Toxinas de Bacillus Thuringiensis

24 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - n 38

Pesquisa

Pesquisa

TOXINAS DE BACILLUSTHURINGIENSIS

Laura Massochin Nunes Pinto

Biloga (PUCRS) e Mestre e Doutoranda

em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida

Silvestre (UNISINOS).

Diouneia Lisiane Berlitz

Biloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia:

Diversidade e Manejo de Vida Silvestre

(UNISINOS).

Raquel Castilhos-Fortes

Biloga (UNISINOS) e Mestre em

Microbiologia Agrcola e do Ambiente

(UFRGS)

Lidia Mariana Fiuza

Engenheira Agrnoma (UPF), Mestre em

Fitotecnia Fitossanidade (UFRGS),

Doutora em Cincias Agronmicas

(ENSAM-Montpellier) e Ps-Doutora em

biotecnologia Vegetal (CIRAD-Montpellier).

toxicidade de B. thuringi-ensis est relacionada sn-tese das protenas Cry queatuam especificamente nointestino mdio dos insetos,as quais so codificadas por

genes cry. Essas protenas tm atividadeinseticida a diferentes ordens de insetos-praga, de acordo com a presena dos ge-nes cry, nas cepas bacterianas. Alm des-sas protenas, o entomopatgeno produzoutros tipos de toxinas, como exotoxinas,protenas Vip, endotoxinas, entre outras.Sendo assim, esse artigo apresenta a atualclassificao dos genes cry, as ordens deinsetos-alvo das protenas Cry e outros fa-tores de toxicidade da bactria.

1.1 Protenas Cry

Juntamente com a esporulao, B. thu-ringiensis libera incluses cristalinas para-esporais que podem conter uma ou maisprotenas inseticidas, denominadas Cry, asquais so codificadas por genes tambmdenominados cry. Estas protenas apresen-tam peso molecular entre 40 e 140kDa etornam-se txicas a insetos, aps sua in-gesto e solubilizao, no intestino mdiodas larvas (Bravo, 1997).

Estudos sobre a seleo de B. thurin-giensis tm identificado diferentes cepasdesta bactria, as quais mostram ao so-bre diversas ordens de insetos, como Lepi-doptera, Coleoptera, Diptera, Hymenopte-ra, Homoptera, Hemiptera, Isoptera, Or-thoptera, Siphonaptera, Thisanoptera eMallophaga (Feitelson et al., 1992; Maagdet al., 2001; Cavados et al., 2001; Castilhos-Fortes et al., 2002; Pinto et al., 2003; Ma-agd et al., 2003), alm de nematides (Mar-roquim et al., 2000).

Assim, sabe-se que diversos grupos deinsetos so suscetveis aos cristais txicosde B. thuringiensis e que uma espcie deinseto pode ser afetada por mais de umacepa da bactria, pois estas freqentemen-te produzem diferentes protenas insetici-das. Isso significa que um cristal proticopode ser txico a uma grande variedadede insetos, principalmente lepidpteros.Alm disso, as protenas Cry de B. thurin-giensis podem ter seu efeito alterado deacordo com a radiao solar, temperaturae pH (Nishiitsutsuji-Uwo et al., 1977; Ro-

sas-Garca et al., 2008).A busca por novos genes cry, que sin-

tetizem novas protenas Cry, com diferen-tes efeitos inseticidas tem sido uma dasgrandes metas na pesquisa com B. thurin-giensis, desde os primeiros trabalhos pu-blicados sobre a manipulao gentica deB. thuringiensis (Schnepf & Whiteley, 1981).

As toxinas Cry tm sido classificadas deacordo com sua homologia na seqnciade aminocidos (Figura 1), na qual a de-nominao Cry apresenta quatro ranqueshierrquicos de nmeros e letras (mais-culas e minsculas), como por exemplo,Cry3Aa2. As protenas Cry (Tabela 1) comcerca de 45% de homologia em sua seqn-cia so colocadas no primeiro ranque equando apresentam 78 e 95% de identida-de, constituem o segundo e terceiro ran-que, respectivamente.

