NORDMANN,

Y. and DEYBACH, J.C., 2000. Hepatocellular carcinoma in patients with

acute hepatic porphyria: frequency of occurrence and related factors. J.

Hepatol., 32:933–939.

ANTONI, L., SODHA, N., COLLINS, I. and GARRETT, M.D., 2007. CHEK2

kinase: cancer susceptibility and cancer therapy-two side of the same coin?.

Nat. Rev. Cancer., 7:925-936.

BAEYENS, A., CLAES, K., WILLEMS, P., DE RUYCK, K., THIERENS, H. and

VRAL, A., 2005. Chromosomal radiosensitivity of breast cancer with a

CHEK2 mutation. Cancer Genet. Cytogenet., 163(2):106-112.

142

BARTEK, J., FALCK, J. and LUKAS, J., 2001. CHK2 kinase--a busy messenger.

Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 2(12):877-886.

BARTEK, J. and LUKAS, J., 2003. Chk1 and Chk2 kinases in checkpoint control

and cancer. Cancer Cell., 3(5):421-9.

BARTEK, J. and LUKAS, J., 2007. DNA damage checkpoints: from initiation to

recovery or adaptation. Curr. Opin. Cell. Biol. 19(2):238-45.

BARTKOVA, J., HOREJSÍ, Z., KOED, K., KRÄMER, A., TORT, F., ZIEGER, K.,

GULDBERG, P., SEHESTED, M., NESLAND, J. M., LUKAS, C.,

ØRNTOFT, T., LUKAS, J. and BARTEK, J., 2005. DNA damage response

as a candidate anti-cancer barrier in early human tumorigenesis. Nature,

434:864–870.

BARTSCH, D. K., KRYSEWSKI, K., SINA-FREY, M., FENDRICH, V., RIEDER,

H., LANGER, P., KRESS, R., SCHNEIDER, M., HAHN, S.A. and SLATER,

E.P., 2006. Low frequency of CHEK2 mutations in familial pancreatic

cancer. Fam. Cancer, 5(4):305-308.

BLASINA, A., de WEYER, I. V., LAUS, M.C., LUYTEN, W.H., PARKER, A.E.

and McGOWAN, C.H., 1999. A human homologue of the checkpoint kinase

Cds1 directly inhibits Cdc25 phosphatase. Curr. Biol., 1:1–10.

BELL, D. W., KIM, S. H., GODWIN, A. K., SCHIRIPO, T. A., HARRIS, P. L.,

HASERLAT, S. M., WAHRER, D. C., HAIMAN, C. A., DALY, M. B.,

NIENDORF, K. B., SMITH, M. R., SGROI, D. C., GARBER, J. E.,

OLOPADE, O. I., LE MARCHAND, L., HENDERSON, B. E.,

ALTSHULER, D., HABER, D. A. and FREEDMAN, M. L., 2007. Genetic

and functional analysis of CHEK2 (CHK2) variants in multiethnic

cohorts. Int. J. Cancer, 121(12):2661-2667.

BERNSTEIN, J. L., TERAOKA, S. N., JOHN, E. M., ANDRULIS, I. L., KNIGHT,

J. A., LAPINSKI, R., OLSON, E. R., WOLITZER, A. L., SEMINARA, D.,

WHITTEMORE, A. S. and CONCANNON, P., 2006. The

CHEK2*1100delC allelic variant and risk of breast cancer: screening

results from the Breast Cancer Family Registry. Cancer Epidemiol.

Biomarkers Prev., 15(2):348- 352.

143

BOGDANOVA, N., ENSSEN-DUBROWINSKAJA, N., FESHCHENKO, S.,

LAZJUK, G. I., ROGOV, Y. I., DAMMANN, O., BREMER, M.,

KARSTENS, J. H., SOHN, C. and DÖRK, T., 2005. Association of two

mutations in the CHEK2 gene with breast cancer. Int. J. Cancer,

116(2):263-266.

BOGDANOVA, N., FESHCHENKO, S., CYBULSKI, C. and DÖRK, T., 2007

CHEK2 mutation and hereditary breast cancer. J. Clin. Oncol., 25(19):e26.

BRADBURY, J. M. and JACKSON, S. P. 2003., The complex matter of DNA

double-strand break detection. Biochem. Soc. Trans., 31:40–44.

BRENNAN, P., McKAY, J., MOORE, L., ZARIDZE, D., MUKERIA, A.,

SZESZENIA-DABROWSKA, N., LISSOWSKA, J., RUDNAI, P.,

FABIANOVA, E., MATES, D., BENCKO, V., FORETOVA, L., JANOUT,

V., CHOW, W. H., ROTHMAN, N., CHABRIER, A., GABORIEAU, V.,

ODEFREY, F., SOUTHEY, M., HASHIBE, M., HALL, J., BOFFETTA, P.,

PETO, J., PETO, R. and HUNG, R. J., 2007. Uncommon CHEK2 mis-sense

variant and reduced risk of tobacco-related cancers: case control study. Hum.

Mol. Genet., 16(15):1794-1801.

BROEKS, A., DE WITTE, L., NOOIJEN, A., HUSEINOVIC, A., KLIJN, J. G.,

VAN LEEUWEN, F. E., RUSSELL, N. S. and VAN'T VEER, L. J., 2004.

Excess risk for contralateral breast cancer in CHEK2*1100delC germline

mutation carriers. Breast Cancer Res. Treat., 83(1):91-93.

BURT, R.W., DiSARIO, J.A. and CANNON-ALBRIGHT, L., 1995. Genetics of

colon cancer: impact of inheritance on colon cancer risk. Annu. Rev. Med.,

46:371-9.

CALIGO, M. A., AGATA, S., ACETO, G., CRUCIANELLI, R., MANOUKIAN, S.,

PEISSEL, B., SCAINI, M. C., SENSI, E., VESCHI, S., CAMA, A.,

RADICE, P., VIEL, A., D'ANDREA, E. and MONTAGNA, M., 2004. The

CHEK2 c.1100delC mutation plays an irrelevant role in breast cancer

predisposition in Italy. Hum. Mutat., 24(1):100-101.

144

CENTER, M.M., JEMAL, A. and WARD, E., 2009a. International trends in

colorectal cancer incidence rates. Cancer Epidemiol. Biomarkers

Prev.,18:1688–1694.

CENTER, M.M., JEMAL, A., SMITH, R.A. and WARD, E., 2009b. Worldwide

variations in colorectal cancer. C.A. Cancer J. Clin. 59(6):366-78.

