No d’ordre ……… UNIVERSITE DE OUAGADOUGOU --------------- École Doctorale Sciences et Technologies --------------- Laboratoire de Biologie et de génétique moléculaires (Labiogene) Thèse Présentée Par Cyrille BISSEYE Pour obtenir le grade de Docteur de l’Université de Ouagadougou Option Sciences Biologiques Appliquées Réponses immunes humorales et cellulaires dirigées contre les antigènes de Plasmodium falciparum candidats vaccins dans une zone d’endémie palustre à transmission saisonnière (Gambie) Soutenue le 14 Décembre 2011 devant le jury composé de : Président : David MODIANO, Professeur Titulaire, Université de Rome La Sapienza (Italie) Membres : Yves TRAORE, Maître de Conférences, Université de Ouagadougou (Rapporteur) Jacques SIMPORE, Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou (Directeur de thèse) Virginio Pietra, Chargé de Recherches, Université de Brescia (Italie)
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No d’ordre ………
UNIVERSITE DE OUAGADOUGOU ---------------
École Doctorale Sciences et Technologies
--------------- Laboratoire de Biologie et de
génétique moléculaires (Labiogene)
Thèse Présentée Par Cyrille BISSEYE
Pour obtenir le grade de
Docteur de l’Université de Ouagadougou
Option Sciences Biologiques Appliquées
Réponses immunes humorales et cellulaires dirigées contre les antigènes de Plasmodium falciparum candidats vaccins dans une zone d’endémie palustre à transmission saisonnière (Gambie)
Soutenue le 14 Décembre 2011 devant le jury composé de :
Président : David MODIANO, Professeur Titulaire, Université de Rome La Sapienza (Italie) Membres :
Yves TRAORE, Maître de Conférences, Université de Ouagadougou (Rapporteur)
Jacques SIMPORE, Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou (Directeur de thèse)
Virginio Pietra, Chargé de Recherches, Université de Brescia (Italie)
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DEDICACES Je dédie cette thèse de Doctorat :
A Feu Mon Père ANGOGHE NDONG ROBERT GUY pour l’amour, la patience et l’amitié.
A ma grand-mère AGNEGHE MARIE pour avoir fait de moi un homme.
A ma mère NZE ANTOINETTE (La rose), pour l’amour, la lumière et les prières.
A CYRIANE QUESSIA MARY pour être la raison de croire même quand les nuages s’amoncèlent.
A DZIMEZE MBA JEAN, EMANE, BISSOUE Bi Ekoh ALBERT, ESSINGONE ANGOGHE THIERRY pour l’aide précieuse et les encouragements dans les moments de doute.
A mes Frères, Sœurs, Parents et Amis, pour votre soutien moral, pour être ma famille et pour tous vos encouragements tout au long de ces années. A Yâ Nse et A Yâ Katoue A BETTY, VIVIE et LUCILE.
A mes Oncles OYE MENGOME, NKOUBA, NTSAME, WAGHA, ANGWE, NTOUTOUME, EKOMI, NDONG, BITEGHE OBAME pour l’aide et le soutien pendant mes études.
A mon frère et ami BATOUME CELESTIN pour l’amitié et le soutien dans nos différentes aventures.
A tous mes amis et collegues de FANGUINOVENY, MELEN et de l’EDR (Franceville).
Je n’oublie pas tous les frères et les sœurs d’ADOUMA (Lambaréné), mes compagnons de toujours.
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REMERCIEMENTS
Ce travail a été réalisé en partie au Laboratoire dirigé par le Docteur Jamila Ismaili au Medical Research
Council (MRC) en Gambie, mais aussi au Laboratoire de Biologie Moléculaire et de Génétique (LABIOGENE de l’UFR-
SVT, Université de Ouagadougou), du Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni (CERBA) dirigé par le
Professeur Jacques SIMPORE.
Je tiens à exprimer ma profonde gratitude au Professeur Jacques SIMPORE, Directeur de cette thèse, membre du
jury et Directeur de plusieurs institutions : Laboratoire de Biologie Moléculaire et de Génétique (LABIOGENE de
l’UFR/SVT, Université de Ouagadougou) ; Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni (CERBA) ; Laboratoire du
Centre Médical Saint Camille de Ouagadougou et Recteur de l’Université Saint Thomas d’Aquin (USTA). Le
Professeur SIMPORE est le principal promoteur de la présente thèse, merci pour votre soutien moral et financier,
pour la qualité de l’encadrement scientifique, pour vos précieux conseils et votre disponibilité en dépit de vos
multiples fonctions.
Je remercie également le Docteur Jamila Ismaili pour la fructueuse collaboration au MRC en Gambie sans
laquelle cette thèse n’aurait peut-être pas aboutie.
Je remercie également le Professeur David Modiano (Université de Rome La Sapienza) qui a bien voulu
accepter d’évaluer et de présider le jury de cette thèse.
Je remercie Le Professeur Elie Mavoungou, Directeur de Recherches qui a bien voulu lire et juger la présente
thèse.
Mes remerciements vont aussi au Professeur Yves Traoré (Université de Ouagadougou) qui a accepté de juger la
présente thèse.
Je remercie Le Docteur Virginio Pietra, Médecin épidémiologiste, chargé de recherches (Université de Brescia,
Italie), qui a bien voulu participer au jury de la présente thèse.
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Je remercie aussi les Professeurs Bernard Vray et Sylvain Meuris de l’Université Libre de Bruxelles.
Je remercie le Professeur Bernard Vray pour m’avoir accueilli et initié à l’immunologie dans son laboratoire à
l’université Libre de Bruxelles. Le Professeur Vray me fait aussi la grande amitié de relire cette thèse et donc d’en
améliorer la qualité, Professeur je vous en remercie infiniment.
Je remercie également le Professeur Anthony Holder (National Institute of Medical Research, MRC, UK) pour la
précieuse collaboration dans la préparation de mes publications.
Je remercie également le Docteur Giorgio Sirugo (Université de Rome) pour notre collaboration en Gambie et
pour son aide précieuse.
Je voudrais aussi adresser mes remerciements au Docteur Mahamoudou Sanou Directeur du Centre National de
Transfusion sanguine pour notre fructueuse collaboration.
Je remercie Mr Bolni Marius Nagalo pour la sympathie, la franche collaboration mais aussi pour les bons repas
chez Tantine.
J’adresse mes remerciements à Dénis, Lucien, Robert, Georges et Patrice du Centre Médical Saint Camille
de Ouagadougou pour leur sympathie pendant toutes ces années.
Mes remerciements s’adressent aussi à l’ensemble de l’équipe du CERBA/LABIOGENE, Djeneba, Florencia, Tani,
Zoenabo, Zeba, Rémy, Bazié, Désiré, Stella Laure pour les moments d’échanges et de partage au
laboratoire.
Je remercie aussi mes amis de toujours, Guy Pierre Biteghe, Endama Mbang Anicet (Ziggy), Ango Billie
Alix qui malgré les années et la distance ont su garder le contact.
Je remercie enfin mon frère Engone Moure Engone Wilfried pour avoir été souvent le lien avec la famille.
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TABLE DES MATIERES DEDICACES ........................................................................................................................................................... 2
TABLE DES MATIERES .......................................................................................................................................... 5
LISTE DES FIGURES ............................................................................................................................................. 10
LISTE DES TABLEAUX ......................................................................................................................................... 11
SIGLES ET ABREVIATIONS .................................................................................................................................. 12
Objectifs de la thèse .......................................................................................................................................... 19
I. GENERALITES ............................................................................................................................................. 21
I.1. Situation globale et historique ............................................................................................................... 21
I.1.1. Situation globale du paludisme ...................................................................................................... 21
I.1.2 Historique et pathologie .................................................................................................................. 21
I.2. Le parasite ............................................................................................................................................... 23
I.2.1. Cycle de vie de Plasmodium ............................................................................................................ 23
I.2.2. Pathogenèse du paludisme ............................................................................................................. 25
I.2.2.1. La Séquestration ....................................................................................................................... 25
I.3. La maladie ................................................................................................................................................ 33
I.5.4.1. Altération des ligands peptidiques .......................................................................................... 60
I.5.4.2. Altération des cellules présentatrices d’antigènes ................................................................. 61
I.5.5. Rôle des cellules T régulatrices naturelles dans l’infection palustre ........................................... 61
I.5.5.1. Rôle des Tregs naturelles dans le contrôle de l’infection palustre chez les rongeurs .......... 63
I.5.5.2. Rôle des cellules Tregs naturelles dans le contrôle du paludisme cérébral expérimental ... 64
I.5.5.3. Rôle des cellules T régulatrices dans le contrôle du paludisme chez l’homme..................... 65
II. Matériels et méthodes .................................................................................................................................. 68
II.2. Mesure des anticorps dirigés contre P. falciparum par Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) ............................................................................................................................................................ 70
II.2.1. ELISA MSP119 et AMA1 ................................................................................................................... 70
II.2.2. ELISA pour mesurer les anticorps anti-R32LR (CSP) ..................................................................... 71
II.3. Culture in vitro de P. falciparum et préparation d’extraits de schizontes ......................................... 72
II.4. Séparation et analyse des cellules T CD4+CD25+.................................................................................. 73
II.5. Culture des cellules mononuclées du sang de cordon ........................................................................ 73
II.6. Détection des cellules T CD4+ productrices d’IFN-γ par culture ELISPOT (Enzyme Linked Immunoassay Spot) ....................................................................................................................................... 74
II.7. Extraction de l'ARN et transcription inverse de Foxp3 ........................................................................ 75
II.8. Génotypage de la G6PD et de l’hémoglobine S par PCR en temps réel ........................................... 75
III. Résultats ........................................................................................................................................................ 78
III.1. Article I. L’infection placentaire par Plasmodium falciparum interfère sur l’équilibre Th1/Th2 des cellules T néonatales à travers les cellules T régulatrices CD4+CD25+FoxP3+ et la production d’IL-10 ... 78
III.1.1. But de l’étude................................................................................................................................. 78
III.1.2. Population ...................................................................................................................................... 78
IV.1.3.1 Fréquence des cellules T CD4+CD25+ FoxP3+ parmi les CMSCs ............................................. 79
8
III.1.3.2. Effet des cellules T régulatrices sur les cytokines Th1/Th2 produites par les CMSCs en réponse à la stimulation par la PHA .................................................................................................... 80
III.1.3.3. Effets des Tregs sur les cytokines Th1/Th2 produites par les CMSCs en réponses aux globules rouges intacts parasités et aux antigènes de P. falciparum ............................................... 82
III.1.3.5. Effet de l'IL-10 sur la production des cytokines Th1/Th2 par les CMSCs ............................ 84
III.2. Article II. Un variant de la protéine de 19 kilodaltons de l’extrémité C-terminal du Merozoite Surface Protein 1 de Plasmodium falciparum candidat vaccin induit des taux élevés d’IFN-gamma associés à des réponses immunitaires cellulaires à des séquences peptidiques spécifiques chez les adultes gambiens naturellement exposés au paludisme ........................................................................... 86
Clinical and Experimental Immunology (2011), 166 (3):366-73 ............................................................ 86
III.2.1. But de l’étude................................................................................................................................. 86
III.2.2. Population ...................................................................................................................................... 87
III.3. Article III. Comparaison des réponses humorales dirigées contre CSP, AMA1 et MSP119 et la susceptibilité au paludisme chez les Peuls, Wolofs et Mandingues de Gambie ........................................... 95
Article soumis pour publication ................................................................................................................... 95
III.3.1. But de l’étude ..................................................................................................................................... 95
III.3.2. Population .......................................................................................................................................... 96
IV. Discussion générale ...................................................................................................................................106
V. Conclusion générale ....................................................................................................................................118
VI. Perspectives ................................................................................................................................................120
Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 10
LISTE DES FIGURES
FIGURE 1. DISTRIBUTION DU PALUDISME À P. FALCIPARUM EN FONCTION DE L'ENDÉMICITÉ EN 2007. ...........22 FIGURE 2. CYCLE DE PLASMODIUM FALCIPARUM ET MÉCANISMES IMMUNITAIRES DE L’HÔTE À CHAQUE PHASE DU
CYCLE DU PARASITE. ............................................................................................................24 FIGURE 3. RÉCEPTEURS DE L’HÔTE IMPLIQUÉS DANS LA SÉQUESTRATION DU GLOBULE ROUGE INFECTÉ PAR P.
