TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Phạm Kiên Cườ Ể Ệ Ề … · 2014-12-25 · các vaccine dựa trên protein cấu trúc của WSSV để kí h thí h đáp

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Phạm Kiên Cường

NHÂN DÒNG VÀ BIỂU HIỆN TRÊN BỀ MẶT BÀO TỬ

BACILLUS SUBTILIS GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN VP28

CỦA VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM

Chuyên ngành: Hóa sinh học

Mã số: 62 42 01 16

DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2014

2

Công trình được hoàn thành tại:

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa

PGS.TS. Nguyễn Thị Vân Anh

Phản biện 1: .............................................

Phản biện 2: .............................................

Phản biện 3: .............................................

Luận án sẽ được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Đại học

Quốc gia họp tại: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

vào hồi......giờ......., ngày.......tháng.......năm 2015

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Quốc gia Việt Nam,

- Trung tâm thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội

1

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Nuôi tôm ở Việt Nam đã phát triển mạnh trong những năm gần đây

và trở thành ngành kinh tế quan trọng. Tuy nhiên, ngành nuôi trồng tôm ở

Việt Nam hiện đang đứng trước nhiều khó khăn như dịch bệnh, chất

lượng tôm giống sa sút. Sự bùng nổ của các dịch bệnh nghiêm trọng do

virus tr ng đó ó viru gây hội hứng đốm tr ng (WSSV), đã làm giảm

đáng kể sản lượng tôm, gây thiệt hại lớn về kinh tế ngành nuôi tôm.

Nhiều nghiên cứu trên thế giới được tiến hành để tìm ra giải pháp

hiệu quả chống lại WSSV nhưng kết quả thu được còn hạn chế. Một

hướng nghiên cứu được nhiều nhà khoa học trên thế giới hướng đến là tạo

các vaccine dựa trên protein cấu trúc của WSSV để kí h thí h đáp ứng

miễn dịch ở tôm chống lại bệnh đốm tr ng. VP28 là một loại protein vỏ

chính của WSSV, đóng vai trò hủ đạo giúp virus g n đặc hiệu lên tế bào

tôm, là bước khởi đầu cho quá trình lây nhiễm. Chính vì vậy, VP28 là

pr tein được lựa chọn để tạo kháng thể chẩn đ án WSSV ũng như tạo

vaccine cho tôm phòng bệnh đốm tr ng (Rout và tập thể, 2007;

Witteveldt và tập thể, 2004). Tuy nhiên, những kết quả nghiên cứu tạo

vaccine phòng bệnh đốm tr ng do WSSV ũng hỉ mới dừng lại ở mức

thử nghiệm nhỏ lẻ, hưa tạ được một vaccine chính thức, hiệu quả.

Xuất phát từ thự tế trên, húng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu

nhân dòng và biểu hiện trên bề mặt bào tử Bacillus subtilis gen mã hóa

kháng nguyên VP28 của virus gây bệnh đốm trắng ở tôm” để tạ ra bào

tử Bacillus subtilis biểu hiện kháng nguyên VP28 của virus gây bệnh đốm

tr ng làm ơ ở cho việc sản xuất vaccine dạng probiotic bền nhiệt giúp

phòng bệnh viru đốm tr ng trên tôm.

2

2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

- Nhân dòng, xá định được trình tự và một số đặ trưng ủa gen VP28 từ

các mẫu WSSV phân lập được ở á địa bàn nuôi tôm chủ yếu của Việt Nam.

- Tạ được chủng Bacillus subtilis tái tổ hợp biểu hiện gen mã hóa

protein kháng nguyên VP28 của WSSV trên bề mặt bào tử.

- Bướ đầu đánh giá được khả năng phòng bệnh đốm tr ng trên tôm

thẻ chân tr ng của chế phẩm bào tử B. subtilis biểu hiện VP28 trên bề mặt.

3. Đối tượng và nội dung nghiên cứu của đề tài

Đối tượng nghiên cứu của đề tài:

Gen mã hóa protein VP28 của virus gây bệnh đốm tr ng ở tôm.

Nội dung nghiên cứu của đề tài:

- Nhân dòng, xá định trình tự và một số đặ trưng ủa gen vp28 từ

các mẫu WSSV phân lập được ở Việt Nam.

- Xây dựng quy trình biểu hiện gen mã hóa cho VP28 trên bề mặt bào

tử Bacillus subtilis.

- Nghiên cứu thử nghiệm khả năng phòng bệnh đốm tr ng trên tôm

thẻ chân tr ng khi h tôm ăn thứ ăn trộn bào tử Bacillus subtilis biểu

hiện VP28.

4. Địa điểm thực hiện đề tài

Các nghiên cứu của luận án được thực hiện chủ yếu tại Phòng Thí

nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Pr tein, Trường Đại học Khoa

học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

Phần thử nghiệm khả năng bảo hộ tôm thẻ chân tr ng phòng bệnh

viru đốm tr ng được thực hiện với sự hỗ trợ, hợp tác của Viện Nghiên

cứu nuôi trồng Thủy sản I.

3

5. Đóng góp mới của đề tài

- Công trình nghiên cứu có tính hệ thống từ việc nhân bản, nhân

dòng và biểu hiện gen mã hóa protein VP28 tái tổ hợp ở E. coli và Bacillus

subtilis. Đề tài đã xá định trình tự và một số đặ trưng ủa gen VP28 từ

các mẫu WSSV phân lập được ở Việt Nam.

- Nghiên cứu biểu hiện thành công gen mã hóa protein VP28 của

WSSV trên bề mặt bào tử B. subtilis dưới dạng các cấu trúc protein dung

hợp CotB-VP28 và CotB-GST-VP28, tr ng đó, CotB là protein vỏ của B.

subtilis và GST (Glutathione S Transferase) là protein trung gian nhằm

hạn chế cản trở không gian đối với VP28.

