UJI MUTAGENISITAS HASIL PARTISI EKSTRAK ...UJI MUTAGENISITAS HASIL PARTISI EKSTRAK KLOROFORM DAUN AMBRE (Geranium radula Cavan.) TERHADAP BAKTERI Salmonella typhimurium TA 98, TA 100

UJI MUTAGENISITAS HASIL PARTISI EKSTRAK KLOROFORM

DAUN AMBRE (Geranium radula Cavan.) TERHADAP

BAKTERI Salmonella typhimurium TA 98, TA 100 DAN TA 1535

SERTA PROFIL KANDUNGAN KIMIA BAGIAN TERAKTIF

Skripsi

Untuk memenuhi sebagian persyaratan guna memperoleh gelar Sarjana Sains

Oleh:

Mita Mutia Rahman

NIM. M0406041

JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS SEBELAS MARET

SURAKARTA

2010

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING

SKRIPSI

UJI MUTAGENISITAS HASIL PARTISI EKSTRAK KLOROFORM

DAUN AMBRE (Geranium radula Cavan.) TERHADAP

BAKTERI Salmonella typhimurium TA 98, TA 100 DAN TA 1535

SERTA PROFIL KANDUNGAN KIMIA BAGIAN TERAKTIF

Oleh : Mita Mutia Rahman

M 0406041

Telah disetujui oleh Tim Pembimbing

Tanda Tangan

Pembimbing I : Dr. Artini Pangastuti, M.Si ........................ NIP. 197505312000032001 Pembimbing II : Rita Rakhmawati, S.Farm., M.Si.,Apt. ........................ NIP. 198005102005012002

Surakarta, Mei 2010

Mengetahui

Ketua Jurusan Biologi

Dra. Endang Anggarwulan, M. Si NIP. 195003201978032001

PENGESAHAN

SKRIPSI

UJI MUTAGENISITAS HASIL PARTISI EKSTRAK KLOROFORM

DAUN AMBRE (Geranium radula Cavan.) TERHADAP

BAKTERI Salmonella typhimurium TA 98, TA 100 DAN TA 1535

SERTA PROFIL KANDUNGAN KIMIA BAGIAN TERAKTIF

Oleh : Mita Mutia Rahman

M 0406041

Telah dipertahankan di depan Tim Penguji pada tanggal 26 Maret 2010

dan dinyatakan telah memenuhi syarat Surakarta, ……………

Penguji I

Widya Mudyantini, M.Si., 197305051999032001

Penguji II

Tjahjadi Purwoko, M.Si., 197011302000031002

Penguji III

Dr. Artini Pangastuti, M.Si. NIP. 197505312000032001

Penguji IV

Rita Rakhmawati, S.Farm., M.Si.,Apt.

NIP. 198005102005012002

Mengesahkan

Dekan FMIPA UNS

Prof. Drs. Sutarno, M.Sc. Ph.D. NIP. 196008091986121001

Mengetahui Ketua Jurusan Biologi

Dra. Endang Anggarwulan, M.Si. NIP. 195003201978032001

PERNYATAAN

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi ini adalah hasil penelitian saya sendiri

dan tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar

kesarjanaan di suatu perguruan tinggi, serta tidak terdapat karya atau pendapat

yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali secara tertulis diacu

dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka.

Apabila dikemudian hari dapat ditemukan adanya unsur penjiplakan maka gelar

kesarjanaan yang telah diperoleh dapat ditinjau dan/atau dicabut.

Surakarta, Mei 2010

Mita Mutia Rahman

NIM. M0406041

UJI MUTAGENISITAS HASIL PARTISI EKSTRAK KLOROFORM DAUN AMBRE (Geranium radula Cavan.) TERHADAP

BAKTERI Salmonella typhimurium TA 98, TA 100 DAN TA 1535 SERTA PROFIL KANDUNGAN KIMIA BAGIAN TERAKTIF

Mita Mutia Rahman

Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,

Universitas Sebelas Maret, Surakarta

ABSTRAK

Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui efek mutagenik hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre terhadap bakteri uji Salmonella typhimurium TA 98, 100 dan 1535 dan profil kandungan kimia teraktif dari hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre yang menunjukkan sifat mutagenik terbesar.

Penelitian ini menggunakan metode Ames dengan bakteri termutasi Salmonella typhimurium TA 98 sebagai indikator frameshift mutation dan Salmonella typhimurium 100 dan 1535 sebagai indikator mutasi substitusi pasangan basa. Sampel yang diuji adalah hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre bagian larut dan bagian tidak larut wasbensin dengan konsentrasi 10, 100, 500 dan 1000 µg/mL.

Hasil uji mutagenisitas bagian larut wasbensin ekstrak kloroform daun Ambre yang diuji dengan menggunakan bakteri Salmonella typhimurium TA 100 dan galur TA 1535 dapat menyebabkan mutasi substitusi pasangan basa pada konsentrasi 100 µg/mL dan 500 µg/mL dan yang diuji dengan menggunakan bakteri Salmonella typhimurium TA 98 dapat menyebabkan frameshift mutation pada konsentrasi 10 µg/mL. Hasil uji mutagenisitas bagian tidak larut wasbensin ekstrak kloroform daun Ambre yang diuji dengan menggunakan bakteri Salmonella typhimurium TA 100 dan galur TA 1535 tidak dapat menyebabkan mutasi substitusi pasangan basa dan yang diuji dengan menggunakan bakteri Salmonella typhimurium TA 98 dapat menyebabkan frameshift mutation pada konsentrasi 10 µg/mL.

Hasil uji deteksi bagian larut wasbensin pada plat KLT dengan berbagai deteksi senyawa semprot menunjukkan hasil positif untuk deteksi terpenoid menggunakan vanilin-H2SO4 dan flavonoid menggunakan FeCl3. Senyawa terpenoid dan flavonoid ini diduga merupakan senyawa yang menyebabkan mutasi. Kata kunci: Geranium radula Cavan., metode Ames, frameshift mutation, mutasi

substitusi pasangan basa, partisi.

MUTAGENIC TEST OF PARTITION CHLOROFORM EXTRACT RESULT OF AMBRE LEAVES (Geranium radula Cavan.) TO THE

BACTERIA Salmonella typhimurium TA 98, TA 100 AND TA 1535 AND PROFILE OF THE MOST ACTIVE PART OF CHEMISTRY COMPOUND

Mita Mutia Rahman

Department of Biology, Faculty of Mathematic and Science, University of Sebelas Maret, Surakarta

ABSTRACT

The purpose of research was to know the mutagenic effect of partition chloroform extract of Ambre leaves to the tested bacteria Salmonella typhimurium TA 98, TA 100 and TA 1535 and profile of the most active part of bioactive showing the biggest mutagenic characteristic.

The research used Ames method with mutated bacteria Salmonella typhimurium TA 98 as frameshift mutation indicator and Salmonella typhimurium 100 and 1535 as substitution mutation of base pair indicator. Tested sample was the result of partition chloroform extract of Ambre leaves of the dissolved and non dissolved part in wasbensin at concentration of 10, 100, 500, and 1000 µg/ml.

Mutagenic test result showed chloroform extract of Ambre leaves of the dissolved part in wasbensin used Salmonella typhimurium TA 100 and 1535 could cause substitution mutation of base pair in concentration 100 µg/mL and 500 µg/mL and used Salmonella typhimurium TA 98 could cause frameshift mutation in concentration 10 µg/mL. Mutagenic test result showed chloroform extract of Ambre leaves of non dissolved part in wasbensin used Salmonella typhimurium TA 100 and 1535 couldn’t cause substitution mutation of base pair and used Salmonella typhimurium TA 98 could cause frameshift mutation in concentration 10 µg/mL.

Result of detection on result compound of partition chloroform extract of Ambre leaves of dissolved part in wasbensin on KLT plat with various detection of sprayed compound showed a positive result for detection of terponoid used vanillin-H2SO4 and flavonoid used FeCl3. Terpenoid and flavonoid presumed as compound that causing mutation.

Keywords: Geranium radula Cavan., Ames method, frameshift mutation,

substitution mutation of base pair, partition.

MOTTO

Dengan menyebut nama Allah yang maha pengasih dan penyayang (Al-Fatihah ayat 1)

Allah tidak membebani seseorang melainkan sesuai dengan kesanggupannya (Al-Baqarah ayat 286)

Rahmat sering datang kepada kita dalam bentuk kesakitan, kehilangan dan kekecewaan;

tetapi kalau kita sabar, kita segera akan melihat bentuk aslinya. (Joseph Addison)

Belajarlah dari kesalahan orang lain. Anda tak dapat hidup cukup lama untuk melakukan

semua kesalahan itu sendiri. (Martin Vanbee)

Orang-orang yang sukses telah belajar membuat diri mereka melakukan hal yang harus dikerjakan ketika hal itu memang harus dikerjakan, entah mereka menyukainya atau tidak.

(Aldus Huxley)

Bersikaplah kukuh seperti batu karang yang tidak putus-putusnya dipukul ombak. Ia tidak saja tetap berdiri kukuh, bahkan ia menenteramkan amarah ombak dan gelombang itu.

(Marcus Aurelius)

Jadilah kamu manusia yang pada kelahiranmu semua orang tertawa bahagia, tetapi hanya kamu sendiri yang menangis; dan pada kematianmu semua orang menangis sedih, tetapi

hanya kamu sendiri yang tersenyum. (Mahatma Gandhi)

Kita melihat kebahagiaan itu seperti pelangi, tidak pernah berada di atas kepala kita sendiri,

tetapi selalu berada di atas kepala orang lain. (Thomas Hardy)

PERSEMBAHAN

Skripsi ini aku persembahkan untuk

Allah SWT yang menjadikan aku lebih sabar, lebih semangat menjalani hidup dan selalu yakin bahwa Allah selalu memberiku yang terbaik.

Bapak Dadun Abdurahman dan Ibu Iis Nuriah yang selalu mendukungku dengan doa-doa

terbaiknya, mudah-mudahan aku bisa memberi yang terbaik untuk kalian

Kakakku Tika Kandita Rahman, Adik-adiku Amelia Rahman dan Naura Azkiya Rahman

KATA PENGANTAR

Segala puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas segala

limpahan rahmat, karunia serta hidayah-Nya yang tak tehingga sehingga penulis

dapat menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi yang berjudul : “Uji

Mutagenisitas Hasil Partisi Ekstrak Kloroform Daun Ambre (Geranium

radula Cavan.) terhadap Bakteri Salmonella typhimurium TA 98, TA 100 dan

TA 1535 Serta Profil Kandungan Kimia Bagian Teraktif”. Penyusunan skripsi

ini merupakan suatu syarat untuk memperoleh gelar kesarjanaan strata 1 (S1) pada

Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas

Sebelas Maret Surakarta.

Dalam pelaksanaan penelitian maupun penyusunan skripsi ini penulis

mendapatkan banyak masukan, bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak yang

sangat bermanfaat baik secara langsung maupun tidak langsung. Oleh karena itu

pada kesempatan ini penulis ingin menyampaikan terima kasih yang setulusnya

kepada:

Prof. Drs. Sutarno, M.Sc. Ph.D., selaku dekan FMIPA Universitas Sebelas

Maret Surakarta atas ijin penelitian untuk keperluan skripsi.

Dra. Endang Anggarwulan, M.Si., selaku Ketua Jurusan Biologi FMIPA

Universitas Sebelas Maret Surakarta yang telah memberikan arahan serta ijin

penelitian skripsi.

Tim Research Grand PHK A2 Jurusan Biologi FMIPA UNS, atas

kesempatan dan fasilitas sehingga penelitian ini dapat berjalan dengan lancar.

Dr. Okid Parama Astirin, MS., selaku pembimbing akademik yang telah

memberikan bimbingan, arahan serta dukungan.

Dr. Artini Pangastuti, M.Si., selaku dosen pembimbing I yang telah

memberikan bimbingan, arahan serta dukungan selama penelitian hingga

selesainya penyusunan skripsi.

Rita Rakhmawati, M.Si., Apt., selaku dosen pembimbing II yang telah

memberikan bimbingan, arahan serta dukungan selama penelitian hingga

selesainya penyusunan skripsi.

Tjahjadi Purwoko, M.Si., selaku dosen penelaah I yang telah memberikan

bimbingan dan petunjuk selama penelitian sampai selesainya penyusunan skripsi.

Widya Mudyantini, M.Si., selaku dosen penelaah II yang telah

memberikan bimbingan dan petunjuk selama penelitian sampai selesainya

penyusunan skripsi.

Dinar Sari C.W., M.Si., Apt. yang telah memberikan bimbingan dan

petunjuk selama penelitian sampai selesainya penelitian.

Kepada segenap dosen dan staf jurusan Biologi FMIPA UNS atas segala

bentuk dukungan yang diberikan.

Keluarga besar Dadun Abdurahman, atas dukungan dan doanya. Keluarga

besar biologi 2006 untuk semangat, kebersamaan, dan persaudaraan yang luar

biasa.

Dengan kerendahan hati penulis menyadari bahwa dalam penelitian dan

penyusunan skripsi ini masih jauh dari sempurna, oleh karena itu saran dan kritik

yang membangun dari para pembaca akan sangat membantu. Semoga skripsi ini

dapat bermanfaat bagi kita semua.

Surakarta, Mei 2010 Penyusun

DAFTAR ISI

Halaman HALAMAN JUDUL…………………………………………………........

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING…………………………..

HALAMAN PENGESAHAN…………………………………….……….

HALAMAN PERNYATAAN…………………………………………….

ABSTRAK…………………………………………………………...……

ABSTRACT……………………………………………………………….

HALAMAN MOTTO……………………………………………………..

HALAMAN PERSEMBAHAN…………………………………………..

KATA PENGANTAR…………………………………………………….

DAFTAR ISI………………………………………………………………

DAFTAR TABEL…………………………………………………………

DAFTAR GAMBAR………………………………………………….......

