UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK KLOROFORM DAUN PACAR AIR (Impatiens balsamina L.) TERHADAP KULTUR SEL HeLa SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi Oleh: Lise Natalia NIM : 058114079 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2009
80
Embed
UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK KLOROFORM DAUN PACAR AIR · Ekstrak Kloroform Daun Pacar Air (Impatiens balsamina L.) terhadap Kultur Sel HeLa”. Skripsi ini dibuat untuk memenuhi salah
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK KLOROFORM DAUN PACAR AIR
(Impatiens balsamina L.) TERHADAP KULTUR SEL HeLa
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu SyaratMemperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Lise Natalia
NIM : 058114079
FAKULTAS FARMASIUNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA2009
ii
UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK KLOROFORM DAUN PACAR AIR
(Impatiens balsamina L .) TERHADAP KULTUR SEL HeLa
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu SyaratMemperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Lise Natalia
NIM : 058114079
FAKULTAS FARMASIUNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA2009
iii
iv
v
HALAMAN PERSEMBAHAN
“If you can imagine it, you can achieve it. If you can dream it,
you can become it."
- William Arthur Ward -
Kupersembahkan karya ini untuk
Papa dan mamaku tercinta, atas kasih sayang, doa dan dukungan
yang terus menyertaiku.
Adik-adikku terkasih, Victor dan Vera
Teman-teman dan Almamaterku
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUANPUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS
Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma :
Nama : Lise Natalia
Nomor Mahasiswa : 058114079
Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada PerpustakaanUniversitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul :
“Uji Sitotoksisitas Ekstrak Kloroform Daun Pacar Air (Impatiens balsaminaL.) terhadap Kultur Sel HeLa”
beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikankepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, me-ngalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data,mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau medialain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupunmemberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagaipenulis.
Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya.
Dibuat di Yogyakarta
Pada tanggal : 1 Juni 2009
Yang menyatakan,
(Lise Natalia)
vi
PRAKATA
Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala anugerah-Nya
sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul “Uji Sitotoksisitas
Ekstrak Kloroform Daun Pacar Air (Impatiens balsamina L.) terhadap Kultur Sel
HeLa”. Skripsi ini dibuat untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar
Sarjana Farmasi (S.Farm.) pada Program Studi Farmasi di Universitas Sanata
Dharma.
Penulisan skripsi ini tidak mungkin terselesaikan tanpa adanya bimbingan,
bantuan dan dukungan dari berbagai pihak, maka pada kesempatan ini, penulis
mengucapkan terima kasih kepada:
1. Rita Suhadi, M.Si., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma yang telah banyak meluangkan waktu, tenaga dan atas segala
masukan serta sarannya dalam penyusunan skripsi ini.
2. Drs. A. Yuswanto S.U., Ph.D., Apt., selaku dosen pembimbing yang telah
banyak meluangkan waktu, tenaga dan atas segala masukan serta sarannya
dalam penyusunan skripsi ini.
3. Drs. Mulyono, Apt., selaku dosen penguji yang telah berkenan menguji dan
memberikan banyak masukan dan saran.
4. Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku dosen penguji yang telah berkenan
menguji dan memberikan banyak masukan dan saran.
vii
5. Ign. Y Kristyo B, M.Si., yang telah memberikan banyak masukan dalam
identifikasi dan determinasi tumbuhan.
6. Drs. P. Sunu Hardiyanta, S.G., M.Sc., yang telah memberikan masukan dan
saran dalam pengolahan statistik.
7. Segenap dosen dan karyawan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma,
terima kasih atas bantuannya selama ini.
8. Kepala Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu UGM atas ijin yang
diberikan untuk melakukan penelitian skripsi ini.
9. Mbak Yuli dan segenap karyawan Laboratorium Penelitian dan Pengujian
Terpadu UGM yang telah banyak membantu dalam penelitian skripsi ini.
10. Orang tua dan adik-adikku tercinta, atas segala dukungan dan doa yang selalu
menyertaiku.
11. Suharso, atas segala dukungan dan kasih sayang yang diberikan selama
penyusunan skripsi ini.
12. Anni dan Dhita, atas kerjasama, canda tawa dan keluh kesah selama
penyusunan skripsi ini.
13. Limdrawati dan Meri, terima kasih atas segala semangat dan bantuan yang
diberikan selama penyusunan skripsi ini.
14. Semua pihak yang telah banyak membantu penyusunan skripsi ini.
Atas segala bantuan yang telah diberikan selama ini, penulis mengucapkan
banyak terima kasih. Penulis juga menyadari bahwa penulisan skripsi ini tidak
terlepas dari kekurangan-kekurangan. Oleh karena itu, penulis mengharapkan
viii
kritik dan saran yang bersifat konstruktif demi penyempurnaan skripsi ini. Skripsi
ini diharapkan dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan.
Penulis
ix
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA
Saya menyatakan bahwa sesungguhnya skripsi yang saya tulis ini tidak memuat
karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan
dan daftar pustaka, sebagai layaknya karya ilmiah.
Yogyakarta, 13 Mei 2009
Penulis,
Lise Natalia
x
INTISARI
Pengobatan tradisional menggunakan tanaman obat di masyarakat sudahcukup luas. Tanaman Pacar air (Impatiens balsamina) secara empiris dapatdigunakan untuk mengobati berbagai penyakit, antara lain kanker. Penelitian inibertujuan untuk mengetahui apakah ekstrak kloroform daun pacar air memilikiefek sitotoksik terhadap sel HeLa.