Cinco blocos de seqncias so comunsa maioria das protenas Cry. Quando seanalisa o tamanho destas protenas tambmfica evidente sua diversidade entre as dife-rentes protoxinas. A extenso C-terminal,encontrada nas protenas mais longas, nofaz parte da toxina ativa, pois digeridapelas proteases no intestino dos insetos,mas pode ter ao na formao do cristal(Schnepf et al., 1998).

A estrutura tridimensional das formasativas das toxinas Cry1 (Grochulski et al.,1995), Cry2 e Cry3 (Li et al.,1991), quandoanalisadas em cristalografia de raio X, mos-traram-se muito similares, cada uma apre-sentando trs domnios. As incluses cris-talferas ingeridas por larvas susceptveisdissolvem-se no intestino dos insetos e asprotoxinas inativas so solubilizadas e cli-vadas na longa regio C-terminal, por pro-teases intestinais, originando fragmentos re-sistentes a proteases com cerca de 60 kDa(Maagd et al., 2003).

O domnio I, N-terminal, consiste em setealfa-hlices e participa na insero da mem-brana intestinal e formao do poro. O do-mnio II, ou beta-prisma, apresenta trsfolhas dobradas simtricas, formando asbeta-folha. O domnio III C-terminal con-siste em duas beta-folha antiparalelas. Es-tes dois domnios esto envolvidos no re-conhecimento dos receptores e ligao,alm do domnio III tambm ter sido asso-ciado formao de poros (Maagd et al.,2001).

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Figura 1. Dendograma de protenas Cryde Bacillus thuringiensis (Fonte http://www.lifesci.susx.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt. Acesso em 19/11/2008).


Tabela 1. Classificao e caracterizao das protenas Cry de Bacillus thuringiensis.


L- Lepidoptera; C- Coleoptera; D- Diptera; H- Hymenoptera; N- Nematoda; Le- leuccitos cancerosos humanos.


Figura 2. Dendograma das protenas Vip sintetizadas por Bacillus thuringiensis(Fonte: http://www.lifesci.susx.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt)

Atualmente, existem 428 protenas Crydescritas, que esto classificadas em 55 clas-ses Cry (Tabela 1). O autor Crickmore man-tm um site na internet, o qual rene asinformaes sobre todas as toxinas Cry jpublicadas, alm de permitir o acesso scaractersticas moleculares de cada uma.Estes dados so atualizados periodicamen-te e podem ser acessados no endereo:http: / /www.l i fesci . susx.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt.

Este nmero tem crescido regularmen-te, pois a descoberta de novos genes im-plica na obteno de novas toxinas quepossam ter maior especificidade ou toxici-dade. Dentre os grupos de genes cry maisestudados, destacam-se cry1, cry2, e cry9,os quais j foram descritos com amplo es-

pectro inseticida aos lepidpteros.Dentre estes grupos, os genes cry1 so

os mais freqentes na natureza, represen-tando mais de 43% dos genes cry caracteri-zados e freqentemente as bactrias quepossuem genes deste grupo codificam pro-toxinas entre 130 e 140kDa, que so arma-zenados em cristais bipiramidais (Hofte &Whiteley, 1989; Rosas-Garca et al., 2008;Thammasittirong & Tipvadee, 2008).

O dendograma da Figura 1 mostra osgrupos de protenas Cry, que so classifi-cados de acordo com a similaridade entrea seqncia de genes que codificam as re-feridas toxinas bacterianas.

De acordo com Crickmore et al. (1998),o primeiro domnio apresenta em torno de45% de similaridade entre si, ao passo que

o segundo domnio mostra-se entre 45 e 75%similares e o terceiro domnio a partir de 75%de similaridade, quando se trata da seqnciade aminocidos.