- Đã tối ưu đượ điều kiện thu nhận bào tử tái tổ hợp B. subtilis biểu

hiện tốt kháng nguyên VP28 của WSSV trên bề mặt bào tử và nghiên cứu

các tính chất của bào tử tái tổ hợp B. subtilis CotB-VP28, CotB-GST-

VP28 trong một số điều kiện môi trường khác nhau.

- Đã đánh giá được ự tăng hoạt độ của các enzyme phenoloxidase

(PO), superoxide dismutase (SOD) phản ánh đáp ứng miễn dịch của tôm

thẻ hân tr ng và đánh giá khả năng phòng bệnh đốm tr ng trên tôm thẻ

hân tr ng với mứ bả hộ trên 70% của bào tử B. subtilis biểu hiện VP28

trên bề mặt.

6. Ứng dụng thực tiễn của đề tài

- Kết quả nghiên cứu của đề tài là ơ ở để tạo chế phẩm probiotic

dạng bào tử B. subtilis tái tổ hợp bền nhiệt, biểu hiện VP28 trên bền mặt,

có khả năng tăng ường miễn dịch và bảo vệ tôm khỏi nhiễm bệnh đốm

tr ng, giúp góp phần kiểm soát dịch bệnh trên tôm.

- Thành công của đề tài sẽ là tiền đề cho việc phát triển các vaccine

tái tổ hợp dạng bào tử B. subtilis tái tổ hợp có khả năng phòng bệnh do các

vi sinh vật khác gây ra ở tôm.

4

7. Bố cục của luận án

Luận án gồm 120 trang bao gồm: Phần mở đầu (3 trang); Tổng quan

tài liệu (40 trang); Đối tượng và phương pháp nghiên ứu (19 trang); Kết

quả và thảo luận (39 trang); Kết luận và kiến nghị (1 trang), Các công

trình khoa học của tác giả liên quan đến luận án (1 trang), Tài liệu tham

khảo (16 trang ,với 122 tài liệu gồm 2 thứ tiếng tiếng Việt (8 tài liệu) và

tiếng Anh (11 tài liệu). Luận án có 15 bảng, 43 hình.

5

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu chung về virus gây bệnh đốm trắng ở tôm

Virus gây bệnh đốm tr ng (White Spot Syndrome Virus, đượ viết

t t là WSSV) thuộc họ Nimaviridae và chi Whispovirus

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTV/). VP28, đượ mã hóa bởi đ ạn gen

hay khung đọ mở(ORF) 421 bp (wsv421), là một protein vỏ quan trọng,

đóng vai trò rất quan trọng trong những bướ đầu tiên của quá trình nhiễm

WSSV vào tôm (Van Hulten và tập thể, 2001). Ch đến nay hưa ó giải

pháp hiệu quả để ngằn ngừa sự tấn công của loại virus này ở tôm.

1.2. Nghiên cứu tạo vaccine dựa trên kháng nguyên vỏ WSSV

Tôm thuộ nhóm động vật giáp xá , ó hệ miễn dịch òn ơ khai,

nhưng một số nghiên cứu gần đây h thấy có khả năng phòng ngừa đặc

hiệu WSSV khi được kích thích bởi các dạng kháng nguyên VP28. Vì vậy

protein VP28 đã đượ họn làm kháng nguyên đí h tr ng việ tạ á hế

phẩm dạng va ine để phòng ngừa bệnh đốm tr ng ở tôm. VP28 đã được

biểu hiện thành công ở E. coli (Zhang và tập thể, 2002; Sathish và tập thể,

2004; Witteveldt và tập thể 2004; Jha và tập thể, 2005; Caipang và tập thể,

2008; Hou và tập thể, 2011; Syed-Musthaq và tập thể, 2011; Mu và tập thể,

2012). Sử dụng VP28 tái tổ hợp là một biện pháp giúp tăng khả năng ống

sót của tôm đối với WSSV. Tuy vậy, phương pháp này có hạn hế là khó

áp dụng trên thực tế do protein VP28 không bền vững nếu như được cho

trực tiếp và á đầm nuôi tôm, việ ử dụng bằng á h tiêm từng á thể

mất nhiều thời gian, ông ứ và hi phí để sản xuất VP28 ũng rất cao.

D đó, gần đây đã ó một ố nghiên cứu tập trung vào việc phát triển các

dạng vaccine vi khuẩn sống tái tổ hợp biểu hiện VP28. ết quả thu đượ

cho thấy rằng các loại bào tử tái tổ hợp VP28 giúp bảo vệ và tăng tỷ lệ

6

sống của tôm khi thử nghiệm với WSSV so với tôm hưa được dùng bào

tử tái tổ hợp VP28 (Fu và tập thể, 2010; Ning và tập thể, 2011). Tuy vậy

các kết quả nghiên cứu mới chỉ là bướ đầu, hưa ó một loại vaccine

chính thứ nà được tạo ra. Vì vậy việc tiếp tục nghiên cứu để tạ được

vaccine phòng bệnh đốm tr ng là hết sức cần thiết.

7

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng và nguyên liệu

2.1.1. Đối tượng

23 mẫu tôm có biểu hiện nhiễm WSSV được thu thập từ các đầm

nuôi tôm tại các địa phương khác nhau (Hải Phòng; Huế; Khánh Hòa;

Thành phố Hồ Chí Minh; Só Trăng; Ninh Thuận; Bến Tre; Bình Định,

Kiên Giang; Trà Vinh), được bảo quản ở -80oC hoặc trong cồn 95

oC. Tôm

thẻ chân tr ng (2-5g/con) dùng trong thử nghiệm thử thách khả năng bảo

hộ phòng ngừa WSSV được lấy từ Phân viên nghiên cứu nuôi trồng Thủy

sản B c Trung bộ thuộc Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1.

2.1.2. Nguyên liệu

Chủng vi khuẩn B. subtilis PY79 và vector pDG364, pDG364-CotB;

pDG364-CotB-GST là quà tặng của GS. Simon Cutting, Đại học Hoàng

gia Holloway, London, Vương quố Anh.