FALCIPARUM. ....................................................................................................................26 FIGURE 4. REPRÉSENTATION SCHÉMATIQUE DE MSP1 DE P. FALCIPARUM...............................................28 FIGURE 5. ASSEMBLAGE ET PROCESSING DU COMPLEXE MSP1. ............................................................28 FIGURE 6. REPRÉSENTATION SCHÉMATIQUE D’AMA1. .......................................................................31 FIGURE 7. REPRÉSENTATION SCHÉMATIQUE DE CSP ET DU VACCIN RTS, S. .............................................33 FIGURE 8. EFFET DU PALUDISME PENDANT LA GROSSESSE SUR LA SANTÉ MATERNELLE, NÉONATALE ET INFANTILE.
......................................................................................................................................36 FIGURE 9. REPRÉSENTATION SCHÉMATIQUE DU POSSIBLE MÉCANISME D’ACTION DE L’IMMUNITÉ À MÉDIATION
CELLULAIRE DIRIGÉE CONTRE LE STADE SANGUIN DE PLASMODIUM ..................................................49 FIGURE 10. MÉCANISMES DE BASE UTILISÉS PAR LES TREGS .................................................................62 FIGURE 11. (A) CONTRÔLE DE QUALITÉ DE LA DÉPLÉTION DES CELLULES T CD4+CD25+
(B) EXPRESSION DE
L’ARNM FORKHEAD BOX P3 (FOXP3) ET (C) PRODUCTION DE L’IL-10 APRÈS STIMULATION PAR LA PHA
PENDANT 18 H...................................................................................................................79 FIGURE 12. POURCENTAGE DES CELLULES TREGS CHEZ LES CMCS PARASITÉS OU NON PARASITÉS. .................80 FIGURE 13. PRODUCTION DE CYTOKINES PAR LES CMSCS EN RÉPONSE À LA PHYTOHÉMAGGLUTININE (PHA). ..81 FIGURE 14. PRODUCTION DE CYTOKINES PAR LES CMSCS EN RÉPONSE AUX GLOBULES PARASITÉS ET AUX
ANTIGÈNES DE P. FALCIPARUM. ..............................................................................................83 FIGURE 15. LE TRAITEMENT DES CULTURES CELLULAIRES AVEC DES ANTICORPS ANTI-IL-10 RESTAURE LA
PRODUCTION D’IFN- DANS LE GROUPE DE PLACENTAS PARASITÉS. .................................................84 FIGURE 16. PRODUCTION DE CYTOKINES PAR LES PBMC EN RÉPONSE AUX PROTÉINES MSP119. ..................89
FIGURE 17. (A) FRÉQUENCE DES DONNEURS ET DES CELLULES SÉCRÉTRICES D’IFN- EN RÉPONSE AUX PEPTIDES DE
MSP-119 CHEZ 43 ADULTES GAMBIENS EXPOSÉS AU PLASMODIUM. ...............................................90 FIGURE 18. PRODUCTION DE CYTOKINES PAR LES PBMCS EN RÉPONSE AUX PEPTIDES MSP-119. ..................92 FIGURE 19. CONCENTRATION EN IGG, IGG1 ET IGG3 ANTI-CSP, ANTI-AMA1 ET ANTI-MSP119 CHEZ LES
PEULS, WOLOFS ET MANDINGUES. ....................................................................................... 102
FIGURE 20. COURBE DE SURVIE DE KAPLAN-MEIER REPRÉSENTANT LES RÉPONSES HUMORALES ET L’INCIDENCE
DU PALUDISME DANS LES 3 GROUPES ETHNIQUES PEUL , MANDINGUE ET WOLOF . ........................... 104
Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 11
LISTE DES TABLEAUX
TABLEAU I : DONNÉES ÉPIDÉMIOLOGIQUES DES FEMMES GAMBIENNES DE SUKUTA. ...................................78
TABLEAU II. SÉQUENCE DES PEPTIDES MUTANTS ET SAUVAGES DE MSP119 .............................................88
TABLEAU III. ALLÈLES HLA-DR CLASS II DÉTECTÉS DANS LA POPULATION D’ÉTUDE. ...................................93
TABLEAU IV. CARACTÉRISTIQUES DES PARTICIPANTS DE L’ÉTUDE ET DE LA RÉPONSE HUMORALE AUX ANTIGÈNES
DE P. FALCIPARUM CSP, AMA1 ET MSP119 À L’INCLUSION .........................................................97
TABLEAU V. CARACTÉRISTIQUES DES PARTICIPANTS DU GROUPE À L’ENRÔLEMENT ET INCIDENCE DU PALUDISME
EN ASSOCIATION AVEC LES TAUX D’IGG ANTI-AMA1, ANTI-MSP119 ET ANTI-CSP AJUSTÉS POUR LES
Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 15
RESUME Le paludisme demeure un problème majeur de santé publique en Afrique subsaharienne. Du
fait de la résistance du parasite aux antimalariques, et du vecteur aux insecticides, le
contrôle voire même l’éradication de la maladie passe par la mise au point d’un vaccin
efficace. À ce stade de la recherche aucun vaccin efficace n’a été mis sur le marché. La mise
au point d’un vaccin se heurte à la complexité du parasite. Différents antigènes du parasite
sont des candidats vaccins en phase d’essai clinique. La présente thèse est une contribution
à l’étude de l’immunité humorale et cellulaire contre les antigènes candidats vaccins AMA1,
CSP et MSP119 dans une zone d’endémie palustre à transmission saisonnière.
Nous avons étudié le rôle des cellules T régulatrices dans la réponse Th1/Th2 des cellules T
néonatales. Nous avons montré que l’infection placentaire influence la différentiation Th1
des cellules T néonatales en impliquant les cellules T régulatrices à travers la production d’IL-
10.
La réponse immunitaire cellulaire a été aussi évaluée en étudiant l’antigénicité d’une
protéine triple mutant de MSP119 chez des Gambiens adultes naturellement exposés au
paludisme. Cette protéine MSP119 triple mutant est responsable d’une production plus
élevée d’IFN-γ que la protéine native par les PBMCs de Gambiens adultes.
La réponse humorale dirigée contre les antigènes de P. falciparum a été évaluée en étudiant
les différences interethniques des réponses humorales dirigées contres ces derniers chez des
Peuls de Gambie et des groupes ethniques sympatriques Wolofs et Mandingues.
Nous avons montré, contrairement aux études précédentes, que l’incidence du paludisme, la
prévalence parasitaire et les réponses humorales dirigées contre les antigènes de P.
falciparum étaient les mêmes chez les Peuls de Gambie comparativement aux groupes
ethniques Wolofs et Mandingues.
Mots-clés : Immunité, Lymphocyte T, anticorps, groupe ethnique, Tregs.
Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 16
ABSTRACT
Malaria remains a major public health problem in sub-Saharan Africa. Because of parasite
resistance to antimalarial drugs and vectors to insecticides; control even eradication of the
disease necessites the development of an effective vaccine.
At this stage of researches, no effective vaccine is available on the market. The development
of a vaccine is hampered by the complexity of the parasite. Different parasite antigens which
are vaccine candidates are actually tested clinically.
The present thesis is a contribution to the humoral and cellular immunity against antigens
vaccine candidates AMA1, MSP119 and CSP in an area of malaria seasonal transmission.
We studied the role of regulatory T cells in the neonatal T cells Th1/Th2 bias and found that
Plasmodium placental infection influence the Th1 differentiation of neonatal T cells through
regulatory T cells and IL-10.
The cellular immune response was also assessed by studying the antigenicity of a triple
mutant MSP119 protein among Gambian adults naturally exposed to malaria.
The triple mutant MSP119 protein showed a higher production of IFN-γ than the native
protein by PBMCs of adult Gambians.
The antibody responses directed against P. falciparum antigens were assessed by studying
the inter-ethnic humoral differences in the Gambian Fulani and the sympatric ethnic groups
Wolof and Mandinka. In contrast to previous reports, we found that the prevalence and the
incidence of malaria parasite as well as humoral responses directed against P. falciparum
antigens were the same in the Gambian Fulani compared to Wolof and Mandinka.
Keywords: immunity, T cells, antibodies, ethnic group, Tregs.
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Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 18
INTRODUCTION
Le paludisme demeure un problème majeur de santé publique en Afrique subsaharienne. En
effet, le paludisme continue d’y tuer les enfants, essentiellement ceux de moins de cinq ans.
Les femmes enceintes payent aussi un lourd tribut dans la morbidité palustre. Du fait de la
complexité du parasite à travers son cycle de vie, de sa résistance aux antipaludiques, des
échecs observés dans la lutte anti vectorielle et d’une compréhension incomplète des
mécanismes immunitaires assurant la protection de l’hôte contre la maladie; le
développement d’un vaccin anti palustre est l’outil qui permettrait le contrôle de l’infection
voire même son éradication.
Le développement d’un vaccin anti palustre se heurte non seulement à la complexité du
parasite à travers, son polymorphisme et sa variation antigénique, mais aussi à la
complexité des interactions entre le parasite et le système immunitaire de l’hôte.
Dans les régions hyper endémiques pour le paludisme, les adultes sont mieux protégés que
les enfants contre les formes sévères de la maladie. Cela, met en évidence un mécanisme de
protection des adultes, protection acquise au cours de longues années d’exposition au
parasite. Les mécanismes immunitaires responsables de cette protection ne sont pas bien
connus. Il a été montré que le parasite induit chez l’hôte de fortes réponses immunitaires
humorales et cellulaires. Ces réponses sont dirigées contre les antigènes du parasite dont
certains sont considérés comme de potentiels candidats vaccins. La présente thèse est une
contribution à une meilleure compréhension des mécanismes immunitaires humoraux et
cellulaires dirigés contre les antigènes de Plasmodium falciparum candidats vaccins. Les
différentes études qui font l’objet de cette thèse ont été menées en Gambie, dans une
région où la transmission du paludisme est saisonnière.
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Objectifs de la thèse
Objectif principal
Le principal objectif de ce travail est l’étude des réponses immunes humorales et cellulaires
dirigées contre quelques antigènes de P. falciparum candidats vaccins dans une zone
d’endémie palustre à transmission saisonnière.
Objectifs spécifiques
Ce travail se décompose en trois principaux objectifs spécifiques qui sont :
L’étude du rôle des cellules T régulatrices dans le biais Th1/Th2 des cellules T
néonatales
L’évaluation de l’antigénicité des peptides et des protéines du candidat vaccin
MSP119.
L’évaluation des réponses humorales dirigées contre les antigènes candidats vaccins
MSP119, AMA1 et CSP chez des sujets appartenant aux principaux groupes ethniques
de Gambie : Peul, Wolof et Mandinka.