CHATURVEDI, P., ENG, W. K., ZHU, Y., MATTERN, M. R., MISHRA, R.,

HURLE, M. R., ZHANG, X., ANNAN, R. S., LU, Q., FAUCETTE, L. F.,

SCOTT, G. F., LI, X., CARR, S. A., JOHNSON, R. K., WINKLER, J. D. and

ZHOU, B. B., 1999. Mammalian Chk2 is a downstream effector of the ATM-

dependent DNA damage checkpoint pathway. Oncogene, 18:4047–4054.

CHEK2 BREAST CANCER CASE-CONTROL CONSORTIUM., 2004.

CHEK2*1100delC and susceptibility to breast cancer: a collaborative

analysis involving 10860 breast cancer cases and 9065 controls from 10

studies. Am. J. Hum. Genet., 74(6):1175-1182.

CHEKMARIOVA, E. V., SOKOLENKO, A. P., BUSLOV, K. G., IYEVLEVA, A.

G., ULIBINA, Y. M., ROZANOV, M. E., MITIUSHKINA, N. V., TOGO, A.

V., MATSKO, D. E., VOSKRESENSKIY, D. A., CHAGUNAVA, O. L.,

DEVILEE, P., CORNELISSE, C., SEMIGLAZOV, V. F. and IMYANITOV,

E. N., 2006. CHEK2 1100delC mutation is frequent among Russian breast

cancer patients. Breast Cancer Res. Treat., 100(1):99-102.

CHEN, W., YURONG, S. and LIANSHENG, N., 2008. Breast cancer low-

penetrance allele 1100delC in the CHEK2 gene: not present in the Chinese

familial breast cancer population. Adv. Ther., 25(5):496-501.

CHOI, D. H., CHO, D. Y., LEE, M. H., PARK, H. S., AHN, S. H., SON, B. H. and

HAFFTY, B. G., 2008. The CHEK2 1100delC mutation is not present in

Korean patients with breast cancer cases tested for BRCA1 and BRCA2

mutation. Breast Cancer Res. Treat., 112(3):569-73.

CHUNG, D.C. and RUSTGI, A.K., 2003. The hereditary nonpolyposis colorectal

cancer syndrome: genetics and clinical implications. Ann. Intern. Med.

138(7):560-70.

145

CYBULSKI, C., HUZARSKI, T., GÓRSKI, B., MASOJĆ, B., MIERZEJEWSKI,

M., DEBNIAK, T., GLINIEWICZ, B., MATYJASIK, J., ZŁOWOCKA, E.,

KURZAWSKI, G., SIKORSKI, A., POSMYK, M., SZWIEC, M., CZAJKA,

R., NAROD, S. A. and LUBIŃSKI, J. 2004a., A novel founder CHEK2

mutation is associated with increased prostate cancer risk. Cancer Res.,

64(8):2677-2679.

CYBULSKI, C., GÓRSKI, B., HUZARSKI, T., MASOJĆ, B., MIERZEJEWSKI,

M., DEBNIAK, T., TEODORCZYK, U., BYRSKI, T., GRONWALD, J.,

MATYJASIK, J., ZLOWOCKA, E., LENNER, M., GRABOWSKA, E., NEJ,

K., CASTANEDA, J., MEDREK, K., SZYMAŃSKA, A., SZYMAŃSKA, J.,

KURZAWSKI, G., SUCHY, J., OSZUREK, O., WITEK, A., NAROD, S. A.,

LUBIŃSKI, J., 2004b. CHEK2 is a multiorgan cancer susceptibility gene,

Am. J. Hum. Genet., 75(6):1131-1135.

CYBULSKI, C., GÓRSKI, B., HUZARSKI, T., BYRSKI, T., GRONWALD, J.,

DEBNIAK, T., WOKOLORCZYK, D., JAKUBOWSKA, A., KOWALSKA,

E., OSZUREK, O., NAROD, S. A. and LUBINSKI, J., 2006a. CHEK2-

positive breast cancers in young Polish women. Clin. Cancer Res.,

12(16):4832-4835.

CYBULSKI, C., WOKOŁORCZYK, D., HUZARSKI, T., BYRSKI, T.,

GRONWALD, J., GÓRSKI, B., DEBNIAK, T., MASOJĆ, B.,

JAKUBOWSKA, A., GLINIEWICZ, B., SIKORSKI, A., STAWICKA, M.,

GODLEWSKI, D., KWIAS, Z., ANTCZAK, A., KRAJKA, K., LAUER, W.,

SOSNOWSKI, M., SIKORSKA-RADEK, P., BAR, K., KLIJER, R.,

ZDROJOWY, R., MAŁKIEWICZ, B., BORKOWSKI, A., BORKOWSKI,

T., SZWIEC, M., NAROD, S. A. and LUBIŃSKI, J., 2006b. A large

germline deletion in the Chek2 kinase gene is associated with an increased

risk of prostate cancer. J. Med. Genet., 43(11):863-866.

CYBULSKI, C., WOKOŁORCZYK, D., HUZARSKI, T., BYRSKI, T.,

GRONWALD, J., GÓRSKI, B., DEBNIAK, T., MASOJĆ, B.,

JAKUBOWSKA, A., VAN DE WETERING, T., NAROD, S. A. and

146

LUBIŃSKI, J., 2007. A deletion in CHEK2 of 5,395 bp predisposes to breast

cancer in Poland. Breast Cancer Res. Treat., 102(1):119-22.

CYBULSKI, C., MASOJC, B., OSZUTOWSKA, D., JAWOROWSKA, E.,

GRODZKI, T., WALOSZCZYK, P., SERWATOWSKI, P., PANKOWSKI,

J., HUZARSKI, T., BYRSKI, T., GÓRSKI, B., JAKUBOWSKA, A.,

DEBNIAK, T., WOKOLORCZYK, D., GRONWALD, J., TARNOWSKA,

C., SERRANO-FERNÁNDEZ, P., LUBINSKI, J. and NAROD, S. A., 2008.

Constitutional CHEK2 mutations are associated with a decreased risk of lung

and laryngeal cancers. Carcinogenesis, 29(4):762-765.

CYBULSKI, C., HUZARSKI, T., BYRSKI, T., GRONWALD, J., DEBNIAK, T.,

JAKUBOWSKA, A., GÓRSKI, B., WOKOŁORCZYK, D., MASOJĆ, B.,

NAROD, S. A. and LUBIŃSKI, J., 2009. Estrogen receptor status in CHEK2-

positive breast cancers: implications for chemoprevention. Clin. Genet.,

75(1):72-8.

de BOCK, G. H., SCHUTTE, M., KROL-WARMERDAM, E. M., SEYNAEVE, C.,

BLOM, J., BREKELMANS, C. T., MEIJERS-HEIJBOER, H., VAN

ASPEREN, C. J., CORNELISSE, C. J., DEVILEE, P., TOLLENAAR, R. A.

and KLIJN, J. G., 2004. Tumour characteristics and prognosis of breast

cancer patients carrying the germline CHEK2*1100delC variant. J. Med.