DAFTAR LAMPIRAN……………………………………………………

DAFTAR SINGKATAN………………………………………………….

BAB I. PENDAHULUAN………………………………………………...

A. Latar Belakang…………………………………………………

B. Rumusan Masalah………………………………………...……

C. Tujuan Penelitian……………………………………………….

D. Manfaat Penelitian……………………………………………..

BAB II. LANDASAN TEORI…………………………………………….

A. Tinjauan Pustaka……………………………………………….

1. Uraian Ambre (Geranium radula Cavan.)…………………..

a. Klasifikasi…………………………………………….......

b. Habitat…………………………………………………….

c. Morfologi…………………………………………………

d. Kandungan Kimia dan Manfaat Daun Ambre……………

2. Uji Mutagenisitas dan Bakteri Salmonella typhimurium……

3. Pemisahan Komponen Bioaktif dengan Ekstraksi dan

i

ii

iii

iv

v

vi

vii

viii

ix

xi

xiv

xv

xvi

xvii

1

1

3

3

3

4

4

4

4

4

5

5

7

......Partisi.....................................................................................

4. Kromatografi Lapis Tipis ( KLT)…………………………...

B. Kerangka Pemikiran……………………………………………

BAB III. METODE PENELITIAN……………………………………….

A. Waktu dan Tempat Penelitian………………………………….

B. Alat dan Bahan Penelitian ..………………………………........

1. Alat Penelitian..……………………………………………...

a. Alat untuk pemisahan komponen bioaktif ……………….

b. Alat untuk uji mutagenisitas ……………………………..

c. Alat untuk penentuan profil kandungan senyawa kimia….

2. Bahan Penelitian..…………………………………………...

a. Bahan untuk pemisahan komponen bioaktif ……………..

b. Bahan untuk uji mutagenisitas …………………………...

c. Bahan untuk penentuan profil kandungan senyawa kimia..

C. Cara Kerja…….………………………………………………...

1. Pengambilan Sampel…………………………………….......

2. Pemisahan Komponen Bioaktif...............................................

a. Ekstraksi…………………………………………………..

b. Partisi.......................................…………………………...

3. Uji Mutagenisitas.....................................................................

a. Penanganan bakteri uji……………………………………

b. Pembuatan biakan semalam………………………………

c. Uji mutagenesitas larutan uji……………………………...

d. Uji kontrol positif………………………………………....

e. Uji kontrol negatif………………………………………...

f. Larutan uji……………………………………………......

4. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan Penentuan Profil

......Kandungan Senyawa Kimia..................................................

a. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)........................................

b. Penentuan profil kandungan senyawa kimia.......................

D. Analisis Data…………………………………………………...

11

12

15

18

18

18

18

18

18

18

18

18

19

19

19

19

19

19

20

20

20

21

21

21

22

22

22

22

23

25

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN…………………………………

A. Ekstraksi dan Partisi……………………………………………

1. Ekstraksi…………………………………………………......

2. Partisi……………………………………………….………..

B. Uji Mutagenisitas…..…………………………………………..

C. Deteksi Golongan Senyawa Partisi Teraktif...............................

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN…………………………………..

A. Kesimpulan…………………………………………………….

B. Saran……………………………………………………………

DAFTAR PUSTAKA……………………………………………………..

RIWAYAT HIDUP PENULIS……………………………………………

26

26

26

29

31

43

48

48

48

50

64

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 1. Rata-rata hasil uji mutagenisitas hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre............................................................

Tabel 2. Rata-rata hasil uji mutagenisitas kontrol................................. Tabel 3. Perbandingan jumlah bakteri yang tumbuh tiap konsentrasi

dengan kelompok kontrol negatif ........................................... Tabel 4. Hasil KLT hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre larut

wasbensin dengan deteksi sinar tampak, sinar UV dan dengan pereaksi semprot spesifik............................................

33

33

34

46

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Geranium radula Cavan................................................... Gambar 2. Bunga Geranium radula Cavan........................................ Gambar 3. Alur Kerangka Pemikiran………………………………. Gambar 4. Skema Cara Kerja.……………………………………… Gambar 5. Kromatogram hasil KLT ekstrak kloroform daun Ambre

deteksi dengan sinar tampak, UV254, UV366, dan serium (IV) sulfat ........................................................................

Gambar 6. Kromatogram hasil KLT partisi ekstrak kloroform daun

Ambre deteksi dengan sinar tampak, UV254, UV366, dan serium (IV) sulfat.............................................................

Gambar 7. Profil KLT hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre

larut wasbensin deteksi dengan sinar tampak, UV254, UV366, dan serium (IV) sulfat...........................................

Gambar 8. Profil KLT hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre

larut wasbensin deteksi dengan Vanilin-H2SO4, Liebermenn-burchard, FeCl3……………………………

6

6

17

24

28

30

43

45

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Kunci determinasi tumbuhan Ambre (Geranium radula Cavan.) ……………………………………………………

Lampiran 2. Hasil uji mutagenisitas dengan menggunakan bakteri

Salmonella typhimurium TA 98…………………………..

Lampiran 3. Hasil uji mutagenisitas dengan menggunakan bakteri Salmonella typhimurium TA 100........................................

Lampiran 4. Hasil uji mutagenisitas dengan menggunakan bakteri Salmonella typhimurium TA 1535......................................

Lampiran 5. Gambar hasil uji mutagenisitas dengan menggunakan bakteri Salmonella typhimurium TA 98..............................

Lampiran 6. Gambar hasil uji mutagenisitas dengan menggunakan

bakteri Salmonella typhimurium TA 100............................ Lampiran 7. Gambar hasil uji mutagenisitas dengan menggunakan

bakteri Salmonella typhimurium TA 1535.......................... Lampiran 8. Komposisi media dan larutan stok....................................... Lampiran 9. Daftar riwayat hidup penulis………………………………

56

57

58

59

60

61

62

63

64

Daftar Singkatan

Singkatan Keterangan BST B2P2TOOT Ce(IV)(SO4)2

DMSO DNA EBPI Faktor R FeCl3

GF254

G2

His IQ KLT LB LC50

MGMT MIPA MMS MNU NOPD OECD PLDB Rf RNA S SA Trp UV uvr A uvr B UV366

UV254

Vanilin H2SO4

2AA 9-AAD 4NQO

Brine Shrimp Letality Test Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional Serium (IV) sulfat Dimethyl sulfoxide Deoksiribonukleic acid/ Asam deoksiribonukleat Enviromental Bio-Detection Products inc. Faktor resistensi Ferri clorida Gypsum Fosforesense pada panjang gelombang 254 Gap 2 Histidin 2-amino-3-methyl-3H-imidazo-(4,5-f-)-quinoline Kromatografi Lapis Tipis Luria Bertani Letal Concentrate 50 % O6-methylguanine-DNA methyltransferase levels Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Methyl methanesulponate N-nitroso-N-methylurea 4-Nitro-o-phenylenediamine Organisasion for Economic Coorperation and Development Protein Linked DNA Breaks Retardation factor Ribonukleic acid/ Asam ribonukleat Sintesis Sodium azide Triptofan Ultraviolet Ultraviolet radiation A Ultraviolet radiation B Ultraviolet panjang gelombang 366 Ultraviolet panjang gelombang 254 Vanilin-asam sulfat 2-aminoanthrancene 9-aminoacridine 4-nitroquinoline-N-oxide

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Penyakit kanker merupakan salah satu penyakit penyebab kematian

terbesar di dunia terutama di negara-negara maju (Pato, 2003). Kanker merupakan

penyakit sel yang ditandai dengan adanya perubahan (transformasi) pada sel

sehingga bentuk, sifat dan kinetiknya berubah. Sel tumbuh menjadi autonom, liar,

tidak terkendali, terlepas dari koordinasi petumbuhan normal, dan bersifat ganas

(Aulia dkk., 2002; Maliya, 2004). Kejadian dan jenis penyakit kanker erat

hubungannya dengan berbagai faktor antara lain adalah jenis kelamin, usia, ras

dan paparan terhadap beberapa zat yang bersifat karsinogenik (Katzung, 1994).

Zat yang bersifat karsinogenik dapat berupa zat kimia organik maupun anorganik.

Selain itu, virus dan radiasi sinar dapat pula menyebabkan kanker (Dalimartha,

2004).

Dalam pengobatan kanker dibutuhkan pendekatan sistemik melalui

kemoterapi kanker, disamping pembedahan, radiasi, dan kemoterapi ajuvan

(Nafrialdi dan Gan, 1995). Tumbuh-tumbuhan merupakan salah satu sumber obat-

obatan kemoterapi yang potensial sehingga pencarian obat-obatan kemoterapi dari

tumbuh-tumbuhan masih terus dilakukan (Sukardiman dkk., 2006). Berdasarkan

penelitian skrining toksisitas beberapa tanaman di kawasan Tawangmangu

Surakarta dengan menggunakan metode Brine Shrimp Letality Test (BST)

menunjukkan bahwa ekstrak kloroform dari daun Ambre (Geranium radula

Cavan.) memiliki aktivitas toksisitas dengan nilai LC50 sebesar 40,63 µg/mL

(Wahyuni dan Rakhmawati, 2008). Suatu ekstrak berpotensi sebagai kandidat

antikanker berdasarkan metode BST jika harga LC50 kurang dari 1000 µg/mL dan

hasil uji toksisitas menggunakan metode BST ini dapat diasosiasikan dengan sifat

sitotoksik yang digunakan sebagai prasyarat antikanker (Erma dkk., 2004).

Berdasarkan penelitian, Ames telah membuktikan bahwa 90% senyawa

yang bersifat mutagenik juga bersifat karsinogenik (Lehninger, 1982). Disisi lain

banyak teori yang menyebutkan bahwa mekanisme kerja dari beberapa senyawa

yang digunakan sebagai obat antikanker mirip dengan mekanisme kerja senyawa

karsinogen terhadap protein, DNA atau sel normal (Foye, 1996). Ini membuktikan

bahwa senyawa antikanker dapat pula menyebabkan mutasi. Hal ini dapat

dimengerti mengingat ada beberapa obat antikanker yang berasal dari tanaman

dapat secara langsung menghambat perkembangan siklus sel kanker dan

menyebabkan terjadinya kerusakan DNA (Katzung, 1994). Berdasarkan hal

tersebut, maka perlu adanya penelitian untuk melihat efek mutagenik dari daun

Ambre dengan melakukan uji mutagenisitas terhadap hasil partisi dari ekstrak

kloroform daun Ambre menggunakan metode Ames. Pada uji mutagenisitas ini

digunakan bakteri Salmonella typhimurium TA 98, 100 dan 1535. Daun Ambre

diperiksa untuk melihat efek mutagenik dengan melakukan pengamatan terhadap

ada tidaknya pertumbuhan bakteri dalam media. Selanjutnya dicari profil

kandungan senyawa kimia teraktif dari hasil partisi yang menunjukkan sifat

mutagenik terbesar.

B. Perumusan Masalah

Adapun rumusan masalah dalam penelitian ini adalah :

a. Bagaimana efek mutagenik hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre

terhadap bakteri uji Salmonella typhimurium TA 98, 100 dan 1535 ?

b. Bagaimana profil kandungan kimia teraktif dari hasil partisi ekstrak

kloroform daun Ambre yang menunjukkan sifat mutagenik terbesar ?

C. Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini adalah :

a. Mengetahui efek mutagenik dari hasil partisi ekstrak kloroform daun

Ambre terhadap bakteri Salmonella typhimurium TA 98, 100 dan 1535.

b. Mengetahui profil kandungan kimia teraktif dari hasil partisi ekstrak

kloroform daun Ambre yang menunjukkan sifat mutagenik terbesar.

D. Manfaat Penelitian

Manfaat yang diharapkan dari adanya penelitian ini adalah :

a. Memberikan informasi ilmiah dan pengetahuan tentang efek mutagenik

dari hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre sehingga dapat digunakan

sebagai dasar penelitian berikutnya.

b. Menambah nilai ilmiah dan ekonomi tanaman Ambre sehingga dapat

dimanfaatkan sebagai bahan dasar untuk pembuatan obat dari bahan alam.

BAB II

LANDASAN TEORI

A. Tinjauan Pustaka

1. Uraian Ambre (Geranium radula Cavan.)

a. Klasifikasi

Divisi : Spermatophyta

Sub divisi : Angiospermae

Kelas : Dicotyledoneae

Ordo : Geraniales

Famili : Geraniaceae

Genus : Geranium

Spesies : Geranium radula Cavan.

Sinonim : Pelargonium odoratissimum Hort.; Pelargonium roseum Hort.

Nama daerah : Daun Ambre (Sumatra), Ambre (Melayu) (Depkes RI, 2009).

b. Habitat

Tumbuh baik pada tanah yang sedikit asam dengan pH 6,0-6,5, pada

kondisi lingkungan yang lembab dan terkena sinar matahari penuh (Rothman,

2009).

c. Morfologi

Ambre merupakan tanaman perdu, dengan tinggi + 1,5 m. Memiliki

batang berkayu berbentuk bulat dengan permukaan kasar dan berbulu. Pada waktu

muda batang berwarna hijau setelah tua berwarna coklat. Berdaun tunggal dengan

panjang tangkai 5-12 cm dan memiliki rambut yang kasar. Pada daun bagian tepi

bergerigi dengan ujung tumpul dan pangkalnya berlekuk. Pertulangan daun

menyirip dengan panjang + 13 cm dan lebar + 9 cm, daunnya berwarna hijau

muda sampai hijau (Backer dan Bakhuizen,1968).