Penelitian ini adalah penelitian eksperimental murni dengan rancanganacak pola satu arah. Uji sitotoksisitas dilakukan pada kultur sel HeLa dan sel Veromenggunakan metode direct counting dengan perwarna trypan blue. Data yangdiperoleh berupa persen kematian kultur sel HeLa dan sel Vero. Efeksitotoksisitas ekstrak kloroform daun pacar air terhadap kultur sel HeLa dan Verodianalisis secara statistik dengan uji z dan harga LC50 akan dihitung dengananalisis probit.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak kloroform daun pacar airmemiliki efek sitotoksik terhadap kultur sel HeLa dan sel Vero. Harga LC50ekstrak klroform daun pacar air terhadap kultur sel HeLa sebesar 53,7 µg/ml dansel Vero sebesar 275,4 µg/ml.
Kata kunci : daun pacar air, sel HeLa, sitotoksisitas, LC50
xi
ABSTRACT
Traditional medication using herbs is widely spreaded in society.Impatiens balsamina herbs can be used to cure many kinds of diseases, one ofthem is cancer. This research is aimed to determine whether the chloroformextract of Impatiens balsamina leaves have cytotoxic effect to HeLa cell cultures.
The study is a pure experimental research with random complete and oneway design. The cytotoxicity assay is tested to HeLa and Vero cell cultures usingdirect counting method with trypan blue stained. The data obtained were deathpercentage of HeLa and Vero cell cultures. The cytotoxicity effect of thechloroform extract of Impatiens balsamina leaves to HeLa cell cultures areanalyzed using z-test and the LC50 values are analyzed using probit.
The result shows that chloroform extract of Impatiens balsamina leaveshave a cytotoxic effect to HeLa and Vero cell cultures. The LC50 value ofchloroform extract of Impatiens balsamina leaves to HeLa cell cultures is 53,7µg/ml and Vero cell culture is 275,4 µg/ml.
Keywords : Impatiens balsamina leaves, HeLa cell cultures, cytotoxicity, LC50
xii
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ..................................................................................... ii
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .......................................... iii
HALAMAN PENGESAHAN ...................................................................... iv
HALAMAN PERSEMBAHAN .................................................................. v
PRAKATA ................................................................................................... vi
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ....................................................... ix
INTISARI ..................................................................................................... x
ABSTRACT ................................................................................................... xi
DAFTAR ISI ................................................................................................ xii
DAFTAR TABEL ........................................................................................ xvi
DAFTAR GAMBAR ................................................................................... xviii
DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................ xx
BAB I PENGANTAR ................................................................................. 1
A. Latar Belakang ........................................................................................ 1
1. Rumusan masalah .......................................................................... 2
g/ml dan 100 g/ml. Untuk kontrol, digunakan 100 μl suspensi sel dan
ditambahkan medium. Selanjutnya plate diinkubasikan selama 24 jam pada suhu
37oC, dalam incubator dengan aliran 5% CO2 (Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan,
1979). Pada akhir masa inkubasi, tiap sumuran sel diresuspensi, kemudian
ditambahkan 100 l trypan blue. Pipet 10 μl tiap sumuran dan masukkan dalam
haemocytometer. Hitung jumlah sel hidup dan mati pada tiap konsentrasi dan
kontrol di bawah mikroskop. Sel yang hidup akan tampak relatif bulat transparan.
Sedangkan sel yang mati akan tampak gelap dan tidak cemerlang (Doyle and
Griffiths, 2000).
17
E. Analisis Hasil
Analisis hasil dilakukan dengan perhitungan persentase kematian sel
dengan rumus :
% kematian =A
BA )( x 100%
Keterangan:
A : jumlah sel yang hidup pada sumuran kontrol media
B : jumlah sel yang hidup pada sumuran yang telah diberi perlakuan ekstrak
kloroform daun pacar air
Untuk menghitung harga LC50 dilakukan perhitungan menggunakan
analisis probit sedangkan untuk menganalisis signifikansi antara perlakuan dan
kontrol dilakukan pengolahan data statistik uji z. Untuk menganalisis signifikansi
antara LC50 sel HeLa dan sel Vero digunakan analisis statistik uji t sampel
independen.
18
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Determinasi Tanaman
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian adalah daun pacar air.
Untuk memastikan identitas tanaman uji dan menghindari terjadinya kesalahan
dalam pengambilan tanaman uji maka dilakukan determinasi tanaman.
Determinasi dilakukan dengan mencocokkan tanaman dengan kunci determinasi
(Backer dan Brink, 1965).
Determinasi dilakukan di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia, Fakultas
Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Hasil determinasi menyatakan
bahwa tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah benar Impatiens
balsamina (Lampiran 7).
B. Pengumpulan Daun Pacar Air
Daun pacar air yang digunakan diambil dari tanaman pacar air yang
tumbuh di daerah Tajem, Sleman pada bulan Agustus 2008. Daun pacar air yang
akan digunakan perlu dicuci dengan air mengalir untuk membersihkan kotoran
dan debu yang menempel pada permukaan daun.
Pembuatan simplisia daun pacar air dilakukan dengan pengeringan
menggunakan oven pada suhu 450C selama 12 jam. Pengeringan dilakukan untuk
mencegah kerusakan simplisia karena air merupakan media pertumbuhan kapang
dan mikroorganisme lain. Daun yang sudah kering kemudian diserbuk
menggunakan mesin sehingga menghasilkan serbuk dengan ukuran 65 mesh. Hal
19
ini bertujuan untuk memperkecil ukuran partikel sehingga memperluas area
kontak daun terhadap pelarut pada proses ekstraksi.
C. Ekstraksi
Bahan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstrak kloroform
daun pacar air. Ekstraksi dilakukan secara maserasi dengan larutan penyari
klorofom. Pada metode ini sampel direndam dalam larutan penyari pada suhu
ruangan. Perendaman menyebabkan cairan penyari menembus dinding sel
sehingga dapat melarutkan zat aktif. Adanya perbedaan konsentrasi antara larutan
zat aktif di dalam sel dengan yang ada di luar sel menyebabkan zat aktif yang ada
di dalam sel akan terdesak ke luar sel. Peristiwa ini akan terjadi terus menerus
hingga terjadi keseimbangan antara konsentrasi larutan di dalam sel dan luar sel.