Genet., 41(10):731-735.

de BOCK, G. H., MOURITS, M. J., SCHUTTE, M., KROL-WARMERDAM, E. M.,

SEYNAEVE, C., BLOM, J., BREKELMANS, C. T., MEIJERS-HEIJBOER,

H., VAN ASPEREN, C. J., CORNELISSE, C. J., DEVILEE, P.,

TOLLENAAR, R. A. and KLIJN, J. G., 2006. Association between the

CHEK2*1100delC germ line mutation and estrogen receptor status. Int. J.

Gynecol. Cancer, 16 (Suppl 2):552-555.

de JONG, M. M., NOLTE, I. M., TE MEERMAN, G. J., VAN DER GRAAF, W. T.,

MULDER, M. J., VAN DER STEEGE, G., BRUINENBERG, M.,

SCHAAPVELD, M., NIESSEN, R. C., BERENDS, M. J., SIJMONS, R. H.,

HOFSTRA, R. M., DE VRIES, E. G. and KLEIBEUKER, J. H., 2005a.

147

Colorectal cancer and the CHEK2 1100delC mutation. Genes Chromosomes

Cancer, 43(4):377-382.

de JONG, M. M., NOLTE, I. M., TE MEERMAN, G. J., VAN DER GRAAF, W. T.,

OOSTEROM, E., BRUINENBERG, M., STEEGE, G., OOSTERWIJK, J. C.,

VAN DER HOUT, A. H., BOEZEN, H. M., SCHAAPVELD, M.,

KLEIBEUKER, J. H. and DE VRIES, E. G., 2005b. No increased

susceptibility to breast cancer from combined CHEK2 1100delC genotype

and the HLA class III region risk factors. Eur. J. Cancer, 41(12):1819-1823.

de la CHAPELLE A., 2004. Genetic predisposition to colorectal cancer. Nat. Rev.

Cancer. 4(10):769-80.

DEBNIAK, T., SCOTT, R. J., GÓRSKI, B., CYBULSKI, C., VAN DE

WETERING, T., SERRANO-FERNANDEZ, P., HUZARSKI, T., BYRSKI,

T., NAGAY, L., DEBNIAK, B., KOWALSKA, E., JAKUBOWSKA, A.,

GRONWALD, J., WOKOLORCZYK, D., MALESZKA, R., KŁADNY, J.

and LUBINSKI, J., 2008. Common variants of DNA repair genes and

malignant melanoma. Eur. J. Cancer, 44(1):110-114.

DJUREINOVIC, T., LINDBLOM, A., DALÉN, J., DEDORSON, S., EDLER, D.,

HJERN, F., HOLM, J., LENANDER, C., LINDFORSS, U., LUNDQVIST,

N., OLIVECRONA, H., OLSSON, L., PÅHLMAN, L., RUTEGÅRD, J.,

SMEDH, K., TÖRNQVIST, A., EIBERG, H. and BISGAARD, M. L., 2006.

The CHEK2 1100delC variant in Swedish colorectal cancer. Anticancer Res.,

26(6C):4885-8.

DONG, X., WANG, L., TANIGUCHI, K., WANG, X., CUNNINGHAM, J. M.,

MCDONNELL, S. K., QIAN, C., MARKS, A. F., SLAGER, S. L.,

PETERSON, B. J., SMITH, D. I., CHEVILLE, J. C., BLUTE, M. L.,

JACOBSEN, S. J., SCHAID, D. J., TINDALL, D. J., THIBODEAU, S. N.

and LIU, W., 2003. Mutations in CHEK2 associated with prostate cancer risk.

Am. J. Hum. Genet. 72(2):270-280

DRAGANI, T.A., 2010. Risk of HCC: Genetic heterogeneity and complex genetics.

J. Hepatol., 52: 252-257.

148

DUFAULT, M. R., BETZ, B., WAPPENSCHMIDT, B., HOFMANN, W.,

BANDICK, K., GOLLA, A., PIETSCHMANN, A., NESTLE-KRÄMLING,

C., RHIEM, K., HÜTTNER, C., VON LINDERN, C., DALL, P., KIECHLE,

M., UNTCH, M., JONAT, W., MEINDL, A., SCHERNECK, S.,

NIEDERACHER, D., SCHMUTZLER, R. K. and ARNOLD, N., 2004.

Limited relevance of the CHEK2 gene in hereditary breast cancer. Int. J.

Cancer, 110(3):320-325.

EINARSDÓTTIR, K., HUMPHREYS, K., BONNARD, C., PALMGREN, J., ILES,

M. M., SJÖLANDER, A., LI, Y., CHIA, K. S., LIU, E. T., HALL, P., LIU, J.

and WEDRÉN, S., 2006. Linkage disequilibrium mapping of CHEK2:

common variation and breast cancer risk. PLoS Med. 3(6):e168.

EL HALLANI, S., BOISSELIER, B., MARIE, Y., PARIS, S., IDBAIH, A.,

CARPENTIER, C., HOANG-XUAN, K., DELATTRE, J. Y. and SANSON,

M., 2009. TP53 mutations but no CHEK2 *1100DelC variant in familial

gliomas. Cancer Genet. Cytogenet., 188(2):126-8.

El-SERAG, H.B. and RUDOLPH, K.L., 2007. Hepatocellular carcinoma:

epidemiology and molecular carcinogenesis. Gastroenterology,

132(7):2557-76.

FAIRBANKS, K.D. and TAVILL A.S., 2008. Liver disease in alpha 1-antitrypsin

deficiency: a review. Am. J. Gastroenterol., 103:2136–2141.

FALCHETTI, M., LUPI, R., RIZZOLO, P., CECCARELLI, K., ZANNA, I., CALÒ,

V., TOMMASI, S., MASALA, G., PARADISO, A., GULINO, A.,

GIANNINI, G., RUSSO, A., PALLI, D. and OTTINI, L., 2008.

BRCA1/BRCA2 rearrangements and CHEK2 common mutations are

infrequent in Italian male breast cancer cases. Breast Cancer Res. Treat.,

110(1):161-7.

FALCK, J., LUKAS, C., PROTOPOPKOVA, M., LUKAS, J., SELIVANOVA, G.

and BARTEK J., 2001a. Functional impact of concomitant versus alternative

defects in the Chk2-p53 tumour suppressor pathway. Oncogene, 20:5503–

5510.

