BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH…………………………………………………………………...3 CHỮ VIẾT TẮT………………………………………………………………………6 LỜI MỞ ÐẦU…………………………………………………………………………7 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………………………..8 1.1.Giới thiệu về khoa xét nghiệm di truyền y học bệnh viện Từ Dũ………………….8 1.2.Tổng quan về các phương pháp…………………………………………………...11 1.2.1.Karyotype……………………………………………………………………….11 1.2.2.Sinh học phân tử………………………………………………………………...14 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP…………………………………...22 2.1. Karyotype.………………………………………………………………………..22 2.1.1.Vật liệu ………………………………………………………………………….22 2.1.2. Dụng cụ và thiết bị……………………………………………………………..22 2.1.3.Hóa chất…………………………………………………………………………22 2.1.4.Quy trình………………………………………………………………………...22 GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 1 LẠI ĐÌNH BIÊN
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ
MỤC LỤC
DANH MỤC HÌNH…………………………………………………………………...3
CHỮ VIẾT TẮT………………………………………………………………………6
LỜI MỞ ÐẦU…………………………………………………………………………7
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………………………..8
1.1.Giới thiệu về khoa xét nghiệm di truyền y học bệnh viện Từ Dũ………………….8
1.2.Tổng quan về các phương pháp…………………………………………………...11
1.2.1.Karyotype……………………………………………………………………….11
1.2.2.Sinh học phân tử………………………………………………………………...14
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP…………………………………...22
2.1. Karyotype.………………………………………………………………………..22
2.1.1.Vật liệu………………………………………………………………………….22
2.1.2. Dụng cụ và thiết bị……………………………………………………………..22
chất. Việc dùng cột mao quản có nhiều ưu việt, như tốn ít mẫu và các hoá chất khác
phục vụ cho sự tách, số đĩa hiệu dụng Nef lớn, sự tách các chất xẩy ra nhanh và hiệu
quả cao.
+Cơ chế điện di: Dưới tác dụng của lực điện trường E (Electric Field Force: EFF)
và dòng điện di thẩm thấu (Electro-Osmotic Flow: EOF), các phân tử chất tan sẽ di
chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau vì điện tích, kích thước và độ linh
động của chúng khác nhau.
1.2.2.2.Real time PCR (xét nghiệm HPV)
Siêu vi sinh dục papilom ở người (Human Papillomavirus) còn gọi là siêu vi
HPV, là siêu vi thông thường gây nhiễm trùng tế bào da. Thông thường, cơ thể sẽ tự
chống lại siêu vi HPV trước khi chúng có thể gây ra những vấn đề sức khỏe. Vì lý do
này, hầu hết những người bị nhiễm siêu vi HPV không có triệu chứng và không biết
mình đã bị nhiễm bệnh. Nhưng đôi khi cơ thể không tự chống lại siêu vi HPV. Trong
những trường hợp này, siêu vi HPV có thể gây ra các vấn đề cho sức khỏe, như: Mụn
cóc sinh dục ở đàn ông và phụ nữ; ung thư cổ tử cung ở phụ nữ; những loại ung thư ít
phổ biến khác ở đàn ông và phụ nữ, như ung thư hậu môn.
Siêu vi HPV làm cho những tế bào bình thường trong cơ thể trở nên bất thường.
Người ta không thể nhìn thấy hay cảm thấy những tế bào bất thường này. Hầu hết các
trường hợp, cơ thể sẽ tự chống lại siêu vi HPV và các tế bào sẽ trở lại bình thường.
Nhưng nếu không thì siêu vi HPV có thể biến tế bào thành ung thư theo thời gian. Sau
nhiều năm thì ung thư mới phát triển ở một người bị nhiễm siêu vi HPV. (Nguồn:
Marina D.M Limaa, b, Paulo Henrique Braz-Silvaa, c, Sônia M. Pereirad, Catalina
Rierae, Ariane C. Coelhof, Marina Gallottinia 2014, “Oral and cervical HPV infection
in HIV-positive and HIV-negative women attending a sexual health clinic in São
Paulo, Brazil”)
Giới thiệu chung
Trong PCR truyền thống, sản phẩm khuếch đại được phát hiện nhờ sự phân tích
đầu cuối (end-point) bằng cách chạy điện di DNA trên agarose gel sau khi phản ứng
GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 17 LẠI ĐÌNH BIÊN
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ
kết thúc. Ngược lại, phương pháp real-time PCR cho phép phát hiện và định lượng sản
phẩm khuếch đại khi tiến trình phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở phản ứng huỳnh
quang, trong đó sự tăng lên về số lượng DNA tương ứng với sự tăng lên của tín hiệu
huỳnh quang. Trong real-time PCR, người ta thường sử dụng các loại thuốc nhuộm
liên kết DNA sợi đôi (SYBR Green) để phát huỳnh quang, và các probe hoặc primer
đặc hiệu chuỗi (trình tự) được đánh dấu huỳnh quang (TaqMan PCR). Thiết bị ổn nhiệt
chu kỳ (máy PCR) đặc biệt được gắn với một module phát hiện tín hiệu huỳnh quang
để theo dõi tiến trình phản ứng khi sự khuếch đại xảy ra. Tín hiệu huỳnh quang đo
được phản ánh số lượng sản phẩm được khuếch đại trong mỗi chu kỳ. Real-time PCR
có ưu điểm chính so với PCR truyền thống là cho phép chúng ta định lượng số copy
khởi đầu của khuôn mẫu với độ chính xác và độ nhạy cao trên một phạm vi động học
lớn. Các kết quả của real-time PCR có thể là chất lượng (sự có mặt hoặc không của
trình tự đích) hoặc định lượng (số bản copy của DNA). Real-time PCR định lượng còn
được biết như là qPCR. Số liệu của real-time PCR có thể đánh giá mà không cần điện
di gel, thời gian thí nghiệm được rút ngắn và số lượng nguyên liệu đưa vào quá trình
được tăng lên. Cuối cùng, do các phản ứng được chạy và số liệu được đánh giá trong
một hệ thống tube đóng kín, nên các cơ hội nhiễm bẩn được giảm thiểu và sự cần thiết
của các thao tác hậu khuếch đại được loại bỏ.
Phân tích tổng quát một phản ứng Real-time PCR
Để hiểu được real-time PCR như thế nào, chúng ta bắt đầu bằng một đường cong
khuếch đại mẫu. Trong hình này, số chu kỳ PCR được trình bày trên trục x, và tín hiệu
huỳnh quang từ phản ứng khuếch đại, tỷ lệ với số lượng sản phẩm được khuếch đại
trong tube, được trình bày trong trục y.
Đường cong khuếch đại có 2 pha, 1 pha hàm mũ được tiếp theo bởi một pha ổn
định. Trong suốt pha hàm mũ, số lượng PCR xấp xỉ gấp đôi trong mỗi chu kỳ. Tuy
nhiên, khi phản ứng diễn ra thành phần phản ứng sẽ bị tiêu hao, cuối cùng làm cho một
hoặc nhiều thành phần bị hạn chế. Ở điểm nàu phản ứng chậm lại và đi vào pha ổn
định (các chu kỳ 28-29).
GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 18 LẠI ĐÌNH BIÊN
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ
Đầu tiên tín hiệu huỳnh quang duy trì ở mức độ nền, và việc tăng tín hiệu huỳnh
quang là không thể phát hiện được (các chu kỳ 1-18) cho dù sản phẩm tích lũy theo
hàm mũ. Sau đó, sản phẩm khuếch đại tích lũy đủ để đạt tới một hiệu suất cho phép
phát hiện được tín hiệu huỳnh quang. Số chu kỳ để đạt được hiệu suất này gọi là chu
kỳ ngưỡng (CT). Do đó giá trị CT được đo trong pha hàm mũ khi các tác nhân phản ứng
không bị hạn chế, nên real-time PCR có thể được sử dụng để tính toán chính xác và tin
cậy số lượng khởi đầu của khuôn mẫu hiện diện trong phản ứng.
CT được xác định chủ yếu bởi số lượng của khuôn mẫu hiện diện ở lúc bắt đầu
phản ứng khuếch đại. Khi lượng khuôn mẫu nhiều thì chỉ cần một vài chu kỳ khuếch
đại để tích lũy sản phẩm đủ cho một tín hiệu huỳnh quang ở trên background. Vì vậy,
phản ứng sẽ có CT thấp hơn hoặc sớm. Ngược lại, nếu lượng khuôn mẫu lúc bắt đầu
phản ứng quá ít, thì số chu kỳ khuếch đại cần nhiều hơn để tín hiệu huỳnh quang tăng
trên background. Vì vậy phản ứng sẽ có CT cao hoặc muộn. Các dạng quan hệ này là
cơ sở cho hướng định lượng của real-time PCR.
Một số ứng dụng chính của real-time PCR
-Nghiên cứu biểu hiện gen. Xác định sự hoạt động của gen và định lượng mức độ
biểu hiện của nó thông qua RNA bằng kỹ thuật RT-PCR
GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 19 LẠI ĐÌNH BIÊN
Hình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nềnHình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nềnHình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nềnHình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nềnHình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nềnHình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nềnHình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nềnHình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nềnHình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nềnHình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nềnHình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nềnHình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nềnHình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nềnHình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nềnHình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nềnHình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nềnHình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nềnHình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nềnHình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nềnHình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nềnHình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nềnHình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nềnHình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nềnHình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nềnHình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nềnHình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nềnHình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nềnHình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nềnHình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nềnHình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nềnHình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nềnHình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nềnHình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nềnHình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nềnHình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nềnHình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nềnHình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nềnHình 2. Đường cong khuếch đại. Tín hiệu huỳnh quang được trình bày đã trừ đường nền
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ
-Chuẩn đoán phân tử. Nghiên cứu mức độ nhiễm virus và vi khuẩn để chuẩn
đoán các bệnh viêm nhiếm.
-Xét nghiệm phân biệt allele. Là phương pháp xét nghiệm đầu cuối được dùng để
xác định kiểu gen của mẫu vật (đồng hợp tử: chỉ có allele 1 hoặc chỉ có allele 2, dị hợp
tử: có cả 2 allele 1 và 2) và phân biệt sự đa hình nucleotide đơn.
1.2.2.3.Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH):
FISH (Fluorescent insitu hybridization) là kỹ thuật trung gian giữa di truyền tế
bào và di truyền phân tử, sử dụng một đoạn mồi đặc hiệu (probe) gắn tín hiệu huỳnh
quang, để phát hiện sự có mặt hoặc vắng mặt của một đoạn gen nào đó trên nhiễm sắc
thể, với ưu điểm nhanh, đặc hiệu và chính xác. FISH đặc biệt có hiệu quả trong việc
phát hiện những mất đoạn gen nhỏ (microdeletion), hoặc để khẳng định nguồn gốc của
các loại chuyển đoạn đặc biệt.
Ngoài ra interphase FISH (FISH nhanh) còn được sử dụng rộng rãi trong chẩn
đoán trước sinh, để phát hiện những bất thường số lượng của một số nhiễm sắc thể
thường gặp (13,18,21,X,Y)
Kỹ thuật FISH được chỉ định trong các trường hợp sau: Chẩn đoán trước sinh các
bất thường số lượng NST ở thai nhi, phát hiện các mất đoạn nhỏ ở một số hội chứng di
truyền, xác định các đoạn nhiễm sắc thể chưa rõ nguồn gốc, phát hiện các bất thường
nhiễm sắc thể đặc hiệu trong ung thư.
Kỹ thuật FISH trong chẩn đoán trước sinh:
Kỹ thuật interphase FISH (FISH nhanh) được sử dụng để sàng lọc một số hội
chứng di truyền thường gặp: hội chứng Down (trisomy 21), hội chứng Patau (trisomy
13), hội chứng Edward (trisomy 18), hội chứng Turner (monosomy X), hội chứng
Kleinerfelter (XXY)… với ưu điểm:
GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 20 LẠI ĐÌNH BIÊN
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ
-Nhanh: Thời gian xét nghiệm trong vòng 48h kể từ khi nhận mẫu dịch ối. Hoàn
thành các thủ tục quản lý chất lượng xét nghiệm sau 4 ngày. Chú ý: Các quyết định
đình chỉ thai nghén không nên chỉ dựa vào một mình kết quả FISH
-Độ chính xác cao
-Yêu cầu chỉ 10-20ml dịch ối.
-Có thể thực hiện trên mẫu bệnh phẩm gai nhau.
GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 21 LẠI ĐÌNH BIÊN
Hình 3. FISH chẩn đoán nhanh hội chứng Down, Patau, Edward, Turner, Kleinerfelter trong chẩn đoán trước sinh. Thai nhi mắc hội chúng Patau (trisomy
13)
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Karyotype:
2.1.1.Vật liệu: Mẫu máu từ các cặp vợ chồng, đứa trẻ có nghi ngờ đột biến
nhiễm sắc thể, dịch ối từ các bà mẹ mang thai.