Pemilihan larutan penyari dilakukan berdasarkan kelarutan dari senyawa
aktif yang diinginkan. Dalam penelitian ini, senyawa yang akan diuji adalah
naftokuinon dimana senyawa tersebut larut dalam kloroform, sehingga larutan
penyari yang digunakan adalah kloroform. Metode maserasi tidak menggunakan
panas sehingga zat aktif yang termolabil tidak rusak.
D. Pembuatan Medium Pencuci dan Medium Penumbuh
Dalam penelitian digunakan 2 macam medium yaitu : medium pencuci dan
medium penumbuh. Medium pencuci untuk sel HeLa adalah RPMI-1640
ditambah HEPES dan natrium bikarbonat.
Medium penumbuh mengandung RPMI-1640, natrium bikarbonat,
HEPES, FBS (Foetal Bovine Serum) 10%, penisilin-streptomisin 0,5%, dan
fungison 0,5%. Dalam media ini, FBS digunakan sebagai suplemen pertumbuhan
20
karena mampu mendukung nutrisi pertumbuhan pada kultur sel HeLa. Medium
pencuci dan penumbuh untuk sel Vero juga sama, namun yang berbeda adalah
mediumnya yaitu M199.
Dalam medium, kombinasi antibiotik penisilin-streptomisin digunakan
untuk menghindari kontaminan bakteri, baik gram positif maupun negatif. Selain
itu, fungison dalam medium digunakan untuk menjaga agar medium bebas dari
kontaminan jamur. Medium kultur yang digunakan harus bebas dari kontaminan
agar pertumbuhan kultur sel tidak terhambat akibat adanya persaingan
mendapatkan nutrisi.
E. Propagasi dan Panen Sel HeLa
Sel HeLa yang akan digunakan disimpan dan dibekukan dalam tangki
nitrogen cair agar kondisi sel tetap normal. Medium sel juga harus diganti secara
rutin. Medium diganti pada saat medium yang berwarna merah berubah menjadi
oranye hingga kuning.
Sel HeLa dipanen pada saat konfluen dan jumlahnya telah mencukupi
untuk digunakan dalam penelitian. Sel HeLa diresuspensikan dengan medium dan
medium dibuang. Setelah itu, sel diberi tripsin agar terlepas dari dinding flask dan
disentrifugasi, supernatan dibuang. Sel yang diperoleh, dihitung jumlahnya
menggunakan haemocytometer.
F. Propagasi dan Panen Sel Vero
Untuk.mengetahui efek sitotoksik pada sel normal, dalam penelitian juga
digunakan sel Vero sebagai model sel normal. Propagasi dan panen sel Vero
21
menggunakan langkah yang sama dengan sel HeLa, namun yang berbeda adalah
mediumnya. Medium untuk sel Vero adalah M199.
G. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Kloroform Daun Pacar Air
Uji sitotoksisitas dilakukan untuk mengetahui potensi ketoksikan ekstrak
kloroform daun pacar air terhadap kultur sel HeLa. Hasil dari uji sitotoksisitas
dapat digunakan untuk menentukan LC50, yaitu konsentrasi ekstrak kloroform
daun pacar air yang mampu mematikan 50% populasi kultur sel HeLa.
Uji sitotoksisitas dilakukan menggunakan metode perhitungan langsung
dengan haemocytometer. Dalam metode ini pengamatan dilakukan langsung di
bawah mikroskop. Untuk membedakan sel mati dan hidup maka sel akan diberi
pewarna trypan blue dimana trypan blue masuk ke membran sel yang mati
sehingga sel yang mati akan tampak lebih gelap sedangkan sel yang hidup relatif
bulat dan transparan (gambar 1).
Sebelum sel diberi trypan blue, terlebih dahulu dilakukan pengamatan
morfologi sel di bawah mikroskop. Sel yang hidup akan tampak bulat, bening,
cemerlang dan sel yang melekat di sumuran berbentuk lonjong. Sel yang mati
berubah bentuk, tepinya tidak rata dan keruh (gambar 2).
22
i
ii
Gambar 1. Kultur sel HeLa di haemocytometer setelah diberi trypan blue Ket. : i = sel HeLahidup dan ii = sel HeLa mati
i
i
ii
A B
Gambar 2. Kultur sel HeLa di sumuran (perbesaran 100x). A : sel HeLa tanpa perlakuan(kontrol), B : sel HeLa diberi ekstrak kloroform daun pacar air konsentrasi 100 µg/ml
Ket. i = sel hidup dan ii = sel mati
i ii
i
A B
Gambar 3. Kultur sel Vero di sumuran (perbesaran 100x). A : sel Vero tanpa perlakuan(kontrol), B : sel Vero diberi ekstrak kloroform daun pacar air konsentrasi 100 µg/ml
Ket. i = sel hidup dan ii = sel mati
23
Tabel I. Jumlah Sel yang Hidup dari Tiap Sumuran pada Berbagai TingkatKonsentrasi Ekstrak klroform daun pacar air dengan Metode Direct Counting
KonsentrasiReplikasi
I II III
kontrol 39000 39000 39000
200 µg/ml 4000 4000 4000
175 µg/ml 7500 7500 7500
150 µg/ml 10000 10500 10500
125 µg/ml 12500 12500 12500
100 µg/ml 15500 15000 15500
75 µg/ml 18500 18000 18500
50 µg/ml 21000 21500 21500
25 µg/ml 24000 24500 24000
Dari hasil yang diperoleh (tabel I), maka dapat dihitung persentase kematian sel
HeLa dengan pengurangan jumlah sel HeLa hidup pada kelompok kontrol dengan
jumlah sel HeLa hidup pada kelompok perlakuan dibagi jumlah sel HeLa hidup
pada kelompok kontrol. Persentase kematian sel HeLa semakin meningkat dengan
meningkatnya konsentrasi ekstrak kloroform daun pacar air (gambar 4).