Memiliki bunga majemuk yang berbentuk payung, panjang tangkainya

5-12 cm, dengan kelopak lepas terdiri dari 5 helai, daun mahkota berjumlah 5

helai berbentuk bulat telur dengan panjang 1-5 cm dan lebar 5-7 mm. Bunga

berwarna merah muda dengan benang sari sebanyak sepuluh buah yang

pangkalnya berlekatan dan memiliki bakal buah sebanyak 5 ruang. Buahnya

merupakan buah buni yang berbentuk kerucut dengan panjang 5-6 mm, berwarna

hijau. Berbiji kecil dan berwarna putih. Perakarannya tunggang dan berwarna

coklat muda (Backer dan Bakhuizen,1968).

d. Kandungan kimia dan manfaat daun Ambre

Daun Ambre dipercaya berkhasiat sebagai obat reumatik, obat jerawat

dan bahan baku kosmetika. Biasanya digunakan hanya untuk dipakai di luar tubuh

dengan cara mengoleskan hasil tumbukkan daun pada bagian yang sakit. Daun

mengandung minyak atsiri, saponin, flavonoida dan tannin (Depkes RI, 2009).

Saponin, flavonoida dan tannin telah dilaporkan memiliki aktivitas antikanker

(Zakaria, 2007). Berdasarkan penelitian ternyata ekstrak daun Ambre memiliki

aktivitas toksisitas dengan nilai LC50 sebesar 40,63 µg/mL (Wahyuni dan

Rakhmawati, 2008). Pada konsentrasi 80% ekstrak daun Ambre efektif

menunjukkan daya tolak terhadap nyamuk Aedes aegypti (Linn.) (Dewi dan Leni,

2006).

Gambar 1. Geranium radula Cavan.

Gambar 2. Bunga Geranium radula Cavan (Depkes RI, 2009)

2. Uji Mutagenisitas dan Bakteri Salmonella typhimurium

Uji mutagenisitas digunakan untuk mengetahui apakah suatu bahan uji

bersifat mutagen atau tidak. Ada beberapa metode uji untuk mengetahui suatu

bahan bersifat mutagenik diantaranya dengan menggunakan mencit yang terdiri

dari metode mikronukleus pada tulang sumsum, metode spot test atau dengan

menggunakan mencit transgenik dan dengan menggunakan bakteri (Wegrzyn dan

Czyz, 2003; Wahnschaffe dkk1., 2005; Wahnschaffe dkk2., 2005; Sumpena dkk.,

2009; Shoebi dkk., 2009).

Uji mutagenisitas dengan menggunakan bakteri lebih banyak digunakan

dengan alasan lebih mudah dilakukan dan waktu yang digunakan lebih singkat

bila dibandingkan dengan uji mutagenisitas lainnya. Uji mutagenisitas dengan

menggunakan bakteri memiliki banyak macam diantaranya adalah uji Ames, uji

mutatox, uji vitotox, dan uji dengan menggunakan bakteri Vibrio harveyi yang

dikenal dengan Vibrio harveyi assay (Ames dkk1., 1973; Wegrzyn dan Czyz,

2003).

Uji Ames telah diperkenalkan sejak 30 tahun lalu, karena uji ini banyak

digunakan untuk mengetahui sifat mutagenik suatu senyawa lambat laun uji ini

mengalami modifikasi, namun tetap dengan prinsip dasar yang sama misalnya

dengan bioluminescent assay yang dipadukan dengan metode Ames (Guadano

dkk., 1999; Wegrzyn dan Czyz, 2003 ).

Prinsip dari uji Ames adalah bakteri yang digunakan sudah dimutasi

sehingga tidak mampu mensintesis salah satu jenis asam amino esensial misalnya

histidin dan triptofan untuk pertumbuhannya, oleh karena itu bakteri butuh media

yang mengandung histidin atau triptofan agar bisa tumbuh normal. Bila bahan uji

yang diperiksa bersifat mutagen, maka bakteri uji akan mengalami mutasi balik ke

fungsinya yang semula. Dengan demikian, gen his dan gen trp yang termutasi

akan mengalami mutasi balik. Gen his dan gen trp tersebut kembali normal

sehingga bakteri uji dapat mensintesis sendiri histidin dan triptofan yang

dibutuhkan dalam pertumbuhannya, ditunjukkan dengan pertumbuhan bakteri di

dalam media yang kekurangan histidin atau triptofan (Radji dkk., 2004).

Uji mutagenisitas dengan menggunakan uji Ames ini umumnya

menggunakan strain bakteri Salmonella typhimurium yang sudah dimodifikasi.

Bakteri tersebut termutasi pada bagian gen his yang menyebabkan terganggunya

proses sintesis histidin (Ames dkk1., 1973; Wegrzyn dan Czyz, 2003). Selain itu,

digunakan juga galur Escherichia coli WP2 yang mengandung gen mutasi uvrA

(OECD, 1997).

Beberapa contoh bakteri Salmonella typhimurium termutasi diantaranya

adalah TA 97, TA 97a, TA 98, TA100, TA 102, TA 104, TA1535, TA 1537, dan

TA 1975. Masing-masing galur mengandung gen termutasi histidin, mutasi rfa,

mutasi uvrB, faktor R (pKM101) dan plasmid pAQ1 untuk meningkatkan

kepekaan bakteri terhadap senyawa mutagenik (Ames dkk1., 1973; OECD, 1997;

Suzuki dkk., 1997; Dillon dkk., 1998).

Mutasi DNA repair (uvr A/B) menghilangkan sistem excision repair

pada DNA. Sistem excision repair merupakan jalur perbaikan DNA yang rusak

akibat terkena sinar UV dan mutagen tertentu. Adanya mutasi uvr A/ B membuat

strain tersebut lebih sensitif terhadap beberapa partikel yang diujikan. Mutasi uvr

A/B juga menyebabkan terjadinya delesi pada gen bio yang mengakibatkan

bakteri tidak dapat mensintesis biotin dan membutuhkan biotin untuk

pertumbuhannya, mutasi uvr A/B ditandai dengan kepekaan terhadap sinar UV

(Genpharmtox, 2009).

Gen rfa merupakan gen yang berfungsi dalam mengatur biosintesis

lipopolisakarida (Sanderson dan Saeed, 1972). Adanya mutasi gen rfa

menyebabkan hilangnya sebagian kapsul lipopolisakarida yang membungkus

permukaan bakteri sehingga mengakibatkan naiknya permeabilitas terhadap

molekul besar seperti benzo-a-piren yang tidak dapat berpenetrasi ke dalam sel

normal. Mutasi rfa ditandai dengan adanya kepekaan terhadap kristal violet

(OECD, 1997; Tejs, 2008; Genpharmtox, 2009).

Plasmid faktor R (pKM101) membuat strain bakteri lebih responsif

terhadap berbagai mutagen. Plasmid ini membawa gen resisten ampisilin. Plasmid

pAQ1 yang terdapat pada strain TA 102 mengandung mutasi hisG428 dan gen

resisten tetrasiklin (McCann dkk., 1975; Levin dkk., 1984; OECD, 1997).

Galur TA 100 mempunyai mutasi hisG46 pada gen hisG yang

mengkodekan enzim untuk biosintesis histidin. Galur TA 100 ini termutasi

pasangan basanya secara substitusi dan bisa digunakan untuk mendeteksi adanya

mutagen yang menyebabkan adanya salah satu substitusi pasangan basa dari enam

kemungkinan terjadinya mutasi substitusi pasangan basa (A-T à T-A, G-C, C-G ;

G-Cà C-G, A-T, T-A) (Skopek dkk., 1978; Burgess dkk., 1985).

Galur TA 1535 memiliki mutasi substitusi pasang basa yang sama

dengan TA 100, hanya saja galur TA 1535 tidak memiliki plasmid pKM101. Hal

ini membuat galur TA 100 secara umum lebih sensitif bila dibandingkan dengan

TA 1535 (McCann dkk., 1975; Prival dan Zeiger, 1998, Akerele dan Ebor, 2002;

Tejs 2008).

Mutasi hisD3052 pada TA 98 adalah gen hisD pengkode histidinol

dehidrogenase. Galur ini dapat mendeteksi beberapa mutagen frameshift. Mutagen

dapat memantapkan pasangan tergeser yang sering terjadi pada pengulangan

urutan DNA atau hot spot DNA yang menghasilkan mutasi frameshift yang

memulihkan pembacaan frame yang benar untuk sintesis histidin. Mutasi

hisD3052 mempunyai urutan pengulangan –GC- atau –CG- dalam urutan -C-G-C-

G-C-G-C-G- yang terdapat di dekat tempat mutasi frameshift a-1 pada gen hisD

(Levine dkk., 1994; DeMarini dkk., 1998). Bakteri galur TA 98, 100 dan TA 1535

tidak sensitif terhadap mutagen oksidatif seperti radikal bebas dan senyawa penaut

silang (cross linked) yang biasanya menyerang pasangan basa A-T (Dillon dkk.,

1998; OECD, 1997; Sotto dkk., 2009). Pemberian suspensi dari sel tumor

payudara dapat meningkatkan mutasi balik bakteri galur TA 98 dan 100 (Fulton

dkk., 1984).

Pada tahun 1973 Ames melakukan penelitian untuk mendeteksi adanya

mutagen dengan menambahkan aktivator metabolik dan sampai saat ini masih

banyak dilakukan (Ames dkk2.,1973; Shoeibi dkk., 2009). Aktivator metabolik

tersebut berupa ekstrak hati tikus yang disebut S-9 mix yang mengandung enzim

microsomal seperti enzim retikulum endoplasmik yang mampu melakukan

hidroksilasi atau mengubah banyak senyawa organik menjadi bentuk akhirnya,

karena banyak senyawa menjadi bersifat karsinogenik setelah mengalami proses

metabolisme oleh sel (Ames dkk2.,1973; Wegrzyn dan Czyz, 2003; Lehninger,

1982).

Beberapa penelitian melakukan uji konfirmasi genotip, uji viabilitas dan

banyaknya reversi spontan sesaat setelah menerima strain bakteri. Tujuannya

adalah membuktikan keutuhan strain uji (Setiadarma, 2002). Selain konfirmasi

genotip, perlu juga dilakukan uji mutagen standar. Walaupun hasil konfirmasi

sifat genotip memenuhi syarat, tetapi jika mutagen standar tidak memberikan hasil

positif, bakteri tersebut tidak dapat digunakan untuk pengujian (Radji dkk., 2004).

Mutagen standar yang sering digunakan diantaranya adalah Methyl

methanesulponate (MMS), 4-nitroquinoline-N-oxide (4NQO), 2-minoanthrancene

(2AA), 2-amino-3-methyl-3H-imidazo-(4,5-f-)-quinoline (IQ), N-nitroso-N-

methylurea (MNU), 4-Nitro-o-phenylenediamine (NOPD), Sodium azide (SA) dan

9-aminoacridine (9-AAD) (Haworth dkk., 1983; OECD, 1997; Guadano dkk.,

1999; Totusek dkk., 2009).

3. Pemisahan Komponen Bioaktif dengan Ekstraksi dan Partisi

Ekstraksi suatu senyawa dalam tumbuhan dapat dilakukan dengan cara

maserasi, perkolasi, sokletasi dan destilasi uap. Maserasi merupakan proses

perendaman sampel dengan pelarut organik yang digunakan pada temperatur

ruangan. Proses ini sangat menguntungkan karena dengan perendaman maka pada

sampel tumbuhan terjadi pemecahan dinding dan membran sel akibat perbedaan

tekanan antara di dalam dan di luar sel sehingga metabolit sekunder yang ada

dalam sitoplasma akan terlarut dalam pelarut organik dan ekstraksi senyawa akan

sempurna karena dapat diatur lama perendaman yang dilakukan. Pemilihan

pelarut untuk proses maserasi akan memberikan efektifitas yang tinggi dengan

memperhatikan kelarutan senyawa bahan alam tersebut (Leny, 2006).

Partisi merupakan proses sorpsi yang analog dengan ekstraksi pelarut

(Rohman, 2007). Hukum distribusi atau partisi dapat dirumuskan bila suatu zat

terlarut terdistribusi antara dua pelarut yang tidak dapat campur, maka pada suatu

temperatur yang konstan untuk setiap spesi molekul terdapat angka banding

distribusi yang konstan antara kedua pelarut itu, dan angka banding distribusi ini

tidak tergantung pada spesi molekul lain apapun yang mungkin ada. Harga angka

banding berubah dengan sifat dasar pelarut, sifat dasar zat terlarut, dan temperatur

(Svehla, 1990). Hasil dari partisi yang diperoleh kemudian akan diuji dengan

menggunakan kromatografi lapis tipis untuk mengetahui pemisahan komponen

bioaktifnya kemudian dilakukan uji bioassay untuk mengidentifikasi komponen

aktif dengan uji Ames.

4. Kromatografi Lapis Tipis ( KLT)

Kromatografi lapis tipis adalah metode pemisahan fitokimia. Lapisan

yang memisahkan terdiri atas bahan berbutir-butir (fase diam), ditempatkan pada

penyangga berupa pelat gelas, logam, atau lapisan yang cocok. Campuran yang

akan dipisah berupa larutan, ditotolkan berbentuk bercak atau pita (awal),

kemudian pelat dimasukkan di dalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan

pengembang yang cocok (fase gerak), pemisahan terjadi selama perambatan

kapiler (pengembangan). Senyawa yang tidak berwarna selanjutnya harus

ditampakkan (dideteksi) (Stahl, 1985).

Kromatografi lapis tipis dalam pelaksanaannya lebih mudah dan lebih

murah dibandingkan dengan kromatografi kolom. Demikian juga peralatan yang

digunakan. Dalam kromatografi lapis tipis, peralatan yang digunakan lebih

sederhana dan dapat dikatakan bahwa hampir semua laboratorium dapat

melaksanakan setiap saat secara cepat. Beberapa keuntungan kromatorafi lapis

tipis diantaranya :

1. Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis.

2. Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi

warna, fluorosensi, atau dengan radiasi menggunakan sinar

ultraviolet.

3. Dapat dilakukan elusi secara menarik (ascending), menurun

(descending), atau dengan cara elusi 2 dimensi.

4. Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang

akan ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak (Rohman,

2007).