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I. GENERALITES
I.1. Situation globale et historique
I.1.1. Situation globale du paludisme
Selon les estimations mondiales en 2009, 225 millions de personnes étaient malades
de paludisme et parmi elles, 781.000 personnes ont décédé de la maladie (OMS, 2010). Le
nombre de personnes malades dans les zones endémiques d’Afrique subsaharienne et d’Asie
du Sud-Est était respectivement de 176 et 49 milliions. L’Afrique subsaharienne avec
709.000 décès représentait 90% de la mortalité due au paludisme (OMS, 2010).
La majorité d’épisodes cliniques à Plasmodium falciparum (P. falciparum), se produit en
Afrique tropicale et en Asie du Sud-est avec respectivement 70% et 25% d’épisodes cliniques
(Snow et al, 2005) (figure 1).
Le paludisme est responsable en Afrique de 3000 décès par jour, la plupart des décès
concernent les enfants de moins de cinq ans. La distribution du paludisme dans les régions
endémiques du monde est définie en fonction du degré d'endémicité. Le paludisme est
considéré comme endémique dans les zones où il y a une transmission constante au cours
d’années successives. Le paludisme est dit hypo endémique dans les zones où la prévalence
de l'infection est inférieure à 10%, et méso endémique dans les zones où la prévalence de
l'infection se situe entre 11% et 50%. Dans les régions où la prévalence de l'infection est
supérieure à 50%, les zones sont définies comme holo endémiques et hyper endémiques.
I.1.2 Historique et pathologie
Le parasite du paludisme, P. falciparum, a d'abord été décrit par Laveran en 1880
dans le sang d'un patient présentant des fièvres intermittentes.
Les parasites du paludisme de l'homme appartiennent au genre Plasmodium, à la famille
des Plasmodiidae, au sous-ordre des Haemospondiidae et à l’ordre des coccidies. Les
parasites de l'homme appartiennent à deux sous-genres : Laverania et Plasmodium. Quatre
espèces distinctes de Plasmodium sont traditionnellement reconnues comme étant des
parasites de l’homme, il s’agit de: Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae,
Plasmodium ovale et Plasmodium vivax.
Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 22
Figure 1. Distribution du paludisme à P. falciparum en fonction de l'endémicité en 2007.
La couleur rouge claire indique les zones hypo endémiques, le brun rougeâtre les zones méso endémiques et le rouge foncé les zones holo et hyper endémiques (Hay et al, 2009)
Trois parasites du paludisme sont exclusivement trouvés chez l’Homme, ce sont P.
falciparum (Welch, 1897); P. vivax (Grassi, 1890); et P.ovale (Stephens, 1922). Le paludisme à
P. malariae a été décrit aussi bien chez l’homme que chez les singes africains (Grassi, 1890).
Toutefois, il est à noter que les infections par P. knowlesi (parasite simien) ont été
rapportées chez l’homme à Bornéo (Singh et al, 2004).
Les quatre espèces responsables du paludisme chez l'homme se retrouvent dans les régions
tropicales et subtropicales du monde, mais leur répartition est variable: P. falciparum est le
parasite répandu en Afrique subsaharienne; P. vivax est plutôt le parasite le plus
fréquemment trouvé en Asie, en Amérique du Sud et Central alors qu'il est absent de
l'Afrique de l'Ouest, la majorité de la population ne portant pas le facteur Duffy qu’ utilise le
parasite pour entrer dans les globules rouges de l’hôte.
P. malariae et P. ovale sont des parasites beaucoup moins fréquents dans la plupart des
régions d'Afrique. La grande majorité des cas cliniques de la maladie et notamment la quasi-
totalité des décès liés au paludisme sont dues à P. falciparum.
Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 23
I.2. Le parasite
I.2.1. Cycle de vie de Plasmodium
Tous les parasites du paludisme ont besoin de deux hôtes dans leur cycle de vie: l'hôte
définitif où a lieu le développement sexuel (anophèle femelle) et l'hôte intermédiaire
(l'homme par exemple) où se produit le développement sexuel (Figure 2). Le plasmodium,
parasite haploïde adopte trois stratégies au cours de son cycle de vie pour proliférer.
La première stratégie est sa capacité de croissance et de réplication intensive,
réalisée grâce à trois stades différents. Le premier stade est l'oocyste qui se produit chez le
moustique dans un processus appelé sporogonie. Le deuxième stade est la schizogonie pré-
érythrocytaire (ou exo-érythrocytaire ou héatique) et le troisième stade est la schizogonie
érythrocytaire qui se produisent tous les deux chez l’hôte intermédiaire.
La deuxième stratégie adoptée par le parasite est la dispersion et l'invasion des cellules
hôtes. Cette stratégie inclut : les stades mérozoïte, sporozoïte et ookinète du parasite.
La troisième stratégie est la reproduction sexuée impliquant la formation des gamétocytes
chez l'hôte vertébré, elle est complétée lors de la formation de l'ookinète chez l’anophèle
femelle après un repas sanguin.
Les trois stratégies du parasite sont indiquées dans le cycle de vie ci-dessous chez le
moustique et chez l’hôte humain (Figure 2).
Les sporozoïtes sont injectés dans la circulation sanguine avec la salive du moustique, et
circulent pendant une courte période (2-30 min) avant d'entrer dans les hépatocytes.
Dans les hépatocytes, les sporozoïtes se transforment en schizontes pré-érythrocytaires qui
engendrent des mérozoïtes (stade hépatique de 5-15 jours). Un sporozoïte unique qui se
divise peut donner naissance à un schizonte multinuclé de 30.000 mérozoïtes filles. Les
mérozoïtes issus des schizontes hépatiques sont libérés dans la circulation et la phase
érythrocytaire du cycle peut commencer.
Chez P. falciparum, le cycle érythrocytaire dure 48 heures en fonction de la souche du
parasite. Les mérozoïtes envahissent les globules rouges et se développent jusqu’au stade
« ring » (anneaux) (0-24h), puis au stade trophozoïte (24-35h) et enfin au stade schizonte
(35-48h) où les mérozoïtes sont produits. Les mérozoïtes sont libérés dans la circulation
sanguine après la rupture des schizontes pour commencer un nouveau cycle érythrocytaire.
Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 24
Figure 2. Cycle de Plasmodium falciparum et mécanismes immunitaires de l’hôte à chaque phase du
cycle du parasite.
Adapté de Crompton et al, 2010.
Certains parasites se différencient en gamétocytes, formes sexuées, qui sont repris par le
moustique lors d'un repas sanguin. Les microgamétocytes (mâles) suibssent le phénomène
d’exflagellation et fécondent les macrogamétocytes (femelles). Les gamétocytes sont
fécondés et produisent les ookinètes dans l’estomac du moustique. L’ookinète mûrit,
ensuite donne naissance à un oocyste qui traverse l'épithélium intestinal et migre vers les
glandes salivaires où il mâture et donne naissance aux sporozoïtes. Les sporozoïtes sont
ensuite inoculés à un hôte humain lors d'un repas sanguin et le cycle pré-érythrocytaire puis
érythrocytaire recommence. Les stimuli déclenchant la gamétocytogénèse ne sont pas
Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 25
encore entièrement compris, mais résulteraient très probablement de diverses formes de
stress, y compris la pression exercée par le système immunitaire de l'hôte.
I.2.2. Pathogenèse du paludisme
Comme le montre son cycle de vie, P. falciparum survit chez le moustique où sa
reproduction sexuée s’effectue, et le moustique vecteur transmet le parasite à l'hôte
humain.
Chez l’homme le parasite a besoin de proliférer et de survivre sans être détruit par la
réponse immunitaire de l'hôte. Pour ce faire, P. falciparum utilise différentes techniques afin
de contourner le système immunitaire de l'hôte et cela aboutit au développement d’une
maladie qui peut devenir grave.
Les techniques les mieux connues incluent notamment la cyto-adhérence et la
séquestration, la formation de rosettes et la variation antigénique.
I.2.2.1. La Séquestration
La séquestration est définie comme l’élimination des globules rouges infectés de la
circulation périphérique grâce à leur liaison à l'endothélium vasculaire des veinules post-
capillaires des tissus profonds. La surface du globule rouge infecté est recouverte
d'excroissances appelées Knobs qui sont le point de contact avec les cellules hôtes.
Une protéine unique du parasite, P. falciparum Erythrocyte Membrane Protein 1 (PfEMP1),
assure sa liaison avec divers récepteurs (Baruch et al, 1995).
PfEMP1 est codée par la grande famille des gènes variables var, comprenant environ 60 loci
polymorphes dans le génome de P. falciparum (Su et al, 1995, Gardner et al, 2002).
La séquestration du globule rouge infecté dans la micro vascularisation des organes vitaux
est un trait marquant du paludisme à P. falciparum. La séquestration massive des globules
rouges parasités dans le cerveau est considérée comme la principale cause du coma dans le
paludisme cérébral souvent rapidement mortel (Turner et al, 1994). La séquestration des
parasites dans le cerveau impliquerait des récepteurs de l’hôte tels que : le CD36 et l’ICAM1
(Intercellular Adhesion molecule 1) (Figure 3).
Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 26
Figure 3. Récepteurs de l’hôte impliqués dans la séquestration du globule rouge infecté par P.
(sens) 5’- AGCTGGAGTTCCGCAAGAAAC-3’ et Foxp3 (anti-sens) 5’-
TGTTCGTCCATCCTCCTTTCC-3’.
II.8. Génotypage de la G6PD et de l’hémoglobine S par PCR en temps
réel
L'ADN a été extrait à partir de PBMCs en utilisant le kit d'extraction d'ADN Puregene
(Flowgen, Ashby de la Zouch, Royaume-Uni) ou la méthode standard salting-out. Le déficit
en G6PD et l’'hémoglobine S ont été génotypés en utilisant les sondes Taqman (ABI, Applera
Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 76
International Inc, Foster City, CA, USA) suivantes, rs1050828 (G6PD 202G/A), rs1050829
(G6PD 376A/G) et rs334 (HbS), dans un volume réactionnel de 10 µl, en utilisant soit le
Rotor-Gene 3000 (Corbett Robotics Pty Ltd, Brisbane, Queensland, Australie ) ou le système
PCR en Temps réel 7500 ABI. Les courbes de fluorescence ont été analysés avec la version 6
du logiciel Rotor-Gene et le système de détection de séquence 7500 ABI version 1.1.
Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 77
Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 78
III. Résultats
III.1. Article I. L’infection placentaire par Plasmodium falciparum interfère sur l’équilibre Th1/Th2 des cellules T néonatales à travers les cellules T régulatrices CD4+CD25+FoxP3+ et la production d’IL-10
C. Bisseye*, M. van der Sande*, W. D. Morgan†, A. A. Holder†, M. Pinder* and J. Ismaili*
*Medical Research Council Laboratories, Banjul, The Gambia, and †Division of Parasitology,
National Institute for Medical Research, Mill Hill, London, U
Clinical and Experimental Immunology (2009), 158: 287–293
III.1.1. But de l’étude
Des études antérieures ont montré que Plasmodium falciparum induit un biais Th2 dans
l’infection palustre au cours de la grossesse. L’infection placentaire affecte aussi l’équilibre
Th1/Th2 des cellules T néonatales. Nous avons étudié le rôle potentiel des cellules T
régulatrices dans cet équilibre en comparant les réponses des lymphocytes T des cellules
mononuclées du sang de cordon (CMSCs) provenant de placentas de femmes gambiennes
parasitées et non parasitées par Plasmodium falciparum.
III.1.2. Population
La description du groupe de femmes gambiennes utilisées dans la présente étude a déjà été
faite par Ismaili et al, (2003). Le tableau I résume les données épidémiologiques de ce
groupe de femmes de l’étude.