Các chủng vi khuẩn E. coli DH5α; E. coli BL21 (DE3 RIL được

mua từ hãng Novagen. Vector pET28b của hãng Novagen (Mỹ); các

oligonucleotide của hãng Life Technology, kit nhân dòng trực tiếp sản

phẩm PCR pGEM TA easy vàT DNA liga e được mua từ hãng

Promega; thang chuẩn protein, thang chuẩn DNA 1kb và 100 bp, hỗn hợp

dNTP được mua từ hãng Fermentas; Hot-Taq DNA p lymera e được

mua từ hãng Enzynomics; kit thôi gel được mua từ Bioneer; MagPure

viral DNA/RNA nan kit được mua từ ANABIO R&D; Qiaprep-miniprep

kit được mua của hang Qiagen; lyz zyme được mua từ hãng Biobasic.

Các cặp mồi được thiết kế đặc hiệu h á đ ạn gen mã hóa cho

VP28 của virus gây bệnh đốm tr ng WSSV, cotB; cặp mồi đặc hiệu cho vị

8

trí amyE front, amyE back của vector pDG 364, cặp mồi của vector pGEM

T và cặp mồi T7 promoter Fw/T7 terminator Rv của hãng Life Technology.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Thu nhận virus gây bệnh đốm tr ng từ mẫu tôm nhiễm bệnh

2.2.2. iểm tra ự ó mặt ủa WSSV bằng PCR và định lượng WSSV

bằng real-time PCR

2.2.3. Nuôi cấy tạo bào tử B. subtilis the phương pháp ủa Nicholson và

Setlow (1990)

2.2.4. Tách chiết DNA bằng kit ủa Qiagen, ANABIO R&D, Định lượng

DNA bằng đ độ hấp thụ ánh áng tử ng ại ở bướ óng 260 nm

2.2.5. Nhân bản và kiểm tra ự ó mặt ủa gen vp28 bằng PCR

2.2.6. Định lượng pr tein the phương pháp Brad rd (1976) và tinh sạch

proteinVP28 bằng k ái lự qua ột Hisbind

2.2. . iểm tra độ ạ h ủa pr tein bằng điện di gel p la rylamide ó SDS

(SDS-PGAGE) theo Laemmli (1970)

2.2.8. iểm tra ự biểu hiện ủa gen bằng SDS-PA E, thẩm tá h miễn

dị h và miễn dị h hu nh quang

2.2.9. Thử nghiệm khả năng phòng bệnh đốm tr ng của bào tử B. subtilis

tái tổ hợp thông qua đánh giá mứ độ ống ót ủa tôm qua thời gian au

khi h nhiễm WSSV và á hỉ ố h ạt độ phen l xida e, superoxide

dismutase.

9

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 NHÂN DÒN , XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ VÀ MỘT SỐ ĐẶC TRƯN

CỦA GEN VP28 TỪ CÁC MẪU WSSV PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM

3.1.1 Nh n n đ ạn g n m hóa P2 ng PCR

23 mẫu tôm nhiễm WSSV đã đượ thu thập tại á địa phương khá

nhau, DNA của các mẫu tôm bị nhiễm WSSV được tách chiết và dùng làm

khuôn cho phản ứng PCR để nhân đ ạn gen mã hóa h pr tein VP28 .

Hình 3.1: Nhân b n vp28 b ng PCR từ các mẫu tôm nhiễm WSSV ở

các địa điểm khác nhau

M: Thang chuẩn DNA 1kb ; - : Đối chứng âm

1-23:Sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen vp28 từ các mẫu tôm nhiễm

WSSV thu thập ở các địa phương khác nhau

Kết quả PCR (hình 3.1) cho thấy, cả 23 mẫu tôm dương tính với

WSSV đều có cho một băng DNA nhân bản duy nhất với kí h thướ như

tính toán lý thuyết (615 bp) của vp28. Tr ng khi đó, mẫu đối hứng âm,

mẫu không ó DNA thì không xuất hiện băng DNA. Kết quả này cho phép

khẳng định rằng húng tôi đã nhân bản thành ông đ ạn gen mã hóa cho

VP28 từ DNA hệ gen của tôm nhiễm viru đốm tr ng

3.1.2. Xác định trình tự và nghiên cứu tính đa hình của gen mã hóa VP28

Đ ạn gen nhân bản bằng PCR ủa á mẫu nghiên ứu đã đượ nhân

dòng vào ve t r p E T tạ ra dạng ve t r tái tổ hợp p E -VP28 và au

10

đó á gen vp28 tr ng ve t r tái tổ hợp đã đượ xá định trình tự. hi ánh

trình nu le tide và trình tự a id amin uy diễn ủa vp28 với trình tự vp28 đã

đượ ông bố trướ đó (Phan Thị Phượng Trang và tập thể, năm 2003) ủa

Việt Nam mang mã ố AY168644 (Bảng 3.2) thì thấy rằng ó 5 ự ai khá về

trình tự nu leotide đượ phát hiện, đó là A125 , A183 , A22 , A 03 ,

T51 C và tr ng 5 ai khá này dẫn đến ự thay đổi trình tự a id amin

(A125G ->D42G, A183G -> T76A, A403G-> T135A, T517C-> C173R).