2.1.2. Dụng cụ và thiết bị:
Kính hiển vi, lam kính, máy ly tâm, ống chứa máu chân không, kim tiêm, bể cách
thủy có lắc, tủ lạnh, Pipetman, đầu côn, cồn tuyệt đối, máy sấy lam, tủ ấm, máy in, tủ
Hình 9. Nhỏ KCl vào ống ly tâmHình 9. Nhỏ KCl vào ống ly tâmHình 9. Nhỏ KCl vào ống ly tâmHình 9. Nhỏ KCl vào ống ly tâmHình 9. Nhỏ KCl vào ống ly tâmHình 9. Nhỏ KCl vào ống ly tâmHình 9. Nhỏ KCl vào ống ly tâmHình 9. Nhỏ KCl vào ống ly tâmHình 9. Nhỏ KCl vào ống ly tâmHình 9. Nhỏ KCl vào ống ly tâmHình 9. Nhỏ KCl vào ống ly tâmHình 9. Nhỏ KCl vào ống ly tâmHình 9. Nhỏ KCl vào ống ly tâmHình 9. Nhỏ KCl vào ống ly tâmHình 9. Nhỏ KCl vào ống ly tâmHình 9. Nhỏ KCl vào ống ly tâmHình 9. Nhỏ KCl vào ống ly tâmHình 9. Nhỏ KCl vào ống ly tâmHình 9. Nhỏ KCl vào ống ly tâmHình 9. Nhỏ KCl vào ống ly tâmHình 9. Nhỏ KCl vào ống ly tâmHình 9. Nhỏ KCl vào ống ly tâmHình 9. Nhỏ KCl vào ống ly tâmHình 9. Nhỏ KCl vào ống ly tâmHình 9. Nhỏ KCl vào ống ly tâmHình 9. Nhỏ KCl vào ống ly tâmHình 9. Nhỏ KCl vào ống ly tâmHình 9. Nhỏ KCl vào ống ly tâmHình 9. Nhỏ KCl vào ống ly tâmHình 9. Nhỏ KCl vào ống ly tâmHình 9. Nhỏ KCl vào ống ly tâmHình 9. Nhỏ KCl vào ống ly tâmHình 9. Nhỏ KCl vào ống ly tâmHình 9. Nhỏ KCl vào ống ly tâmHình 9. Nhỏ KCl vào ống ly tâmHình 9. Nhỏ KCl vào ống ly tâmHình 9. Nhỏ KCl vào ống ly tâmHình 9. Nhỏ KCl vào ống ly tâm
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ
Cho vào ống dung dịch canoy, ủ ở ngăn đá 20 phút, ly tâm 1800 vòng/ 8 phút,
hút bỏ dịch nổi. Nếu dung dịch chưa có màu trắng thì lặp lại cho dung dịch carnoy
thêm 1 đến 2 lần nữa rồi đem đi ly tâm liền ở 1800 vòng/ 8 phút rồi hút bỏ dịch nổi.
+Nhỏ lam:
Có 2 cách nhỏ lam: Nhỏ cao (nhỏ từ trên cao xuống) và nhỏ ngang ( nhỏ chạm
trên mép lam kính đập).
GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 26 LẠI ĐÌNH BIÊN
Hình 12. Dung dịch có màu trắng Khi nhỏ dung dịch Carnoy lần 3
Hình 11. Sau khi chi dung dịch carnoy vào lần 2
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ
Đầu tiên lấy lam kính từ trong cồn tuyệt đối để lạnh rửa lần lượt qua 2 hủ đá có
nước rồi sau đó lấy pipet hút mẫu nhỏ lên lam kính nếu nhỏ cao thì khi nhỏ xong để
lên máy sấy lam khoảng 550C, nếu nhỏ ngang thì khi nhỏ xong phải đập lam kính rồi
để trên máy sấy lam 550C. Khi lam kính khô lấy ra để ở nhiệt độ phòng khoảng 2 ngày
rưỡi 3 ngày.
+Nướng lam: Để lam kính vào trong tủ ấm ở 800C trong 30 phút.
+Nhuộm lam:
Lam kính được nhúng trong trypsine để trong bể 370C trong vòng khoảng 14, 16,
18, 20, 22 giây để test lam xem thử ở thời gian nào sẽ quan sát được NST đẹp nhất,
chọn ra để làm cho tất cả mẫu trong ngày. Sau đó nhúng vào 2 hủ PBS lạnh sau đó để
ráo.
Pha dung dịch buffer: Giemsa với tỷ lệ 9 buffer : 1 giemsa. Hút dung dịch này
nhỏ đầy lên lam kính đợi 10 – 15 phút. Rửa nước, để khô.
GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 27 LẠI ĐÌNH BIÊN
Hình 13. Nhỏ ngang Hình 14. Nhỏ cao
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ
+Phân tích, đọc kết quả:
Đem lên kính hiển vi quan sát ở thấu kính 10 để xác định NST sau đó chỉnh sang
thấu kính 100 để phân tích.
-Bước 5: Ra kết quả
GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 28 LẠI ĐÌNH BIÊN
Hình 16. Quan sát dưới kính hiển viHình 16. Quan sát dưới kính hiển viHình 16. Quan sát dưới kính hiển viHình 16. Quan sát dưới kính hiển viHình 16. Quan sát dưới kính hiển viHình 16. Quan sát dưới kính hiển viHình 16. Quan sát dưới kính hiển viHình 16. Quan sát dưới kính hiển viHình 16. Quan sát dưới kính hiển viHình 16. Quan sát dưới kính hiển viHình 16. Quan sát dưới kính hiển viHình 16. Quan sát dưới kính hiển viHình 16. Quan sát dưới kính hiển viHình 16. Quan sát dưới kính hiển viHình 16. Quan sát dưới kính hiển viHình 16. Quan sát dưới kính hiển viHình 16. Quan sát dưới kính hiển viHình 16. Quan sát dưới kính hiển viHình 16. Quan sát dưới kính hiển viHình 16. Quan sát dưới kính hiển viHình 16. Quan sát dưới kính hiển viHình 16. Quan sát dưới kính hiển viHình 16. Quan sát dưới kính hiển viHình 16. Quan sát dưới kính hiển viHình 16. Quan sát dưới kính hiển viHình 16. Quan sát dưới kính hiển viHình 16. Quan sát dưới kính hiển viHình 16. Quan sát dưới kính hiển viHình 16. Quan sát dưới kính hiển viHình 16. Quan sát dưới kính hiển viHình 16. Quan sát dưới kính hiển viHình 16. Quan sát dưới kính hiển viHình 16. Quan sát dưới kính hiển viHình 16. Quan sát dưới kính hiển viHình 16. Quan sát dưới kính hiển viHình 16. Quan sát dưới kính hiển viHình 16. Quan sát dưới kính hiển viHình 16. Quan sát dưới kính hiển vi
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ
Một bệnh nhân lấy 25 mẫu NST lựa chon 10 bộ đẹp nhất đem đi phân tích ra
kết quả
-Bước 6: Kiểm tra kết quả
Kiểm tra các bộ NST có đủ 22 cặp không. Nếu không đạt thì lấy mẫu lại.
-Bước 7: Nhập kết quả
Nhập kết quả xét nghiệm và in phiếu trả kết quả qua phần mềm nhiễm sắc
thể đồ máu cho bệnh nhân.
-Bước 8: Tư vấn
Tư vấn về mặt di truyền cho bệnh nhân: Tranh ảnh, tài liệu tư vấn.
-Bước 9: Chuyển bệnh nhân về lại nơi chỉ định xét nghiệm hoặc nơi có điều
trị chuyên khoa phù hợp
-Bước 10: Lưu hồ sơ.
2.2.Sinh học phân tử
2.2.1.QF-PCR
2.2.1.1.Vật liệu: Dịch ối từ các thai phụ có nguy cơ cao về rối loạn NST
được tư vấn và đồng ý tham gia chọc ối tại bệnh viện Từ Dũ.
2.2.1.2.Dụng cụ và thiết bị:
Tube vô trùng các loại 200μl, 500μl và 1,5ml; Pipette: 0,5 – 10μl, 2 – 20μl,
10 – 100μl, 100 – 1000μl (Eppendorf) và đầu côn tương ứng; Lam kính; Máy
vortex; Máy ly tâm (Eppendorf); tủ mát 4 – 80C; Máy định lượng DNA
Biophotometer Plus (Eppendorf); Máy luân nhiệt Mastercycler (Eppendorf); Hệ
thống điện di mao quản ABI 3500/ABI 3130 (Applied Biosystems); Máy vi tính,
máy in, phần mềm phân tích đoạn DNA GeneMarker (SoftGenetics).
GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 29 LẠI ĐÌNH BIÊN
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ
2.2.1.3.Hóa chất: Proteinase K, Buffer lysis type 10, Elution buffer type 5,
lysis buffer type 6, Instagene matrix, Hi-di-Fomamide, 560 sizer orange.
2.2.1.4. Cách tiến hành:
-Ly trích DNA:
+Đối với kit Instagene Matrix:
Dịch ối được ly tâm 1500 rpm/ 5 phút.
Chuẩn bị ống tube 1,5 ml đánh mã số cho khớp với ống chứa dịch ối.
Hút 200µl dịch ối chứa cặn vào tube đem ly tâm 14000 rpm trong 1 phút,
hút bỏ nước lấy cặn. Bổ sung khoảng 100-150 µl Instagene Matrix. Đem lắc 1300
rpm trong 3 phút, spin rồi lắc ủ 990C/ 800rpm/ 10 phút. Tiếp đó lắc 800 vòng/ 3
phút, ly tâm 12000rpm/ 2 phút. Thu được DNA trong dung dịch.
+Đối với Kit GE:
Ly tâm dịch ối 1500 rpm/ 5 phút.
Hút 20 µl Proteinase K vào ống tube 1.5. Hút 200 µl cặn dịch ối, đối với
máu thì hút phần ở giữa phần tách lớp các tế bào màu và huyết tương, thêm 400
GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 30 LẠI ĐÌNH BIÊN
Hình 17. Ống type được đánh số theo mã số của ống chứa dịch ối
Hình 18. Mẫu được lắc ủ 990C 800rpm trong 10 phút
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ
µl lysis byuffer tube 10 vortex kỹ, lắc 1500 rpm/10 phút, ủ ở nhiệt độ phòng/ 10
phút.
Chuẩn bị hút 200 µl dung dịch elution buffer type 5 vào ống tube mới ủ ở
700C.
Chuyển toàn bộ mẫu ủ qua ống tube khác có màng lọc, ly tâm 14000rpm/1
phút loại bỏ nước. Bổ sung 500 µl lysis buffer type 10, ly tâm 14000 rpm/1
phút bỏ nước, tiếp tục cho 500 µl wash buffer type 6, ly tâm 14000 rpm/ 1 phút,
rồi tiếp tục ly tâm 14000 rpm/3 phút.
Chuyển màng lọc qua ống tube mới, cho vào đó 200 µl elution buffer tube 5
700C đã chuẩn bị truước đó, ủ nhiệt độ phòng trong 1 phút, đem ly tâm 14000
rpm trong 1 phút, lấy nước bỏ màng lọc. Thu được DNA trong dung dịch.
-Chạy PCR
Chuẩn bị 2 loại tube có chứa 2 loại mastermix một loại chứa NST 13, 18,
21, một loại chứa cho NST giới tính X, Y, 13, 18, 21 đem rả đông. Hút 1,5-2 µl
dịch trong của mẫu cho vào lần lượt 2 tube chứa 2 mastermix. Đưa mẫu vào máy
chạy
QF-PCR Mỗi mẫu sẽ được chạy 2 phản ứng PCR đa mồi riêng biệt trong bộ
Devyser Complete, chạy xong lấy mẫu ra.
GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 31 LẠI ĐÌNH BIÊN
Hình 21. Máy PCR
Hình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọc Hình 20. Nhỏ dung dịch wash buffer type 6Hình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọcHình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọcHình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọcHình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọcHình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọcHình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọcHình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọcHình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọcHình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọcHình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọcHình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọcHình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọcHình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọcHình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọcHình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọcHình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọcHình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọcHình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọcHình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọcHình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọcHình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọcHình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọcHình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọcHình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọcHình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọcHình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọcHình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọcHình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọcHình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọcHình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọcHình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọcHình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọcHình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọcHình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọcHình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọcHình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọcHình 19. Màng lọc cuả ống type có màng lọc
Hình 21. Máy PCRHình 21. Máy PCRHình 21. Máy PCRHình 21. Máy PCRHình 21. Máy PCRHình 21. Máy PCRHình 21. Máy PCRHình 21. Máy PCRHình 21. Máy PCRHình 21. Máy PCRHình 21. Máy PCRHình 21. Máy PCRHình 21. Máy PCRHình 21. Máy PCRHình 21. Máy PCRHình 21. Máy PCRHình 21. Máy PCRHình 21. Máy PCRHình 21. Máy PCRHình 21. Máy PCRHình 21. Máy PCRHình 21. Máy PCRHình 21. Máy PCRHình 21. Máy PCRHình 21. Máy PCRHình 21. Máy PCRHình 21. Máy PCRHình 21. Máy PCRHình 21. Máy PCRHình 21. Máy PCRHình 21. Máy PCRHình 21. Máy PCRHình 21. Máy PCRHình 21. Máy PCRHình 21. Máy PCRHình 21. Máy PCRHình 21. Máy PCR
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ
-Điện di:
Chuẩn bị ống tube, hút 600 µl Hi-Di-Formamide cộng với 12 µl 560 sizer
orange. Hút 12 µl hỗn hợp vào mỗi giếng và thêm 0,9 µl mẫu và đưa vào máy
chạy điện di mao quản theo chu trình điện di của phân tích đoạn với: Điện thế
bơm mẫu: 2,5V; Thời gian bơm mẫu: 20 giây, điện thế điện di: 15V; thời gian
điện di: 30 phút
Dữ liệu sau khi điện di mao quản được xuất dưới dạng tập tin .fsa và được
phân tích kết quả trisomy bằng phần mềm GeneMarker 1.85. Tất cả các tiêu
chuẩn phân tích, đánh giá được căn cứ theo Hướng dẫn thực hành chẩn đoán lệch
bội
bằng QF-PCR (2007) của Hiệp hội Di truyền Lâm sàng Vương quốc Anh, ra
kết quả và trả cho bệnh nhân.