Fase diam yang digunakan dalam KLT adalah bahan penyerap. Penyerap

yang umum adalah silika gel, alumunium oksida, selulosa, kiselgur, selulosa dan

turunannya. Dua sifat yang penting dari penyerap adalah besar partikel dan

homogenitasnya, karena adhesi terhadap penyokong sangat tergantung pada hal

tersebut. Partikel yang butirannya sangat kasar tidak akan memberikan hasil yang

memuaskan dan salah satu alasan untuk menaikkan hasil pemisahan adalah

menggunakan penyerap yang butirannya halus (Sastrohamidjojo, 1991).

Fase gerak adalah medium angkut dan terdiri atas satu atau beberapa

pelarut. Ia bergerak di dalam fase diam karena adanya gaya kapiler. Laju rambat

tergantung kepada viskositas pelarut dan struktur lapisan (misalnya butiran

penyerap). Pemisahan yang baik dan reproducible perlu diperhatikan pemilihan

kondisi kerja yang meliputi sifat pengembangan, kejenuhan bejana dan lain-lain

(Stahl, 1985). Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembang akan bergerak

sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik

(ascending), atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun

(descending) (Rohman, 2007).

Terdapat berbagai kemungkinan untuk deteksi senyawa tak berwarna

pada kromatogram. Deteksi paling sederhana adalah jika senyawa menunjukkan

penyerapan di daerah ultraviolet (UV) gelombang pendek (radiasi utama pada

kira-kira 254 nm) atau jika senyawa tersebut dapat dieksitasi ke flourosensi radiasi

UV gelombang pendek dan atau gelombang panjang (366 nm). Jika dengan kedua

cara itu senyawa tidak dapat dideteksi, maka harus dicoba dengan menggunakan

reaksi kimia.

Pada sistem KLT dikenal istilah kecepatan rambat suatu senyawa yang

diberi simbol Rf (Retardation factor). Harga Rf ditentukan oleh jarak rambat

senyawa dari titik awal dan jarak rambat fase gerak dari titik awal. Harga Rf ini

dapat digunakan untuk identifikasi senyawa yang dianalisa. Penentuan harga Rf

adalah sebagai berikut:

(Stahl, 1985).

B. Kerangka Pemikiran

Berdasarkan penelitian skrining toksisitas beberapa tanaman di kawasan

Tawangmangu Surakarta dengan menggunakan metode Brine Shrimp Letality Test

(BST) menunjukkan bahwa ekstrak kloroform dari daun Ambre memiliki aktivitas

toksisitas dengan nilai LC50 sebesar 40,63 µg/mL (Wahyuni dan Rakhmawati,

2008). Suatu ekstrak berpotensi sebagai kandidat antikanker berdasarkan metode

BST jika harga LC50 kurang dari 1000 µg/mL dan hasil uji toksisitas

menggunakan metode BST ini dapat diasosiasikan dengan sifat sitotoksik yang

digunakan sebagai prasyarat senyawa antikanker (Erma dkk., 2004).

Berdasarkan penelitian, Ames telah membuktikan bahwa 90% senyawa

yang bersifat mutagenik juga bersifat karsinogenik (Lehninger, 1982). Disisi lain

banyak teori yang menyebutkan bahwa mekanisme kerja dari beberapa senyawa

yang digunakan sebagai obat antikanker mirip dengan mekanisme kerja senyawa

karsinogen terhadap protein, DNA atau sel normal (Foye, 1996). Ini membuktikan

bahwa senyawa antikanker dapat pula menyebabkan mutasi. Berdasarkan hal

tersebut, maka perlu adanya penelitian untuk melihat efek mutagenik dari daun

Ambre dengan melakukan uji mutagenisitas terhadap hasil partisi dari ekstrak

kloroform daun Ambre menggunakan metode Ames. Setiap tahap ekstraksi dan

partisi pemisahannya dimonitor dengan kromatografi lapis tipis

Jarak perambatan bercak dari titik awal Rf = Jarak perambatan fase gerak dari titik awal

Ekstraksi dilakukan dengan menggunakan metode maserasi dengan

pelarut yang digunakan adalah kloroform. Ekstrak kloroform tersebut dipartisi

dengan menggunakan pelarut wasbensin, sehingga dihasilkan bagian yang larut

dan tidak larut wasbensin. Selanjutnya dilakukan uji mutagenisitas dengan uji

Ames dan ditentukan profil kandungan kimia teraktif yang menunjukkan sifat

mutagenik terbesar.

Partisi ekstrak kloroform daun Ambre

Ekstrak kloroform daun Ambre

Pemisahannya dimonitoring dengan KLT

daun Ambre

Uji mutagenisitas

Senyawa antikanker dapat menyebabkan mutasi

Ekstrak kloroform daun Ambre berdasarkan uji BST berpotensi

sebagai kandidat antikanker (Wahyuni dan Rakhmawati, 2008)

Mekanisme kerja beberapa obat antikanker mirip dengan senyawa karsinogen terhadap protein, DNA

dan sel normal (Foye, 1996)

Profil kandungan kimia bagian teraktif yang menunjukkan sifat

mutagenik

Perlu adanya penelitian untuk melihat efek

mutagenik

Sebesar 90% senyawa yang

bersifat mutagenik juga bersifat karsinogenik

(Lehninger, 1982)

Gambar 3. Alur Kerangka Pemikiran

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Pusat MIPA Universitas

Sebelas Maret Surakarta selama bulan Juli-Desember 2009.

B. Alat dan Bahan Penelitian

1. Alat Penelitian

a. Alat untuk pemisahan komponen bioaktif

Alat-alat gelas, Rotary Evaporator (Heidolph vv 2000, Germany),

Sentrifuge, corong buchner.

b. Alat untuk uji mutagenisitas

Tabung reaksi, cawan petri, gelas ukur, mikropipet, gelas beker, jarum

ose, drigalsky, bunsen, laminar air flow.

c. Alat untuk penentuan profil kandungan senyawa kimia

Lampu UV254 dan UV366, pipa kapiler, syringe, chamber, pompa vakum,

alat-alat gelas.

2. Bahan Penelitian

a. Bahan untuk pemisahan komponen bioaktif

Bahan utama untuk pemisahan adalah simplisia kering daun Ambre,

kloroform (untuk maserasi), pelarut wasbensin untuk partisi, plat silika gel 60

GF254 sebagai fase diam dan fase gerak yang digunakan yaitu kloroform.

b. Bahan uji mutagenisitas

Bakteri Salmonella typhimurium TA 98, 100 dan 1535 beserta growth

medium yang diperoleh dari Enviromental Bio-Detection Products inc. (EBPI)

California. Media yang digunakan adalah media Luria Bertani (LB), media

histidin-biotin, dan media minimal yang ditambah glukosa. Bahan kimia yang

digunakan adalah d-biotin, l-histidin, amonium sulfat, dextrose, dipotasium fosfat,

magnesium fosfat, monopotasium fosfat, sodium sitrat, sodium azide (EBPI), 2-

nitrofluorene (EBPI) dan Dimethyl sulfoxide (DMSO).

c. Bahan untuk penentuan profil kandungan senyawa kimia

Plat silika gel 60 GF254, kloroform, pereaksi kimia Ce(IV)(SO4)2 , FeCl3,

vanilin H2SO4, dan Lieberman-Burchard.

C. Cara Kerja

1. Pengambilan Sampel

Sampel berupa simplisia kering daun Ambre sebanyak 290 gram dan

telah dideterminasi yang diperoleh dari Balai Besar Penelitian dan Pengembangan

Tanaman Obat dan Obat Tradisional (B2P2TOOT) pada bulan Mei tahun 2009.

2. Pemisahan Komponen Bioaktif

a. Ekstraksi

Serbuk daun Ambre dimaserasi menggunakan kloroform selama 24 jam

disertai pengadukan, maserasi dilakukan hingga 3 kali. Setelah 24 jam, rendaman

disaring dengan corong buchner, ampasnya dipisahkan dan filtrat I yang diperoleh

diuapkan dengan bantuan rotary evaporator sehingga didapat ekstrak kloroform

yang kemudian dikeringkan dengan bantuan kipas angin dan disimpan di

eksikator. Ampas dimaserasi kembali dengan kloroform seperti cara diatas

sehingga diperoleh filtrat II dan III lalu diuapkan menggunakan rotary

evaporator, ekstrak yang didapat digabung dengan ekstrak kloroform yang

pertama. Profil hasil senyawa pada ekstrak dimonitor dengan kromatografi lapis

tipis.

b. Partisi

Ekstrak kloroform daun Ambre dipartisi dengan cara partisi padat-cair

dengan pelarut wasbensin menggunakan sentrifuge sehingga dihasilkan dua

bagian yaitu bagian larut dan tidak larut wasbensin untuk kemudian pelarut

diuapkan. Kedua bagian yang telah diuapkan dimonitor hasil pemisahannya

dengan kromatografi lapis tipis, apabila hasil pemisahan tidak tumpang tindih

antara keduanya, maka dilakukan uji mutagenisitas dengan uji Ames.

3. Uji Mutagenisitas

Uji mutagenisitas dilakukan dengan menggunakan uji Ames tanpa

aktivator metabolik S-9 mix.

a. Penanganan bakteri uji

Masing-masing bakteri yang akan diuji disimpan pada frezer -4oC dan

growth media disimpan pada lemari pendingin 40C.

b. Pembuatan biakan semalam

Bakteri yang disimpan pada frezer -4oC kemudian dihidrasi dengan

menambahkan growth media kedalam tempat yang berisi bakteri, divortex dan

diinkubasi selama 16-18 jam. Sebanyak 50-100 µL bakteri tersebut diinokulasi

pada media LB dan diinkubasi selama 16-18 jam. Dalam proses pengujian kondisi

harus dalam keadaan fresh yaitu antara jam ke 16-18 setelah proses inokulasi,

karena pada periode jam tersebut bakteri berada pada fase eksponensial sampai

awal fase stasioner, lewat dari itu bakteri tidak boleh digunakan.

c. Uji mutagenesitas larutan uji

Sebanyak 3 mL medium yang mengandung histidin-biotin ditambahkan

50 µL biakan semalam bakteri uji dan larutan uji sesuai konsentrasi, medium

tersebut dituangkan pada cawan petri yang berisi media minimal yang ditambah

glukosa. Setelah medium yang mengandung histidin-biotin memadat, diinkubasi

pada suhu 370 C selama 72 jam. Selanjutnya dihitung jumlah koloni yang tumbuh.

d. Uji kontrol positif

Sebanyak 3 mL medium yang mengandung histidin-biotin ditambahkan

50 µL biakan semalam bakteri uji dan masing-masing sebanyak 17,1 µL sodium

azide untuk Salmonella typhimurium TA 100 dan 1535 dan 2-nitroflourene untuk

Salmonella typhimurium TA 98 sebagai kontrol positif. Sodium azide dan 2-

nitroflourene sebagai kontrol positif karena keduanya telah digunakan sebagai

mutagen standar untuk masing-masing bakteri. Medium histidin-biotin tersebut

dituangkan ke dalam cawan petri berisi media minimal yang ditambah glukosa.

Setelah medium histidin-biotin memadat, diinkubasi pada suhu 370 C selama 72

jam. Selanjutnya dihitung jumlah koloni yang tumbuh.

e. Uji kontrol negatif

Sebanyak 3 mL medium yang mengandung histidin-biotin ditambahkan

50 µL biakan semalam bakteri uji dan sebanyak 100 µL DMSO sebagai kontrol

negatif. Medium tersebut dituang ke dalam cawan petri berisi media minimal yang

ditambah glukosa. Setelah medium histidin-biotin memadat, diinkubasi pada suhu

370 C selama 72 jam. Selanjutnya dihitung jumlah koloni yang tumbuh.

f. Larutan uji

Konsentrasi larutan uji yang digunakan 1000, 500, 100, dan 10 µg/mL.

Larutan uji dibuat dengan menimbang sebanyak 50 mg sampel hasil partisi

ekstrak kloroform daun Ambre, dilarutkan dengan 100 µL DMSO dan air suling

steril hingga volumenya 5 mL. Selanjutnya larutan uji disaring dengan penyaring

bakteri. Data hasil uji mutagenisitas diperoleh dengan penghitungan jumlah koloni

yang tumbuh dari setiap bakteri uji pada masing-masing cawan petri

4. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan Penentuan Profil Kandungan

Senyawa Kimia

a. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Proses pemisahan pada tahap ekstraksi dan partisi dimonitor profil

kandungan senyawa kimianya dengan kromatografi lapis tipis. Hasil setiap

tahapan tersebut dilarutkan di pelarut kemudian ditotolkan pada lempeng KLT

yaitu silika gel 60 GF254 menggunakan pipa kapiler. Pengembangan dilakukan

dalam bejana pengembang menggunakan fase gerak kloroform. Hasil KLT

dideteksi dengan sinar UV254 nm, UV366 nm dan disemprot dengan serium (IV)

sulfat untuk mendeteksi keberadaan senyawa organik secara umum dengan hasil

positif menunjukkan adanya perubahan warna menjadi coklat.

b. Penentuan profil kandungan senyawa kimia

Penentuan golongan senyawa dilakukan setelah diketahui bagian teraktif

dari hasil partisi yang telah dimonitor dengan kromatografi lapis tipis dan uji

mutagenisitas dengan uji Ames. Profil kandungan kimia teraktif yang

menunjukkan sifat mutagenik kemudian ditentukan dengan menggunakan

pereaksi semprot khusus yaitu FeCl3 untuk mendeteksi senyawa flavonoid dengan

hasil positif menunjukkan adanya perubahan warna menjadi kuning. Vanilin

H2SO4 untuk mendeteksi keberadaan senyawa terpenoid dengan hasil positif

menunjukkan adanya perubahan warna menjadi biru sampai ungu setelah

pemanasan pada suhu 110oC selama 10 menit. Lieberman-Burchard untuk

mendeteksi keberadaan senyawa triterpenoid (steroid) dengan hasil positif

menunjukkan adanya perubahan warna menjadi merah untuk triterpenoid dan biru

untuk steroid setelah pemanasan pada suhu 110 oC selama 10 menit.