B ng 3.2: Một số sai khác của về trình tư nucl tid và acid amin của

VP28 thu thập tại Việt Nam so với trình tự đ công ố (AY168644)

Tên mẫu Sai khác

nucleotide

Sai khác mức axit

amin suy diễn

Só Trăng, Ninh Thuận, Cam Ranh

1.2 Khánh Hòa và Cần Giờ 1, 4, 7, 9,

10 ở thành phố Hồ Chí Minh

Bến Tre, Bình Định 1, Điền Hương 1,

2, Phong Hải ở Huế Cần Giờ 2, 3, 5,

6, 8 ở thành phố Hồ Chí Minh, Kiên

Giang, Hải Phòng, Trà Vinh

A125G D42G

Bình Định 2 A403G T135A

Cần Giờ 2

A125G D42G

A183G T76A

A226G

T517C C173R

11

Các nghiên cứu của Wang và tập thể (2008) cho thấy các vị trí quyết

định kháng nguyên của VP28 là các vị trí từ a id amin 28 đến , 8 đến

93 và 171đến 20 . D đó A125 dẫn đến sự thay thế aspartatic bằng

glycine (D42G) và T517C dẫn đến sự thay thế cysteine bằng arginine

(C173R) của các mẫu thu được từ Bến Tre, Bình Định (1), Huế và Cần

Giờ (2) ở thành phố Hồ Chí Minh là những sai khác trong vị trí quyết định

kháng nguyên của VP28 và rất cần được quan tâm trong các nghiên cứu

tiếp theo. 3 trong số 23 trình tự gen vp28 có những khác biệt đáng lưu

với các ký hiệu 05VN.VP28.HCM2.12, 06VN.VP28.BD1.11,

0 VN.VP28.BD2.12 đã đượ đăng k trên enBank với các mã số

(accession number) tương ứng là JX444992.1, JX444993.1 và JX444994.1.

3.2. NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA VP28

3.2.1. Biểu hiện P28 b ng hệ thống vector pET28b trong E. coli

Ve t r tái tổ hợp đượ k hiệu là pGEM – VP28 và đượ tá h ra ở

dạng tinh ạ h đượ dùng làm khuôn h phản ứng PCR. Cặp mồi đặc

hiệu (VP28.2 Fw/Rv được thiết kế dựa trên trình tự nu le tide hai đầu của

gen vp28 ó đưa và thêm trình tự nhận biết của BamHI ở đầu và HindIII

ở cuối để thuận tiện cho ghép gen vào vector pET28b về sau.

Đ ạn gen vp28 nhân bản bằng ặp mồi VP28.2 Fw/Rv đượ xử lý

bằng HindIII và BamHI và g n và pET28b ũng đã đượ xử l bằng ùng

hai enzyme, ử dụng enzyme g n T DNA liga e. Sản phẩm g n đượ biến

nạp vào chủng E. coli BL21-RIL. Vector tái tổ hợp pET28b-VP28 au đ

đã được tách ra, tinh sạch và giải trình tự đ ạn gen vp28, sử dụng cặp mồi

T7Fw/Rv. Kết quả đọc trình tự khẳng định ch c ch n gen vp28 đã đưa được

g n và ve t r pET28b đúng trình tự và vị trí khung đọ . D đó, đủ ơ ở

để khẳng định đã nhân dòng thành ông gen vp28 vào vector pET28b.

12

Kết quả biểu hiện gen vp28 được kiểm tra bằng SDS-PAGE và thẩm

tách miễn dịch (Hình 3.6) cho thấy dịch chiết tế bào BL21-RIL mang

vector pET28b-VP28 có chứa băng pr tein 28 kDa, (Đường chạy 7, 8, 9,

Hình 3. A . Tr ng khi đó, ở mẫu đối chứng âm (tế bào BL21-RIL không

mang vector pET28b-VP28) không ó băng pr tein này. Kết quả thẩm tách

miễn dịch, sử dụng kháng thể đặc hiệu kháng VP28 ũng h thấy sự có

mặt của băng pr tein 28 kDa ở các mẫu tương ứng với mẫu trên SDS-

PA E. (Đường chạy 7, 8, 9, Hình 3.6B). Từ đó, húng tôi kết luận rằng đã

biểu hiện được VP28 ở E. coli.

Hình 3.6: SDS-PAGE (A) và thẩm tách miễn dịch (B) kiểm tra biểu

hiện VP28 ở E. coli

- 1: Dịch đồng nhất tủa tế bào

BL21-RIL

- 7: Dịch đồng nhất tủa tế bào BL21-

RI mang pET28b-VP28

- 2: Dịch chiết protein tổng số tế

bào BL21-RIL

- 8: Dịch chiết protein tổng số tế bào

BL21-RIL mang pET28b-VP28

- 3: Dịch hòa phân đoạn tủa tế

bào BL21-RIL

- 9: Dịch hòa phân đoạn tủa tế bào

BL21-RIL mang pET28b-VP28

- 4, 6: không tra mẫu - 5: Protein marker

925

bp

13

Dịch chiết tế bào có chứa pr tein VP28 (dưới dạng g n với Hi tag)

au đó được tinh sạch bằng cách cho s c ký qua cột His-bind. Kết quả

kiểm tra độ tinh sạch của protein VP28 (Hình 3.7A) cho thấy việc sử dụng

cột His-bind trong tinh sạ h pr tein VP28 thu được hiệu quả tốt bởi hầu

hết các thành phần protein phức tạp bị loại bỏ hết. Tr ng á phân đ ạn

rửa chiết bằng imidaz l, húng tôi thu được chỉ một băng pr tein ó kí h

thước khoảng 28 kDa, tương ứng với kí h thước của protein VP28 tái tổ

hợp. So sánh kết quả thẩm tách miễn dịch (Hình 3.7B) với kết quả SDS-

PAGE cho thấy những băng pr tein xuất hiện trên màng PDVF có cùng

kí h thước 28 kDa với á phân đ ạn tinh sạ h khi điện di SDS-PAGE cho

phép khẳng định rằng húng tôi đã tinh ạch thành công protein VP28. Kết

quả định lượng protein cho thấy từ 100 ml dịch nuôi cấy, húng tôi đã thu

được tổng số 1,26 mg protein VP28-Histag. Protein VP28 tinh sạ h được

sử dụng làm đối chứng dương tr ng á nghiên ứu về biểu hiện trên bề

mặt bào tử tiếp theo.