149

FALCK, J., MAILAND, N., SYLJUÅSEN, R. G., BARTEK, J. and LUKAS, J.,

2001b. The ATM-Chk2-Cdc25A checkpoint pathway guards against

radioresistant DNA synthesis. Nature, 410:842–847.

FARAZI, P.A. and DePINHO, R.A., 2006. Hepatocellular carcinoma pathogenesis:

from genes to environment. Nat. Rev. Cancer, 6(9):674-87.

FRIEDRICHSEN, D. M., MALONE, K. E., DOODY, D. R., DALING, J. R. and

OSTRANDER, E. A., 2004. Frequency of CHEK2 mutations in a population

based, case-control study of breast cancer in young women. Breast Cancer

Res.;6(6):R629-635.

GIOVANNUCCI, E., 2002. Modifiable risk factors for colon cancer. Gastroenterol.

Clin. North Am., 31(4):925-43.

GONZÁLEZ-HORMAZÁBAL, P., CASTRO, V. G., BLANCO, R., GÓMEZ, F.,

PERALTA, O., WAUGH, E., BRAVO, T., REYES, J. M. and JARA, L.,

2008. Absence of CHEK2 1100delC mutation in familial breast cancer cases

from a South American population. Breast Cancer Res. Treat. 110(3):543-54.

GORGOULIS, V. G., VASSILIOU, L. V., KARAKAIDOS, P., ZACHARATOS, P.,

KOTSINAS, A., LILOGLOU, T., VENERE, M., DITULLIO RA, J. R.,

KASTRINAKIS, N. G., LEVY, B., KLETSAS, D., YONETA, A., HERLYN,

M., KITTAS, C. and HALAZONETIS, T. D., 2005. Activation of the DNA

damage checkpoint and genomic instability in human precancerous lesions.

Nature, 434:907–913.

GÓRSKI, B., CYBULSKI, C., HUZARSKI, T., BYRSKI, T., GRONWALD, J.,

JAKUBOWSKA, A., STAWICKA, M., GOZDECKA-GRODECKA, S.,

SZWIEC, M., URBAŃSKI, K., MITUŚ, J., MARCZYK, E., DZIUBA, J.,

WANDZEL, P., SURDYKA, D., HAUS, O., JANISZEWSKA, H.,

DEBNIAK, T., TOŁOCZKO-GRABAREK, A., MEDREK, K., MASOJĆ,

B., MIERZEJEWSKI, M., KOWALSKA, E., NAROD, S. A. and

LUBIŃSKI, J., 2005 Breast cancer predisposing alleles in Poland. Breast

Cancer Res. Treat. 92(1):19-24.

HOEIJMAKERS, J. H., 2001. Genome maintenance mechanisms for preventing

cancer. Nature, 411:366–374.

150

HUANG, J., DOMCHEK, S. M., BROSE, M. S., REBBECK, T. R., NATHANSON,

K. L. and WEBER, B. L., 2004. Germline CHEK2*1100delC mutations in

breast cancer patients with multiple primary cancers. J. Med. Genet.

41(11):e120.

HUXLEY, R., 2007. The role of lifestyle risk factors on mortality from colorectal

cancer in populations of the Asia-Pacific region. Asian Pac. J. Cancer Prev.,

8(2):191-8.

HUZARSKI, T., CYBULSKI, C., DOMAGAŁA, W., GRONWALD, J., BYRSKI,

T., SZWIEC, M., WOYKE, S., NAROD, S. A. and LUBIŃSKI, J., 2005.

Pathology of breast cancer in women with constitutional CHEK2 mutations.

Breast Cancer Res. Treat. 90(2):187-189.

ISINGER, A., BHAT, M., BORG, A. and NILBERT, M., 2006. CHEK2 1100delC in

patients with metachronous cancers of the breast and the colorectum. BMC

Cancer, 6:64.

JANECKE, A.R., MAYATEPEK, E. and UTERMANN, G., 2001. Molecular

genetics of type 1 glycogen storage disease. Mol. Genet. Metab., 73:117–125.

JEKIMOVS, C. R., CHEN, X., ARNOLD, J., GATEI, M., RICHARD, D. J.,

SPURDLE, A. B., KHANNA, K. K., CHENEVIX-TRENCH, G. and

kConFab Investigators., 2005. Low frequency of CHEK2 1100delC allele in

Australian multiple-case breast cancer families: functional analysis in

heterozygous individuals. Br. J. Cancer, 92(4):784-790.

JO, W.S. and CHUNG, D.C., 2005. Genetics of hereditary colorectal cancer. Semin.

Oncol., 32(1):11-23.

KILPIVAARA, O., LAIHO, P., AALTONEN, L. A. and NEVANLINNA, H., 2003. CHEK2 1100delC and colorectal cancer. J. Med. Genet., 40(10):e110.

KILPIVAARA, O., VAHTERISTO, P., FALCK, J., SYRJÄKOSKI, K., EEROLA,

H., EASTON, D., BARTKOVA, J., LUKAS, J., HEIKKILÄ, P.,

AITTOMÄKI, K., HOLLI, K., BLOMQVIST, C., KALLIONIEMI, O. P.,

BARTEK, J. and NEVANLINNA, H. 2004., CHEK2 variant I157T may be

associated with increased breast cancer risk. Int. J. Cancer, 111(4):543-547.

151

KILPIVAARA, O., BARTKOVA, J., EEROLA, H., SYRJÄKOSKI, K.,

VAHTERISTO, P., LUKAS, J., BLOMQVIST, C., HOLLI, K., HEIKKILÄ,

P., SAUTER, G., KALLIONIEMI, O. P., BARTEK, J. and NEVANLINNA,

H., 2005. Correlation of CHEK2 protein expression and c.1100delC mutation

status with tumor characteristics among unselected breast cancer patients. Int.

J. Cancer, 113(4):575-580.

KILPIVAARA, O., ALHOPURO, P., VAHTERISTO, P., AALTONEN, L. A., and

NEVANLINNA, H., 2006. CHEK2 I157T associates with familial and

sporadic colorectal cancer. J. Med. Genet., 43(7):e34.

KLEIBL, Z., NOVOTNY, J., BEZDICKOVA, D., MALIK, R., KLEIBLOVA, P.,

FORETOVA, L., PETRUZELKA, L., ILENCIKOVA, D., CINEK, P. and

POHLREICH, P., 2005. The CHEK2 c.1100delC germline mutation rarely

contributes to breast cancer development in the Czech Republic. Breast

Cancer Res. Treat., 90(2):165-167.