Tableau I : Données épidémiologiques des femmes gambiennes de Sukuta.
Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 79
III.1.3. Résultats
IV.1.3.1 Fréquence des cellules T CD4+CD25+ FoxP3+ parmi les CMSCs
Nous avons d'abord comparé les fréquences des T CD4+CD25+FoxP3+ dans les deux
groupes de CMSCs provenant de femmes parasitées et non parasitées. Les CMSCs ont été
délestées de leurs cellules T CD4+CD25+FoxP3+, puis mises en culture en présence de
mitogène, de parasites vivants ou d’antigène de P. falciparum. La fraction des cellules T
CD4+CD25+FoxP3+ a été aussi mise en culture en présence de PHA pendant 18 heures. La
production élevée d’IL-10 par les T CD4+CD25+ comparativement aux cellules T CD4+CD25-
suggère fortement que la quasi-totalité des cellules T CD4+CD25+FoxP3+ sont des cellules T
régulatrices et non des cellules effectrices (Figure 11).
Figure 11. (a) Contrôle de qualité de la déplétion des cellules T CD4+CD25+ (b) Expression de l’ARNm
forkhead box P3 (FoxP3) et (c) Production de l’IL-10 après stimulation par la PHA pendant 18 h.
L’expression de l’ARNm FoxP3 et la production d’IL-10 sont significativement plus élevées chez les cellules T
CD4+CD25+ (n = 5) comparativement aux cellules T CD4+CD25- (n = 6) (P* = 0,0427).
Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 80
La fréquence des cellules T CD4+CD25+Foxp3+ était faible et similaire dans les CMSCs des
deux groupes (1,2% ± 0,2 comparativement à 1,4% ± 0,3 ; P = 0,11) (Figure 12).
Figure 12. Pourcentage des cellules Tregs dans les CMSCs parasités ou non parasités.
Une sélection d’échantillons des cellules mononuclées du sang de cordon (CMSC) provenant des groupes
parasités (n = 8) et non parasités (n = 8) a été colorée avec des anticorps anti-CD25-PE et anti-CD4-FITC et
analysée au cytomètre de flux. Le résultat d’un échantillon sur 8 est montré.
III.1.3.2. Effet des cellules T régulatrices sur les cytokines Th1/Th2 produites par les CMSCs
en réponse à la stimulation par la PHA
Comme dans l’étude de Ismaili et al, (2003), nous montrons que l’infection placentaire par P.
falciparum entraîne une diminution significative de la production d’IFN- (p2 = 0,03) par les
CMSCs en réponse à la stimulation in vitro par la PHA, alors que la production de sCD30
n’est pas affectée (Figure 13).
La production de l’IL-10 par les cultures de CMSC de placentas parasités est plus élevée (p5 =
0,025) que celle de placentas non parasités. Nous montrons de façon très intéressante, que
la production d’IL-10 est significativement réduite par la déplétion des Tregs dans les deux
groupes (p3 = 0,028; p4 = 0,035). La déplétion des Tregs restaure la production d’IFN- (p1 =
0,02) par les CMSCs du groupe parasité et elle entraîne aussi une légère augmentation de la
production de sCD30 par les CMSCs dans les deux groupes (Figure 13).
Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 81
Figure 13. Production de cytokines par les CMSCs en réponse à la phytohémagglutinine (PHA).
Les CMSCs des nouveau-nés dont les placentas des mères étaient parasités à l’accouchement (barres noires, n
= 21) ou non parasités (barres grises, n = 34) ont été cultivées pendant 3 jours en présence de PHA et évaluées
pour leur capacité à produire les cytokines et le CD30 soluble (sCD30). La production d’IFN- (Th1), d’IL-10 et de
sCD30 (Th2) est mesurée par ELISA en présence (+) ou en absence (-) de déplétion des cellules T CD4+ CD25+.
La production d’IFN- par les CMSCs du groupe parasité (P2 = 0,003) est significativement plus faible par
rapport au groupe non parasité, tandis que la production de sCD30 est similaire dans les deux groupes. La
production d'IL-10 est plus élevée dans le groupe placenta parasité (P5 = 0,025). La déplétion des cellules T
régulatrices diminue la production d’IL-10 par les CMSCs des deux groupes (p3 = 0,028; p4 = 0,035) et restaure
celle de l’IFN- (p1 = 0,02). Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± déviation standard.
Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 82
III.1.3.3. Effets des Tregs sur les cytokines Th1/Th2 produites par les CMSCs en réponses
aux globules rouges intacts parasités et aux antigènes de P. falciparum
Les CMSCs ont également été testés pour leur capacité à produire in vitro les cytokines en
réponse à leur stimulation par les globules rouges infectés par P. falciparum, les extraits de
schizontes Pf164 et la protéine purifiée MSP119 après 6 jours en culture (Figure 14).
Nous montrons une baisse de la production d'IFN- (schizontes Pf164 p1 = 0,0485; MSP119
p2 = 0,00497) et une augmentation de celle de l'IL-10 (schizontes Pf164 p12 = 0,048;
MSP119 p13 = 0,0478) par les CMSCs en réponse à la stimulation par les extraits de
schizontes Pf164, les globules rouges infectés (Live Pf) et l’antigène MSP119 dans le groupe
parasité par rapport au groupe non parasité.
En outre, la production de sCD30 observée en réponse à la stimulation par les antigènes de
P. falciparum (schizontes Pf164 p7 = 0,0245; MSP119 p8 = 0,021) est plus élevée dans le
groupe parasité.
La déplétion des Tregs affecte la production des cytokines par les CMSCs. Elle restaure la
production de l’IFN-, réduit celle de l’IL-10 et augmente la production du sCD30 dans les
deux groupes (Figure 14). Dans le cas du sCD30, l’augmentation reste significative en
réponse aux antigènes de P. falciparum (schizontes Pf164 p10 = 0,032; MSP119 p11 = 0,041).
Les globules rouges infectés par P. falciparum (Live Pf) induisent des concentrations les plus
élevées de toutes les cytokines testées par rapport aux antigènes (schizontes Pf164 et
MSP119). Une plus faible concentration d’IFN- (p6 = 0,015) et de plus fortes productions
d’IL-10 (p15 = 0,038) et de sCD30 (p9 = 0,028) sont observées dans le groupe parasité.
En outre, la déplétion des cellules T CD4+CD25+ réduit la production d’IL-10 (p14 = 0,049),
elle restaure celle de l'IFN-(p3 = 0,0209) et augmente la production de sCD30 dans les deux
groupes conduisant à une production similaire dans ces deux derniers.
Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 83
Figure 14. Production de cytokines par les CMSCs en réponse aux globules parasités et aux antigènes
de P. falciparum.
Les CMSCs provenant des groupes de placentas non parasités (-) (n = 21) et parasités (+) (n = 25) ont été
évaluées pour la production de cytokines et de sCD30 en réponse à la stimulation par MSP-119, un extrait de
schizontes Pf164 et les globules rouges intacts parasités (live Pf). Les CMSCs non stimulées, ou stimulées soit en
présence de d’extraits de globules rouges non parasités ou de globules rouges intacts non parasités, ont été
utilisées comme contrôles négatifs. Les cytokines ont été mesurées en présence (barres grises) ou en absence
(barres noires) de cellules T CD4+CD25+. Une faible production d'IFN- (schizontes Pf164 p1 = 0,0485; MSP-119
p2 = 0,0497, Live Pf p6 = 0,015), tout comme une production élevée de sCD30 (Pf164 schizontes p7 = 0,0245;
MSP-119 p8 = 0,021 ; live pf p9 = 0,028) et d’IL-10 (Pf164 schizontes p12 = 0,048; MSP-119 p13 = 0,0478; Live Pf
p15 = 0,038) ont été obtenues en réponse à l’extrait de schizontes Pf164, à l’antigène MSP-119 et aux parasites
vivants. La déplétion des cellules T CD4+CD25+ a réduit la production de l’IL-10 dans les deux groupes et elle est
significative en réponse au Live Pf (p14 = 0,0315). La déplétion des T CD4+CD25+ a maintenu une production
élevée de sCD30 en réponse aux protéines de P. falciparum dans le groupe parasité (Pf164 schizontes p10 =
0,032; MSP119 p11 = 0,041) et elle a restauré la production d’IFN- en réponse aux parasites vivants (p3 =
0,0209). Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± déviation standard.
Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 84
III.1.3.5. Effet de l'IL-10 sur la production des cytokines Th1/Th2 par les CMSCs
Comme le montrent les figures 13 et 14, les CMSCs provenant de placentas parasités
produisent des taux plus élevés d'IL-10. La déplétion des CMSCs en cellules T CD4+CD25+
entraîne une baisse de la production de l'IL-10 et la restauration de l'expression de l'IFN-.
Afin d'examiner le rôle direct de l'IL-10, nous avons comparé les cultures de CMSCs des deux
groupes en présence de globules rouges parasités (Live Pf), soit après déplétion des Tregs ou
en présence d’anticorps neutralisants anti-IL-10. Comme le présente la Figure 15, la
déplétion des Tregs et le traitement des cultures par les anti-IL-10 restaurent la production
d’IFN- par les CMSCs du groupe parasité. En revanche, le traitement des anti-IL-10 n’a
aucun impact significatif sur la sécrétion de sCD30 (données non présentées).
Figure 15. Le Traitement des cultures cellulaires avec des anticorps anti-IL-10 restaure la production
d’IFN- dans le groupe de placentas parasités.
Les CMSCs du groupe parasité (figure de haut, barres noires; n = 10) et du groupe non parasité (Figure de bas,
barres grises; n = 12) étaient soient délestées en cellules T régulatrices (Tregs-) ou non traitées et mises en
culture en présence d'anti-IL-10 ou d’un anticorps isotype de contrôle. La production d’IFN- a été mesurée
après stimulation par les globules rouges infectés par Pf164. Une production significative d’IFN- a été
observée après la déplétion des Tregs (P1 = 0,014) et le traitement par les anticorps bloquant anti-IL-10 (P2 =
0,021). Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± déviation standard.
Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 85
III.1.4. Conclusion
Le déséquilibre Th1/Th2 des cellules T néonatales dû à l'infection active du placenta par P.
falciparum, est une stratégie possible utilisée par le parasite pour échapper à la réponse
immunitaire de l’hôte. Elle implique les Tregs à travers leur production d’IL-10, comme le
révèlent leur déplétion et l’inhibition de l’IL-10 qui restaurent la production d’IFN-. Nos
résultats suggèrent que la réduction de la production de l’IFN- pourrait être incriminée à la
fois aux CPA par leur faible production d’IL-12 et aux Tregs à travers l’IL-10, d’où une
exacerbation de la polarisation Th2.
Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 86
III.2. Article II. Un variant de la protéine de 19 kilodaltons de
l’extrémité C-terminal du Merozoite Surface Protein 1 de Plasmodium
falciparum candidat vaccin induit des taux élevés d’IFN-gamma
associés à des réponses immunitaires cellulaires à des séquences
peptidiques spécifiques chez les adultes gambiens naturellement
exposés au paludisme
Cyrille Bisseye*‡, Louis M. Yindom*, Jacques Simporé‡, William D. Morgan†, Anthony A.
Holder† and Jamila Ismaili*2#
*Medical Research Council Laboratories, PO Box 273, Banjul, The Gambia; †Division of Parasitology,
MRC National Institute for Medical Research, Mill Hill, London NW7 1AA, United Kingdom; ‡Centre de
Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni, Ouagadougou, Burkina Faso.