Hình 3.7: Kết qu SDS-PAGE (A) và thẩm tách miễn dịch (B) kiểm

tra độ tinh sạch của VP28

1: Dịch chiết tế bào có chứa protein VP28lên cột His-bind

2: Dịch rửa cột His-bind bằng đệm A có imidazol 5 mM

3: Dịch rửa cột His-bind bằng đệm A có imidazol 80 mM

14

4: Dịch rửa cột His-bind bằng đệm A có imidazol 100 mM

5: Thang chuẩn p otein

6-9 Dịch rửa chiết cột His-bind bằng đệm A có Imidazol 250 mM

3.2.2. Biểu hiện VP28 dạng dung hợp với protein CotB trên bề mặt

bào tử B. subtilis

Plasmid pDG364-cotB, pDG364-cotB- ST đượ tạ thành từ

plasmid pD 3 ó g n thềm gen tB, tB- ST ở vị trí enzyme giới

hạn BamHI, HindIII. Việ dung hợp thêm pr tein ST (26 kDa) ó thể

làm tăng khả năng bộ lộ ủa pr tein ng ại lai trên bề mặt bà tử B.

subtilis (Li và tập thể, 2008). Vector pDG364-cotB, pDG364-cotB-GST

đượ lựa họn để biểu hiện VP28 trên bề mặt bà tử B. subtilis. Trong

ve t r tái tổ hợp pDG364cotB-VP28, pDG364cotB-GST-VP28 tạ

đượ đã ba gồm những vùng pr m ter tB (P tB và đ ạn gen ó

kí h thướ 825 bp, 1325 bp tương ứng mã hóa h CotB ải biến và

C tB ó g n ST.

Đ ạn gen vp28 đượ nhân lên từ p E -VP28 bằng PCR ử dụng

ặp mồi VP28.3 Fw và VP28.3 Rv có hứa trình tự ủa HindIII ở đầu Fw

và EcoRI ở đầu Rv để thuận tiện cho việ đưa và vector pDG364-cotB,

pDG364-cotB-GST au này. Để đưa đượ đ ạn gen vp28 vào vector

pDG364-cotB, pDG364-cotB-GST cả đ ạn gen VP28 nhân bản bằng PCR

và pDG364-cotB và pDG364-cotB- ST đều được xử lý bằng HindIII và

EcoRI để tạ đầu g n tương thí h. en và ve t r tương ứng đượ g n bằng

T4 DNA ligase và đượ biến nạp và tế bà E. coli DH5α. Các khuẩn lạc

thu được sau quá trình biến nạp được kiểm tra bằng phương pháp PCR, với

cặp mồi của vp28 và của vector pDG364. ết quả phân tí h PCR, đọc trình

tự cho thấy gen mã hóa VP28 đã đượ đưa vào vector pDG364-cotB và

pDG364-cotB- ST đúng trình tự và vị trí khung đọ . Như vậy, ó thể kết

15

luận rằng húng tôi đã tạo thành công vector tái tổ hợp pDG364-cotB-

vp28 và pDG364-cotB-GST-vp28.

Để dung hợp đ ạn gen cotB-vp28, cotB-GST-vp28 vào hệ gen của B.

subtilis PY79 dựa trên ơ hế tra đổi chéo kép tương đồng, húng tôi đã

sử dụng enzyme XhoI t mở vòng ve t r này và au đó tiến hành biến nạp

vào tế bào B. subtilis PY79. Kết quả kiểm tra bằng á h nuôi ấy vi khuẩn

trên đĩa thạch có hứa 1% tinh bột và chloramphenicol 5µg/ml cho thấy

các khuẩn lạ được kiểm tra đều không òn khả năng tổng hợp amylase

thủy phân tinh bột, hứng tỏ đ ạn gen cotB-vp28, cotB-GST-vp28 đã được

dung hợp vào hệ gen B. subtilis PY79 (Hình 3.10).

A B

Hình 3.10: Kiểm tra sự có mặt của gen dung hợp trong DNA hệ gen B. subtilis

A) Đĩa thạch LB chứa các khuẩn lạc B.subtilis mọ được trên môi

trường có kháng sinh CM

B) Đĩa (A au khi lựa chọn cấy chuyển ang đĩa LB+ tinh bột 1 , gạt

bỏ á khuẩn lạ để kiểm tra vòng phân giải tinh bột

1-30: các khuẩn lạc kiểm tra 1-30

ĐC(-): B. subtilis PY79 dạng thể dại không chứa đ ạn gen dung hợp

Để kiểm tra ch c ch n sự có mặt của gen cotB-vp28, CotB-GST-

vp28 trong hệ gen của B. subtilis, chúng tôi tiến hành nuôi và tách

DNA của 02 khuẩn lạ dương tính. ết quả phản ứng PCR với các cặp

mồi vp28, tB, pD 3 , đã thu được những kết quả hoàn toàn phù

hợp với tính toán lý thuyết.

16

Từ kết quả này, có thể kết luận rằng đã dung hợp thành công gen

cotB-vp28, CotB-GST-vp28 vào hệ gen của B. subtilis và chủng tái tổ hợp

đượ k hiệu là B. subtilis CotB-VP28 và B. subtilis CotB-GST-VP28.

Một số khuẩn lạc của 2 chủng tái tổ hợp CotB-VP28 và CotB-GST-VP28

được chọn nuôi, tạo bào tử để kiểm tra sự biểu hiện của VP28. So sánh bào

tử của chủng chuẩn B. subtilis PY79 với bào tử của chủng CotB-VP28 và

CotB-GST-VP28, chúng tôi nhận thấy không có sự khác biệt về mặt hình

thái. Bào tử tạo thành bởi 3 chủng đều đạt hơn 95 .

Với mụ đí h xá định VP28 có biểu hiện trên lớp áo của bào tử và

dung hợp với CotB hoặc CotB-GST hay không, chúng tôi đã thu dịch chiết

tổng số từ 5× 109 bào tử chủng B. subtilis PY79, CotB-VP28 và CotB-

GST-VP28 và phân tích ự ó mặt ủa VP28 bằng SDS-PA E và thẩm

tá h miễn dị h ử dụng kháng thể đa dòng kháng VP28. Theo tính toán lý

thuyết, protein dung hợp giữa CotB-VP28 có KLPT khoảng 63 kDa (CotB

khoảng 35 kDa và VP28 kh ảng 28 kDa), tr ng khi đó pr tein dung hợp

CotB-GST-VP28 ó kí h thước khoảng 89 kDa d ó thêm GST (26 kDa).