Carlson et al. (1994) relatam que B. thu-ringiensis apresenta em seu genoma de 2,4 a5,7 milhes de pares de bases, e a maioria dosisolados apresentam elementos extra cromos-smicos lineares ou circulares. Os genes cryesto localizados em plasmdios e muitos iso-lados de B. thuringiensis possuem diversos ge-nes cry responsveis pela sntese de diferen-tes protenas inseticidas (Lereclus et al., 1993).Durante seu desenvolvimento, B. thuringien-sis passa por duas fases, a fase vegetativa e aestacionria, semelhantes ao desenvolvimentode Bacillus subtilis.

A primeira fase caracteriza-se pelo cresci-mento exponencial das clulas de B. thuringi-ensis, momento em que h grande disponibili-dade de nutrientes no meio. A fase estacion-ria ocorre quando o meio se torna hostil e abactria adapta-se diminuio de nutrientesatravs de mecanismos genticos. A expres-so dos genes cry de B. thuringiensis geral-mente ocorre na fase estacionria da clula,acumulando seu produto na clula me, naforma de uma incluso cristalfera, a qual liberada no meio ao final da esporulao (Le-reclus et al., 2000). Esta incluso pode repre-sentar cerca de 25% do peso seco de clulas jesporuladas (Agaisse & Lereclus, 1995). Essesautores relatam que apesar da expresso dosgenes cry estarem estreitamente relacionadaao evento da esporulao, existem genes cryque so expressos independentemente da es-porulao.

A quantidade de protena produzida poruma clula de B. thuringiensis no est direta-mente relacionada com o nmero de cpiasde genes cry, pois a capacidade de produode protena pela clula, mesmo com apenasuma cpia de um determinado gene cry, podeser elevada. Por exemplo, a cepa B. thuringi-ensis kurstaki HD73, possui apenas uma cpiade gene cry1, mas sintetiza cristais bipirami-dais em quantidades semelhantes quelas pro-duzidas por cepas que apresentam trs ou qua-tro diferentes genes cry1. Desta forma, a snte-se protica atinge um limite mximo, com cer-to nmero de cpias de genes cry na clula eacima deste no h acrscimo na produo detoxinas (Agaisse & Lereclus, 1995).

As toxinas Cry so as mais proeminentesde uma srie de fatores que permitem o desen-volvimento de sua virulncia morte ou enfra-quecimento dos insetos. Esses dados sugeremque muitas estirpes de B. thuringiensis podemser consideradas como patgenos oportunistasde insetos. Seria de grande importncia umacompreenso mais profunda das verdadeirasfunes ecolgicas de B. thuringiensis, tantopara melhorar a confiabilidade da avaliao dosriscos e para o desenvolvimento de mtodoseficientes de isolamento de estirpes de B. thu-ringiensis, contendo genes cry ativos.

1.2 Protenas Vip

As protenas VIP foram descritas por Estru-


Tabela 2. Protenas Vip com efeito txico a diferentes insetos

ch et al. (1996) e recebem essa denomina-o por serem produzidas na fase vegetati-va de crescimento de B. thuringiensis. Suaconcentrao tambm permanece alta an-tes e depois da fase de esporulao.

Vrios estudos foram realizados apssua descoberta visando a caracterizao,identificao de novos tipos, ao insetici-da e tambm produo de plantas com ca-pacidade de express-las. Estes estudos, po-rm, so incipientes quando comparadoscom as endotoxinas.

A localizao dos genes responsveispor sua produo ainda no foi determina-da, embora existam vrios conjuntos deprimers que podem ser utilizados para iden-tific-las como vip1 e vip2 (Rice, 1999; Fanget al., 2007; Selvapandiyan et al., 2001 )vip3A (Rice, 1999), vip3Aa (Seifinejad et al.,2008), vip5 e vip6 (Loguercio et al., 2002).