Clinical and Experimental Immunology (2011), 166 (3):366-73
III.2.1. But de l’étude
La protéine de 19 kDa de MSP119 de P. falciparum est un important candidat vaccin du stade
sanguin du paludisme. Elle est la cible des réponses immunitaires humorales et cellulaires
chez les individus naturellement infectés par P. falciparum. Des variants génétiquement
modifiés de cette protéine ont été conçus pour être potentiellement de meilleurs candidats
vaccins. Cependant, la réponse immunitaire humaine à ces protéines n'a pas encore été
entièrement caractérisée. Nous avons donc étudié d’une part, l'antigénicité d'une protéine
triple mutant de MSP119 par rapport à celle de la protéine sauvage, et d’autre part
l’antigénicité des peptides mutés par rapport aux peptides non mutés chez les adultes vivant
dans une zone endémique en Gambie.
Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 87
III.2.2. Population
Quarante trois (43) adultes gambiens ont été recrutés dans cette étude. L’antigénicité des
protéines et peptides de MSP119 a été évaluée par ELISPOT en culture et par ELISA en
mesurant respectivement, les cellules T CD4+ sécrétrices d’IFN- et les cytokines Th1 et Th2
produites en réponses à ces derniers.
III.2.3. Résultats
III.2.3.1. Réponses des adultes gambiens aux protéines MSP119 par ELISPOT en culture
La réponse des cellules des adultes gambiens aux protéines MSP119 a été évaluée en premier
par ELISPOT en culture, en mesurant le nombre de cellules T CD4+ productrices d’IFN- après
stimulation par ces protéines (mutant et sauvage). Nous avons obtenu 27% (11/43) de
répondeurs pour la protéine normale contre 30% (13/43) pour la protéine triple mutant, la
différence n’était pas significative (654 ± 189 et 721 ± 299 SFU/106 PBMCs respectivement,
pour la protéine sauvage et le triple mutant).
III.2.3.2. Production des cytokines en réponses aux protéines MSP119
Nous avons ensuite mesuré la production de l’IFN-, de l’IL-13 et du marqueur Th2 CD30
soluble par les PBMCs d’adultes gambiens en réponse aux protéines normale et triple
mutant. Les réponses obtenues sont indiquées sur les figures 16 ci- dessous.
Une production significativement élevée d’IFN- par les PBMCs a été obtenue en réponse à
la protéine triple mutant par rapport à la protéine sauvage (4500 ± 256 et 3186 ± 267, P* =
0,015) (figure 16a). La production d’IL-13 et de CD30 soluble induite en réponse aux deux
protéines était identique (Figures 16b et 16c).
III.2.3.3. Réponses des adultes gambiens aux peptides MSP119 par ELISPOT en culture
Nous avons évalué la fréquence des répondeurs aux peptides normaux ou mutants de
MSP119 (Tableau II) chez les adultes gambiens pour déterminer le ou les peptides
Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 88
immunodominants. Les fréquences des répondeurs et des cellules T CD4+ sécrétrices d’IFN-
en réponse aux peptides sont représentées dans les figures 17a et 17b.
Le peptide P16 est le peptide immunodominant car reconnu par la majorité des donneurs
(27/43 soit 63%), alors que le peptide P13 n’a été reconnu que par 26% des donneurs.
Aucune différence statistiquement significative n’a été observée en comparant le nombre de
répondeurs aux peptides sauvages et mutants de MSP119.
Tableau II. Séquence des peptides mutants et sauvages de MSP119
Bisseye C et al, 2011, Clinical and Experimental immunology in press
Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 89
Figure 16. Production de cytokines par les PBMC en réponse aux protéines MSP119.
Les PBMCs de 43 adultes ont été cultivées pendant 3 jours en présence de protéines MSP119.
Les cytokines Th1 (IFN-) (a) et Th0/Th2 (IL-13 et sCD30) (b et c) ont été mesurées par ELISA. Les résultats sont
présentés comme moyenne ± écart-type.
(a) Une production significative de l'IFN- par les PBMCs a été obtenue en réponse à la protéine triple mutant
de MSP119 (barre hachurée à droite) par rapport à la protéine normale (barre hachurée à gauche) (4500 ± 256
et 3186 ± 267, p* = 0,015).
(b et c) En revanche, les mêmes quantités d'IL-13 et de sCD30 ont été produites par les PBMCs en réponse aux
protéines triple mutant et sauvage de MSP119.
Comme le montre la figure 17b, le nombre de cellules T sécrétrices d’IFN- est le plus élevé
en réponse aux peptides P16 et P21 (531 ± 598 et 400 ± 689 SFU/106 de PBMC) chez les
adultes gambiens semi immuns. Il n'y avait aucune différence dans la fréquence des cellules
T sécrétrices d’IFN- entre les peptides sauvages et mutants.
Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 90
Figure 17. (a) Fréquence des donneurs et des cellules sécrétrices d’IFN- en réponse aux peptides de
MSP-119 chez 43 adultes gambiens exposés au Plasmodium.
Les donneurs dont le nombre de cellules productrices d’IFN- était significativement différent (Loi binomiale, P
<0,05) au milieu de culture en réponse aux peptides ont été considérés comme répondeurs.
Les résultats sont présentés en pourcentage de répondeurs pour les peptides de MSP-119 de type sauvage
(barres vides) ou de type muté (barres hachurées), 27/43 (63%) des adultes ont répondu au peptide
immunodominant P16 et seulement 11/43 (26%) ont répondu au peptide P13. Aucune différence dans le
nombre de répondeurs n’a été observée en comparant les réponses des peptides mutés et sauvages.
(b) Fréquences des cellules T sécrétrices d’IFN- en réponse aux peptides sauvages (barres vides) et mutés
(barres hachurées) de MSP-119. Les résultats sont présentés comme moyenne ± SD SFU/106 PBMC. Un nombre
plus élevé de cellules sécrétrices d’IFN- a été obtenu en réponse aux peptides P16 et P21 (531 ± 598 et 400 ±
689 SFU/106 PBMC). Aucune différence n'a été trouvée pour la fréquence des cellules T sécrétrices d’IFN- en
réponse aux peptides sauvages et mutants.
Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 91
III.2.3.4. Production de cytokines en réponse aux peptides mutants et sauvages de MSP119
Nous avons également mesuré la sécrétion d'IFN- (Th1), d’IL-13 et de CD30 soluble
(Th0/Th2) en réponse aux peptides sauvages et mutants de MSP119 comme indiquée sur les
figures 18a à 18c. Aucune différence n’a été observée dans la production d’IFN- entre les
peptides sauvages et mutants. La production d’IFN- était significativement plus élevée en
réponse au peptide P16 comparativement aux autres peptides (sauf pour les peptides P14,
P14M, P15M, P16M, P17M, et P21) (Figure 18a). La production d’IL-13 était plus élevée en
réponse aux peptides mutants par rapport aux peptides sauvages (P13M vs P13, P = 0,025;
P15M vs P15, P = 0,001; P17M vs P17, P = 0,03) (Figure 18b). La production d’IL-13 a été
significativement plus élevée en réponse au peptide P19 comparativement aux autres
Diatta1, Giorgio Sirugo1, Margaret Pinder1, Sam dunyo1, William D. Morgan3, Michael J.
Blackman3, Anthony A. Holder3, Jacques Simporé4 and Paul Milligan1,2.
Medical Research Council Laboratories, PO Box 273, Banjul, The Gambia1; Department of Infectious and Tropical
Diseases, London School of Hygiene and Tropical Medicine, Keppel Street, London, WC1E 7HT, United Kingdom2;
Division of Parasitology, MRC National Institute for Medical Research, Mill Hill, London NW7 1AA, United
Kingdom3; and Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni, Ouagadougou, Burkina Faso4
Article soumis pour publication
III.3.1. But de l’étude
Les Peuls du Burkina Faso sont plus résistants au paludisme que les groupes ethniques
sympatriques Mossi et Rimaibé. Cette résistance a été associée à une réponse humorale
immunitaire plus élevée dirigée contre les antigènes de P. falciparum. Peu d’études sur la
résistance au paludisme par les Peuls ont été faites ailleurs en Afrique de l’Ouest. Par
conséquent, nous avons mené cette étude en Gambie sur un grand groupe de participants
appartenant aux groupes ethniques Peul, Wolof et Mandingue afin d’étudier la réponse
humorale interethnique, la prévalence parasitaire et la résistance au paludisme. Nous avons
étudié les réponses humorales aux protéines CSP, AMA1 et MSP119. Toutes ces protéines
sont des candidats vaccins contre le paludisme à P. falciparum en cours de développement.
Notre étude avait pour but de tester l’hypothèse de la résistance des Peuls de Gambie au
paludisme comparativement aux groupes ethniques sympatriques Wolof et Mandingue.
Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 96
III.3.2. Population
L’étude a été réalisée dans un groupe stratifiée de 658 enfants et adultes âgés de 6 mois à
45 ans recrutés parmi les trois groupes ethniques Peul, Wolof et Mandingue. Les participants
ont bénéficié d’un suivi clinique actif de 23 semaines à partir de la date de leur inclusion
dans l’étude.
III.3.3. Résultats
III.3.3.1. Caractéristiques des participants de l’étude
Les caractéristiques démographiques des participants de l’étude sont résumées dans le
tableau II. La cohorte a été constituée pour être représentative des trois principaux groupes
ethniques dans chaque tranche d’âge. Les Wolofs, les Peuls et les Mandingues
représentaient respectivement 31,26%, 36,39% et 32,35% des participants à l’étude. Ils ont
été classés en trois catégories d’âge < 5ans, 6-15 ans et > 15 ans avec respectivement
20.88%, 42.39% et 36.73% des sujets. Parmi les participants de l’étude, près de 60% étaient
de sexe féminin, 25% utilisaient une moustiquaire et 1% une moustiquaire imprégnée
d’insecticide. Le taux d'inoculation entomologique (EIR) était supérieur à 50 dans 18% des
sites de résidence. En ce qui concerne les facteurs génétiques de l’hôte affectant la
protection contre le paludisme, 1/5 des sujets étaient hétérozygotes HbAS et environ 1%
étaient homozygotes HbSS. La déficience en G6PD affectait respectivement environ 4% et
1% des hommes hémizygotes et des femmes hétérozygotes. L'immunité acquise à P.
falciparum a été évaluée lors de l’enrôlement dans l’étude. Les anticorps dirigés contre les
antigènes CSP, MSP119 et AMA1 ont été retrouvés respectivement chez 76,75%, 64,29% et
50% des participants à l’étude (Tableau IV).
III.3.3.2. Comparaisons interethniques de l'incidence du paludisme
Nous avons étudié les différences interethniques de l'incidence du paludisme chez les trois
principaux groupes ethniques de la Gambie, Peul (n = 234), mandingue (n = 208) et wolof (n
= 201). Le taux d'incidence du paludisme était similaire dans les trois groupes ethniques.
Cependant, les EIRs enregistrés dans les villages et les génotypes G6PD et Hb ont été
associés à un risque accru de paludisme et à l'ethnicité. En effet, les Peuls vivaient plus
souvent dans les villages où l’EIR était faible.
Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 97
Tableau IV. Caractéristiques des participants de l’étude et de la réponse humorale aux antigènes de
P. falciparum CSP, AMA1 et MSP119 à l’inclusion
N = 658 n %
Groupe ethnique
Wolof 201/643 31,26
Peul 234/643 36,39
Mandingue 208/643 32,35
Age
<5 ans 133/637 20,88
5-15 ans 270/637 42,39
>15 ans 234/637 36,73
Ac anti-CSP Négatif 146/628 23,25
Positif 482/628 76,75
Ac anti-AMA1 Négatif 315/630 50,00
Positif 315/630 50,00
Ac anti-MSP119 Négatif 225/630 35,71
Positif 405/630 64,29
Sexe Homme 280/654 42,81
Femme 374/654 57,19
Moustiquaire Non 494/658 75,08
Oui 164/658 24,92
Moustiquaire imprégnée Non 651/658 98,94
Oui 7/658 1,06
EIR
0 90/606 14,85
≤50 409/606 67,49
>50 107/606 17,66
G6PD
Normal 533/656 94,34
A-hétérozygote 25/656 4,42
A- 7/656 1,24
Type Hb
AA 467/592 78,89
AS 118/592 19,93
SS 7/592 1,18
Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 98
Après ajustement pour les effets des covariables, l’ethnicité Peule a été associée à un risque
légèrement accru de paludisme par rapport aux deux autres groupes ethniques.
Des estimations corrigées de l'incidence du paludisme, en association avec les
caractéristiques de base décrites dans le tableau V et en particulier la présence de la
parasitémie lors de l'enrôlement abolissent les différences interethniques de susceptibilité
au paludisme clinique et aucune différence significative de l'incidence du paludisme a été
trouvée entre les trois groupes ethniques [estimations brutes (4.226; ST dev: 0,325; Pr (> | z
|): 0.000) et les estimations ajustées pour tous les facteurs confondants (3,972; ST dev:
0,344; Pr (> | z |): 0)].
III.3.3.3. Comparaisons interethniques dans la réponse humorale à CSP, AMA1 et MSP119
La réponse humorale anti-CSP, MSP119 et AMA1 (IgG, IgG1 et IgG3), augmente avec l'âge.
Aucune association significative n'a été trouvée d’une part, entre la réponse humorale et
l'utilisation de moustiquaires et d’autre part, entre la réponse humorale et l'EIR, ni en
utilisant la régression logistique, ou la régression log-linéaire (non représentée).
La proportion de patients ayant répondu à AMA1 était similaire dans les 3 groupes
ethniques. Elle était cependant plus faible chez les Mandingues pour CSP et MSP119
comparativement aux 2 autres groupes ethniques (Tableau VI).
Les concentrations en IgG totales et sous-classes (IgG1 et IgG3) anti-CSP, AMA1 et MSP119
ont été comparées chez les participants des différents groupes ethniques. Les
concentrations en IgG et IgG1 anti-MSP119 étaient plus élevées chez les Peuls (figure 19)
tandis que les IgG, IgG1 et IgG3 anti- AMA1 étaient similaires dans les 3 groupes ethniques.
Comme le montre la figure 19, la concentration en IgG anti-CSP était plus faible chez les
Mandingues comparativement aux Peuls et Wolofs, qui avaient des concentrations
anticorpales similaires. Les participants des 3 groupes ethniques avaient les mêmes
concentrations en IgG1 et IgG3 anti-CSP.
Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 99
Tableau V. Caractéristiques des participants du groupe à l’enrôlement et incidence du paludisme en association avec les taux d’IgG anti-AMA1, anti-MSP119
et anti-CSP ajustés pour les facteurs confondants.
* Nombre total des participants de l’étude ; †CSP: Protéine Circumsporozoite ; ‡MSP119 : Merozoite Surface Protein 1 ; §AMA1: Apical Membrane Antigen 1
III.3.3.4. Association anticorps et incidence du paludisme et de la parasitémie
Comme l’indique les courbes de survie de Kaplan-Meier (figure 20), les taux élevés
d’anticorps sont associés à un temps prolongé avant la première attaque clinique du
paludisme. Des concentrations élevées d'anticorps anti-CSP, AMA1 et MSP119 sont
protectrices contre l'infection palustre. L'analyse brute a également montré une association
significative entre les Ac dirigés contre les antigènes CSP (IgG1 et IgG3), AMA1 (IgG) et
MSP119 (IgG, IgG1 et IgG3) et la protection contre le paludisme (non représentée).
Comme le montre le tableau V, après ajustement pour l'âge, les variables d'exposition, les
génotypes Hb et G6PD (hormis la parasitémie au moment de l’enrôlement) pour les 3
antigènes (IgG anti-AMA1, MSP119 et CSP), il y avait seulement une association significative
entre l'incidence du paludisme et la concentration en anticorps anti-MSP119 et AMA1.
Considérant les sous-classes d’IgG (Tableau VII), les concentrations en IgG1 anti-AMA1 et
anti-CSP étaient associées à l’incidence du paludisme. Aucune association entre IgG1 anti-
MSP119 et IgG3 dirigés contre les 3 antigènes et l’incidence du paludisme n’a été observée.
Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 102
CSP
Ant
ibod
y tit
ers
0
100
200
300
400
500
600
700
T otal IgG IgG 1 IgG 3
MSP
1-19
Ant
ibod
y tit
ers
0
20 0
40 0
60 0
80 0
F ulaM andinkaW olo f
AMA-
1 An
tibod
y tit
ers
0
20 0
40 0
60 0
80 0
100 0
Figure 19. Concentration en IgG, IgG1 et IgG3 anti-CSP, anti-AMA1 et anti-MSP119 chez les Peuls,
Wolofs et Mandingues.
Après ajustement de l’effet des IgG sur les 3 antigènes, l'ethnicité était indépendamment
associée à l'incidence du paludisme. Les sujets des groupes ethniques Mandingue et Wolof
avaient une incidence palustre réduite par rapport aux Peuls.
Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 103
Tableau VII. Incidence du paludisme en association avec les taux des sous-classes d’IgG anti-AMA1,
CSP et MSP119 ajustés pour tous les facteurs confondants
Sous-classe Ac concentration Ac (µg/ml)
Ratio brut (95%IC)
Ajusté pour les facteurs confondants
RL
IgG1 anti-AMA1
0-368
1
1
X2=6,91 (2), P=0,0316 N=299
369-905
0,78 (0,48-1,26)
0,79 (0,45-1,37)
>905
0,48 (0,28-0,85)
0,39 (0,19-0,81)
IgG3 anti-AMA1
0-11
1 1
X2=0,77 (2), P=0,6792 N=299
12-65
0,59 (0,35-0,97)
1,15 (0,64-2,07)
>65
0,46 (0,27-0,79)
0,85 (0,43-1,71)
IgG1 Anti-MSP119
0-28
1 1
X2=2,75 (2), P=0,2534 N=320
29-173
0,66 (0,42-1,04)
0,97 (0,58-1,65)
>173
0,25 (0,13-0,47)
0,57 (0,27-1,20)
IgG3 Anti-MSP119
0-6
1 1
X2=3,43 (2), P=0,1799 N=320
7-27
0,43 (0,26-0,71)
0,59 (0,34-1,05)
>27
0,35 (0,20-0,60)
0,73 (0,37-1,41)
IgG1 Anti-CSP <2
1 1
X2=9,2 (2), P=0,0101 N=401
2-93
0,51 (0,34-0,77)
0,68 (0,41-1,13)
>93
0,22 (0,12-0,39)
0,39 (0,20-0,76)
IgG3 Anti-CSP <2
1 1
X2=1,41 (2), P=0,4932 N=401
2-99
0,45 (0,29-0,70)
0,79 (0,47-1,34)
>99
0,59 (0,40-0,88)
1,10 (0,68-1,79)
En incluant la parasitémie au moment de l’enrôlement comme un facteur confondant dans
les analyses, toutes les associations observées ont été abolies (données non présentées).
Nous avons regardé les effets cumulatifs des différents anticorps sur la protection contre le
paludisme. Aucune interaction significative entre la protection liée à CSP et les antigènes du
stade sanguin AMA1 et MSP119 n’a été observée, que ce soit en présence ou en absence de
parasitémie.
Thèse de Doctorat Unique 2011 Cyrille BISSEYE Page 104
Figure 20. Courbe de survie de Kaplan-Meier représentant les réponses humorales et l’incidence du
paludisme dans les 3 groupes ethniques Peul (trait noir), Mandingue (trait rouge) et Wolof (trait
vert).
Les données des parasitémies issues des 3 enquêtes transversales (données non montrées),
Juillet 2003, Octobre-Novembre 2003 et Décembre 2003, ont montré la tendance d’une
parasitémie à P. falciparum plus élevée chez les Wolofs par rapport aux autres groupes
ethniques. Cependant, les faibles prévalences et les fluctuations des densités parasitaires
Present addresses: †IBL, Institut Pasteur, Lille, France.
‡Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni (CERBA), Ouagadougou, Burkina
Faso
182
Abstract
The Fulani of Burkina Faso and Mali seem to be more resistant to malaria than other groups
due to their higher levels of antibody responses to several malaria antigens. Few studies have
investigated this finding elsewhere in West Africa. We used a large cohort of individuals aged
6 months to 45 years and living in The Gambia to assess interethnic differences in malaria
incidence and humoral responses to malaria antigens (CSP, MSP119 and AMA1) between
Fulani and the sympatric Mandinka and Wolof. In contrast to the situation in Burkina Faso
and Mali, we found similar malaria incidence, and parasite prevalence in the three groups,
although the humoral response to MSP119 in the Gambian Fulani was higher than that of their
sympatric groups. High responses to MSP119 and AMA1, but not to CSP, were associated
with protection against malaria. Interestingly, adjusting for parasitaemia at enrolment
abolished the association of responses to all vaccine candidates with protection against
clinical malaria.
183
Introduction
It is well established that Fulani from Burkina Faso and Mali, have lower parasite density and
higher levels of antibodies to a variety of malaria antigens when compared to the other
sympatric Mossi, Rimaibe and Dogon ethnic groups (Modiano et al, 1996; Dolo et al, 2005).
Very few studies are available for Fulani from other West African countries. Riley et al.
(1992a) reported a higher antibody response of the Gambian Fulani to the Pf155 ring-infected
erythrocyte surface antigen (RESA), associated this immune response with resistance to
clinical malaria and correlated it with class II DQA-DQB, which is common in the Fulani
ethnic group. Other reports have referred to splenomegaly and higher IgM levels as more
frequent in the Fulani from Nigeria (Oomen et al, 1979), Burkina Faso and Mali (Bolad et al,
2005) and The Gambia (Greenwood et al, 1987) compared to other sympatric ethnic groups.
However, the latter studies did not provide parasitological or specific immunological data and
did not verify to what extent the high antibody response to Plasmodium falciparum is a
common trait of the Fulani ethnic group across West Africa. Consequently we have conducted
a cohort study in the Gambia in a wide age range of participants from the three major ethnic
groups: Mandinka, Fulani and Wolof, to investigate humoral responses, parasite prevalence,
and resistance to malaria. We investigated the humoral response to the pre-erythrocytic stage
circumsporozoite protein (CSP) and to the erythrocytic stage merozoite antigens, apical
membrane antigen 1 (AMA1), and the 19 kDa C-terminal region of merozoite surface protein
1 (MSP119). All proteins are candidates in development for inclusion in a vaccine against P.
falciparum malaria. Immune responses to these antigens may prevent or reduce malaria–
related morbidity and mortality by inhibiting sporozoites invasion and development within
hepatocytes or merozoite invasion of erythrocytes, thus eliminating or reducing the parasite
load, as supported by evidence drawn from studies of malaria in humans and several animal
184
models (Heppner et al, 2005; Egan et al, 1996; Polley et al, 2004). However, there is
conflicting evidence for the protective effects of responses to CSP and MSP119 in studies
from different West African countries (Dodoo et al, 1999; Riley et al, 1992b). In addition,
further evidence is needed for a broad protective effect of AMA1-specific antibodies, for
example because of extensive antigenic polymorphism. Here we have used a cohort study to
reassess the protective effects of responses to each of the vaccine candidates. We have re-
examined antigen-specific IgG1/IgG3 subclass levels present before the malaria season to
predict the proteins' potential efficacy as vaccine candidates, adjusting for the confounding
effects of exposure and age, as well as the prevalence of parasites and ethnicity. This is also
the first report of a cohort study designed to compare humoral responses to these antigens in
blood samples from Gambians of Fulani, Mandinka and Wolof ethnicity and with reference to
their susceptibility to clinical malaria.