Skema cara kerja dalam penelitian ini tergambar dari bagan di bawah ini :

Serbuk simplisia (290 g)

Maserasi dengan kloroform selama 24 jam

(3x)

Residu/Ampas Filtrat yang diuapkan

Ekstrak kloroform (11 g)

dipartisi dengan wasbensin

Uji Ames

Pemisahannya dimonitoring dengan KLT

Bagian larut wasbensin sebagai bagian yang teraktif

dengan efek mutagenik terbesar

Bagian tidak larut wasbensin (3,6 g)

Bagian larut wasbensin (5,9 g)

Kandungan Kimia : Terpenoid dan flavonoid

Menyebabkan mutasi pasangan basa dan frameshift mutation

Gambar 4. Skema Cara Kerja

D. Analisis Data

Data hasil uji mutagenisitas diperoleh secara kuantitatif dengan

penghitungan jumlah koloni yang tumbuh dari setiap bakteri uji pada konsentrasi

yang diberikan. Analisis data uji mutagenisitas dilakukan dengan menghitung

pertumbuhan koloni bakteri dimana jumlah koloni yang tumbuh dibandingkan

dengan jumlah koloni bakteri pada kontrol negatif. Apabila hasilnya : 1,8- 2 kali

atau lebih dari kelompok kontrol negatif maka sampel yang di uji bersifat sangat

mutagen, 1,6 – 1,7 kali dari kelompok kontrol negatif maka sampel yang di uji

kemungkinan bersifat mutagen dan 1< - 1,5 kali dianggap tidak mutagen. Batas

suatu bahan uji dikatakan bersifat mutagen jika konsentrasi sampel yang

memberikan hasil positif kurang dari 10.000 µg/mL (Suprastiwi, 2009; Radji,

2004).

Profil kandungan kimia teraktif yang menunjukkan sifat mutagenik

terbesar dimonitor kromatografi lapis tipis dengan fase gerak dan fase diam yang

sesuai serta pereaksi semprot yang spesifik. Profil kromatografi lapis tipis hasil

deteksi semprot spesifik dianalisis secara kualitatif dengan analisis deskriptif

berdasarkan bercak warna yang terbentuk dan nilai Rf yang ditentukan dengan

rumus :

(Stahl, 1985)

Jarak perambatan bercak dari titik awal Rf = Jarak perambatan fase gerak dari titik awal

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek mutagenik dari hasil

partisi ekstrak kloroform daun Ambre terhadap bakteri Salmonella typhimurium

TA 98, 100 dan 1535 beserta profil kandungan kimia teraktif dari hasil partisi

ekstrak kloroform daun Ambre yang menunjukkan sifat mutagenik terbesar. Uji

mutagenisitas dilakukan dengan menggunakan metode Ames.

A. Ekstraksi dan Partisi

1. Ekstraksi

Metode ekstraksi yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode

maserasi. Maserasi adalah proses ekstraksi zat aktif yang dilakukan dengan

merendam serbuk simplisia dalam pelarut yang sesuai selama periode waktu

tertentu pada suhu ruang dan terlindung dari cahaya matahari, tujuannya adalah

mencegah terjadinya reaksi yang dikatalis oleh cahaya atau mencegah terjadinya

perubahan warna.

Metode maserasi dipilih dalam penelitian ini karena proses

pengerjaannya mudah dan peralatan yang digunakan sederhana, selain itu karena

metode maserasi termasuk metode ekstraksi tanpa pemanasan sehingga senyawa

yang diharapkan tidak menjadi rusak akibat pemanasan. Dalam penelitian ini

pelarut yang digunakan adalah kloroform untuk menarik senyawa-senyawa yang

bersifat nonpolar sampai semi polar (Ristiningsih, 2009). Selain alasan tersebut,

penggunaan kloroform sebagai pelarut dalam proses ekstraksi mengacu pada

penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Wahyuni dan Rakhmawati (2008)

yang menunjukkan bahwa ekstrak kloroform daun Ambre memiliki aktivitas

toksisitas pada uji Brine Shrimp Letality Test (BST). Berat ekstrak yang diperoleh

adalah 11 gram dari 290 gram serbuk daun Ambre yang diekstraksi.

Proses pemisahan pada tahap ekstraksi dimonitor profil kandungan

senyawa kimianya dengan kromatografi lapis tipis, kemudian dilakukan deteksi

terhadap keberadaan senyawa kimia organik secara umum yang ada di dalamnya

menggunakan pereaksi semprot serium (IV) sulfat dengan bercak yang terbentuk

berwarna coklat setelah pemanasan. Warna coklat terbentuk disebabkan karena

dalam serium (IV) sulfat terdapat H2SO4 10% yang bersifat reduktor dalam

merusak gugus kromofor dari zat aktif simplisia sehingga serapan panjang

gelombangnya akan bergeser ke arah yang lebih panjang (UV menjadi VIS) dan

noda menjadi tampak oleh mata. Deteksi UV digunakan untuk mengetahui

senyawa yang tidak terlihat atau dengan sinar tampak (Tim Pengajar Teknik

Laboratorium, 2009).

Profil senyawa pada ekstrak kloroform daun Ambre hasil KLT dapat

dilihat pada Gambar 5.

A B C D

Gambar 5. Kromatogram hasil KLT ekstrak kloroform daun Ambre deteksi dengan (A) sinar tampak (B) UV254 (C) UV366 (D) serium (IV) sulfat

Fase diam : Silika Gel GF254 Fase gerak : Kloroform (CHCl3) Jarak pengembangan : 8 cm

Rf

Deteksi hasil KLT menggunakan sinar tampak, UV254, UV366, dan

serium (IV) sulfat menunjukkan adanya beberapa bercak yang terlihat pada

masing-masing deteksi. Deteksi kromatogram dengan sinar tampak (Gambar 5.A)

memperlihatkan bercak berwarna hijau tua dan kuning. Deteksi kromatogram

dengan sinar UV254 (Gambar 5.B) memperlihatkan terjadinya peredaman yang

ditandai dengan adanya beberapa bercak yang berwarna gelap pada latar belakang

yang berflourosensi hijau yang menunjukkan adanya senyawa.

Deteksi dengan sinar UV366 (Gambar 5.C) memperlihatkan bercak yang

berpendar menunjukkan bahwa senyawa tersebut memiliki ikatan rangkap

terkonjugasi yang panjang sehingga dapat berpendar pada penyinaran UV

0,75

0,5

0,25

0

1

gelombang panjang. Deteksi dengan pereaksi serium (IV) sulfat (Gambar 5.D)

memperlihatkan beberapa bercak berwarna coklat gelap. Hal ini menunjukkan

bahwa pada ekstrak kloroform daun Ambre tersebut terdapat senyawa organik.

2. Partisi

Tahapan partisi yang dilakukan pada penelitian ini menggunakan pelarut

wasbensin. Partisi bertujuan untuk memisahkan ekstrak kloroform daun Ambre

menjadi dua bagian yaitu bagian non polar dan bagian polar. Wasbensin bersifat

non polar, sehingga berdasarkan prinsip like disolve like (Harbone, 1987) bagian

non polar akan larut wasbensin, sedangkan bagian yang polar tidak larut

wasbensin. Berat hasil partisi ekstrak kloroform bagian larut wasbensin yang

diperoleh adalah 5,9 gram dan hasil partisi ekstrak kloroform bagian tidak larut

wasbensin adalah 3,6 gram.

Analisis profil kandungan kimia pada hasil partisi dilakukan untuk

mengetahui kesempurnaan pemisahan senyawa dengan partisi. Hasil dari KLT

partisi ekstrak kloroform daun Ambre dilihat pada Gambar 6.

Deteksi hasil KLT menggunakan sinar tampak, UV254, UV366, dan

serium (IV) sulfat terlihat adanya bercak-bercak pada posisi yang berbeda antara

bercak yang terdapat pada hasil partisi ekstrak kloroform bagian larut wasbensin

dengan bercak yang terdapat pada hasil partisi ekstrak kloroform bagian tidak

larut wasbensin. Hal ini menunjukkan bahwa partisi yang dilakukan dapat

memisahkan senyawa-senyawa yang terdapat ekstrak kloroform daun Ambre.

1 2 1 2 1 2 1 2 A B C D

Gambar 6. Kromatogram hasil KLT hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre deteksi dengan (A) sinar tampak (B) UV254 (C) UV366 (D) serium (IV) sulfat

Fase diam : Silika Gel GF254 Fase gerak : Kloroform (CHCl3) Jarak pengembangan : 8 cm Keterangan : 1. Larut wasbensin

2. Tidak larut wasbensin

Rf

0,75

0,5

0,25

0

1

B. Uji Mutagenisitas

Uji mutagenisitas dilakukan untuk mengetahui apakah suatu senyawa

bersifat mutagenik atau tidak. Uji mutagenisitas dapat dilakukan dengan berbagai

metode salah satunya dengan menggunakan bakteri yang dikenal dengan uji Ames

seperti yang dilakukan dalam penelitian ini. Prinsipnya bakteri yang digunakan

sudah dimutasi sehingga tidak mampu mensintesis salah satu jenis asam amino

esensial misalnya histidin untuk pertumbuhannya, oleh karena itu bakteri butuh

media yang mengandung histidin agar bisa tumbuh normal. Bila bahan uji yang

diperiksa bersifat mutagen, maka bakteri uji akan mengalami mutasi balik ke

fungsinya yang semula. Dengan demikian gen his yang termutasi akan mengalami

mutasi balik, gen his tersebut kembali normal sehingga bakteri uji dapat

mensintesis sendiri histidin yang dibutuhkan dalam pertumbuhannya, ditunjukkan

dengan pertumbuhan bakteri di dalam media yang kekurangan histidin (Radji

dkk., 2004)

Bahan uji berupa hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre yaitu

bagian larut dan bagian tidak larut wasbensin, masing-masing dilarutkan dengan

DMSO dan aquades. Tujuan penambahan DMSO adalah untuk mempermudah

proses pelarutan sampel uji. Pemberian DMSO tidak boleh melebihi 2% total

pelarut, karena DMSO dapat merusak senyawa jika terlalu banyak diberikan.

Selain itu DMSO bersifat tidak membunuh bakteri sehingga cocok digunakan

sebagai pelarut sampel.

Pengujian dilakukan menggunakan 3 bakteri uji dengan 4 seri

konsentrasi bahan uji dengan 3 ulangan. Bakteri dan bahan uji dimasukkan pada

media yang mengandung histidin-biotin. Medium yang mengandung histidin-

biotin sangat dibutuhkan oleh bakteri karena bakteri uji kehilangan kemampuan

dalam mensintesis histidin dan biotin sehingga bakteri membutuhkan histidin dan

biotin dari luar untuk pertumbuhannya (Radji dkk., 2004). Medium yang

mengandung histidin-biotin tersebut dituang pada cawan petri berisi media

minimum yang ditambahkan glukosa, diinkubasi selama 72 jam dan dihitung

jumlah koloni bakteri yang tumbuh. Bakteri dihitung dengan prinsip satu bakteri

akan membentuk satu koloni tanpa memperdulikan besar kecilnya koloni yang

terbentuk.

Sebagai kontrol positif digunakan sodium azide untuk Salmonella

typhimurium TA 100 dan 1535 serta 2-nitroflourene untuk Salmonella

typhimurium TA 98. Sodium azide dan 2-nitroflourene adalah mutagen standar

untuk masing-masing bakteri. Sodium azide dapat menyebabkan terjadinya mutasi

pasangan basa, sedangkan 2-nitrofluorene dapat menyebabkan terjadinya

frameshift mutation. Kontrol positif bertujuan untuk melihat kemampuan

mutagenisitas bakteri uji (Suprastiwi, 2009). Sebagai kontrol negatif digunakan

DMSO untuk melihat bahwa mutasi yang terjadi bukan disebabkan karena

pengaruh DMSO, melainkan dari sampel yang diuji.

Rata-rata hasil uji mutagenisitas partisi ekstrak kloroform daun Ambre

dengan menggunakan tiga bakteri uji Salmonella typhimurium TA 98, TA 100 dan

TA 1535 dapat dilihat pada Tabel 1 dan Tabel 2.

Tabel 1. Rata-rata hasil uji mutagenisitas partisi ekstrak kloroform daun Ambre

Jumlah rata-rata pertumbuhan koloni bakteri pada konsentrasi sampel uji (µg/mL)

Strain bakteri uji Sampel uji

1000 500 100 10 A

102 99,3 84,3 115 S. typhimurium

TA 98 B

96,7 93,3 76 79,3

A Tidak Terhingga

Tidak Terhingga

Tidak Terhingga

119 S. typhimurium

TA 100 B

81 56 55 50

A Tidak Terhingga

Tidak Terhingga

64 41 S. typhimurium

TA 1535 B

79,7 28,7 26,7 41

Keterangan : A. Bagian larut wasbensin ekstrak kloroform daun Ambre B. Bagian tidak larut wasbensin ekstrak kloroform daun Ambre

Tabel 2. Rata-rata hasil uji mutagenisitas kontrol

Strain bakteri uji Kontrol

Jumlah rata-rata pertumbuhan koloni bakteri

DMSO (-) 40 S. typhimurium TA 98 2-nitroflourene (+) 99 DMSO (-) 99,7 S. typhimurium TA 100 Sodium azide (+) 173 DMSO (-) 41,3 S. typhimurium TA 1535 Sodium azide (+) 93,7

Adapun perbandingan jumlah bakteri yang tumbuh tiap konsentrasi

dengan kelompok kontrol negatif dapat dilihat pada Tabel 3.