A Figura 2 apresenta um dendogramacom as protenas Vip, j identificadas e ca-talogadas, no site: http://w w w . l i f e s c i . s u s x . a c . u k / h o m e /Neil_Crickmore/Bt. Esse dendograma mos-tra primeiramente dois grandes agrupamen-tos de protenas onde so encontradas se-qncias genticas semelhantes entre si,

subdivididos em cinco grupos menores, deacordo com essa seqncia gentica. Per-cebe-se, claramente que esses cinco gru-pos similares so formados por protenasda mesma classe, ou seja, Vip1, Vip2 e Vip3. A diferena entre a seqncia de genesque codificam essas protenas que definesua classificao, como Vip1Aa, Vip1Ab, en-tre outras.

De acordo com Rang et al. (2005), asprotenas Vip2 exibem entre 21 e 22% desimilaridade com a protena Vip3Ba1, en-quanto as protenas da classe Vip1 so en-tre 8 e 22% similares Vip3Ba1.

Segundo Fang (2007) estas protenasrepresentam uma das maiores descobertasde toxinas com capacidade inseticida, sen-do extremamente relevante a ausncia desimilaridade nas seqncias de aminoci-dos destas protenas com as seqncias deaminocidos das endotoxinas, especialmen-te, em termos de manejo e evoluo daresistncia.

De acordo com o dendograma da Fi-gura 2, estas protenas so classificadas emtrs subfamlias diferentes (Crickmore et al.,2005), sendo que ocorrem em torno de 15%das cepas de B. thuringiensis avaliadas por

Estruch (1996) e 23% das cepas avaliadaspor Rice (1999). As subfamlias Vip1 e Vip2(Tabela 2) so componentes de uma pro-tena binria com atividade inseticida con-tra Diabrotica virgifera e D. longicornis(Han et al., 1999; Warren, 1997). As prote-nas Vip 3 so ativas contra lepidpteros(Tabela 2), como Spodoptera frugiperda eHelicoverpa zea. Seu modo de ao estrelacionado formao de poros na mem-brana do epitlio do intestino mdio (Yuet al., 1997; Loguercio et al., 2002; Lee etal., 2003). Ao mesmo tempo que a Vip 3apresentou toxicidade sobre lepidpterose no mostrou efeitos sobre insetos no-alvo (Whitehouse, 2007).

Devido a sua atividade inseticida rela-cionada a Heliothis zea, as protenas Vip3A esto sendo expressas em plantas dealgodo, conferindo resistncia ao inseto.Nesse sentido, Bommireddy et al. (2007),avaliaram plantas de algodo modificadassomente com a protena Vip 3A, ou com acombinao de Vip 3A e Cry 1Ab (Vip Cot)nos lepidpteros H. zea e H. virescens. Con-siderando o comportamento das lagartas,os resultados desses autores mostram quehouve maior ndice de infestao em plan-tas no modificadas em relao s demais(Vip 3A e Vip Cot).

O conjunto desses dados demonstraque s protenas Vip so promissoras nocontrole de insetos-praga, uma vez que pos-suem diferenas estruturais em relao sdemais protenas de B. thuringiensis, o quepode retardar o processo de resistncia naspopulaes de insetos.

1.3 Demais fatores de virulnciade B. thuringiensis

Alm das protenas Cry e Vip, os isola-dos de B. thuringiensis podem sintetizarprotenas denominadas Cyt, que possuematividade citoltica in vitro e especificidadein vivo aos dpteros (Hfte & Whitheley,1989; De Maagd et al., 2003). De acordocom esses autores fazem parte desse gru-po as protenas Cyt1Ca e Cyt2Aa e seumodo de ao tambm pode estar relacio-nado a um sinergismo com outras toxinasproduzidas pelos isolados.

O entomopatgeno tambm produzoutros fatores de virulncia, como as -exotoxinas, -exotoxinas, hemolisinas, en-terotoxinas, quitinases e fosfolipases (Hf-te & Whiteley, 1989; De Maagd et al., 2001).Esses autores declaram desconhecida aexata contribuio de cada fator na viru-lncia da bactria, sendo uma dificuldadedeterminar o espectro txico de um isola-do que sintetiza mais de uma protena. Issoporque, quando os fragmentos txicos vose ligar aos receptores da membrana dointestino mdio do inseto, ocorre uma com-petio pelos stios de ligao, que podeinterferir na toxicidade do isolado.