Tabel II. % kematian sel HeLa pada berbagai konsentrasi ekstrak kloroform daunpacar air
Konsentrasi % kematian sel HeLaReplikasi I Replikasi II Replikasi III
Gambar 4. Grafik konsentrasi ekstrak kloroform daun pacar air (µg/ml) terhadap %kematian sel HeLa
Dalam penelitian ini digunakan kontrol normal yaitu sel HeLa
ditumbuhkan dalam medium tanpa diberi perlakuan. Kontrol normal digunakan
dengan tujuan untuk mengetahui efek sitotoksik ekstrak kloroform daun pacar air
terhadap sel HeLa. Analisis dilakukan dengan membandingkan jumlah sel hidup
dan mati pada kelompok kontrol terhadap kelompok perlakuan, apakah terdapat
perbedaan yang signifikan atau tidak. Hasil penelitian dianalisis secara statistik
dengan uji z yang dihitung secara manual.
Analisis menggunakan uji z dengan α = 0,05 memperoleh hasil
perhitungan yang menunjukkan z hitung > z tabel sehingga H0 ditolak. Jadi, hasil
perhitungan menunjukkan terdapat perbedaan yang signifikan antara jumlah sel
hidup kelompok kontrol dan perlakuan (Lampiran 5). Dengan demikian dapat
dikatakan bahwa sel yang mati merupakan akibat dari perlakuan yang diberikan
dalam penelitian ini yaitu pemberian ekstrak kloroform daun pacar air ke sel.
0
20
40
60
80
100
0 25 50 75 100 125 150 175 200
%ke
mat
ian
selH
eLa
konsentrasi ekstrak kloroform daun pacar air (ug/ml)
replikasi Ireplikasi IIreplikasi III
25
Untuk memperoleh LC50 ekstrak kloroform daun pacar air terhadap sel
HeLa, maka dilakukan analisis probit. Analisis probit merupakan analisis regresi
antara log konsentrasi dengan harga probit. Pada analisis regresi perlu dilakukan
uji linearitas (Lampiran 4). Hasil uji linearitas menunjukkan r hitung > r tabel
yaitu grafik replikasi I linier terhadap persamaan garis y = 1,61x + 2,22 (gambar
5) yaitu grafik replikasi II linier terhadap persamaan garis y = 1,63x + 2,18
(gambar 6) dan grafik replikasi III linier terhadap persamaan y = 1,61x + 2,21
(gambar 7)
Gambar 5. Grafik log konsentrasi terhadap harga probit pada replikasi I
Gambar 6. Grafik log konsentrasi terhadap harga probit pada replikasi II
0
2
4
6
8
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
Har
gapr
obit
Log konsentrasi
grafik replikasi Iy = 1,61x + 2,22
0
2
4
6
8
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
Har
gapr
obit
Log konsentrasi
grafik replikasi IIy = 1,63x + 2,18
26
Gambar 7. Grafik log konsentrasi terhadap harga probit pada replikasi III
Perhitungan dengan analisis probit memperoleh LC50 ekstrak kloroform
daun pacar air terhadap sel HeLa sebesar 53,7 µg/ml dimana nilai LC50 tersebut >
20 µg/ml. Semakin kecil LC50 suatu senyawa maka semakin toksik senyawa
tersebut. Penelitian sitotoksisitas ekstrak kloroform daun pacar air juga dilakukan
terhadap kultur sel lain dengan nilai LC50 sebesar 52,5 µg/ml pada sel SiHa
(Adhitama, 2009) dan 33,9 µg/ml pada sel T47D (Anni, 2009).
Untuk mengetahui apakah ekstrak kloroform daun pacar air juga bersifat
sitotoksik terhadap sel normal, maka ekstrak tersebut juga diujikan pada sel Vero
sebagai sel normal.
0
2
4
6
8
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
Har
gapr
obit
Log konsentrasi
grafik replikasi IIIy = 1,61x + 2,21
27
Tabel III. Jumlah Sel Vero yang Hidup dari Tiap Sumuran pada Berbagai TingkatKonsentrasi ekstrak kloroform daun pacar air dengan Metode Direct Counting
Gambar 8. Grafik konsentrasi ekstrak kloroform daun pacar air (µg/ml) terhadap %kematian sel Vero
Potensi ketoksikan (LC50) sel Vero dapat diperoleh dengan menggunakan
analisis probit sehingga dapat dibandingkan dengan LC50 pada sel HeLa. Hasil
pengujian linearitas pada analisis probit sel Vero menunjukkan bahwa grafik
replikasi I linier terhadap persamaan garis y = 2,05x + 0,02 (gambar 9), grafik
replikasi II linier terhadap persamaan garis y = 2,01x + 0,10 (gambar 10) dan
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900
pers
enta
seke
mat
ian
selv
ero
(%)
konsentrasi ekstrak kloroform daun pacar air (ug/ml)
replikasi Ireplikasi IIreplikasi III
29
grafik replikasi III linier terhadap persamaan garis y = 2,02x + 0,08 (gambar 11).
Harga LC50 ekstrak kloroform daun pacar air terhadap kultur sel Vero adalah
275,4 µg/ml.