KLEIBL, Z., HAVRANEK, O., HLAVATA, I., NOVOTNY, J., SEVCIK, J.,

POHLREICH, P. and SOUCEK P., 2009. The CHEK2 gene I157T mutation

and other alterations in its proximity increase the risk of sporadic colorectal

cancer in the Czech population. Eur. J. Cancer, 45(4):618-624.

KONSTANTINOVA, D. V., KADIYSKA, T. K., KANEVA, R. P., TOSHEVA, E.

G., GUSEVA, V. T., DIMITROV, B. H., DIMITROV, R. G., DOGANOV,

N. I., IVANOV, S. I., KREMENSKY, I. M. and MITEV, V. I., 2008. CHEK2

I157T and Endometrial Cancer. DNA Cell Biol., doi:10.1089/dna.2008.0781.

KOPPERT, L. B., SCHUTTE, M., ABBOU, M., TILANUS, H. W. and DINJENS,

W. N., 2004. The CHEK2(*)1100delC mutation has no major contribution in

oesophageal carcinogenesis. Br. J. Cancer, 90(4):888-891.

LEE, J. S., COLLINS, K. M., BROWN, A. L., LEE, C. H. and CHUNG, J. H., 2000.

hCds1-mediated phosphorylation of BRCA1 regulates the DNA damage

response. Nature, 404:201–204.

LI, J., WILLIAMS, B. L., HAIRE, L. F., GOLDBERG, M., WILKER, E.,

DUROCHER, D., YAFFE, M. B., JACKSON, S. P., SMERDON, S. J., 2002.

152

Structural and functional versatility of the FHA domain in DNA-damage

signaling by the tumor suppressor kinase Chk2. Mol. Cell., 9:1045–1054.

LIN, O.S., 2009. Acquired risk factors for colorectal cancer. Methods Mol. Biol.,

472:361-72.

LIPTON, L., FLEISCHMANN, C., SIEBER, O. M., THOMAS, H. J., HODGSON,

S. V., TOMLINSON, I. P. and HOULSTON, R. S., 2003. Contribution of the

CHEK2 1100delC variant to risk of multiple colorectal adenoma and

carcinoma. Cancer Lett., 200(2):149-152.

LLOVET, J.M. and BRUIX, J., 2008. Molecular targeted therapies in hepatocellular

carcinoma. Hepatology, 48(4):1312-27.

LYNCH, H.T., SMYRK, T.C., WATSON, P., LANSPA, S.J., LYNCH, J.F.,

LYNCH, P.M., CAVALIERI, R.J. and BOLAND, C.R., 1993. Genetics,

natural history, tumor spectrum, and pathology of hereditary nonpolyposis

colorectal cancer: an updated review. Gastroenterology, 104(5):1535-49.

LYNCH, H.T. and de la CHAPELLE, A., 2003. Hereditary colorectal cancer. N.

Engl. J. Med. 348(10):919-32.

MARCHAND, L.L., 1999. Combined influence of genetic and dietary factors on

colorectal cancer incidence in Japanese Americans. J. Natl. Cancer Inst.

Monogr.,26:101-5.

MARGOLIN, S., EIBERG, H., LINDBLOM, A. and BISGAARD, M. L., 2007.

CHEK2 1100delC is prevalent in Swedish early onset familial breast cancer.

BMC Cancer, 7:163.

MARKOWITZ, S.D. and BERTAGNOLLI, M.M., 2009. Molecular origins of

cancer: Molecular basis of colorectal cancer. N. Engl. J. Med., 361(25):2449-

60.

MARTINEZ-BOUZAS, C., BERISTAIN, E., GUERRA, I., GOROSTIAGA, J.,

MENDIZABAL, J. L., DE-PABLO, J. L., GARCÍA-ALEGRÍA, E., SANZ-

PARRA, A. and TEJADA, M. I., 2007. CHEK2 1100delC is present in

familial breast cancer cases of the Basque Country. Breast Cancer Res. Treat.,

103(1):111-113.

153

MATEUS PEREIRA, L. H., SIGURDSON, A. J., DOODY, M. M., PINEDA, M. A.,

ALEXANDER, B. H., GREENE, M. H. and STRUEWING, J. P., 2004.

CHEK2:1100delC and female breast cancer in the United States. Int. J.

Cancer, 112(3):541-543

MATSUOKA, S., HUANG, M. and ELLEDGE, S. J., 1998. Linkage of ATM to cell

cycle regulation by the Chk2 protein kinase. Science, 282:1893–1897.

McINERNEY, N. M., MILLER, N., ROWAN, A., COLLERAN, G., BARCLAY, E.,

CURRAN, C., KERIN, M. J., TOMLINSON, I. P. and SAWYER, E., 2009.

Evaluation of variants in the CHEK2, BRIP1 and PALB2 genes in an Irish

breast cancer cohort. Breast Cancer Res. Treat., doi: 10.1007/s10549-009-

0540-9.

MEIJERS-HEIJBOER, H., VAN DEN OUWELAND, A., KLIJN, J.,

WASIELEWSKI, M., DE SNOO, A., OLDENBURG, R., HOLLESTELLE,

A., HOUBEN, M., CREPIN, E., VAN VEGHEL-PLANDSOEN, M.,

ELSTRODT, F., VAN DUIJN, C., BARTELS, C., MEIJERS, C., SCHUTTE,

M., McGUFFOG, L., THOMPSON, D., EASTON, D., SODHA, N., SEAL,

S., BARFOOT, R., MANGION, J., CHANG-CLAUDE, J., ECCLES, D.,

EELES, R., EVANS, D. G., HOULSTON, R., MURDAY, V., NAROD, S.,

PERETZ, T., PETO, J., PHELAN, C., ZHANG, H. X., SZABO, C.,

DEVILEE, P., GOLDGAR, D., FUTREAL, P. A., NATHANSON, K. L.,

WEBER, B., RAHMAN, N., STRATTON, M. R. and CHEK2-BREAST

CANCER CONSORTIUM, 2002. Low-penetrance susceptibility to breast

cancer due to CHEK2(*)1100delC in noncarriers of BRCA1 or BRCA2

mutations. Nat. Genet., 31(1):55-59.

MEIJERS-HEIJBOER, H., WIJNEN, J., VASEN, H., WASIELEWSKI, M.,

WAGNER, A., HOLLESTELLE, A., ELSTRODT, F., VAN DEN BOS, R.,

DE SNOO, A., FAT, G. T., BREKELMANS, C., JAGMOHAN, S.,

FRANKEN, P., VERKUIJLEN, P., VAN DEN OUWELAND, A.,

CHAPMAN, P., TOPS, C., MÖSLEIN, G., BURN, J., LYNCH, H., KLIJN,

J., FODDE, R. and SCHUTTE, M., 2003. The CHEK2 1100delC mutation

154

identifies families with a hereditary breast and colorectal cancer phenotype.