Tabel 3. Perbandingan jumlah bakteri yang tumbuh tiap konsentrasi dengan kelompok kontrol negatif

Perbandingan jumlah koloni bakteri yang tumbuh tiap konsentrasi dengan kelompok

kontrol negatif (µg/mL) Strain bakteri uji Sampel uji

1000 500 100 10 A

2,5 2,5 2,1 2,9 S. typhimurium

TA 98 B

2,4 2,3 1,9 2

A

Tidak Terhingga

Tidak Terhingga

Tidak Terhingga

1,2 S. typhimurium

TA 100 B

0,8 0,6 0,5 0,5

A

Tidak Terhingga

Tidak Terhingga

1,5 1 S. typhimurium

TA 1535 B

1,9 0,7 0,6 1

Keterangan : A. Bagian larut wasbensin ekstrak kloroform daun Ambre B. Bagian tidak larut wasbensin ekstrak kloroform daun Ambre

Berdasarkan hasil uji mutagenisitas hasil partisi ekstrak kloroform daun

Ambre menggunakan bakteri Salmonella typhimurium TA 100 dan Salmonella

typhimurium TA 1535, terlihat bahwa bagian larut wasbensin relatif lebih bersifat

mutagenik dibandingkan bagian yang tidak larut wasbensin. Hal ini dapat dilihat

dari rata-rata hasil uji yang menunjukkan bahwa jumlah koloni yang tumbuh pada

cawan petri yang berisi sampel bagian larut wasbensin lebih banyak bila

dibandingkan dengan jumlah koloni bakteri yang tumbuh pada kontrol negatif dan

jumlahnya rata-rata melebihi 1,8 kali jumlah bakteri yang tumbuh pada kontrol

negatif. Ini menunjukkan pada bagian larut wasbensin terdapat senyawa

mutagenik karena mampu membalikkan mutasi substitusi pasangan basa pada

bakteri Salmonella typhimurium TA 100 dan Salmonella typhimurium TA 1535.

Senyawa mutagenik tersebut bersifat non polar karena dapat larut dalam pelarut

wasbensin.

Pada bagian tidak larut wasbensin dengan menggunakan Salmonella

typhimurium TA 1535 sebagai bakteri ujinya, terdapat jumlah koloni bakteri yang

tumbuh lebih banyak bila dibandingkan jumlah koloni bakteri yang tumbuh pada

kontrol negatif yaitu 1,9 kali jumlah koloni bakteri pada kontrol negatif. Hal ini

terjadi karena pada bagian tidak larut wasbensin terdapat senyawa yang bersifat

mutagenik, namun tidak begitu kuat sehingga senyawa tersebut bisa bersifat

mutagenik pada konsentrasi tinggi. Ini dapat dilihat dari hasil uji yang

menunjukkan bahwa hanya pada konsentrasi 1000 µg/mL bagian tidak larut

wasbensin yang menunjukkan sifat mutagenik. Senyawa mutagenik tersebut

bersifat polar karena tidak dapat larut dalam pelarut wasbensin.

Pada pengujian sampel dengan menggunakan bakteri Salmonella

typhimurium TA 98 menunjukkan bagian larut wasbensin maupun tidak larut

wasbensin bersifat mutagenik. Keduanya menunjukkan jumlah pertumbuhan

koloni bakteri yang lebih banyak bila dibandingkan dengan kontrol negatif yaitu

rata-rata jumlahnya melebihi 1,8 kali jumlah bakteri pada kontrol negatif. Hasil uji

ini menunjukkan bahwa terdapat senyawa non polar pada bagian larut wasbensin

dan senyawa polar pada bagian tidak larut wasbensin hasil partisi ekstrak

kloroform daun Ambre yang mampu membalikkan frameshift mutation pada

bakteri Salmonella typhimurium TA 98.

Dilihat jumlah koloni bakteri yang tumbuh, senyawa atau zat aktif yang

terdapat pada bagian larut wasbensin dapat menyebabkan mutasi substitusi

pasangan basa dan frameshift mutation karena bakteri Salmonella typhimurium

TA 100 dan Salmonella typhimurium TA 1535 merupakan indikator jenis mutasi

substitusi pasangan basa, sedangkan Salmonella typhimurium TA 98 yang

merupakan indikator jenis mutasi frameshift mutation dapat tumbuh pada

pengujian ini. Berbeda dengan hasil uji bagian larut wasbensin, untuk bagian tidak

larut wasbensin hanya dapat menyebabkan terjadinya mutasi frameshift saja, hal

ini terbukti dengan banyaknya bakteri Salmonella typhimurium TA 98 yang

tumbuh.

Sifat mutagenik yang terdapat pada bagian larut wasbensin yang dapat

menyebabkan frameshift mutation lebih kuat bila dibandingkan sifat mutagenik

yang menyebabkan substitusi pasangan basa, karena pada konsentrasi 10 µg/mL

sudah mampu membalikkan frameshift mutation pada bakteri Salmonella

typhimurium TA 98. Sementara itu, hasil partisi bagian larut wasbensin yang diuji

dengan menggunakan bakteri Salmonella typhimurium TA 100 sudah mampu

membalikkan mutasi pasangan basa pada konsentrasi 100 µg/mL dan galur TA

1535 pada konsentrasi 500 µg/mL.

Perbedaan hasil antara galur TA 100 dan TA 1535 disebabkan karena

galur TA 1535 tidak memiliki plasmid pKM101. Gen his46 yang dimiliki oleh

galur TA 100 bekerjasama dengan plasmid pKM101 dalam mengkodekan gen

mucAB yang analog dengan gen umuDC pada E.coli K-12 yang berperan dalam

SOS-repair, sehingga galur TA 100 secara umum lebih sensitif bila dibandingkan

dengan TA 1535 ( Little dkk., 1989; Prival dan Zeiger, 1998). Ini dapat dilihat

dari jumlah bakteri yang tumbuh pada galur TA 100 jumlah bakteri tidak

terhingga muncul pada sampel dengan konsentrasi 100 µg/mL dan pada galur TA

1535 muncul pada konsentrasi 500 µg/mL.

Mutagen adalah segala sesuatu yang dapat menyebabkan mutasi, baik

berasal dari alam maupun sintetik. Mutasi adalah perubahan dalam materi genetik,

dapat diturunkan dan mencakup mikrolesi dan makrolesi. Mikrolesi adalah

perubahan pada struktur DNA (point of mutation), sedangkan makrolesi adalah

perubahan kromosom atau aberasi kromosom (Isnawati dan Alegantina, 2004).

Mutasi bisa bersifat merugikan bisa juga bersifat menguntungkan. Menurut Ames

menyatakan bahwa 90% senyawa yang menyebabkan mutasi dapat pula bersifat

karsinogenik (Lehninger, 1984). Namun tidak semua senyawa yang menyebabkan

mutasi dapat menyebabkan kanker, bahkan sebaliknya dapat menghentikan

aktivitas sel kanker dengan mekanisme tertentu.

Mutasi yang dapat menyebabkan kanker adalah mutasi yang

menyebabkan kelainan fungsi genetik yang merupakan akibat dari peristiwa-

peristiwa mutasional berganda. Mutasi-mutasi tersebut mengubah fungsi normal

suatu sel sehingga sel itu memiliki ciri-ciri berikut : (1) gangguan diferensiasi dari

sel dan jaringan akibat sel yang menjadi immortal (2) sel menjadi independen dari

kontrol-kontrol selular normal yang membatasi pertumbuhan dan pembelahan sel

(3) sel menjadi invasif dengan menyebar ke jaringan-jaringan lain dalam sebuah

proses yang disebut metastasis, (4) dan adanya pergeseran metabolisme ke arah

pembentukkan makromolekul dari nukleosida dan asam amino serta peningkatan

katabolisme karbohidrat untuk energi sel (Nafrialdi dan Gan, 1995: Elrod dan

Stansfield, 2002).

Selain itu, senyawa mutagen yang dapat menyebabkan kanker harus

memiliki kemampuan menyebabkan mutasi pada sel yang mengarahkan pada

pertumbuhan kanker. Diperlukan 5-10 mutasi genetik, untuk menjadi sel kanker

(Zakaria, 2001). Ada dua tipe mutasi yang berbeda yang bisa mengarah pada

pertumbuhan kanker. Tipe pertama adalah mutasi “pemerolehan fungsi” atau

“gain of function”. Pada sebuah gen yang dalam keadaan normal berfungsi dalam

pertumbuhan dan pembelahan sel. Pembelahan sel adalah suatu proses yang amat

rumit dan kemungkinan besar dikontrol oleh banyak gen berbeda (sebagian

merangsang, sebagian menghambat). Interferensi pada waktu gen-gen tersebut

bekerja, pada jumlah produk gen yang dihasilkan, atau pada aktivitas produk gen,

bisa mengarah pada kanker (Elrod dan Stansfield, 2002).

Kebanyakan sel dalam tubuh telah terdiferensiasi dan tidak membelah

secara aktif, dengan demikian gen-gen pembelahan sel biasanya dimatikan. Jika

gen-gen itu teraktivasi secara tidak benar, bisa mengakibatkan pembelahan sel

yang tidak terkendali, Gen tersebut diantaranya adalah onkogen, yang aktif akibat

mutasi akan memicu pertumbuhan sel yang mengarah pada terjadinya kanker

(Elrod dan Stansfield, 2002; Sofyan, 2005).

Tipe mutasi kedua adalah mutasi “hilangnya fungsi” atau “loss-of-

function” dalam gen supresor tumor. Peran normal gen supresor tumor adalah

sebagai supresor pertumbuhan dan pembelahan sel. Gen supresor tumor diaktifkan

dalam sel-sel normal. Jika gen tersebut dinonaktifkan secara tidak benar, sel bisa

memasuki siklus sel dan membelah (Elrod dan Stansfield, 2002; Sofyan, 2005 ).

Sebaliknya senyawa mutagen juga bisa bersifat sebagai antikanker bisa

dilihat dari mekanisme kerja beberapa obat antikanker yang berpengaruh langsung

terhadap asam nukleat sebagai target sasarannya. Adanya ganguan replikasi DNA,

transkripsi, translasi, dan sebagai zat pengalkil merupakan beberapa mekanisme

yang dapat menyebabkan gangguan fungsi dalam sel kanker yang sedang berlipat

ganda dengan cepat (Katzung, 1994; Myek dkk., 1997; Nogrady, 1992).

Berdasarkan hasil yang diperoleh, terlihat bahwa bagian larut wasbensin

memiliki sifat mutagenik terbesar dibandingkan bagian tidak larut wasbensin

dengan kemampuan dapat menyebabkan mutasi substitusi pasangan basa dan

frameshift mutation.

Mutasi substitusi pasangan basa terdiri dari transisi dan transversi.

Mutasi ini mengakibatkan terjadinya pergantian asam amino oleh asam amino lain

pada urutan polipeptida yang disandi oleh suatu gen. Pada kasus tertentu residu

asam amino yang digantikan dapat bersifat kritis dan menyebabkan protein sama

sekali tidak dapat melakukan fungsi biologis normalnya. Mutasi tersebut

seringkali mematikan sel (Lehninger, 1982; Roberts, 2000).

Frameshift mutation merupakan peristiwa pergeseran bingkai pembacaan

yang disebabkan oleh adanya delesi atau insersi dari satu atau beberapa nukleotida

(Elrod dan Stansfield, 2002). Frameshift mutation dapat menyebabkan perubahan

yang ekstensif pada produk gen sehingga produk gen menjadi tidak aktif, terjadi

kerusakan kolinearitas diantara kodon-kodon pada urutan DNA dan urutan asam

amino polipeptida (Lehninger, 1982 ; Roberts, 2000).

Senyawa yang dapat menyebabkan frameshift mutation memiliki

kemampuan melakukan interkalasi atau penyisipan (Lehninger, 1982; Roberts,

2000). Sifat inilah yang dapat dimanfaatkan sebagai agen antikanker dengan

mekanisme yang sama yang dilakukan oleh beberapa obat antikanker. Beberapa

obat antikanker yang melakukan mekanisme tersebut adalah daktinomisin yang

dikenal dengan aktinomisin D, doksorubisin, adriamisin, dan daunorubisin (Myek

dkk., 1997; Foye, 1996; Nogrady, 1992). Mekanisme yang dilakukan oleh

daktinomisin adalah dengan cara melakukan interkalasi pada celah kecil heliks

rangkap antara pasangan basa DNA guanin dan sitosin, membentuk suatu

kompleks daktinomisin-DNA. Kompleks ini mengganggu polimerase RNA dan

pada dosis tinggi mampu menghambat sintesis DNA dan menstabilkan kompleks

DNA-topoisomerase II (Myek dkk., 1997).

Doksorubisin dan daunorubisin yang maksimal bekerja pada fase S dan

G2 melakukan interkalasi pada pasangan basa yang berdekatan dan mengikat ruas

fosfat-gula DNA sampai melingkar, sehingga menghambat sintesis DNA dan

RNA. Interkalasi ini dapat mengganggu reaksi lepas sambung pilah DNA yang

dikatalisasi oleh topoisomerase II sehingga pecah dan tidak dapat diperbaiki

(Myek dkk., 1997).

Enzim DNA topoisomerase II mempunyai fungsi yang penting dalam

proses intraseluler, yaitu berperan dalam proses replikasi, transkripsi, rekombinasi

DNA, dan proses proliferasi dari sel kanker. Adanya interkalasi yang dilakukan

suatu senyawa dapat mengganggu reaksi lepas sambung DNA yang dikatalisasi

oleh enzim topoisomerase II. Hal ini disebabkan karena ikatan antara enzim

dengan DNA sel kanker menjadi semakin lama. Akibatnya akan terbentuk Protein

Linked DNA Breaks (PLDB), dan terjadi fragmentasi atau kerusakan DNA sel

kanker dan selanjutnya berpengaruh terhadap proses di dalam sel khususnya

proses replikasi sel yang diakhiri dengan kematian sel kanker secara apoptosis

(Cumming dan Smyth, 1993; Sukardiman dkk., 2005; Yuwono, 2005; Myek dkk.,

1997).