Materials and methods
Study Design
A cohort of 658 adults and children was recruited from 8 rural villages surrounding Farafenni,
a town on the North bank of the River Gambia which experiences annual peak malaria
transmission from August to December (October to November being the highest transmission
period). We used the MRC Household Registration System to recruit a sample of children and
adults aged from 6 months to 45 years, stratified by age and ethnicity so that the age
distribution was the same in each group (Wolof, Mandinka and Fulani). Informed consent
was obtained from all adult participants or the parent or guardian for the children below 18-
185
years old. Venous blood samples were collected during the period 14th to 28th July 2003 from
each participant for analysis of their immune responses and parasitaemia.
500 µl of blood collected in EDTA tubes was used for sickle cell haemoglobin genotyping,
packed cell volume (PCV) measurement and thick blood smear microscopy for parasite
detection. The remainder of the blood was collected into a heparin tube for subsequent
measurement of humoral and cell immune responses. Plasma samples were stored at –20°C
prior to measurement of antibody levels.
Following initial sampling in July 2003, each participant in the cohort was visited weekly by a
field worker for a period of 23 weeks (up to January 2004). Axillary temperature was
measured with a digital thermometer, and in cases of fever (temp >37.5°C), a rapid diagnostic
test (ICT Malaria Pf/PvTM: histidine-rich protein antigen II- AMRAD, Australia) was
performed and the person treated for malaria according to national guidelines (at that time,
SP+CQ), if the test was positive. A blood film was also taken to determine parasite density by
microscopy. Clinical malaria incidence for any cohort participant, who attended the Farafenni
APFRC hospital or outpatients clinic, was also recorded. Cross-sectional surveys of all
participants were also carried out; finger prick samples were collected at the end of October
and the beginning of November (the peak of highest transmission) and during mid December
(low transmission) for preparation of thick blood films. Parasitaemia was assessed by
microscopic examination of Giemsa-stained smears; all slides were read twice by experienced
microscopists and any discrepancy resolved by a third reader. One hundred fields at 1000x
magnification were examined before declaring a slide negative (limit of detection,
approximately 2 parasites/l). Malaria was defined as fever (axillary temperature >37.5oC)
with a parasite density > 5000/µL (Migot-Nabias et al, 2000). Details of bed-net use and
condition, insecticide use, and type of house were collected in July 2003. A surveillance was
186
carried out in the villages to estimate the entomological inoculation rate (EIR). The ethnicity
of participants was determined from questionnaires to collect information on the ethnicity of
their parents and grandparents.
The study was approved by the Joint Gambia Government/MRC Ethical Committee.
Sickle cell haemoglobin and G6PD genotyping
Genomic DNA was extracted from the buffy coat cell fraction or whole blood using a
standard salting out procedure, and sickle cell trait genotyping was performed by PCR, using
an amplification refractory mutation system (ARMS), to detect the sickle cell mutation (an A
to T transition in codon six of the β-globin gene). Primer sequences for typing HbS were as
follows:
HbS allele - 5'GGCAGTAACGGCAGACTTCTCCA 3'
Normal HbA allele - 5' GGCAGTAACGGCAGACTTCTCCT 3'
Reverse primer - 5' GCCAGTGCCAGAAGAGCCAA 3'
Sixty 60 ng genomic DNA was mixed with 15 pmol of each forward and reverse primer, in a
15 µl reaction containing 16mM (NH4)2SO4, 67mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25ºC), 3.45 mM
MgCl2, 0.6 mM each dNTP, and 0.5 U Taq DNA polymerase (Bioline Ltd., London, UK).
Cycling conditions were 96oC 1 min; 5 cycles of 96oC 35 sec, 70oC 45 sec and 72oC 35 sec;
then 21 cycles of 96oC 25 sec, 65oC 50 sec and 72oC 40 sec; then 6 cycles of 96oC 35sec,
and 55ºC 1 min; followed by 72oC 90 sec. PCR products were electrophoresed on a 2%
agarose gel, stained with ethidium bromide and digitally photographed using a Gel Doc
System 2000 apparatus (Bio-Rad Laboratories Ltd. Hertfordshire, UK).
187
For G6PD status determination, samples (4 ng of DNA) were genotyped by Taqman assays
(ABI, Applera International Inc, Foster City, CA, USA) in 10 µl reaction volume using the
ABI 7500 real-time PCR systems. Fluorescence curves were analyzed with the 7500
Sequence Detection Software version 1.2.1 for allelic discrimination.
Antibody responses to MSP119, AMA1 and R32LR
Levels of antibody to MSP119 and AMA1 were measured in the plasma samples using ELISA.
Briefly, ELISA plates (Immunlon4, Dynatech Laboratories Inc.) were coated with 1µg/ml of
MSP119 or AMA1 in 100 µl carbonate buffer and incubated overnight at 4 ˚C, then washed
with PBS-Tween (0.05%), flicked dry and 150 µl of PBS-1% BSA blocking solution was
added. Plates were incubated at room temperature for 3 hours, then flicked dry and diluted
plasma samples were added. The plasma samples in duplicate were assayed at 1:1000;
1:2000, 1:4000, and 1:8000 dilutions for MSP119 and at 1:1000 and 1: 2000 dilutions for
AMA1. Serial dilutions of purified human IgG and anti human IgG-POD were used as
standards on each plate to assess the relative concentration of antibody (Ab) to AMA1 and
MSP119. The plates were incubated overnight at 4˚C, washed 6 times and horseradish-
peroxidase (HRP)-goat anti-human IgG (Dako A/S, Denmark) or horseradish-peroxidase
(HRP)-rabbit anti-human IgG1 or anti-IgG3 for the subtype determination (The Binding Site,
UK) were added at a 1:5000 dilution in PBS-1% BSA. The plates were incubated for 3 hours
at room temperature, washed 6 times and the reaction developed by adding 100 µl
tetramethyl-benzidine (TMB) (Sigma, UK). The reaction was stopped with 100 µl 2M H2SO4
and the plates read at 450 nm.
Samples from donors resident in Brefet were used as positive controls and sera of European
tourists with no previous exposure to malaria were used as negative controls. The mean + 3
188
standard deviation (SD) of the negative control European sera was used as the end point titre
cut-off to define ‘responders’.
To quantify IgG binding to the P. falciparum CSP NANP-repeat sequence, 0.1 µg of the
R32LR recombinant antigen in 50µl PBS and casein (4 µl of boiled casein [0.5% casein with
Phenol Red, Thimerosal, PBS, 5N NaOH; SIGMA] per 5 ml of diluted antigen) was used to
coat each well on Immunlon plates. Following incubation overnight at room temperature, the
wells were then blocked with 250 µl of blocking buffer (0.5% Boiled Casein and Tween) for
one hour at room temperature. The contents of the well were removed by aspiration and 50 µl
of an appropriate plasma dilution were added. Each plate contained the following wells: a
blank, negative and positive serum (DGP) controls and the samples (in triplicate) starting at a
1:50 dilution and with further two-fold dilutions. Samples were incubated in the wells for two
hours at room temperature and then the wells were washed with PBS-Tween 20. Goat
antihuman IgG conjugated to horse radish peroxidase (Kierkegaard and Perry Laboratories) at
a dilution of 1: 1000 was added at 50 µl/well and incubated for one hour at room temperature.
Wells were washed four times with PBS-Tween 20 and 100ul of substrate solution (ABTS
HRP Substrate Kit, Kierkegaard and Perry Laboratories) were added and incubated for one
hour at room temperature. Ten µl of 20% SDS (SIGMA) were used to stop the reaction and
then the absorbance was read at 414 nm. For each plasma sample tested three readings of a
dilution which gave an OD value of around 1.0 were selected. The mean OD reading was
calculated and this mean was multiplied by the dilution factor to obtain the weighted mean
(WM). The corrected weighted mean (CWM) for each plate was calculated: CWM =
Average WM DGP x WM sample / WM DGP. The IgG concentration (µg/ml) on each plate
was calculated by the formula: IgG in sample (µg/ml) = known concentration for DGP (9.8) x
CWM of sample / CWM of DGP standard.
189
Statistical analysis
Incidence rate ratios for the association of immunological variables and ethnicity with malaria
incidence were estimated by fitting a weibull model to the times of malaria episodes, this
model was chosen because it allows for seasonality in the incidence of malaria. To allow for
the lack of independence among repeated observations on the same individual, a random
effect was included to allow for variation in individual baseline risk, which was assumed to
follow a gamma distribution. Antibody concentrations were included in the model as category
variables, with 5 levels, the first category for zero values, and the remaining 4 categories
obtained by grouping the positive values according to quartiles; a likelihood ratio test was
used to obtain a P-value for the association of each antibody level with malaria incidence.
Covariates were specified in advance: EIR, net use, age group, sickle cell and glucose-6-
phosphate dehydrogenase (G6PD) genotype, and whether the house had open eaves. Several
models were fitted. Firstly, to assess the independent effects of total IgG to AMA1, MSP119
and CSP, all three variables were included in the model with the covariates. Secondly, to
examine the association with IgG subclasses, models were fitted for each antigen in turn,
including the concentration of IgG1 and IgG3 (as category variables with three levels
according to tertiles) and the same list of covariates.
Association between antibody level and various effects was analysed using both one way
analysis of variance and the Bernoulli lognormal model. In the Bernoulli lognormal model,
we modelled the event that the antibody levels from a subject were zero or non zero with a
Bernoulli variable, and modelled the non zero measurement on antibody level with a
lognormal variable. In this dataset, antibody levels are left truncated, i.e. measurements that
are less than 10 pg/ml are considered to be zero. The Bernoulli lognormal mixture model also
considers this by incorporating a left-censoring process in the lognormal component.
190
To detect effects that are protective against malaria infection, we did Poisson regression
analysis on malaria incidence vs. various effects, including age, ethnicity, antibody level, Hb
type, entomology, and housing information. Antibody levels were included as an ordinal
variable in the analysis, i.e. subjects were categorized into high, medium, or low responders
based on the continuous antibody levels. To check how antibody levels were related to time
to the first malaria incidence, Kaplan-Meier plots were made for each antibody, with 3 strata,
high, medium, and low antibody levels.
Results
Baseline characteristics of study participants
Demographic and baseline characteristics of study subjects are shown in Table 1. The cohort
sample was made to be representative of each of the three main ethnic groups in each age
group, the distribution of participants across ethnicity (31.26%, 36.39% and 32.35% in the
Wolof, Fulani and Mandinka groups, respectively) and age categories (20.88%, 42.39% and
36.73% in the less than 5 years, 6-15 years and > 15 years old categories, respectively) was
similar. Nearly 60% of study subjects were female. Reported insecticide-treated net (ITN)
ownership at the beginning of the study was roughly 25%, whereas only 1% had had the net
impregnated with insecticide. The entomological inoculation rate (EIR) was found to be
higher than 50 in 18% of sites of residence and more than 50% of households reported having
an eaves gap in their housing. Acquired immunity to P. falciparum was assessed at enrolment.