2.2.2.FISH
GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 32 LẠI ĐÌNH BIÊN
Hình 22. Điện di mao quản sản phẩm PCR
Hình 22. Điện di mao quản sản phẩm PCR
Hình 22. Điện di mao quản sản phẩm PCR
Hình 22. Điện di mao quản sản phẩm PCR
Hình 22. Điện di mao quản sản phẩm PCR
Hình 22. Điện di mao quản sản phẩm PCR
Hình 22. Điện di mao quản sản phẩm PCR
Hình 22. Điện di mao quản sản phẩm PCR
Hình 22. Điện di mao quản sản phẩm PCR
Hình 22. Điện di mao quản sản phẩm PCR
Hình 22. Điện di mao quản sản phẩm PCR
Hình 22. Điện di mao quản sản phẩm PCR
Hình 22. Điện di mao quản sản phẩm PCR
Hình 22. Điện di mao quản sản phẩm PCR
Hình 22. Điện di mao quản sản phẩm PCR
Hình 22. Điện di mao quản sản phẩm PCR
Hình 22. Điện di mao quản sản phẩm PCR
Hình 22. Điện di mao quản sản phẩm PCR
Hình 22. Điện di mao quản sản phẩm PCR
Hình 22. Điện di mao quản sản phẩm PCR
Hình 22. Điện di mao quản sản phẩm PCR
Hình 22. Điện di mao quản sản phẩm PCR
Hình 22. Điện di mao quản sản phẩm PCR
Hình 22. Điện di mao quản sản phẩm PCR
Hình 22. Điện di mao quản sản phẩm PCR
Hình 22. Điện di mao quản sản phẩm PCR
Hình 22. Điện di mao quản sản phẩm PCR
Hình 22. Điện di mao quản sản phẩm PCR
Hình 22. Điện di mao quản sản phẩm PCR
Hình 22. Điện di mao quản sản phẩm PCR
Hình 22. Điện di mao quản sản phẩm PCR
Hình 22. Điện di mao quản sản phẩm PCR
Hình 22. Điện di mao quản sản phẩm PCR
Hình 22. Điện di mao quản sản phẩm PCR
Hình 22. Điện di mao quản sản phẩm PCR
Hình 22. Điện di mao quản sản phẩm PCR
Hình 22. Điện di mao quản sản phẩm PCR
Hình 22. Điện di mao quản sản phẩm PCR
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ
Khi xét nghiệm bằng kỹ thuật QF-PCR không cho kết quả hoặc kết quả không rõ
ràng thì tiến hành thêm kỹ thuật FISH.
Nguyên tắc: Sử dụng các đoạn dò được đánh dấu chất phát huỳnh quang bắt cặp
chuyên biệt với một vùng NST đặc hiệu. Dưới kính hiển vi huỳnh quang, các vị trí
đoạn dò huỳnh quang gắn với NST sẽ được phát hiện. Dựa vào số lượng tín hiệu màu
huỳnh quang để xác định số lượng các NST: tế bào 2n cho 2 tín hiệu, tế bào bất
thường cho ít hơn hoặc nhiều hơn 2 tín hiệu.
2.2.2.1.Vật liệu: Dịch ối từ các thai phụ.
2.2.2.2.Dụng cụ và thiết bị: Kính hiển vi, lam kính, Lamelle, máy ủ nhiệt, máy
ly tâm, máy ổn nhiệt có lắc, pipetman, đầu côn, máy sấy lame, máy lai FISH.
2.2.2.3.Hóa chất: Trypsin-EDTA 1X (GIBCO), Dung dịch KCl 0,075M, Dung
dịch carnoy, Sử dụng bộ kit FISH thương mại VYSIS (Mỹ), DAPI, NP40 0,3%, NP40
0,1%, SSC 2X, Pepsine, PBS, FA, Ethanol, prenatal X, Y and 18 enumeration Probe
và prenatal 13 and 21 enumeration Probe, Keo, Antifate.
2.3.2.2.Cách tiến hành:
-Ly tâm dịch ối 1800 rpm trong 8 phút.
-Thu hoạch gồm các bước:
Hút bỏ dịch, lấy cặn, nhỏ 2ml trypsine ủ ở 370C trong 10 phút, ly tâm 1800
vòng/12 phút hút bỏ dịch nổi lấy cặn, bổ sung thêm 8-10ml KCl 7,5%, ủ
370C/40 phút ly tâm hút bỏ dịch nổi ở những bước sau cũng làm tương tự như
cách thu hoạch máu ở kyraotube nhưng khác là ủ ở 37 0C trong 40 phút và ly tâm
1800 rpm trong 12 phút.
-Nhỏ lam: Hút mẫu nhỏ lên lam kính đã kẻ vòng tròn để sẵn trên máy sấy
lam 550C, để khô.
-Chuẩn bị lai:
GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 33 LẠI ĐÌNH BIÊN
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ
Nhúng lam vào dung dịch SSC 2X ở 370C/ 60 phút nhúng qua pepsine
370C/ 11 phút cho qua dung dịch PBS ở nhiệt độ phòng 4 phút nhúng vào
dung dịch FA 0,95% ở nhiệt độ phòng/5 phút cho vào PBS nhiệt độ phòng 4
phút đem phơi khô nhúng qua cồn 700/ 2 phút cho vào cồn 1000/2 phút phơi
khô.
-Lai: Tiến hành nhỏ probe NST 13, 18, 21, X, Y vào lai, đậy lamelle tránh
bọt khí hàn lamelle bằng parafin cho vào máy lai tự động được cài đặt sẳn
chương trình 750C/2 phút, 370C trong 24 giờ.
-Xử lý mẫu sau lai: Gỡ bỏ keo bằng cách rửa với SSC 2X ở nhiệt độ phòng
tiếp đến ngâm ngâm trong NP40 0,3% trong 730C/ 2 phút rồi ngâm trong NP40
0,1% /1 phút ở nhiệt độ phòng.
Vớt lam kính, nhỏ DAPI lên lam kính, sau đó nhỏ antifate để bảo vệ tế bào
khỏi tia huỳnh quang, đậy lamelle đem đọc phân tích dưới kính hiển vi.
GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 34 LẠI ĐÌNH BIÊN
Hình 24.Gỡ keo sau laiHình 23. Cho vào máy lai PCR
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ
2.2.3.Real time PCR
2.2.3.1.Vật liệu: Phết cổ tử cung từ bệnh nhân.
2.2.3.2.Dụng cụ và thiết bị: Plate, máy ly trích tự động DNA, pipetman, đầu
côn, tube, Máy định lượng DNA Biophotometer Plus (Eppendorf), máy ly tâm, tủ
Ly trích DNA sử dụng bộ kít real time PCR của hãng SACACE BIOTECHOLOGIES và sử dụng máy ly trích DNA tự động
Thu nhận dịch nhày cổ tử cung và nhập thông tin bệnh nhân
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ
-Thu nhận dịch nhầy cổ tử cung và nhập thông tin bệnh nhân.
Bước này ta chủ yếu nhận dịch phết của bệnh nhân từ phòng soi cổ tử cung các
khoa khám phụ khoa. Sau khi nhận ta đánh mã số cho từng mẫu, sau đó ta sẽ đánh
máy lưu thong tin bệnh nhân.
-Đưa mẫu vào tủ cấy cấp 2, bật tia uv trong 15 phút.
GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 36 LẠI ĐÌNH BIÊN
Hình 25. Đánh mã số cho mẫu
Hình 26. Bật tia UV trong tủ cấy an toàn sinh học cấp 2
Hình 25. Đánh mã số cho mẫuHình 25. Đánh mã số cho mẫuHình 25. Đánh mã số cho mẫuHình 25. Đánh mã số cho mẫuHình 25. Đánh mã số cho mẫuHình 25. Đánh mã số cho mẫuHình 25. Đánh mã số cho mẫuHình 25. Đánh mã số cho mẫuHình 25. Đánh mã số cho mẫuHình 25. Đánh mã số cho mẫuHình 25. Đánh mã số cho mẫuHình 25. Đánh mã số cho mẫuHình 25. Đánh mã số cho mẫuHình 25. Đánh mã số cho mẫuHình 25. Đánh mã số cho mẫuHình 25. Đánh mã số cho mẫuHình 25. Đánh mã số cho mẫuHình 25. Đánh mã số cho mẫuHình 25. Đánh mã số cho mẫuHình 25. Đánh mã số cho mẫuHình 25. Đánh mã số cho mẫuHình 25. Đánh mã số cho mẫuHình 25. Đánh mã số cho mẫuHình 25. Đánh mã số cho mẫuHình 25. Đánh mã số cho mẫuHình 25. Đánh mã số cho mẫuHình 25. Đánh mã số cho mẫuHình 25. Đánh mã số cho mẫuHình 25. Đánh mã số cho mẫuHình 25. Đánh mã số cho mẫuHình 25. Đánh mã số cho mẫuHình 25. Đánh mã số cho mẫuHình 25. Đánh mã số cho mẫuHình 25. Đánh mã số cho mẫuHình 25. Đánh mã số cho mẫuHình 25. Đánh mã số cho mẫuHình 25. Đánh mã số cho mẫu
Hình 26. Bật tia UV trong tủ cấy an toàn sinh học cấp 2Hình 26. Bật tia UV trong tủ cấy an toàn sinh học cấp 2Hình 26. Bật tia UV trong tủ cấy an toàn sinh học cấp 2Hình 26. Bật tia UV trong tủ cấy an toàn sinh học cấp 2Hình 26. Bật tia UV trong tủ cấy an toàn sinh học cấp 2Hình 26. Bật tia UV trong tủ cấy an toàn sinh học cấp 2Hình 26. Bật tia UV trong tủ cấy an toàn sinh học cấp 2Hình 26. Bật tia UV trong tủ cấy an toàn sinh học cấp 2Hình 26. Bật tia UV trong tủ cấy an toàn sinh học cấp 2Hình 26. Bật tia UV trong tủ cấy an toàn sinh học cấp 2Hình 26. Bật tia UV trong tủ cấy an toàn sinh học cấp 2Hình 26. Bật tia UV trong tủ cấy an toàn sinh học cấp 2Hình 26. Bật tia UV trong tủ cấy an toàn sinh học cấp 2Hình 26. Bật tia UV trong tủ cấy an toàn sinh học cấp 2Hình 26. Bật tia UV trong tủ cấy an toàn sinh học cấp 2Hình 26. Bật tia UV trong tủ cấy an toàn sinh học cấp 2Hình 26. Bật tia UV trong tủ cấy an toàn sinh học cấp 2Hình 26. Bật tia UV trong tủ cấy an toàn sinh học cấp 2Hình 26. Bật tia UV trong tủ cấy an toàn sinh học cấp 2Hình 26. Bật tia UV trong tủ cấy an toàn sinh học cấp 2Hình 26. Bật tia UV trong tủ cấy an toàn sinh học cấp 2Hình 26. Bật tia UV trong tủ cấy an toàn sinh học cấp 2Hình 26. Bật tia UV trong tủ cấy an toàn sinh học cấp 2Hình 26. Bật tia UV trong tủ cấy an toàn sinh học cấp 2Hình 26. Bật tia UV trong tủ cấy an toàn sinh học cấp 2Hình 26. Bật tia UV trong tủ cấy an toàn sinh học cấp 2Hình 26. Bật tia UV trong tủ cấy an toàn sinh học cấp 2Hình 26. Bật tia UV trong tủ cấy an toàn sinh học cấp 2Hình 26. Bật tia UV trong tủ cấy an toàn sinh học cấp 2Hình 26. Bật tia UV trong tủ cấy an toàn sinh học cấp 2Hình 26. Bật tia UV trong tủ cấy an toàn sinh học cấp 2Hình 26. Bật tia UV trong tủ cấy an toàn sinh học cấp 2Hình 26. Bật tia UV trong tủ cấy an toàn sinh học cấp 2Hình 26. Bật tia UV trong tủ cấy an toàn sinh học cấp 2Hình 26. Bật tia UV trong tủ cấy an toàn sinh học cấp 2Hình 26. Bật tia UV trong tủ cấy an toàn sinh học cấp 2Hình 26. Bật tia UV trong tủ cấy an toàn sinh học cấp 2
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ
- Sau khi xong 30 phút ta tiến hành thu dịch phết cổ tử cung bằng cách đổ lọ sinh
thiết ra tube 1.5ml (nếu dịch nhầy khô ta tiến hành đổ nước muối sinh lý vô trùng vào
lắc đều và thu dịch).
-Sau khi thu dịch xong ta tiến hành đi ly tâm mẫu 14000v/p trong vòng 1 phút để
dịch nhầy lắng xuống đáy tube.
-Trong khi ly tâm ta chuẩn bị pha dung dịch mastermix gồm có: buffer Al,
Isopropanol, Magaffract susperision.
-Tiến hành cho hóa chất và mẫu vào giếng gồm có 12 cột 1 12, 8 hàng A H.
+ Hàng A cho vào mỗi giếng là 65µl lysate bao gồm 2µl protease K + 20µl mẫu
+ 43µl mastermix.
+ Hàng B và C cho vào các mỗi giếng 100µl dung dịch buffer AW1.
+ Hàng D và E, mỗi giếng 100µl dung dịch buffer AW2
+Hàng F 30µl dung dịch AE.
Sau đó ta sẽ bỏ vào máy ly trích DNA tự động. máy sẽ tự tách DNA làm theo chu
trình cài đặt sẵn. Thu được DNA ở những giếng của hàng F.
GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 37 LẠI ĐÌNH BIÊN
Hình 27. Máy trích ly DNA tự độngHình 27. Máy trích ly DNA tự độngHình 27. Máy trích ly DNA tự độngHình 27. Máy trích ly DNA tự độngHình 27. Máy trích ly DNA tự độngHình 27. Máy trích ly DNA tự độngHình 27. Máy trích ly DNA tự độngHình 27. Máy trích ly DNA tự độngHình 27. Máy trích ly DNA tự độngHình 27. Máy trích ly DNA tự độngHình 27. Máy trích ly DNA tự độngHình 27. Máy trích ly DNA tự độngHình 27. Máy trích ly DNA tự độngHình 27. Máy trích ly DNA tự độngHình 27. Máy trích ly DNA tự độngHình 27. Máy trích ly DNA tự độngHình 27. Máy trích ly DNA tự độngHình 27. Máy trích ly DNA tự độngHình 27. Máy trích ly DNA tự độngHình 27. Máy trích ly DNA tự độngHình 27. Máy trích ly DNA tự độngHình 27. Máy trích ly DNA tự độngHình 27. Máy trích ly DNA tự độngHình 27. Máy trích ly DNA tự độngHình 27. Máy trích ly DNA tự độngHình 27. Máy trích ly DNA tự độngHình 27. Máy trích ly DNA tự độngHình 27. Máy trích ly DNA tự độngHình 27. Máy trích ly DNA tự độngHình 27. Máy trích ly DNA tự độngHình 27. Máy trích ly DNA tự độngHình 27. Máy trích ly DNA tự độngHình 27. Máy trích ly DNA tự độngHình 27. Máy trích ly DNA tự độngHình 27. Máy trích ly DNA tự độngHình 27. Máy trích ly DNA tự độngHình 27. Máy trích ly DNA tự độngHình 27. Máy trích ly DNA tự động
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ
-Sau khi ly trích DNA ta lấy 5µl mấu DNA đã tách đem bỏ vào tube thể tích
0.2ml đã có sẵn các đoạn mồi, dung dịch đệm các mẫu dò cho trưng type hpv sau đó
dem chạy trên máy real time PCR BIO-RAD có gắn hệ thống máy tính có gắn sẵn
phần mềm phân tích kết quả. Mỗi lần phóng đại xong ta sẽ có tín hiệu xuất hiện trên
máy, dựa vào đó ta kết luận và gửi trả kết quả cho bệnh nhân .