Am. J. Hum. Genet., 72(5):1308-1314.

MELLEMKJAER, L., DAHL, C., OLSEN, J. H., BERTELSEN, L., GULDBERG,

P., CHRISTENSEN, J., BØRRESEN-DALE, A. L., STOVALL, M.,

LANGHOLZ, B., BERNSTEIN, L., LYNCH, C. F., MALONE, K. E.,

HAILE, R. W., ANDERSSON, M., THOMAS, D. C., CONCANNON, P.,

CAPANU, M., BOICE, J. D. Jr., WECARE STUDY COLLABORATIVE

GROUP, and BERNSTEIN, J. L., 2008. Risk for contralateral breast cancer

among carriers of the CHEK2*1100delC mutation in the WECARE Study.

Br. J. Cancer, 98(4):728-733.

MURAKAMI, H. and OKAYAMA, H., 1995. A kinase from fission yeast

responsible for blocking mitosis in S phase. Nature, 374:817–819.

NEUHAUSEN, S., DUNNING, A., STEELE, L., YAKUMO, K., HOFFMAN, M.,

SZABO, C., TEE, L., BAINES, C., PHAROAH, P., GOLDGAR, D. and

EASTON, D., 2004. Role of CHEK2*1100delC in unselected series of non-

BRCA1/2 male breast cancers. Int. J. Cancer, 108(3):477-478.

NIIDA, H. and NAKANISHI, M., 2006. DNA damage checkpoints in mammals,

Mutagenesis, 21(1):3-9.

OFFIT, K., PIERCE, H., KIRCHHOFF, T., KOLACHANA, P., RAPAPORT, B.,

GREGERSEN, P., JOHNSON, S., YOSSEPOWITCH, O., HUANG, H.,

SATAGOPAN, J., ROBSON, M., SCHEUER, L., NAFA, K. and ELLIS, N.,

2003. Frequency of CHEK2*1100delC in New York breast cancer cases and

controls. BMC Med. Genet., 4:1.

OHAYON, T., GAL, I., BARUCH, R. G., SZABO, C. and FRIEDMAN, E., 2004.

CHEK2*1100delC and male breast cancer risk in Israel. Int. J. Cancer,

108(3):479-480.

OLDENBURG, R. A., KROEZE-JANSEMA, K., KRAAN, J., MORREAU, H.,

KLIJN, J. G., HOOGERBRUGGE, N., LIGTENBERG, M. J., VAN

ASPEREN, C. J., VASEN, H. F., MEIJERS, C., MEIJERS-HEIJBOER, H.,

de BOCK, T. H., CORNELISSE, C. J. and DEVILEE, P., 2003. The

155

CHEK2*1100delC variant acts as a breast cancer risk modifier in non-

BRCA1/BRCA2 multiple-case families. Cancer Res., 63(23):8153-8157.

OSORIO, A., RODRIGUEZ-LÓPEZ, R., DIEZ, O., DE LA HOYA, M., IGNACIO

MARTÍNEZ, J., VEGA, A., ESTEBAN-CARDEÑOSA, E., ALONSO, C.,

CALDÉS, T. and BENÍTEZ, J., 2004. The breast cancer low-penetrance

allele 1100delC in the CHEK2 gene is not present in Spanish familial breast

cancer population. Int. J. Cancer, 108(1):54-56.

PANG, R.W. and POON, R.T., 2007. From molecular biology to targeted therapies

for hepatocellular carcinoma: the future is now. Oncology, 72 (Suppl 1):30-

44.

PARKIN, D.M., BRAY, F., FERLAY, J. and PISANI, P., 2005. Global cancer

statistics, 2002. C.A. Cancer J. Clin.55:74–108.

RAJKUMAR, T., SOUMITTRA, N., NANCY, N. K., SWAMINATHAN, R.,

SRIDEVI, V. and SHANTA, V., 2003. BRCA1, BRCA2 and CHEK2 (1100

del C) germline mutations in hereditary breast and ovarian cancer families in

South India. Asian Pac. J. Cancer Prev., 4(3):203-208.

RASHID, M. U., JAKUBOWSKA, A., JUSTENHOVEN, C., HARTH, V., PESCH,

B., BAISCH, C., PIERL, C. B., BRÜNING, T., KO, Y., BENNER, A.,

WICHMANN, H. E., BRAUCH, H., HAMANN, U. and GENICA

NETWORK, 2005. German populations with infrequent CHEK2*1100delC

and minor associations with early-onset and familial breast cancer. Eur. J.

Cancer, 41(18):2896-2903.

ROCK, C.L., 1998. Nutritional factors in cancer prevention. Hematol. Oncol. Clin.

North Am. 12(5):975-91.

ROTMAN, G. and SHILOH, Y., 1997. The ATM gene and protein:possible roles in

genome surveillance, checkpoint controls and cellular defence against

oxidative stres. Cancer Surv., 29:285–304.

RUDD, M. F., SELLICK, G. S., WEBB, E. L., CATOVSKY, D. and HOULSTON,

R. S., 2006. Variants in the ATM-BRCA2-CHEK2 axis predispose to chronic

lymphocytic leukemia. Blood, 108(2):638-644.

156

RUIJS, M. W., BROEKS, A., MENKO, F. H., AUSEMS, M. G., WAGNER, A.,

OLDENBURG, R., MEIJERS-HEIJBOER, H., VAN'T VEER, L. J. and

VERHOEF, S., 2009. The contribution of CHEK2 to the TP53-negative Li-

Fraumeni phenotype. Hered. Cancer Clin. Pract., 7(1):4.

SÁNCHEZ DE ABAJO, A., DE LA HOYA, M., GODINO, J., FURIÓ, V., TOSAR,

A., PÉREZ-SEGURA, P., DIAZ-RUBIO, E. and CALDÉS, T., 2005. The

CHEK2 1100delC allele is not relevant for risk assessment in HNPCC and

HBCC Spanish families. Fam. Cancer, 4(2):183-186.

SCHMIDT, M. K., TOLLENAAR, R. A., DE KEMP, S. R., BROEKS, A.,

CORNELISSE, C. J., SMIT, V. T., PETERSE, J. L., VAN LEEUWEN, F. E.,

VAN'T VEER, L. J., 2007. Breast cancer survival and tumor characteristics in

premenopausal women carrying the CHEK2*1100delC germline mutation. J.

SCHUTTE, K., BORNSCHEIN, J. and MALFERTHEINER P., 2009. Hepatocellular

carcinoma--epidemiological trends and risk factors. Dig. Dis., 27(2):80-92.