Hình 3. 13: Kết qu SDS-PAGE (A) và thẩm tách miễn dịch (B) kiểm

tra sự biểu hiện VP28 trên bào tử B. subtilis

17

(+ : Đối chứng dương, pr tein VP28 tinh ạch

M: Thang chuẩn protein

1: Bào tử B. subtilis cotB-vp28 biểu hiện protein CotB-VP28

2: Bào tử B. subtilis PY79 chủng chuẩn

3: Bào tử B. subtilis cotB-GSTvp28 biểu hiện CotB-GST-VP28

Kết quả SDS-PAGE và thẩm tách miễn dịch (hình 3.13) cho thấy ó

sự xuất hiện băng pr tein với KLPT khoảng 63 kDa trong dịch chiết bào tử

CotB-VP28 (đường chạy 1 và băng pr tein với khối lượng phân tử

khoảng 89 kDa trong dịch chiết áo bào tử tương ứng với kí h thước của

CotB-GST-VP28 (đường chạy 3 . Tr ng khi đó, ở đường chạy số 2 là mẫu

bào tử hình thành từ tế bào B. subtilis chủng PY79 không xuất hiện băng

protein nào.

Áp dụng phương pháp dùng phần mềm SCION IMAGE (Nguyễn Thị

Vân Anh và tập thể, 2013), với lượng VP28 chiết xuất từ 5x109 bào tử

CotB-VP28 và CotB-GST-VP28 vào khoảng 225 ng, căn ứ vào KLPT

của VP28 (27,5 kDa), có thể tính toán đượ rằng ó khoảng 1000 phân tử

VP28 tái tổ hợp đượ biểu hiện trên một bà tử B. subtilis. Kết quả này,

bướ đầu khẳng định bào tử B. subtilis của 2 chủng tái tổ hợp đã biểu hiện

protein dung hợp CotB-VP28, CotB-GST-VP28.

ết quả kiểm tra khả năng biểu hiện protein VP28 và GST-VP28

trên bề mặt bào tử bằng phương pháp miễn dịch hu nh quang (hình 3.14

h thấy, ở mẫu đối chứng âm là mẫu bào tử PY79 thể dại, các tín hiệu

màu đỏ quan át được rất yếu, hầu như không rõ. Tr ng khi đó, ở cùng

điều kiện kích thích, mẫu bào tử CotB-VP28, CotB-GST-VP28 cho thấy

các tín hiệu màu đỏ sáng nét, rõ ràng, chứng tỏ bào tử tái tổ hợp biểu hiện

VP28 mạnh hơn nhiều so với dạng bào tử PY79. Như vậy, protein dung

18

hợp CotB-VP28, CotB-GST-VP28 đã đượ biểu hiện thành ông trên bề

mặt bào tử B. subtilis.

Hình 3.14: Ảnh chụp ết u ph n tích miễn dịch huỳnh quang kiểm tra biểu

hiện CotB-VP28 và cotB-GST-VP28 trên bề mặt bào tử B. subtilis

Ning và tập thể (2011) đã biểu hiện protein VP28 trên bề mặt của

bào tử B. subtilis sử dụng một đ ạn DNA 825 bp mã hóa cho 275 acid

amin đầu tiên của CotB làm yếu tố dung hợp. Mặc dù, mứ độ biểu hiện

của protein VP28 tr ng nghiên ứu ủa nhóm tá giả này khi được kiểm

tra bằng điện di gel p lya rylamide là không rõ nét, nhưng á kết quả thử

nghiệm ban đầu khẳng định chế phẩm tạo ra có khả năng giúp tôm kháng

lại sự tấn công của viru đốm tr ng.

Các chủng CotB-VP28, CotB-GST-VP28 được lấy ra và nuôi cấy tạo

bào tử và nghiên cứu một số tính chất của bào tử cho thấy bào tử tái tổ hợp B.

subtilis cotB-VP28 và cotB-GST-VP28 được tạo thành tối ưu tr ng môi

19

trường DSM sau 48 giờ và đạt mật độ tương ứng là 3,1 x 109, 4,2 x 10

9,

bền ở nhiệt độ 80oC, nồng độ muối 4% và chịu được pH trong khoảng từ

2-10, có thể bảo quản ở điều kiện khô ráo ở nhiệt độ ngoài trời (25-37o C)

trong vòng 3 tháng.

3.3. HẢ NĂN PHÒN BỆNH ĐỐ TRẮN TRÊN TÔ THẺ

CHÂN TRẮN CỦA BÀO TỬ TÁI TỔ HỢP

3.3.1 Sự tồn tại của bào tử B. subtilis biểu hiện VP28 trong ruột tôm

thẻ chân trắng

Thứ ăn au khi trộn với bào tử và dầu bao áo (chất kết dính) có cảm

quan về màu s không thay đổi, không bị dính bết và vẫn là dạng hạt nhỏ

riêng rẽ nhau. Kết quả đếm thể hiển các mẫu thứ ăn trộn bào khi kiểm tra

đúng chủng vi khuẩn như ghi trên nhãn ản phẩm và có nồng độ gần với

nồng độ dự kiến ban đầu khi trộn, khoảng 1 x 109 CFU/gam. Kết quả đánh

giá mứ độ sống ót ủa bà tử ở nồng độ pha loãng 10-2

, trong ruột tôm

(hình 3.22) h thấy khi h tôm ăn thứ ăn trộn bào tử B. subtilis CotB-

VP28 và C tB-GST-V28, mật độ bào tử tr ng ruột tôm tăng dần the thời

gian, chứng tỏ sự tồn tại của bào tử trong ruột tôm.