Gambar 9. Kurva log konsentrasi terhadap harga probit sel Vero pada replikasi I
Gambar 10. Kurva log konsentrasi terhadap harga probit sel Vero pada replikasi II
0
2
4
6
8
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
Har
gapr
obit
Log konsentrasi
grafik replikasi Iy = 2,05x + 0,02
0
2
4
6
8
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
Har
gapr
obit
Log konsentrasi
grafik replikasi IIy = 2,01x + 0,10
30
Gambar 11. Kurva log konsentrasi terhadap harga probit sel Vero pada replikasi III
Untuk mengetahui apakah terdapat perbedaan antara LC50 sel Vero dan
LC50 sel HeLa digunakan analisis statistik uji t sampel independen pada taraf
kepercayaan 95%. Hasil yang diperoleh dari uji t sampel independen
menunjukkan bahwa terdapat perbedaan bermakna antara LC50 sel Vero dan LC50
sel HeLa (lampiran 6). Oleh karena itu, ekstrak kloroform daun pacar air
memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai agen antikanker.
0
2
4
6
8
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
Har
gapr
obit
Log konsentrasi
grafik replikasi IIIy = 2,02x + 0,08
31
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
Dari data yang diperoleh dan analisis yang dilakukan, maka dapat
disimpulkan bahwa :
1. Ekstrak kloroform daun pacar air memiliki efek sitotoksik terhadap kultur sel
HeLa dan Vero.
2. Harga LC50 ekstrak kloroform daun pacar air terhadap kultur sel HeLa adalah
53,7 µg/ml dan 275,4 µg/ml terhadap kultur sel Vero sehingga esktrak ini
memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai agen anti kanker.
B. Saran
Dari hasil penelitian tersebut, maka disarankan :
1. Penelitian lebih lanjut mengenai efek sitotoksisitas fraksi dari ekstrak
kloroform daun pacar air terhadap sel HeLa.
2. Penelitian lebih lanjut mengenai mekanisme kematian sel HeLa oleh ekstrak
kloroform daun pacar air.
32
DAFTAR PUSTAKA
Adhitama, W., 2009, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Kloroform Daun Pacar Air(Impatiens balsamina L.) terhadap Kultur Sel SiHa, Skripsi, FakultasFarmasi USD, Yogyakarta
Anni, 2009, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Kloroform Daun Pacar Air (Impatiensbalsamina L.) terhadap Kultur Sel T47D, Skripsi, Fakultas Farmasi USD,Yogyakarta
Anonim, 1986, Sediaan Galenik, 10-16, Departemen Kesehatan RepubilikIndonesia, Jakarta
Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, edisi V, 7, Departemen KesehatanIndonesia, Jakarta
Anonim, 2000, Parameter Standart Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, cetakan 1,1-61 departemen kesehatan repubilik Indonesia, Jakarta
Anonim, 2007, 800.000 Orang Indonesia Terserang Kanker Tiap Tahun,http://www.suarapembaruan.com/News/2007/05/14/Utama/ut01.htm,diakses tanggal 1 Agustus 2008
Anonim, 2008a, Cancer, http://www.who.int/cancer/en/, diakses tanggal 1Agustus 2008
Anonim, 2008b, Angka Kematian Kanker Leher Rahim Masih Tinggi,http://www.indofamilyhealth.com/index2.php?option=com_content&do_pdf=1&id=518, diakses tanggal 20 Maret 2009
Anonim, 2008c, Cell Biology, http://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx?ATCCNum=CCL2&Template=cellBiology, diakses tanggal 28 Maret 2009
Anonim, 2008d, Cell Biology, http://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx?ATCCNum=CRL-10741&Template=cellBiology, diakses tanggal 10 Mei 2009
Arisandi, Y., dan Andriani, Y., 2006, Khasiat Berbagai Tanaman untukPengobatan, Eska media, Jakarta
Backer, C. A., dan Backuizen van den Brink, R. C., 1965, Flora of Java, VolumeI dan II, N. V. Noordhoff, Graningen
33
Balmer, C.M., Valley, A.W., Iannucci, A., 2005, Pharmacotherapy : APathophysiologic Approach, sixth edition, 2280, 2285-2286, McGraw-Hill, USA
Dolinsky, C., and Christine Hill-Kayser , 2008, Cervical Cancer: The Basics,http://www.oncolink.org/types/article.cfm?c=6&s=17&ss=129&id=8226,diakses tanggal 7 April 2009
Doyle, A., and Griffiths, J.B., 2000, Cell and Tissue Culture For MedicalResearh, 49, 155, John Willey and Sons Ltd, New York
Freshney, R.I., 1986, Animal Cell Culture A Practical Approach, second edition,71-73, IRL Press Ltd, Washington DC.
Freshney, R. I., 2000, Culture f Animal Cells : A Manual of Basic Technique, 14thEdition, 336-338, John Wiley and Sons Inc., New York
Jacoby, W.B., and Pastan, I.H., 1979, Methods in Enzymology Cell Culture,Volume VIII, Academia Press Inc, New York
King, R.J.B., 2000, Cancer Biology, 2nd edition, School of Biological Sciences,University of Surrey, England
Mardiana, L., 2008, Kanker pada Wanita : Seri Agrisehat, 18, Penebar Swadaya,Jakarta
Rahmawati, N., Katno dan Triyono, A., 2008, Uji Efek Sitotoksik EkstrakEtanolik Daun Bandotan (Ageratum conzoides L.) terhadap Sel HeLa,Jurnal Tumbuhan Obat Indonesia, Vol.1, No.1, 51
Thongnopnua, P., Jutima, B., Vilai, C., and Wallet, V., 1991, QuantitativeDetermination og 2-methoxy-1,4-naphthoquinone in Plasma by High-Performance Liquid Chromatography, http://www.journalarchive.jst.go.jp/jnlpdf.php?cdjournal=analsci1985&cdvol=7&noissue=Supple&startpage=1529&lang=en&from=jnlabstract, diakses tanggal 2 April 2009
34
Zhi-Shan, D.,Fu- Sheng, J., Ni-Pi C., and Cheng-Gang Z., 2008, Isolation andIdentification of an Anti-tumor Component from Leaves of Impatiensbalsamina, Molecules, 13; 220-229
35
Lampiran 1. Foto tanaman dan daun pacar air (Impatiens balsamina L.)