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Karyotype
GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 38 LẠI ĐÌNH BIÊN
Hình 29. Plate đựng mẫu và dung dịch AW1Hình 28. Bỏ mẫu vào Plate
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ
Ta thấy có đủ 23 cặp NST trong đó có 22 cặp NST và 1 cặp NST XY phù hợp
với NST của người bình thường. Kết luận bình thường, giới tính nam.
GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 39 LẠI ĐÌNH BIÊN
Hình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếpHình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếpHình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếpHình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếpHình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếpHình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếpHình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếpHình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếpHình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếpHình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếpHình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếpHình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếpHình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếpHình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếpHình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếpHình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếpHình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếpHình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếpHình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếpHình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếpHình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếpHình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếpHình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếpHình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếpHình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếpHình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếpHình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếpHình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếpHình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếpHình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếpHình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếpHình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếpHình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếpHình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếpHình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếpHình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếpHình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếpHình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếpHình 31. Kết quả NST trên màn hình vi tính sau khi sắp xếp
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ
Nhìn hình 5 ta thấy có 22 cặp NST và 1 cặp NST giới tính XX phù hợp với NST
bình thường của con người. Kết luận bình thường, giới tính nữ.
3.2.Sinh học phân tử:
3.2.1. QF PCR
-Kết quả liên quan đến NST giới tính.
Nhìn hình 33 ta thấy locus SRY không có NST Y => không phải con trai. Và
locus Amelogenin hiện diện 1 NST X. Tuy nhiên, sẽ có một số trường hợp đồng hợp
tử các alen trên NST X dẫn đến không thể kết luận được. Lúc này kit Devyser còn có
thêm những marker có thể hiện NST giới tính X khác như X1, X2, X3, X9. Trong hình
ta thấy tại những vị trí X1, X2, đều có 3 NST X tỉ lệ (1:1:1), còn ở X3, X9 thì có 2
NST nhưng tỉ lệ là (1:2) và (2:1). Từ đó suy ra người này dư 1NST giới tính X hay còn
gọi là bệnh siêu nữ.
GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 40 LẠI ĐÌNH BIÊN
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ
Một số loại bệnh liên quan đến NST giới tính:
-Kết quả liên quan đến NST 13, 18, 21.
GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 41 LẠI ĐÌNH BIÊN
Hình 33. Kết quả Trisomy XXX
Hình 35. Kết quả bị hội chứng KlinefelterHình 34. Kết quả bị hội chứng Turner
Hình 33. Kết quả Trisomy XXXHình 33. Kết quả Trisomy XXXHình 33. Kết quả Trisomy XXXHình 33. Kết quả Trisomy XXXHình 33. Kết quả Trisomy XXXHình 33. Kết quả Trisomy XXXHình 33. Kết quả Trisomy XXXHình 33. Kết quả Trisomy XXXHình 33. Kết quả Trisomy XXXHình 33. Kết quả Trisomy XXXHình 33. Kết quả Trisomy XXXHình 33. Kết quả Trisomy XXXHình 33. Kết quả Trisomy XXXHình 33. Kết quả Trisomy XXXHình 33. Kết quả Trisomy XXXHình 33. Kết quả Trisomy XXXHình 33. Kết quả Trisomy XXXHình 33. Kết quả Trisomy XXXHình 33. Kết quả Trisomy XXXHình 33. Kết quả Trisomy XXXHình 33. Kết quả Trisomy XXXHình 33. Kết quả Trisomy XXXHình 33. Kết quả Trisomy XXXHình 33. Kết quả Trisomy XXXHình 33. Kết quả Trisomy XXXHình 33. Kết quả Trisomy XXXHình 33. Kết quả Trisomy XXXHình 33. Kết quả Trisomy XXXHình 33. Kết quả Trisomy XXXHình 33. Kết quả Trisomy XXXHình 33. Kết quả Trisomy XXXHình 33. Kết quả Trisomy XXXHình 33. Kết quả Trisomy XXXHình 33. Kết quả Trisomy XXXHình 33. Kết quả Trisomy XXXHình 33. Kết quả Trisomy XXXHình 33. Kết quả Trisomy XXXHình 33. Kết quả Trisomy XXXHình 33. Kết quả Trisomy XXXHình 33. Kết quả Trisomy XXX
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ
Trong hình 36, ta thấy các NST 13 và 18 đều có 1 hoặc 2 alleles. Riêng NST
21A, 21B, 21C, 21D, 21H có 3 alleles tỉ lệ lần lược là (1:2) (2:1) (1:2) (1:2) (1:2). Từ
đó ta biết được người này bị hội chứng dư 1 NST số 21 (hội chứng down).
Một số loại bệnh liên quan đến NST số 13 và 18:
GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 42 LẠI ĐÌNH BIÊN
Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)
Hình 38. Kết quả Trisomy 18 (hội chứng Edward)
Hình 37. Kết quả Trisomy 13 (hội chứng Patau)
Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)Hình 36. Kết quả Trisomy 21( hội chứng down)
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ
3.2.2. FISH
Dựa vào hình 39 và 40, ta thấy dưới tia huỳnh quang NST 21 bắt màu đỏ. NST
13 bắt màu xanh da trời- blue (khi lai DNA với probe NST 13, 21). Hình 39 có 2 NST
21 và 2 NST 13 phù hợp với NST của người bình thường. Kết luận bình thường.
Hình 40 có 2 NST 13 và 3 NST 21 không phù hợp với NST người bình thường.
Kết luận bị hội chứng down.
GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 43 LẠI ĐÌNH BIÊN
Hình 40. Kết quả FISH 3 NST 21 hội chứng down
Hình 39. Kết quả FISH NST 21 và NST 13 bình thường
Hình 42. Kết quả FISH NST XY và NST 18 bình thường
Hình 41. Kết quả FISH NST XX và NST 18 bình thường
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ
Dựa vào hình 41 và 42, dưới tác dụng của tia huỳnh quang NST X bắt màu xanh
lục, NST Y bắt màu đỏ, NST 18 bắt màu xanh da trời- blue (khi lai DNA với probe
NST X, Y, 18) . Hình 41 có 2 NST X, 2 NST 18 phù hợp với NST của người bình
thường. Kết luận bình thường, giới tính nữ.
Hình 42 ta thấy có cặp NST XY, 2 NST 18 phù hợp với NST của người bình
thường. Kết luận bình thường, giới tính nam.
3.2.3.Realtime PCR chẩn đoán HPV
Ở đây ta xét nghiệm các tube HPV băng phương pháp real time pcr các típ xét
nghiệm là :
-Tube HPV A9 gồm các nhóm 16, 31, 33, 35, 52 và 58 kí hiệu bắt màu xanh.
-Tube HPV A5-A6 gồm các nhóm 51, 59 kí hiệu màu đỏ.