Contoh obat antikanker lain yang melakukan mutasi dalam membunuh

sel kanker adalah cisplatin (cis-diamindikloroplatinum [II]). Cisplatin merupakan

obat kemoterapi yang cukup efektif karena dapat membunuh sel kanker pada

setiap siklus sel dengan menghambat biosintesis DNA, mengikat DNA melalui

pembentukan “interstrand cross-links”. Tempat ikatan utama adalah pada N7

guanin, tetapi interaksi kovalen dengan adenin dan sitosin juga terjadi (Katzung,

1994; Savitri dkk., 2008).

Selain itu terdapat beberapa obat antikanker yang berasal dari tanaman

yang saat ini banyak digunakan, salah satunya adalah paclitaxel. Paclitaxel atau

yang dikenal dengan nama dagang taxol, merupakan senyawa diterpenoid.

Senyawa ini umumnya diproduksi oleh endofit Pestalotiopsis microspora, yang

diisolasi dari tanaman Taxus andreanae, T. brevifolia dan T. wallichiana yang

efektif untuk mengatasi kanker rahim, kanker payudara stadium lanjut, kanker

paru-paru, dan sarcoma karposi. Molekul taxol di dalam tubuh akan berinteraksi

dengan tubulin. Tubulin merupakan komponen dominan dalam mikrotubulus,

berbentuk seperti silinder dan merupakan bagian dari sistem kerangka sel.

Interaksi taxol dengan tubulin akan membentuk ikatan taksol-tubulin sehingga

menciptakan sel yang stabil yang berakibat terhalangnya perubahan formasi

protein. Taxol juga disebut sebagai penstabil mitosis, karena jika taxol

membentuk ikatan dengan tubulin maka protein akan kehilangan fleksibilitasnya

dan mikrotubulus tidak akan bisa dirombak lebih lanjut. Studi lain

memperlihatkan bahwa taxol hanya berikatan dengan tubulin yang telah

terpolimerisasi dalam suatu rantai protofilamen yang biasa terdapat pada sel

kanker, bukan dengan protein bebas (Katzung, 1994; BPOM RI, 2003; Strobel

dan Daisy, 2003; Radji, 2005).

Berdasarkan beberapa contoh obat antikanker tersebut, sifat mutagenik

yang dimiliki suatu senyawa dapat dimanfaatkan sebagai antikanker. Selain itu,

senyawa mutagenik dapat juga mencegah terjadinya mutasi. Kaleeswaran dkk.

(2009) melaporkan hasil penelitiannya tentang senyawa sylimarin yang diisolasi

dari tanaman Silybum marianum. Senyawa ini memiliki sifat mutagenik, dan

dapat berfungsi sebagai antimutagenik. Sifat mutagenik yang dimiliki oleh

senyawa ini efektif meningkatkan sintesis MGMT (O6-methylguanine-DNA

methyltransferase levels). MGMT merupakan suatu enzim yang berfungsi dalam

proses perbaikan protein DNA, melindungi sel dan oncogen yang dapat aktif jika

terkena induksi oleh senyawa mutagenik pengalkil baik yang berasal dari dalam

sel (endogenous alkilating agent) atau yang berasal dari luar sel (exogenous

alkylating agent) (Niture dkk., 2007).

C. Deteksi Golongan Senyawa Partisi Teraktif

Setelah melakukan uji mutagenisitas dengan menggunakan 3 bakteri uji,

diperoleh hasil bahwa hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre bagian larut

wasbensin menunjukkan sifat mutagenik yang lebih besar bila dibandingkan

bagian yang tidak larut wasbensin, sehingga bagian larut wasbensin dideteksi

golongan senyawanya dengan metode KLT dan beberapa pereaksi semprot.

Profil KLT hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre larut wasbensin

dengan berbagai deteksi penampak bercak dapat dilihat pada Gambar 7.

Gambar 7. Profil KLT hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre larut wasbensin deteksi dengan (A) sinar tampak (B) UV254 (C) UV366 (D) serium (IV) sulfat

Fase diam : Silika Gel GF254 Fase gerak : Kloroform (CHCl3) Jarak Pengembangan : 7 cm

A B C D

Rf

0,75

0,5

0,25

0

1

Deteksi hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre larut wasbensin

dengan sinar tampak (visibel) (Gambar 7.A) memperlihatkan beberapa bercak

berwarna kuning, hijau dan coklat. Deteksi dengan sinar UV254 (Gambar 7.B)

memperlihatkan terjadinya peredaman yang ditandai dengan adanya beberapa

bercak yang berwarna gelap berlatar belakang flouresensi hijau. Peredaman yang

terjadi pada UV254 ini menunjukkan adanya suatu senyawa. Deteksi dengan sinar

UV366 (Gambar 7. C) memperlihatkan beberapa bercak yang berflouresensi. Ini

menunjukkan bahwa senyawa tersebut memiliki ikatan rangkap terkonjugasi yang

panjang sehingga dapat berpendar pada penyinaran dengan UV gelombang

panjang. Deteksi untuk senyawa organik secara umum dilakukan penyemprotan

dengan pereaksi semprot serium (IV) sulfat yang memperlihatkan bercak

berwarna coklat (Gambar 7. D) dengan nilai Rf 0,24, 0,39, 0,63, 0,69, 0,77, 0,84

dan 0,79.

Deteksi dilanjutkan dengan menggunakan berbagai pereaksi semprot yang

spesifik untuk mengetahui jenis golongan senyawa yang terdapat pada hasil partisi

ekstrak kloroform daun Ambre bagian larut wasbensin. Pereaksi semprot yang

digunakan diantaranya FeCl3 untuk mendeteksi senyawa flavonoid dengan respon

positif menunjukkan adanya perubahan warna menjadi kuning (Ristiningsih,

2009). Vanilin H2SO4 untuk mendeteksi keberadaan senyawa terpenoid dengan

respon positif menunjukkan adanya perubahan warna menjadi biru sampai ungu

(Sulistijowati dan Gunawan, 2001). Lieberman-Burchard untuk mendeteksi

keberadaan senyawa triterpenoid (steroid) dengan respon positif menunjukkan

adanya perubahan warna menjadi merah untuk triterpenoid atau biru untuk steroid

(Ristiningsih, 2009).

Profil KLT hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre larut wasbensin

dengan berbagai deteksi pereaksi semprot spesifik dapat dilihat pada Gambar 8.

Hasil KLT hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre larut wasbensin

dengan deteksi sinar tampak, sinar UV dan dengan pereaksi semprot spesifik

disajikan pada Tabel 4.

A B C

Gambar 8. Profil KLT hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre larut wasbensin deteksi dengan (A) Vanilin- H2SO4 (B) Liebermenn-burchard (C) FeCl3

Fase diam : Silika Gel GF254 Fase gerak : Kloroform (CHCl3) Jarak Pengembangan : 7 cm

RRf

0,75

0,5

0,25

0

1

Tabel 4. Hasil KLT hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre larut wasbensin dengan deteksi sinar tampak, sinar UV dan dengan pereaksi semprot spesifik

Penampakan Bercak Rf

visibel UV254 UV366 SS VA LB FeCl3 0,24 kuning peredaman - Coklat coklat - coklat 0,39 hijau gelap peredaman - Coklat hijau tua hijau ungu 0,63 kuning peredaman - Coklat ungu ungu ungu 0,69 hijau gelap peredaman putih Coklat ungu coklat ungu 0,77 coklat peredaman - Coklat - hijau kuning 0,84 - peredaman - Coklat coklat hijau - 0,97 kuning peredaman Putih Coklat ungu ungu -

Keterangan : 1. SS = Serium (IV) sulfat 2. VA = Vanilin –asam sulfat 3. LB = Lieberman-Burchard

Berdasarkan data yang diperoleh hasil positif ditunjukkan oleh deteksi

dengan vanilin-H2SO4 dan FeCl3. Hasil positif untuk vanilin-H2SO4 ditunjukkan

dengan bercak berwarna ungu yang menunjukkan adanya senyawa terpenoid

dengan nilai Rf 0,63, 0,69 dan 0,97. Hasil positif untuk FeCl3 ditunjukkan dengan

adanya bercak berwarna kuning yang menunjukkan adanya senyawa flavonoid

dengan nilai Rf 0,77. Senyawa terpenoid dan flavonoid ini diduga merupakan

senyawa yang menyebabkan mutasi.

Senyawa terpenoid golongan diterpenoid dan senyawa flavonoid dari

beberapa tanaman telah diketahui memiliki aktivitas antimutagenik dan antikanker

dengan berbagai metode penelitian. Sotto dkk. (2009) melaporkan, senyawa

diterpenoid secoisopimarane dari tanaman Salvia cinnabarina yang diteliti

dengan uji mutagenisitas, memiliki akitivitas sebagai antimutagenik dengan

menghambat senyawa mutagen. Senyawa diterpenoid andrografolida dari tanaman

Sambiloto (Andrographis paniculata Nees), senyawa clerocidin dari jamur dan

senyawa kuinon salvicina mampu membunuh sel kanker dengan mekanisme

apoptosis (Sukardiman dkk., 2005; Jamora dkk., 2001; Miao dkk., 2003).

Senyawa sylimarin yang merupakan salah satu jenis flavonoida dari

tanamanan Silybum marianum dilaporkan memiliki aktivitas antimutagenik

terhadap beberapa mutagen dengan uji mutagenisitas (Kaleeswaran, 2009). Isolat

flavonoid dari herba benalu mangga (Dendropthoe petandra) mampu

menghambat pertumbuhan kanker pada mencit yang diinduksi dengan

benzopirena (Sukardiman dkk., 1999).

Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa daun Ambre mengandung

senyawa terpenoid dan flavonoid yang berpotensi sebagai antikanker dengan sifat

mutasi yang dimilikinya. Diperlukan penelitian yang lebih lanjut untuk

mengetahui apakah sifat mutasi yang dimiliki daun Ambre benar-benar bersifat

selektif atau tidak, sehingga dapat dimanfaatkan untuk kepentingan manusia

khususnya dalam mengobati penyakit kanker.

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh, maka dapat disimpulkan

bahwa :

1. Bagian larut wasbensin ekstrak kloroform daun Ambre yang diuji dengan

menggunakan bakteri Salmonella typhimurium TA 98 dapat menyebabkan

frameshift mutation pada konsentrasi 10 µg/mL dan yang diuji dengan

menggunakan bakteri Salmonella typhimurium TA 100 dan galur TA 1535

dapat menyebabkan mutasi substitusi pasangan basa pada konsentrasi 100

µg/mL dan 500 µg/, sedangkan bagian tidak larut wasbensin hanya dapat

menyebabkan frameshift mutation pada konsentrasi 10 µg/mL.

2. Pada bagian larut wasbensin ekstrak kloroform daun Ambre ditemukan

senyawa golongan flavonoid dan terpenoid.

B. Saran

1. Perlu adanya uji mutagenisitas lanjutan misalnya dengan menggunakan

aktivator metabolik untuk mengetahui apakah senyawa yang terdapat pada

hasil partisi ekstrak kloroform daun Ambre masih bersifat mutagenik atau

tidak setelah mengalami proses metabolisme.

2. Perlu adanya penelitian untuk mengetahui daya hambat hasil partisi

ekstrak kloroform daun Ambre terhadap senyawa mutagenik dengan uji

antimutagenik.

3. Perlu adanya uji lanjutan dengan meneliti hasil partisi ekstrak kloroform

daun Ambre pada sel kanker atau pada enzim topoisomerase II.

4. Perlu adanya identifikasi lebih lanjut terhadap senyawa yang memiliki

sifat mutagenik tersebut dengan melakukan isolasi.

DAFTAR PUSTAKA

Akrele, J. O. and E. E. O. Ebor. 2002. Studies on the Genotoxic and Mutagenic Potentials of Mefloquine. Tropical Journal of Pharmaceutical Research. 1 (2): 91-98.

Ames, B.N., F. D. Lee and W. E. Durston. 1973. An Improved Bacterial Test System for the Detection and Classification of Mutagens and Carcinogens. Proc. Nat. Acad. Sci. 70 (3) : 782-786.1

Ames, B. N., W. E Durston, E. Yamasaki, and F. D. Lee. 1973. Carcinogens are Mutagens: A Simple Test System Combining Liver Homogenates for Activation and Bacteria for Detection. Proc. Nat. Acad. Sci. 70 (8) : 2281-2285.2

Aulia, Y., J. Sugiyanto dan Y. Aida. 2002. Efek Klorambusil Terhadap Perkembangan Fetus Tikus Putih (Rattus norvegicus) Galur Sprague-Dowley. Biota. 7 (3) : 101-108.

Backer, C. A. and Bakhuizen V.d. B. Jr. 1968. Flora of Java Volume 3.

Netherlands: Netherlands Organisation for the Advancement of Research.

BPOM RI. 2003. Beberapa Tanaman yang Berkhasiat Sebagai Antikanker. InfoPOM. Vol. 6.

Burgess, J. A., C. W. Stevens and W. E. Fahl. 1985. Mutation at Separate Gene Loci in Salmonella typhimurium TA 100 Related to DMA Nucleotide Modification by Stereoisomeric Benzo(a)pyrene 7, 8–Dio l-9, 10-Epoxides. Cancer Research. 45 : 4257-4262.

Cumming, J. and J. F. Smyth. 1993. DNA Topoisomerase I and II as Target of Rational Design of New Anticancer Drugs. Ann. Oncology. 3(7): 533-534.

Dalimartha, S. 2004. Deteksi Dini Kanker dan Simplisia Antikanker. Swadaya, Jakarta.

DeMarini, D.M., M. L. Shelton, A. Abu-Shakra, A. Szakmary, and J. G. Levine. 1998. Spectra of Spontaneous Frameshift Mutations at the hisD3052 Allele of Salmonella typhimurium in Four DNA Repair Backgrounds. Genetics. 149 : 17-36.