Gambar 12. Foto tanaman pacar air
Gambar 13. Daun pacar air
36
Lampiran 2. Perhitungan Jumlah kultur sel yang hidup
Tabel V. Data perhitungan jumlah kultur sel HeLa dengan perhitungan langsung
Konsentrasi
Replikasi
I II III
Hidup Mati Hidup Mati Hidup Mati
kontrol 78 0 78 0 78 0
200 µg/ml 8 31 8 33 8 33
175 µg/ml 15 29 15 29 15 29
150 µg/ml 20 27 21 27 21 27
125 µg/ml 25 25 25 25 25 25
100 µg/ml 31 22 30 22 31 22
75 µg/ml 37 19 36 19 37 19
50 µg/ml 42 16 43 15 43 15
25 µg/ml 48 11 49 11 48 11
37
Tabel VI . Data perhitungan jumlah kultur sel Vero dengan perhitungan langsung
Jumlah kultur sel yang hidup dan mati dari tiap sumuran dapat dihitung dengan
rumus :
Jumlah sel/sumuran =4x
x 10 x 200
Keterangan :
x = jumlah sel hasil perhitungan langsung pada haemocytometer
4 = jumlah bilik dalam haemocytometer
10 = jumlah volume yang masuk dalam bilik haemocytometer (10 µl)
200 = jumlah volume total (200 µl)
Konsentrasi
Replikasi
I II III
Hidup Mati Hidup Mati Hidup Mati
kontrol 74 0 74 0 74 0
800 µg/ml 3 38 4 37 4 37
700 µg/ml 16 31 17 30 16 29
600 µg/ml 24 24 24 24 24 24
500 µg/ml 28 21 28 21 29 20
400 µg/ml 33 18 34 18 34 18
300 µg/ml 40 16 40 16 40 16
200 µg/ml 46 13 46 12 46 13
100 µg/ml 53 10 54 10 54 9
38
Perhitungan jumlah sel HeLa yang hidup pada tiap sumuran
1. Kontrol
Replikasi I = 784 x 10 x 200 = 39000
Replikasi II = 784 x 10 x 200 = 39000
Replikasi III = 784 x 10 x 200 = 39000
2. Konsentrasi 200 µg/ml
Replikasi I = 84 x 10 x 200 = 4000
Replikasi II = 84 x 10 x 200 = 4000
Replikasi III = 84 x 10 x 200 = 4000
3. Konsentrasi 175 µg/ml
Replikasi I = 154 x 10 x 200 = 7500
Replikasi II = 154 x 10 x 200 = 7500
Replikasi III = 154 x 10 x 200 = 7500
4. Konsentrasi 150 µg/ml
Replikasi I = 204 x 10 x 200 = 10000
Replikasi II = 214 x 10 x 200 = 10500
Replikasi III = 214 x 10 x 200 = 10500
5. Konsentrasi 125 µg/ml
Replikasi I = 254 x 10 x 200 = 12500
Replikasi II = 254 x 10 x 200 = 12500
39
Replikasi III = 254 x 10 x 200 = 12500
6. Konsentrasi 100 µg/ml
Replikasi I = 314 x 10 x 200 = 15500
Replikasi II = 304 x 10 x 200 = 15000
Replikasi III = 314 x 10 x 200 = 15500
7. Konsentrasi 75 µg/ml
Replikasi I = 374 x 10 x 200 = 18500
Replikasi II = 364 x 10 x 200 = 18000
Replikasi III = 374 x 10 x 200 = 18500
8. Konsentrasi 50 µg/ml
Replikasi I = 424 x 10 x 200 = 21000
Replikasi II = 434 x 10 x 200 = 21500
Replikasi III = 434 x 10 x 200 = 21500
9. Konsentrasi 25 µg/ml
Replikasi I = 484 x 10 x 200 = 24000
Replikasi II = 494 x 10 x 200 = 24500
Replikasi III = 484 x 10 x 200 = 24000
40
Perhitungan jumlah sel Vero yang hidup pada tiap sumuran
1. Kontrol
Replikasi I = 744 x 10 x 200 = 37000
Replikasi II = 744 x 10 x 200 = 37000
Replikasi III = 744 x 10 x 200 = 37000
2. Konsentrasi 800 µg/ml
Replikasi I = 34 x 10 x 200 = 1500
Replikasi II = 44 x 10 x 200 = 2000
Replikasi III = 44 x 10 x 200 = 2000
3. Konsentrasi 700 µg/ml
Replikasi I = 164 x 10 x 200 = 8000
Replikasi II = 174 x 10 x 200 = 8500
Replikasi III = 164 x 10 x 200 = 8000
4. Konsentrasi 600 µg/ml
Replikasi I = 244 x 10 x 200 = 12000
Replikasi II = 244 x 10 x 200 = 12000
Replikasi III = 244 x 10 x 200 = 12000
5. Konsentrasi 500 µg/ml
Replikasi I = 284 x 10 x 200 = 14000
Replikasi II = 284 x 10 x 200 = 14000
41
Replikasi III = 294 x 10 x 200 = 14500
6. Konsentrasi 400 µg/ml
Replikasi I = 334 x 10 x 200 = 16500
Replikasi II = 344 x 10 x 200 = 17000
Replikasi III = 344 x 10 x 200 = 17000
7. Konsentrasi 300 µg/ml
Replikasi I = 404 x 10 x 200 = 20000
Replikasi II = 404 x 10 x 200 = 20000
Replikasi III = 404 x 10 x 200 = 20000
8. Konsentrasi 200 µg/ml
Replikasi I = 464 x 10 x 200 = 23000