Guttmann & Ellar (2000) identificaramisolados de B. thuringiensis com a presen-a de hemolisinas, quitinases e lecitinases,


sendo eles: Bt kurstaki, Bt israelensis, Btfukuokaensis Bt kyushuensis, Bt darmasta-diensis, Bt thompsoni, Bt tolworthii e Bt os-trinae. J as subespcies Bt galleriae, Bt ai-zawai e Bt wuhanensis apresentaram so-mente hemolisina e quitinase.

Os mesmos autores tambm relatam apresena do gene que codifica a enteroto-xina, uma toxina produzida por diferentescepas de B. thuringiensis, com peso mole-cular em torno de 45kDa, e que pode sertxica a vertebrados, uma vez que anlo-ga toxina produzida por B. cereus. Con-siderando a anlise de 13 isolados de B.thuringiensis avaliados, 9 foram positivospara o gene entS que codifica a enterotoxi-na. No mesmo sentido, Rivera et al. (2000)avaliaram 74 isolados do entomopatgeno,em relao a presena dos genes bce, hbl enhe para a enterotoxina. Os seus resulta-dos mostram que o gene nhe foi o maisfreqente, seguido de hbl e bce mostrandoassim, uma pequena diferena na distribui-o desses genes entre B. thuringiensis eB .cereus.

Outros dados de pesquisa sobre ente-rotoxina (Ngamwongsatit et al., 2008), re-velaram a presena dos genes hbl, nhe, cytKe entFM em 205 isolados de B. thuringien-sis e 411 isolados de B. cereus. Os dadosdesses autores mostram que, em 149 isola-dos de B. thuringiensis todos os genes ocor-reram simultaneamente, sendo os genes nhee entFM aqueles de menor freqncia. Es-ses autores relatam a importncia desseconhecimento uma vez que a enterotoxina

pode causar intoxicao alimentar, quan-do relacionada ao patgeno B. cereus.

Em relao -exotoxina, tambm cha-mada thuringiensina, uma protena compeso molecular de 0,7 kDa (Gohar & Per-chat 2001), insespecfica, termoestvel,identificada por inibir a sntese de rRNA(Mackedonski & Hadjilov, 1972) e prejudi-car a formao do fuso mittico, dentreoutros efeitos observados em ensaios in vi-tro com Alium cepa (Sharma & Sahu, 1977).Por ser inespecfica e txica a vertebrados,a thuringiensina avaliada em testes labo-ratoriais, utilizando roedores como cobai-as.

Os dados de Ohba et al. (1981) mos-tram que, de 740 isolados de B. thuringi-ensis avaliados quanto a presena da -exo-toxina, 28 produziram essa toxina. Almdesses, dois isolados da espcie B. subtilis,um isolado de B. natto e dois isolados daespcie B. megaterium tambm foram pro-dutores da thuringiensina.

Nesse sentido, Hernandz et al. (2003)revelam que 79% dos isolados de B. thu-ringiensis thuringiensis so produtores des-sa toxina, seguidos de 20% para B. thurin-giensis kenyae, 13% para B. thuringiensiskurstaki, contrastando com 0% de produ-o para B. thuringiensis aizawai.

Na Tabela 3 constam dados sobre a pro-duo da -exotoxina pelas diferentes su-bespcies de B. thuringiensis.

A thuringiensina tambm apresenta ati-vidade inseticida a diferentes espcies deinsetos-praga, como demonstra o trabalho

de Barreto et al. (1999) utilizando S. frugiper-da em seus ensaios de toxicidade. Porm, de-vido as suas propriedades no especficas aosinsetos, ou seja, pode tambm afetar organis-mos no-alvo, os isolados bacterianos que soprodutores dessa toxina no podem ser co-mercializados para serem utilizados na agri-cultura visando o controle de insetos-praga.

1.1 Referncias

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Toxinas de Bacillus Thuringiensis

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