Hình 3.22: Sự tồn tại của bào tử B. subtils biểu hiện vp28 trong ruột tôm thẻ chân trắng

20

3.3.2 Đánh giá h năng ích thích miễn dịch trên tôm thẻ chân trắng

của bào tử tái tổ hợp

Để đánh giá khả năng kí h thí h miễn dịch của bào tử tái tổ hợp,

h ạt độ enzyme superoxide dismutase (SOD) và h ạt độ phenoloxidase

(PO) tr ng dị h huyết tương ủa á á mẫu tôm thí nghiệm đượ xá

định. ết quả thu đượ (hình 3.25) h thấy hoạt độ PO ở tất cả các mẫu

tôm được cho thứ ăn không bổ sung hay có bổ sung bào tử thể dại PY79,

bào tử B. subtillis CotB-GST-VP28 và CotB-VP28 thấp nhất ở thời điểm 0

ngày, tăng lên sau 7 hoặc 14 ngày tùy theo từng lô. Đáng hú là mẫu tôm

ăn B. subtilis C tB-VP28 ó h ạt độ PO a hơn đáng kể (30%) với

mẫu đối hứng.

Hình 3.25. Hoạt độ phenoloxidase (PO) trong hemolymph của tôm thẻ

chân trắng ăn à tử tái tổ hợp

Kết quả phân tí h h ạt độ SOD (hình 3.26) ở mô thịt ủa tôm cho thấy

có sự tăng h ạt độ SOD the thời gian, á hế phẩm B. subtilis dạng dại

hay tái tổ hợp đều ó tá dụng làm tăng h ạt độ SOD ủa tôm. Đặ biêt,

hế phẩm B. subtilis C tB- ST-VP28 làm tăng h ạt độ SOD rõ rệt nhất,

21

a nhất ở ngày 1 và tăng 84,3% với đối hứng. Tuy nhiên, hưa thấy

ó ự khá biệt rõ rệt về mứ tăng h ạt SOD giữa hế phẩm B. subtilis

CotB-VP28 và B. subtilis PY79.

Hình 3.26. Hoạt độ enzyme SOD trong mô thịt của tôm thẻ chân trắng

3.3.3. Đánh giá h năng o hộ trên tôm thẻ chân trắng của bào tử

tái tổ hợp

WSSV đượ phân lập từ nguồn tôm bệnh tại trang trại nuôi tôm ở Điền

Hương, Ph ng Điền, Huế. ẫu tôm bệnh đượ kiểm tra bằng PCR để

khẳng định nhiễm WSSV trướ khi tiến hành hiết viru . Bằng phương

pháp Real-time PCR húng tôi đã xá định được số bản copy của WSSV

trong dịch nghiên ứu là khoảng 7,73 x108 bản copy/ml. Tôm đượ h

nhiễm WSSV để xá định liều gây chết 75% (LD75). Kết quả thu được từ

thí nghiệm h thấy liều LD75 là 1,3x104 bản a /lít.

Nhằm xá định khả năng phòng bệnh đốm tr ng ở tôm thẻ chân tr ng

của bào tử B. subtilis CotB-VP28 và C tB- ST-VP28, tôm đượ h ăn

thứ ăn the á ông thứ : lô đối chứng âm, lô đối chứng dương ăn thức

ăn công nghiệp, còn các lô PY79, cotB-VP28 và cotB-GST-VP28 ăn thức

22

ăn ông nghiệp đã bổ xung loại bào tử tương ứng với một độ 109. Các lô

lặp lại 2 lần trong mỗi lần thử nghiệm. Sau 1 ngày, trừ lô đối chứng âm

tất ả á lô tôm còn lại đều đượ ông ường độc bằng WSSV với nồng

độ 1,3x104 bản a /lít. Tôm tiếp tụ h ăn thứ ăn thử nghiệm tương ứng

và theo dõi số lượng tôm òn ống trong 14 ngày ngày tiếp theo. Kết quả

theo dõi quá trình nuôi tôm và đánh giá ố tôm ống ót qua thí nghiệm

(hình 3.32) cho thấy tôm ở lô đối hứng dương ó biểu hiện ăn ít và b t

đầu hết au 2 ngày. Tỷ lệ hết tăng nhanh từ ngày thứ đến ngày thứ 9 và

100% tôm hết ở ngày 11 au khi ường độ . Tại lô thử nghiệm cho tôm

ăn thứ ăn ó bổ sung bà tử PY 9, tôm ó hiện tượng ăn ít ở ngày thứ 5.

Tỷ lệ tôm hết tăng nhanh từ ngày thứ đến ngày thứ 11, và tỷ lệ hết

lên tới 94,5% sau 14 ngày. Tại lô h ăn thứ ăn trộn bào tử cotB-

VP28, cotB-GST-VP28 và lô đối chứng âm tỷ lệ chết sau 14 ngày theo

ghi nhận đượ tương ứng là 19,23%, 26,67% và 25,81%.

Hình 3.32 Tỷ lệ chết tích lũy của các lô tôm khi đánh giá h năng o

hộ của bào tử B. subtilis tái tổ hợp

23

Như vậy, ó thể thấy rằng, mứ độ bảo hộ tôm thẻ chân tr ng hống

lại WSSV của các dạng bảo tử CotB-VP28 và CotB-GST-VP28 (ở mật độ

bào tử 1 x 109 CFU/g thứ ăn) tương ứng là 81% và 73,3%. Các giá trị này

đều cao hơn mức hiệu quả quy ướ (RPP≥ 0 khi kiểm định hiểu quả

bảo vệ của vaccine ở thủy sản và thỏa mãn á điều kiện về đánh giá

hiệu quả vaccine dùng cho thủy sản của Ủy ban châu Âu. D đó hế

phẩm thử nghiệm này có tiềm năng bảo vệ tôm chống lại bệnh đốm

tr ng do WSSV gây ra.