Replikasi II = 464 x 10 x 200 = 23000
Replikasi III = 464 x 10 x 200 = 23000
9. Konsentrasi 100 µg/ml
Replikasi I = 534 x 10 x 200 = 26500
Replikasi II = 544 x 10 x 200 = 27000
Replikasi III = 544 x 10 x 200 = 27000
42
Lampiran 3. Perhitungan persentase kematian kultur sel HeLa dan sel Vero
Perhitungan % kematian pada sel HeLa dapat dihitung dengan rumus :
% kematian =A
BA )( x 100%
Keterangan:
A : jumlah sel HeLa yang hidup pada sumuran kontrol media
B : jumlah sel HeLa yang hidup pada sumuran yang telah diberi perlakuan ekstrak
kloroform daun pacar air
Perhitungan persentase kematian kultur sel HeLa
Replikasi I
Kadar 25 µg/ml = %10039000
2400039000 x = 38,46 %
Kadar 50 µg/ml = %10039000
2100039000 x = 46,15 %
Kadar 75 µg/ml = %10039000
1850039000x
= 52,56 %
Kadar 100 µg/ml = %10039000
1550039000x
= 60,26 %
Kadar 125 µg/ml = %10039000
1250039000x
= 67,95 %
Kadar 150µg/ml = %10039000
1000039000 x = 74,36 %
Kadar 175 µg/ml = %10039000
750039000 x = 80,77 %
Kadar 200 µg/ml = %10039000
400039000x
= 89,74%
43
Replikasi II
Kadar 25 µg/ml = %10039000
2450039000 x = 37,18 %
Kadar 50 µg/ml = %10039000
2150039000 x = 44,87 %
Kadar 75 µg/ml = %10039000
1800039000 x = 53,85 %
Kadar 100 µg/ml = %10039000
1500039000x
= 61,54 %
Kadar 125 µg/ml = %10039000
1250039000x
= 67,95 %
Kadar 150µg/ml = %10039000
1050039000 x = 73,08 %
Kadar 175 µg/ml = %10039000
750039000 x = 80,77 %
Kadar 200 µg/ml = %10039000
400039000x
= 89,74%
Replikasi III
Kadar 25 µg/ml = %10039000
2400039000 x = 38,46 %
Kadar 50 µg/ml = %10039000
2150039000 x = 44,87 %
Kadar 75 µg/ml = %10039000
1850039000x
= 52,56 %
Kadar 100 µg/ml = %10039000
1550039000x
= 60,26 %
Kadar 125 µg/ml = %10039000
1250039000x
= 67,95 %
44
Kadar 150µg/ml = %10039000
1050039000x
= 73,08 %
Kadar 175 µg/ml = %10039000
750039000x
= 80,77 %
Kadar 200 µg/ml = %10039000
400039000 x = 89,74%
Perhitungan persentase kematian kultur sel Vero
Replikasi I
Kadar 100 µg/ml = %10037000
2650037000 x = 28,38 %
Kadar 200 µg/ml = %10037000
2300037000 x = 37,84 %
Kadar 300 µg/ml = %10037000
2000037000 x = 45,95 %
Kadar 400 µg/ml = %10037000
1650037000x
= 55,41 %
Kadar 500 µg/ml = %10037000
1400037000x
= 62,16 %
Kadar 600 µg/ml = %10037000
1200037000 x = 67,57 %
Kadar 700 µg/ml = %10037000
800037000 x = 78,38 %
Kadar 800 µg/ml = %10037000
150037000x
= 95,95%
Replikasi II
Kadar 100 µg/ml = %10037000
2700037000 x = 27,03 %
45
Kadar 200 µg/ml = %10037000
2300037000x
= 37,84 %
Kadar 300 µg/ml = %10037000
2000037000x
= 45,95 %
Kadar 400 µg/ml = %10037000
1700037000 x = 54,05 %
Kadar 500 µg/ml = %10037000
1400037000 x = 62,16 %
Kadar 600 µg/ml = %10037000
1200037000x
= 67,57 %
Kadar 700 µg/ml = %10037000
850037000x
= 77,03 %
Kadar 800 µg/ml = %10037000
200037000x
= 94,60 %
Replikasi III
Kadar 100 µg/ml = %10037000
2700037000x
= 27,03 %
Kadar 200 µg/ml = %10037000
2300037000x
= 37,84 %
Kadar 300 µg/ml = %10037000
2000037000x
= 45,95 %
Kadar 400 µg/ml = %10037000
1700037000x
= 54,05 %
Kadar 500 µg/ml = %10037000
1450037000x
= 60,81 %
Kadar 600 µg/ml = %10037000
1200037000 x = 67,57 %
Kadar 700 µg/ml = %10037000
850037000 x = 78,38 %
Kadar 800 µg/ml = %10037000
200037000 x = 94,60 %
46
Lampiran 4. Perhitungan LC50 dengan analisis probit dan uji linearitas
Perhitungan LC50 dengan analisis probit pada sel HeLa
Replikasi I
Tabel VII. Data log konsentrasi, % kematian dan harga probit sel HeLa pada replikasi I
Dengan Regresi linear log konsentrasi ekstrak kloroform daun pacar air terhadap
harga probit didapatkan nilai : a = 2,22; b = 1,61; r = 0,93
Sehingga persamaannya : y = bx + a
y = 1,61 x + 2,22
5 = 1,61 x + 2,22
x = 1,73