Departemen Kesehatan RI. 2009. Ambre. http://tanamanobat.org//artikel//tentang tanaman obat/depkes/ buu/ 1-134.pdf [10 April 2009].

Dewi dan M. Leni. 2006. Efektivitas Daya Tolak Ekstrak Geranium radula Cavan. Terhadap Nyamuk Aedes aegypti (Linn.). Koleksi Skripsi, Tesis dan Disertasi Perpustakaan UPI. http://digilib.upi.edu/pasca/available/etd-0626106-084844/ [ 2 Mei 2009].

Dillon, D., R. Combes, and E. Zeiger.1998. The Effectiveness of Salmonella Strains TA100, TA102 and TA104 for Detecting Mutagenicity of Some Aldehydes and Peroxides. Mutagenesis. 13 (1): 19-26.

Erma, N. N. S., T. Sundari, A. I. Susanty, D. R. O. Palupi, Isnaeni, dan Sukardiman. 2004. Kajian Pendahuluan Uji Toksisitas Ekstrak Air Miselia dan Tubuh Buah Jamur Shiitake (Lentinus edodes) dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BST). Berk. Penel Hayati. 10 : 13-18.

Erold, S. L. dan W. D. Stansfield. 2002. Genetika edisi keempat. Erlangga, Jakarta.

Foye, W. 1996. Prinsip-prinsip Kimia Medisinal Edisi II. UGM press, Yogyakarta.

Fulton, A. M., S. E. Loveless and G. H. Heppner. 1984. Mutagenic Activity of Tumor-associated Macrophages in Salmonella typhimurium Strains TA98 and TA100. Cancer Research. 44 : 4308-4311.

Gernpharmtox. 2009. AMES TEST: Bacterial Reverse Mutation Assay. http://www.genpharmtox.com/[ 1 Januari 2010].

Guadano, A., E.D.L. Pena, A. Gonzalez-Coloma, and J.E. Alvarez. 1999. Development of New Bioluminescent Mutagenicity Assay Based on the Ames Test. Mutagenesis. 14 (4): 411-415.

Harbone, J.B. 1987. Metode Fitokimia. ITB, Bandung.

Haworth, S., T. Lawlor, K. Mortelmans, W. Specks, and E. Zeiger. 1983. Salmonella Mutagenicity Test Result for Chemicals. Enviromental Mutagenesis Suplement. Vol. 1.

Isnawati, A. dan S. Alegantina. 2004. Efek Mutagenik Ekstrak Etanol Daun Kajibeling (Strobilantus crispus). Bul. Penel. Kesehatan. 32 (3): 112-118.

Jamora, C., M. A. Theodoraki, V. Malhotra, and E. A. Theodorakis. 2001. Investigation of the Biological Mode of Action of Clerocidin Using Whole Cells Assay. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 9 : 1365-1370.

Kaleeswaran, S., P. Sriram, D. Prabhu, C. Vijayakumar, and L. N. Mathuram. 2009. Anti- and Pro-Mutagenic Effects of Silymarin in the Ames Bacterial Reverse Mutation Assay. Phytother. Res. 23 : 1378–1384.

Katzung, B. G. 1994. Basic and Clinical Pharmacology, 6th

Edition. Prentice Hall International Inc., London.

Lehninger, A.L. 1982. Dasar-dasar Biokimia Jilid 3. Erlangga, Jakarta

Leny, S. 2006. Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Pudding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp. USU Repository, Medan.

Levin, D. E., L. J. Marnett, and B. N. Ames. 1984. Spontaneous and Mutagen-Induced Deletions: Mechanistic Studies in Salmonella Tester Strain TA102. Proc. Nal. Acad. Sci. 81: 4457-4461.

Levine, J. G., R. M. Schaaper and D. M. DeMarini. 1994. Complex Frameshift Mutations Mediated by Plasmid pKM101: Mutational Mechanisms Deduced From 4-Aminobiphenyl-Induced Mutation Spectra in Salmonella. Genetics. 136 : 731-746.

Little, C. A., D. J. Tweats and R. J. Pinney. 1989. Relevance of plasmid pKM101-mediated mutagenicity in bacteria to genotoxicity in mammalian cells. Mutagenesis. 4 (5): 371-376.

Maliya, A. 2004. Perubahan Sel Menjadi Kanker dari Sudut Pandang Biologi Molekuler. Infokes. 8 (1).

Miao Z. H., T. Tao, Z. Y. Xiang, Z. J. Sheng, and D. Jian. 2003. Cytotoxicity, Apoptosis Induction and Downregulation of MDR-1 Expression by the Anti-Topoisomerase II Agent, Salvicine, in Multidrug-Resistant Tumor Cells. International Journal of Cancer. 106 (1) : 108-115.

McCann, J., N. E. Spingarn, J. Kobori, and B. N. Ames. 1975. Detection of Carcinogens as Mutagens: Bacterial Tester Strains With R Factor Plasmids. Proc. Nat. Acad. Sci. 72 (3) : 979-983.

Myek, M. J., R. A. Harvey, P. C. Champe, and B. D. Fisher. 1997. Farmakologi Ulasan Bergambar Edisi 2. Widya Medika, Jakarta.

Nafrialdi dan S. Gan. 1995. Farmakologi dan Terapi. Fakultas Kedokteran UI, Depok.

Niture, S. K., C. S. Velu, Q. R. Smith, G. J. Bhat, and K. S. Srivenugopa. 2007. Increased Expression of the MGMT Repair Protein Mediated by Cysteine Prodrugs and Chemopreventative Natural Products in Human Lymphocytes and Tumor Cell Lines. Carcinogenesis. 28 (2) : 378-389.

Nogrady, T. 1992. Kimia Medisinal Pendekatan secara Biokimia. ITB, Bandung.

OECD. (Organisasion for Economic Coorperation and Development). 1997. Guideline for the testing of Chemical : Bacteria Reverse Mutation Test. Guideline.471.

Pato, U. 2003. Potensi Bakteri Asam Laktat Yang Diisolasi Dari Dadih Untuk Menurunkan Resiko Penyakit Kanker. Jurnal Natur Indonesia. 5 (2): 162-166.

Prival M. J. and E. Zeiger.1998. Chemicals Mutagenic in Salmonella typhimurium Strain TA1535 But Not in TA100. Mutation research. Genetic toxicology and environmental mutagenesis. Vol. 412 : 251-260.

Radji, M., A. Sumiaty, dan N. Indani. 2004. Uji Mutagenisitas dan Anti Kanker Ekstrak Aseton dan N-Heksana dari Kulit Batang Sesoot (Garcinia picrorrhiza Miq.). Majalah Ilmu Kefarmasian. 1(2): 69-78.

Radji, M. 2005. Peranan Bioteknologi dan Mikroba Endofit dalam Pengembangan Obat Herbal. Majalah Ilmu Kefarmasian. 2 (3) : 113-126.

Ristiningsih, T. 2009. Uji Antibakteri Komponen Bioaktif Daun Lobak (Raphanus sativus L var. hortensis Back.) Terhadap Staphylococcus aureus Rosenbach. dan Profil Kromatografi Lapis Tipisnya. Skripsi. Universitas Sebelas Maret. Surakarta.

Roberts, G. 2000. Bacterial Genetics. University of Wisconins, Madison. http://lecturer.ukdw.ac.id/dhira/BactGenetics/TOC.html [ 1 Januari 2010].

Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar, Jakarta.

Rothman, S. 2009. Flower Morphology Of Pelargonium Odoratissimum And Pelargonium Ionidiflorum Using Scanning Electron Microscopy. Smith College, Northampton MA.

Sanderson, K. E. and Y. A. Saeed. 1972. P22-Mediated Transduction Analysis of The Rough A (rfa) Region of the Chromosome of Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 112 (1): 58-63.

Sastrohamidjojo, H. 1991. Kromatografi. Liberti, Jakarta.

Savitri, E., Eryadi D. dan Nur Q. 2008. Audiology Figures for Nasopharynx Carcinoma Patients from Wahidin Sudirohusodo Hospital, Makassar Before and After Treatment with Cisplatin. The Indonesian Journal of Medical Science. 1 (1) : 17-21.

Setiadarma, K. 2001. Penentuan Mutagenesis berbagai Zat Kimia dengan Bakteria untuk Kepentingan Manusia (Pendahuluan). Badan Litbang Kesehatan, Jakarta.

Shoeibi S., Rahimifard N., Pirouz N., Yalfani R., Pakzad S. R., Mirab S., and Pirali H.M. 2009. Mutagenicity of Four Natural Flavors: Clove, Cinnamon, Thyme and Zataria multiflora Boiss. Journal of Medicinal Plants. 8 (5) : 89-96.

Skopek, T.R., H. L. Liber, J.J Krolewski, and W. G. Thilly. 1978. Quantitative Forward Mutation Assay in Salmonella typhimurium Using 8-Azaguanine Resistance as a Genetic Marker. Proc. Natl. Acad. Sci. 75 (1) : 410-414.

Sofyan, R. 2005. Terapi Kanker Pada Tingkat Molekuler. Cermin Dunia Kedokteran No. 127.

Sotto, A. D., S. Mastrangelo, G. Romussi, A. Bisio, and G. Mazzanti. 2009. Antimutagenic Activity Of a Secoisopimarane Diterpenoid From Salvia cinnabarina M. Martens et Galeotti in The Bacterial Reverse Mutation Assay. Food and Chemical Toxicology 47 : 2092–2096.

Sukardiman, IGP Santa dan Rahmadhany. 1999. Efek Antikanker Isolat Flavonoid dari Herba Benalu Mangga (Dendrophtoe petandra). Cermin Dunia Kedokteran 122 : 5-8.

Sukardiman, A. Rahman, W. Ekasari, dan Sisimandari. 2005. Induksi Apoptosis Senyawa Andrografolida dari Sambiloto (Andrographis paniculata Nees) terhadap Kultur Sel Kanker. Media Kedokteran Hewan. 21 (3): 105-110.

Sukardiman, W. Ekasari, dan P. P. Hapsari. 2006. Aktivitas Antikanker dan Induksi Apoptosis Fraksi Kloroform Daun Pepaya (Carica papaya L) terhadap Kultur Sel Kanker Mieloma. Media Kedokteran. 22 (2): 104-111.

Sulistijowati, A., dan Gunawan, D. 2001. Efek Ekstrak Daun Kembang Bulan (Tithonia diversifolia) Terhadap Candida albicans Serta Profil Kromatografinya. Cermin Dunia Kedokteran 130: 32-36.

Sumpena, Y., R. Sofyan dan R. Rusilawati. 2009. Uji Mutagenisitas Benzo(a)piren dengan Metode Mikronukleus pada Sumsum Tulang Mencit Albino (Mus musculus). Cermin Dunia Kedokteran. Vol. 36 (1).

Suprastiwi, E. 2009. Analisis Mutagenisitas Tiga Jenis Semen Ionomer Kaca (SIK). Departement of Conservative Dentistry, Faculty of Dentistry University of Indonesia.

Suzuki M., Matsui K., Yamada M., Kasai H., Sofuni T., and Nohmi T. 1997. Construction of Mutants of Salmonella typhimurium Deficient in 8-Hydroxyguanine DNA Glycosylase and Their Sensitivities to Oxidative Mutagens and Nitro Compounds. Mutation Research. 393 (3) : 233-246.

Stahl, E. 1985. Analisis Obat secara Kromatografi dan Mikroskopi, diterjemahkan oleh Kokasih Padmawinata dan Iwang Soedira. ITB, Bandung.

Strobel, G. and B. Daisy. 2003. Bioprospecting for Microbial Endophytes and Their Natural Products. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (4): 491-502.

Svehla, G. 1990. Buku Teks Analisis Anorganik Kualitatif Mikro dan Semimikro. PT. Kalman Media Pustaka, Jakarta.

Tejs, S. 2008. The Ames Test: A Methodological Short Review. Environmental Biotechnology. 4 (1) : 7-14.

Tim Pengajar Teknik Laboratorium. 2009. Mata Kuliah Teknik Laboratorium. Biologi FMIPA Universitas Sebelas Maret, Surakarta.

Totušek, J., D. Lefnerová, M. Kyseláková, J. Balík, J. Veverka, J. Tříska, and N. Vrchotová. 2009. Antimutagenic Activity of Raw Materials and By-Products from Production of Grape Wines .Czech J. Food Sci. 26: 55-59.

Wahnschaffe, U. A. Bitsch, J. Kielhorn and I. Mangelsdorf. 2005. Mutagenicity Testing with Transgenic Mice. Part I: Comparison with the Mouse Spot Test. Journal of Carcinogenesis. 4 :3.1

Wahnschaffe, U. A. Bitsch, J. Kielhorn and I. Mangelsdorf. 2005. Mutagenicity Testing with Transgenic Mice. Part II: Comparison with the Mouse Borne Marrow Micronucleus Test. Journal of Carcinogenesis. 4 :4.2

Wahyuni, D. S. C. dan R. Rakhmawati. 2008. Skrining Toksisitas Beberapa Tanaman di Kawasan Tawangmangu Surakarta dan Profil Kandungan Kimianya. Laporan Penelitian LPPM, Universitas Sebelas Maret.

Wegrzyn G. and A. Czyz. 2003. A REVIEW : Detection of Mutagenic Pollution of Natural Environment Using Microbiological Assays. Journal of Applied Microbiology 95 : 1175–1181.

Yuwono, T. 2005. Biologi Molekuler. Erlangga, Jakarta.

Zakaria, F.R. 2001. Pangan dan Pencegahan Kanker. Teknol dan Industri Pangan. 12 (2).

Zakaria, Z. A. 2007. Free Radical Scavenging Activity of Some Plants Available in Malaysia. Pharmacology and Therapeutics. 5 (1): 87-91.