SCHUTTE, M., SEAL, S., BARFOOT, R., MEIJERS-HEIJBOER, H.,

WASIELEWSKI, M., EVANS, D. G., ECCLES, D., MEIJERS, C.,

LOHMAN, F., KLIJN, J., VAN DEN OUWELAND, A., FUTREAL, P. A.,

NATHANSON, K. L., WEBER, B. L., EASTON, D. F., STRATTON, M. R.,

RAHMAN, N. and BREAST CANCER LINKAGE CONSORTIUM, 2003.

Variants in CHEK2 other than 1100delC do not make a major contribution to

breast cancer susceptibility. Am. J. Hum. Genet., 72(4):1023-1028.

SCHWARZ, J. K., LOVLY, C. M. and PIWNICA-WORMS, H., 2003. Regulation of

the Chk2 protein kinase by oligomerization-mediated cis- and trans-

phosphorylation. Mol. Cancer. Res., 1:598–609. Clin. Oncol., 25(1):64-69.

SCOTT, C.R., 2006. The genetic tyrosinemias. Am. J. Med. Genet. C. Semin. Med.

Genet., 142C:121–126.

SELLICK, G. S., SULLIVAN, K., CATOVSKY, D. and HOULSTON, R. S., 2006.

CHEK2*1100delC and risk of chronic lymphocytic leukemia. Leuk.

Lymphoma. 47(12):2659-2660.

SEPPÄLÄ, E. H., IKONEN, T., MONONEN, N., AUTIO, V., RÖKMAN, A.,

MATIKAINEN, M. P., TAMMELA, T. L. and SCHLEUTKER, J., 2003.

157

CHEK2 variants associate with hereditary prostate cancer. Br. J. Cancer,

89(10):1966-1970.

SIDDIQUI, R., ONEL, K., FACIO, F., NAFA, K., DIAZ, L. R., KAUFF, N.,

HUANG, H., ROBSON, M., ELLIS, N. and OFFIT, K., 2005. The TP53

mutational spectrum and frequency of CHEK2*1100delC in Li-Fraumeni-like

kindreds. Fam. Cancer, 4(2):177-81.

SKASKO, E., KLUSKA, A., NIWIŃSKA, A., KWIATKOWSKA, E., BAŁABAS,

A., PIATKOWSKA, M., DABROWSKA, M., NOWAKOWSKA, D. and

PIEŃKOWSKI, T., 2009. Age at onset of bilateral breast cancer, the presence

of hereditary BRCA1, BRCA2, CHEK2 gene mutations and positive family

history of cancer. Onkologie, 32(4):182-188.

SODHA, N., BULLOCK, S., TAYLOR, R., MITCHELL, G., GUERTL-LACKNER,

B., WILLIAMS, R. D., BEVAN, S., BISHOP, K., MCGUIRE, S.,

HOULSTON, R. S. and EELES, R. A., 2002. CHEK2 variants in

susceptibility to breast cancer and evidence of retention of the wild type allele

in tumours. Br. J. Cancer, 87(12):1445-1448.

SODHA, N., WILSON, C., BULLOCK, S. L., PHILLIMORE, H., HOULSTON, R.

S. and EELES, R. A., 2004. Analysis of familial male breast cancer for

germline mutations in CHEK2. Cancer Lett., 215(2):187-189.

SOKOLENKO, A. P., ROZANOV, M. E., MITIUSHKINA, N. V., SHERINA, N.

Y., IYEVLEVA, A. G., CHEKMARIOVA, E. V., BUSLOV, K. G.,

SHILOV, E. S., TOGO, A. V., BIT-SAVA, E. M., VOSKRESENSKIY, D.

A., CHAGUNAVA, O. L., DEVILEE, P., CORNELISSE, C.,

SEMIGLAZOV, V. F. and IMYANITOV, E. N., 2007. Founder mutations in

early-onset, familial and bilateral breast cancer patients from Russia. Fam.

Cancer, 6(3):281-286.

SOREIDE, K., JANSSEN, E.A., SOILAND, H., KORNER, H. and BAAK, J.P.,

2006. Microsatellite instability in colorectal cancer. Br. J. Surg., 93(4):395-

406.

158

SUCHY, J., CYBULSKI, C., WOKOŁORCZYK, D., OSZUREK, O., GÓRSKI, B.,

DĘBNIAK, T., JAKUBOWSKA, A., GRONWALD, J., HUZARSKI, T.,

BYRSKI, T., DZIUBA, I., GOGACZ, M., WIŚNIOWSKI, R., WANDZEL,

P., BANASZKIEWICZ, Z., KURZAWSKI, G., KŁADNY, J., NAROD, S.

A. and LUBIŃSKI, J., 2009. CHEK2 mutations and HNPCC - related

colorectal cancer. Int. J. Cancer, doi: 10.1002/ijc.25003 .

SUSPITSIN, E. N., SHERINA, N. Y., PONOMARIOVA, D. N., SOKOLENKO, A.

P., IYEVLEVA, A. G., GORODNOVA, T. V., ZAITSEVA, O. A.,

YATSUK, O. S., TOGO, A. V., TKACHENKO, N. N., SHIYANOV, G. A.,

LOBEIKO, O. S., KRYLOVA, N. Y., MATSKO, D. E., MAXIMOV, S. Y.,

URMANCHEYEVA, A. F., PORHANOVA, N. V. and IMYANITOV, E. N.,

2009. High frequency of BRCA1, but not CHEK2 or NBS1 (NBN), founder

mutations in Russian ovarian cancer patients. Hered. Cancer Clin. Pract.

7(1):5.

SYRJÄKOSKI, K., KUUKASJÄRVI, T., AUVINEN, A. and KALLIONIEMI, O.

P., 2004. CHEK2 1100delC is not a risk factor for male breast cancer

population. Int. J. Cancer, 108(3):475-476.

SZYMANSKA-PASTERNAK, J., SZYMANSKA, A., MEDREK, K.,

IMYANITOV, E. N., CYBULSKI, C., GORSKI, B., MAGNOWSKI, P.,

DZIUBA, I., GUGALA, K., DEBNIAK, B., GOZDZ, S., SOKOLENKO, A.

P., KRYLOVA N. Y., LOBEIKO, O. S., NAROD, S. A. and LUBINSKI, J.,

2006. CHEK2 variants predispose to benign, borderline and low-grade

invasive ovarian tumors. Gynecol. Oncol., 102(3):429-431.

TAN, Y., RAYCHAUDHURI, P. and COSTA, R. H., 2007. Chk2 mediates

stabilization of the FoxM1 transcription factor to stimulate expression of

DNA repair genes. Mol. Cell Biol., 27:1007–1016.