No Konsentrasi % kematian Harga probit Log kadar
1 200 µg/ml 89,74 6,28 2,30
2 175 µg/ml 80,77 5,88 2,24
3 150 µg/ml 74,36 5,64 2,18
4 125 µg/ml 67,95 5,47 2,10
5 100 µg/ml 60,26 5,25 2,00
6 75 µg/ml 52,56 5,08 1,88
7 50 µg/ml 46,15 4,90 1,70
8 25 µg/ml 38,46 4,69 1,40
47
Replikasi II
Tabel VIII. Data log konsentrasi, % kematian dan harga probit sel HeLa pada replikasi II
No Konsentrasi % kematian Harga probit Log kadar
1 200 µg/ml 89,74 6,28 2,30
2 175 µg/ml 80,77 5,88 2,24
3 150 µg/ml 73,08 5,61 2,18
4 125 µg/ml 67,95 5,47 2,10
5 100 µg/ml 61,54 5,31 2,00
6 75 µg/ml 53,85 5,10 1,88
7 50 µg/ml 44,87 4,87 1,70
8 25 µg/ml 37,18 4,67 1,40
Dengan Regresi linear log konsentrasi ekstrak kloroform daun pacar air terhadap
harga probit didapatkan nilai : a = 2,18; b = 1,63; r = 0,94
Sehingga persamaannya : y = bx + a
y = 1,63x + 2,18
5 = 1,63x + 2,18
x = 1,73
48
Replikasi III
Tabel IX. Data log konsentrasi, % kematian dan harga probit sel HeLa pada replikasi III
No Konsentrasi % kematian Harga probit Log kadar
1 200 µg/ml 89,74 6,28 2,30
2 175 µg/ml 80,77 5,88 2,24
3 150 µg/ml 73,08 5,61 2,18
4 125 µg/ml 67,95 5,47 2,10
5 100 µg/ml 60,26 5,25 2,00
6 75 µg/ml 52,56 5,08 1,88
7 50 µg/ml 44,87 4,87 1,70
8 25 µg/ml 38,46 4,69 1,40
Dengan Regresi linear log konsentrasi ekstrak kloroform daun pacar air terhadap
harga probit didapatkan nilai : a = 2,21; b = 1,61; r = 0,93
Sehingga persamaannya : y = bx + a
y = 1,61 x + 2,21
5 = 1,61 x + 2,21
x = 1,73
Rata-rata x =3
73,173,173,1 = 1,73
LC50 = antilog 1,73
= 53,7 µg/ml
49
Perhitungan LC50 dengan analisis probit pada sel Vero
Replikasi I
Tabel X. Data log konsentrasi, % kematian dan harga probit sel Vero pada replikasi I
Dengan Regresi linear log konsentrasi ekstrak kloroform daun pacar air terhadap
harga probit didapatkan nilai : a = 0,02; b = 2,05 ; r = 0,86
Sehingga persamaannya : y = bx + a
y = 2,05x + 0,02
5 = 2,05x + 0,02
x = 2,43
No Konsentrasi % kematian Harga probit Log kadar
1 800 µg/ml 95,95 % 6,75 2,90
2 700 µg/ml 78,38 % 5,77 2,85
3 600 µg/ml 67,57 % 5,47 2,78
4 500 µg/ml 62,16 % 5,31 2,70
5 400 µg/ml 55,41 % 5,13 2,60
6 300 µg/ml 45,95 % 4,90 2,48
7 200 µg/ml 37,84 % 4,69 2,30
8 100 µg/ml 28,38 % 4,42 2,00
50
Replikasi II
Tabel XI Data log konsentrasi, % kematian dan harga probit sel Vero pada replikasi II
Dengan Regresi linear log konsentrasi ekstrak kloroform daun pacar air terhadap
harga probit didapatkan nilai : a = 0,10; b = 2,01; r = 0,88
Sehingga persamaannya : y = bx + a
y = 2,01x + 0,10
5 = 2,01x + 0,10
x = 2,44
No Konsentrasi % kematian Harga probit Log kadar
1 800 µg/ml 94,60 % 6,64 2,90
2 700 µg/ml 77,03 % 5,74 2,85
3 600 µg/ml 67,57 % 5,47 2,78
4 500 µg/ml 62,16 % 5,31 2,70
5 400 µg/ml 54,05 % 5,10 2,60
6 300 µg/ml 45,95 % 4,90 2,48
7 200 µg/ml 37,84 % 4,69 2,30
8 100 µg/ml 27,03 % 4,39 2,00
51
Replikasi III
Tabel XII. Data log konsentrasi, % kematian dan harga probit sel Vero pada replikasi III
Dengan Regresi linear log konsentrasi ekstrak kloroform daun pacar air terhadap
harga probit didapatkan nilai : a = 0,08; b = 2,02; r = 0,88
Sehingga persamaannya : y = bx + a
y = 2,02x + 0,08
5 = 2,02x + 0,08
x = 2,44
Rata-rata x =3
44,244,243,2 = 2,44
LC50 = antilog 2,44
= 275,4 µg/ml
No Konsentrasi % kematian Harga probit Log kadar
1 800 µg/ml 94,60 % 6,64 2,90
2 700 µg/ml 78,38 % 5,77 2,85
3 600 µg/ml 67,57 % 5,47 2,78
4 500 µg/ml 60,81 % 5,28 2,70
5 400 µg/ml 54,05 % 5,10 2,60
6 300 µg/ml 45,95 % 4,90 2,48
7 200 µg/ml 37,84 % 4,69 2,30
8 100 µg/ml 27,03 % 4,39 2,00
52
Uji linearitas untuk analisis regresi
Tabel XIII. Nilai r (koefisien korelasi) pada level signifikansi 5% dan 1%