-Tube HPV A7 gồm các nhóm 18, 39, 45, 59. Và được kí hiệu màu cam.
-Mẫu chứng nội tại ( của bệnh nhân ) thì màu xanh dương.
Điều kiện để mẫu cho kết quả là dương tính thì nó phải có đường cong cao hơn
chứng nội tại ( trừ tube A5-A6 thấp hơn chứng nội tại ) và xuất hiện ở chu kì sớm ( tối
đa không quá 25 chu kì ).
GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 44 LẠI ĐÌNH BIÊN
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ
Ở đây ta thấy ở hình âm tính ta chỉ thấy đường cong của chứng nội tại của bệnh
nhân nên ta thấy bệnh nhân không bị bệnh. Và xuất hiện sớm ở chu kì 20 của quá trình
PCR.
Ở kết quả dương tính ta thấy mẫu này bị nhiễm tất cả các loại tube HPV. Các
tube này xuất hiện sớm trong chu ki thứ 14 15 và cao hơn chứng nội tại ở tube A7, A9
và thấp hơn chứng nội tại ở tube A5-A6.
GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 45 LẠI ĐÌNH BIÊN
Hình 44. Kết quả dương tínhHình 43. Kết quả âm tính Hình 44. Kết quả dương tínhHình 44. Kết quả dương tínhHình 44. Kết quả dương tínhHình 44. Kết quả dương tínhHình 44. Kết quả dương tínhHình 44. Kết quả dương tínhHình 44. Kết quả dương tínhHình 44. Kết quả dương tínhHình 44. Kết quả dương tínhHình 44. Kết quả dương tínhHình 44. Kết quả dương tínhHình 44. Kết quả dương tínhHình 44. Kết quả dương tínhHình 44. Kết quả dương tínhHình 44. Kết quả dương tínhHình 44. Kết quả dương tínhHình 44. Kết quả dương tínhHình 44. Kết quả dương tínhHình 44. Kết quả dương tínhHình 44. Kết quả dương tínhHình 44. Kết quả dương tínhHình 44. Kết quả dương tínhHình 44. Kết quả dương tínhHình 44. Kết quả dương tínhHình 44. Kết quả dương tínhHình 44. Kết quả dương tínhHình 44. Kết quả dương tínhHình 44. Kết quả dương tínhHình 44. Kết quả dương tínhHình 44. Kết quả dương tínhHình 44. Kết quả dương tínhHình 44. Kết quả dương tínhHình 44. Kết quả dương tínhHình 44. Kết quả dương tínhHình 44. Kết quả dương tínhHình 44. Kết quả dương tínhHình 44. Kết quả dương tínhHình 44. Kết quả dương tínhHình 44. Kết quả dương tínhHình 44. Kết quả dương tínhHình 44. Kết quả dương tínhHình 44. Kết quả dương tínhHình 44. Kết quả dương tínhHình 44. Kết quả dương tínhHình 43. Kết quả âm tínhHình 43. Kết quả âm tínhHình 43. Kết quả âm tínhHình 43. Kết quả âm tínhHình 43. Kết quả âm tínhHình 43. Kết quả âm tínhHình 43. Kết quả âm tínhHình 43. Kết quả âm tínhHình 43. Kết quả âm tínhHình 43. Kết quả âm tínhHình 43. Kết quả âm tínhHình 43. Kết quả âm tínhHình 43. Kết quả âm tínhHình 43. Kết quả âm tínhHình 43. Kết quả âm tínhHình 43. Kết quả âm tínhHình 43. Kết quả âm tínhHình 43. Kết quả âm tínhHình 43. Kết quả âm tínhHình 43. Kết quả âm tínhHình 43. Kết quả âm tínhHình 43. Kết quả âm tínhHình 43. Kết quả âm tínhHình 43. Kết quả âm tínhHình 43. Kết quả âm tínhHình 43. Kết quả âm tínhHình 43. Kết quả âm tínhHình 43. Kết quả âm tínhHình 43. Kết quả âm tínhHình 43. Kết quả âm tínhHình 43. Kết quả âm tínhHình 43. Kết quả âm tínhHình 43. Kết quả âm tínhHình 43. Kết quả âm tínhHình 43. Kết quả âm tínhHình 43. Kết quả âm tínhHình 43. Kết quả âm tínhHình 43. Kết quả âm tínhHình 43. Kết quả âm tínhHình 43. Kết quả âm tínhHình 43. Kết quả âm tínhHình 43. Kết quả âm tínhHình 43. Kết quả âm tínhHình 43. Kết quả âm tính
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN
Sau một thời gian thực tập tại khoa xét nghiệm di truyền y học bệnh viện Từ Dũ
TpHCM, chúng em đã được mở rộng hiểu biết thêm về tầm quan trọng cũng như các
kinh nghiệm quý báu trong quy trình xét nghiệm phát hiện bệnh, thao tác phải tỉ mĩ,
gọn gàng, quan trọng nhất là không để nhầm mẫu.
Với cách tổ chức, quản lý chặt chẽ, trang thiết bị cơ sở vật chất đảm bảo, các bác
sĩ cùng thạc sĩ, cử nhân sinh học, xét nghiệm tài giỏi và y đức đáp ứng nhu cầu ngày
cao của nhân dân.
Qua quá trình thực tập tại khoa, chúng em đã được tạo đầy đủ điều kiện học tập
với đúng nội dung đã đăng ký đồng thời giúp em củng cố kiến thức đã học cũng như
nắm được cách vận dụng lý thuyết vào thực tế. Qua đây chúng em cũng hiểu thêm
trách nhiệm của người bác sĩ phải làm trong công tác chăm sóc sức khỏe cho nhân
dân.Được sự giúp đỡ của các cán bộ bác sĩ, thạc sĩ, cử nhân sinh học và xét nghiệm tại
khoa xét nghiệm di truyền y học và quý Thầy Cô khoa công nghệ sinh học và kỹ thuật
môi trường, chngs em đã hoàn thành bài báo cáo thực tập tại khoa xét nghiệm di
truyền y học bệnh viện Từ Dũ TpHCM.
GVHD: NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN Trang 46 LẠI ĐÌNH BIÊN
BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP BỆNH VIỆN TỪ DŨ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng việt
[1] Hồ Huỳnh Thùy Dương (1998), Sinh học phân tử, NXB Giáo Dục.
[2] Trần Thị Thanh Hương, Hoàng Thu Lan Hoàng Thị Ngọc Lan, Nguyễn,Thị
Quỳnh Thơ, Nguyễn Danh Cường (2007), Chẩn đoán trước khi sinh hội chứng down,
hội chứng turner bằng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang kết hợp phân tích nhiễm sắc
thể của tế bào ối, Bộ môn Y Sinh học – Di truyền - Trường Đại học Y Hà Nội ,Bệnh
viện Phụ sản Trung Ương.
[3] Nguyễn Anh Trí, Trần Công Hoàng, Kỹ thuật FISH và ứng dụng của kỹ thuật
FISH trong chẩn đoán và theo dõi điều trị bệnh huyết học.
Tài liệu tiếng anh
[1] Haissam Rahil1, Je´rome Solassol, Christophe Philippe, et al. Rapid
detection of common autosomal aneuploidies by quantitative fluorescent PCR on