THIRTHAGIRI, E., CHEONG, L. S., YIP, C. H. and TEO, S. H., 2009.

CHEK2*1100delC does not contribute to risk to breast cancer among Malay,

Chinese and Indians in Malaysia. Fam. Cancer, 8(4):355-358.

THOMPSON, D., SEAL, S., SCHUTTE, M., McGUFFOG, L., BARFOOT, R.,

RENWICK, A., EELES, R., SODHA, N., HOULSTON, R., SHANLEY, S.,

159

KLIJN, J., WASIELEWSKI, M., CHANG-CLAUDE, J., FUTREAL, P. A.,

WEBER, B. L., NATHANSON, K. L., STRATTON, M., MEIJERS-

HEIJBOER, H., RAHMAN, N. and EASTON, D. F., 2006. A multicenter

study of cancer incidence in CHEK2 1100delC mutation carriers. Cancer

Epidemiol. Biomarkers Prev., 15(12):2542-2545.

THOMPSON, L. H. and SCHILD, D., 2002. Recombinational DNA repair and

human disease. Mutat Res., 509:49–78.

VAHTERISTO, P., BARTKOVA, J., EEROLA, H., SYRJÄKOSKI, K., OJALA, S.,

KILPIVAARA, O., TAMMINEN, A., KONONEN, J., AITTOMÄKI, K.,

HEIKKILÄ, P., HOLLI, K., BLOMQVIST, C., BARTEK, J.,

KALLIONIEMI, O. P. and NEVANLINNA, H., 2002. A CHEK2 genetic

variant contributing to a substantial fraction of familial breast cancer. Am. J.

Hum. Genet., 71(2):432-438.

VOGELSTEIN, B., FEARON, E.R., HAMILTON, S.R., KERN, S.E.,

PREISINGER, A.C., LEPPERT, M., NAKAMURA, Y., WHITE, R., SMITS,

A.M. and BOS, J.L., 1988. Genetic alterations during colorectal-tumor

development. N. Engl. J. Med., 319(9):525-32.

WANG, H. C., CHOU, W. C., SHIEH, S. Y. and SHEN, C. Y., 2006a. Ataxia

telangiectasia mutated and checkpoint kinase 2 regulate BRCA1 to promote

the fidelity of DNA endjoining. Cancer Res., 66:1391–1400.

WANG, H. C., CHOU, W. C., SHIEH, S. Y. and SHEN, C. Y., 2006b. Checkpoint

kinase 2-mediated phosphorylation of BRCA1 regulates the fidelity of

nonhomologous end-joining. Cancer Res., 66:1401–1408.

WEISCHER, M., BOJESEN, S. E., TYBJAERG-HANSEN, A., AXELSSON, C. K.

and NORDESTGAARD, B. G., 2007. Increased risk of breast cancer

associated with CHEK2*1100delC. J. Clin. Oncol., 25(1):57-63.

WEISCHER, M., BOJESEN, S. E., ELLERVIK, C., TYBJAERG-HANSEN, A. and

NORDESTGAARD, B. G., 2008. CHEK2*1100delC genotyping for clinical

assessment of breast cancer risk: meta-analyses of 26000 patient cases and

27000 controls. J. Clin. Oncol., 26(4):542-548.

160

WU, X., WEBSTER, S. R. and CHEN, J., 2001. Characterization of tumor-

associated Chk2 mutations. J. Biol. Chem., 276:2971–2974.

YAM, J.W., WONG, C.M. and NG, I.O., 2010. Molecular and functional genetics of

hepatocellular carcinoma. Front. Biosci. (Schol Ed)., 2:117-34.

ZHANG, J., WILLERS, H., FENG, Z., GHOSH, J. C., KIM, S., WEAVER, D. T.,

CHUNG, J. H., POWELL, S. N. and XIA, F., 2004. Chk2 phosphorylation of

BRCA1 regulates DNA double-strand break repair. Mol. Cell Biol., 24:708–

718.

ZHANG, S., PHELAN, C. M., ZHANG, P., ROUSSEAU, F., GHADIRIAN, P.,

ROBIDOUX, A., FOULKES, W., HAMEL, N., McCREADY, D.,

TRUDEAU, M., LYNCH, H., HORSMAN, D., DE MATSUDA, M. L.,

AZIZ, Z., GOMES, M., COSTA, M. M., LIEDE, A., POLL, A., SUN, P. and

NAROD, S. A., 2008 Frequency of the CHEK2 1100delC mutation among

women with breast cancer: an international study. Cancer Res., 68(7):2154-

2157.

ZHOU, B. B. and ELLEDGE, S. J., 2000. The DNA damage response: putting

checkpoints in perspective. Nature, 408:433–439.

ZHOU, B. B., ANDERSON, H. J. and ROBERGE, M., 2003. Targeting DNA

checkpoint kinases in cancer therapy. Cancer Biol. Ther. 2:S16–S22.

ZŁOWOCKA, E., CYBULSKI, C., GÓRSKI, B., DEBNIAK, T., SŁOJEWSKI, M.,

WOKOŁORCZYK, D., SERRANO-FERNÁNDEZ, P., MATYJASIK, J.,

VAN DE WETERING, T., SIKORSKI, A., SCOTT, R. J. and LUBIŃSKI, J.,

2008. Germline mutations in the CHEK2 kinase gene are associated with an

increased risk of bladder cancer. Int. J. Cancer, 122(3):583-586.

161

ÖZGEÇMİŞ

1981 yılında Adana’da doğdu. İlk, orta, lise eğitimini bu ilde tamamladı. 1999

yılında Çukurova Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümünde

öğrenimine başladı ve 2003 yılında Biyolog ünvanıyla mezun oldu. Aynı yıl

Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı’nda yüksek

lisans öğrenimine başladı. 2005 yılında “Lamivudin’in İnsan Periferal

Lenfositlerinde In Vitro Genotoksik Etkileri” adlı Yüksek Lisans tezini tamamladı.

2006 yılında Çukurova Üniversitesi. Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim

Dalında doktora öğrenimine ve araştırma görevlisi olarak çalışmaya başladı.

13.09.2004 tarihinden itibaren Ç. Ü. Tıp Fakültesi İç Hastalıkları Anabilim Dalı,

Gastroenteroloji Bilim Dalının Moleküler Biyoloji ve Genetik laboratuvarında

araştırıcı olarak çalışmaktadır.

ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA … · tiplerinde DNA hasarı yanıtına katılır. Bu yüzden farklı kanser türlerine yatkınlığın belirlenmesi

Documents