Nhìn hung lại, húng tôi thấy rằng hế phẩm bà tử B. subtilis

C tB-VP28 và C tB-GST-VP28 tạ ra tr ng nghiên ứu này thể hiện tính

bền với nhiệt, ổn định tr ng một dải pH rộng (2-10), hịu đượ nồng độ

muối a (4%). Cá hế phẩm này ó khả năng kí h thí h đáp ứng miễn

dị h ở tôm thẻ hân tr ng và khi đượ trộn và thứ ăn nuôi tôm đã thể

hiện khả năng bả hộ tôm hống lại viru gây bênh đốm tr ng ở mứ độ

tốt (trên 70 . Những tính hất mới ủa hế phẩm B. subtilis C tB-VP28

và C tB- ST-VP28 tạ ra là ơ ở để phát triển va ine dạng pr bi ti

dùng phòng bệnh đốm tr ng h tôm.

24

KẾT LUẬN

1. Đã nhân bản, nhân dòng và xá định trình tự gen mã hóa cho

protein VP28 (615 bp) từ 23 mẫu tôm bị bệnh đốm tr ng của á địa

phương khá nhau ở Việt Nam và phát hiện ra 5 sự sai khác về nucleotide

(A125G, A183G, A226G, A403G, T517C) so với trình tự gen đã ông bố

(AY168644). Trong số các sai khác về nucleotide, có 4 sai khác dẫn đến

sự sai khác acid amin.

2. Đã biểu hiện thành công gen mã hóa VP28 ở E. coli dưới dạng

VP28-His-tag và tạ được chế phẩm bào tử Bacillus subtilis tái tổ hợp với

sự biểu hiện VP28, GST-VP28 trên bề mặt bào tử dưới dạng dung hợp với

CotB của B. subtilis.

3. Bào tử tái tổ hợp B. subtilis cotB-VP28 và cotB-GST-VP28 được

tạo thành tối ưu tr ng môi trường DSM sau 48 giờ và đạt mật độ tương

ứng là 3,1 x 109, 4,2 x 10

9, bền ở nhiệt độ 80

oC, nồng độ muối 4% và chịu

được pH trong khoảng từ 2-10, có thể bảo quản ở điều kiện khô ráo ở nhiệt

độ ngoài trời (25-37o C) trong vòng 3 tháng.

. Đã xá định được dạng thứ ăn, á h thứ h tôm ăn thứ ăn

trộn bào tử B. subtilis tái tổ hợp và chứng minh sự tồn tại của bào tử

trong ruột tôm.

5. Thử nghiệm bướ đầu cho thấy bào tử B. subtilis dạng mang CotB-

VP28 và CotB-GST-VP28 có khả năng làm tăng h ạt độ phenoloxidase và

superoxide dismutase ở tôm thẻ chân tr ng và có khả năng bảo vệ tôm này

chống lại WSSV ở mức bảo hộ tương ứng là 81% và 73,3%.

KIẾN NGHỊ

Tiếp tục nghiên cứu khả năng phòng bệnh đốm tr ng trên tôm của chế

phẩm bào tử Bacillus subtilis cotB-VP28 và cotB-GST-VP28.

25

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ

LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Pham Kien Cuong, Bui Thu Thuy, Nguyen Viet Dung, Bui Thi

Ngoc Anh, Nguyen Thi Van Anh, Simon Cutting, Phan Tuan Nghia (2012),

"Polymorphism analysis of capsid protein VP28 encoding gene of white

spot syndrome virus isolated from Penaeus monodon shrimp in Viet

Nam", VNU. Journal of Science 28(2S), pp 88-95.

2. Anh Thi Van Nguyen, Cuong Kien Pham, Huong Thi Thu Pham,

Hang Luong Pham, Anh Hoa Nguyen, Lua Thi Dang, Hong Huynh Anh,

Simon Cutting, Tuan-Nghia Phan (2014), "Bacillus subtilis Spores

Expressing the VP28 Antigen:A Potential Oral Treatment to Protect

Litopenaeus vannamei Against White Spot Syndrome", FEMS

Microbiology Letters 358, pp 202–208.

3. Phạm Kiên Cường, Bùi Thị Ngọc Ánh, Trần Thi Thanh

Qu nh, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Thị Việt Hà, Phạm Thị Lương Hằng,

Nguyễn Thị Hồng Loan, Nguyễn Hòa Anh, Phan Tuấn Nghĩa (201 ,

"Nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên VP28 của virus

đốm tr ng trên lớp áo ngoài của bào tử B. subtilis", Tạp chí Công nghệ

Sinh học 12(2), pp 247-253.

Báo cáo hội nghị đ đăng 1. Phan Tuan Nghia, Pham Kien Cuong, Bui Ngoc Anh, Tran Thi

Thanh Quynh, Pham Thi Nga, Nguyen Thi Van Anh, Nguyen Hoa

Anh (2013), "Genetically engineered Bacillus spores expressing VP28 as

vaccine-probiotics against white spot syndrome virus in

shrimps", International Conference on Probiotics and their Applications,

May 31 -June 1 2013, in Hanoi, pp 12.

2. Pham Kien Cuong, Nguyen Thi Hong Loan, Pham Thi Thu

Huong, Pham Luong Hang, Nguyen Hoa Anh, Dang Thi Lua, Nguyen Thi

Van Anh, Simon Cutting, Phan Tuan Nghia (2014), "Cloning and

expression of VP28 on Bacillus subtilis spores for application as probiotics

to induce protection of Penaeus vannamei against white spot syndrome

virus", 6th

European Spore Conference, April 9-11, in London, pp 59 .

3. Tran Thi Tuyet Hoa, Hong Mong Huyen, Pham Kien Cuong,

Phan Tuan Nghia (2014), "Protection against white spot syndrome virus

infection in Penaeus monodon by oral administration of VP28-Bacillus

subtilis", The 9th Symposium on Diseases in Asian Aquaculture (DAA9),

24 - 28 November 2014, in Ho Chi Minh , pp 218.