Regarding genetic factors affecting protection against malaria, almost one fifth of subjects
were found to be heterozygous for sickle-cell and around 1% was homozygous. Around 4%
and 1% were identified as female heterozygous and male hemizygous for G6PD deficiency,
191
respectively. CSP, MSP119 and AMA1-specific antibodies were found to be present in
76.75%, 64.29% and 50% of participants, respectively.
Comparison of malaria incidence among ethnic groups
We investigated the interethnic differences of malaria incidence among the three major
groups in the Gambia, Fulani (n= 234), Mandinka (n=208) and Wolof (n=201). Malaria
incidence rates were similar in the three ethnic groups; however, the EIR recorded in the
village, and the G6PD and sickle cell genotype, were associated with malaria risk and
ethnicity. Fulani for example were more likely to live in villages where EIR was low, and
after adjustment for the effects of covariates, Fula ethnicity was associated with a slightly
increased risk of malaria compared to the two other ethnic groups. However, adjusted
estimates of malaria incidence, in association with the baseline characteristics described in
Table 2 and in particular parasitaemia at enrolment, abolished the interethnic differences of
clinical malaria and no significant difference of malaria incidence was found between the
three groups [Crude estimates (4.226; ST dev: 0.325; Pr(>|z|):0.000) and adjusted estimates
for all confounders (3.972; ST dev: 0.344; Pr(>|z|):0)].
Comparison of humoral responses to CSP, AMA1 and MSP119 among ethnic groups.
Antibody responses to CSP, MSP119 and AMA1 (total IgG, IgG1 and IgG3), increased with
age, while no significant association was found with bed net use or EIR, neither in logistic
regression nor in log linear regression (not shown). While the proportion of responders to
AMA1 was similar in all ethnic groups, for CSP and MSP119, the proportion of responders
was lower in the Mandinka group than in the other two groups (Table 3). The concentration of
total IgG among the responders was compared between ethnic groups; the concentration of
total IgG and IgG1 to MSP119 was higher in the Fulani group (Figure 1) while total IgG, IgG1
192
and IgG3 to AMA1 was similar in the three ethnic groups. As shown in Figure 1, the
concentrations of total IgG specific to CSP were lower within the Mandinka group compared
to Fulani and Wolof participants, who had similar levels of antibodies. In addition, the three
ethnic groups had similar levels of anti-CSP IgG1 or IgG3.
Antibody association with malaria incidence and parasitaemia
Kaplan-Meier analysis (Figure 2) showed that high antibody levels are associated with
prolonged time to the first malaria incidence, i.e. high antibody levels to CSP, AMA1 and
MSP119 are protective against malaria infection. The crude analysis also showed significant
association of antibodies to the individual antigens, CSP (IgG1 and IgG3), AMA1 (total IgG)
and MSP119 (total IgG, IgG1 and IgG3) with malaria protection (not shown).
As shown in Table 2, after adjustment for age, exposure variables, sickle cell genotype, and
G6PD genotype (but not parasitaemia at recruitment) for all three antigens (total IgG to
AMA1, MSP119 and CSP), there was only a significant association between malaria incidence
and the concentration of total IgG anti-MSP119 and AMA1 antibodies, but not anti-CSP
antibodies.
When IgG subclasses were considered, (Table 4), the concentration of IgG1 to AMA1, and of
IgG1 to CSP, were associated with the incidence of malaria, but there was no association of
malaria incidence with IgG1 to MSP119, and no association of IgG3 with malaria for any of
the antigens.
After adjusting for the effects of total IgG to the three antigens, ethnicity was independently
associated with malaria incidence; Mandinka and Wolof ethnicity was associated with
reduced incidence compared to Fulani.
193
When parasitaemia at enrolment was included as a confounder factor, this abolished the
observed associations (not shown). Looking at cumulative protective effects of the different
antibodies, no significant interaction between the protection from CSP and the blood stage
antigens AMA1 and MSP119 was observed, whether or not parasitaemia was included.
The parasitological data from the three cross-sectional surveys (Figure 3), in July, October-
November and December showed that amongst the three ethnic groups Wolof tended to have
a higher prevalence of P. falciparum. However, low parasite prevalence, and the fluctuations
of the parasite rates and densities show that there is no evidence of coherent interethnic
differences.
Discussion
Fulani populations from Burkina Faso and Mali were reported to make stronger antibody
responses to malaria while being less frequently parasitized and less susceptible to clinical
malaria (Modiano et al, 1996) compared to other sympatric groups (Mossi and Rimaibé).
Accordingly, our cohort study investigated interethnic differences in humoral responses, to
the CSP, AMA1 and MSP119 vaccine candidates between Fulani and the sympatric Mandinka
and Wolof in the Gambia. In addition, because different immunoepidemiological studies
conducted at several sites have yielded conflicting evidence on the association of anti-CSP or
anti-MSP119 antibodies with clinical immunity to malaria, and because the only cohort study
described for anti-AMA1 was conducted in Kenya where the pattern of malaria transmission
is different from that in the Gambia (Egan et al, 1996; Polley et al, 2004; Dodoo et al, 1999),
we have also reassessed the association of antibody responses to these antigens with clinical
immunity. To assess the reported discrepancies, with sufficient statistical power and to
examine whether or not there was a real association with protection, the genetic background
194
and parasitaemia at enrolment, which had not been considered in previous studies, were
included as confounders.
The comparison of malaria risk between ethnic groups is complicated by many confounding
factors. In this study, the crude analysis of malaria incidence in three ethnic groups showed
that the Fulani had the highest malaria incidence compared to other ethnic groups in The
Gambia. Whilst the Wolof group had the lowest malaria incidence, after adjustment for all
confounders no significant difference was found between the three ethnic groups. It is
important to allow for differences in EIR and other factors associated with exposure such as
house construction. Although malaria incidence was similar in all three ethnic groups, there
were local geographical differences in relation to EIR; and Fulani tended to live in villages
with lower EIR. There was no evidence that people living in areas of higher EIR had higher
IgG concentrations to any of the antigens or were more likely to be responders. The mean
concentration of IgG to MSP119, which had the strongest association with malaria incidence
of the antigens tested, was higher among Fulani. After adjusting for total IgG and
environmental and genetic factors associated with malaria risk, Mandinka and Wolof ethnicity
was associated with lower malaria incidence. This could reflect genetic differences (Koch et
al, 2002), or residual confounding factors. We found similar overall rates but after adjusting
for these factors Fulani were associated with higher incidence, and stronger immune
responses as reported previously (Bolad et al, 2005). Immune responses could partly reflect
greater exposure.
The previous interethnic comparison (Modiano et al, 1996) revealed that humoral responses
were consistently higher in the Fulani. In our study, the crude analysis of the level of humoral
response showed higher levels of antibody in Fulani compared to other sympatric groups,
which is in agreement with the findings in Burkina Faso. Concentrations of total IgG to CSP
195
were lower within the Mandinka compared to Fulani and Wolof groups, who had similar
levels of antibodies. However, similar levels of CSP-specific IgG1 and IgG3 were present in
all three groups. Levels of total anti AMA1 IgG and IgG1 were similar in the three groups,
whilst IgG3 levels were highest among Fulani, medium in Wolof, and lowest in the Mandinka
group. This finding is in accordance with a previous report which showed a high level of IgG3
among Fulani from Burkina Faso and Mali compared to Mossi and Dogon respectively (Bolad
et al, 2005). In contrast, levels of total anti-MSP119, IgG1 and IgG3 Abs were all higher in
Fulani compared to the Mandinka and Wolof groups, in support of Modiano’s findings
(Modiano et al, 1996).
In the previous study, parasitological and clinical evidence of a higher resistance of the Fulani
to P. falciparum was associated with their stronger humoral reactivity against a different
panel of parasite antigens: TRAP, MSP1, Pf155 (RESA), and Pf332 (Modiano et al, 1996).
We have examined humoral responses to CSP, MSP119 and AMA1 and their association with
protection against clinical malaria, including genetic traits as a new confounder. The crude
analysis associated total IgG to CSP, AMA1 and MSP119 as well as IgG1 and IgG3 to CSP
and MSP119 with protection against malaria. Adjusting for all covariates, except parasitaemia
at recruitment reduced this association for CSP. Furthermore, there was no significant
interaction or extra protection afforded to double or triple responders with total IgG, IgG1 or
IgG3 to CSP, AMA1 or MSP119. Parasitaemia at enrolment was either associated with lower
levels of antibodies or with malaria incidence; but no association of antibodies to CSP, AMA1
and MSP119 with protection and parasitaemia was found at enrolment. Interestingly, including
parasitaemia at enrolment as a confounder completely abolished all the observed associations.
This is in contrast to a study in Kenya, where presence of antibodies to AMA1 was associated
with protection in subjects carrying P. falciparum at recruitment (Polley et al, 2004).
196
We analysed the parasite prevalence and density, using samples from three cross sectional
surveys at the beginning of the transmission season (July), at the highest transmission period
(October-November) and at the end of the transmission season (December). We found that the
Wolof group had a slightly higher prevalence of P. falciparum. However, no clear conclusion
of interethnic differences could be drawn because of the low parasite prevalence in our cohort.
Previous studies had also reported low parasite prevalence in population samples mostly
constituted by Fulani in northern Nigeria (Oomen et al, 1979) and The Gambia (Riley et al,
1992b).
Our data are different from those reported previously from Burkina Faso. This discrepancy
may be attributed to large genetic differences between the Burkina Faso and Gambian Fulani,
or greater genetic differences between the Fulani and the sympatric Raimbé and Mossi groups
in Burkina Faso compared with the Fulani and the sympatric Mandinka and Wolof groups in
The Gambia (Modiano et al, 2001). Indeed, recent studies of GM polymorphism in Eastern
Senegal (Allsopp et al, 1992) and of HLA class I (Blanc et al, 1990) and II (Riley et al,
1992a) in The Gambia indicate rather small genetic distances between the Fulani and their
neighbours; in contrast preliminary analysis of individuals from Burkina Faso suggests a
relatively higher degree of genetic divergence.
The reported higher antibody response of the Fulani may be attributed to factors encoded by
genes outside the HLA class II region and involved in the regulation of humoral immune
responses against P. falciparum antigens (Sjoberg et al, 1992). Higher humoral responses
were also observed in the Gambian Fulani population, even though no association with
protection to malaria was found. Possible immunological mechanisms involving genes related
to B-cell function, antigen-presenting cell (Farouk et al, 2005; Arama et al, 2011), interleukin
4 production (Luoni et al, 2001), or regulatory T cell differentiation (Torcia et al, 2008) may
197
still show interethnic differences and be shared by Fulani across West Africa. Accordingly,
ongoing investigation into interethnic polymorphisms in Th1/Th2 cell cytokine genes may
provide insights into genes involved in regulation of humoral responses (G. Sirugo, in
preparation).
In summary, we report here for the first time studies on interethnic differences of malaria
incidence and humoral responses of Fulani, Mandinka and Wolof in The Gambia. We have
shown that Fulani compared to Mandinka and Wolof had a higher antibody response but a
similar pattern of malaria incidence and parasite prevalence and density. Interestingly,
including parasitaemia at enrolment as a confounder abolished the association of humoral
responses to all three vaccine candidates: MSP119, CSP and AMA1, which is in contrast to
reports of previous studies.
Acknowledgements: We are grateful to the all participants enrolled into the cohort study, to
the staff of Farafenni Health Centre and to the Department of State for Health. We thank all
Farfenni field workers as well as Simon Correa, Idrissa Sambou and Saikou Keita for the
technical support. The work was supported in part by the MRC through U117532067 and
U117532063
198
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201
Table 1. Baseline characteristics of the cohort study subjects at recruitment
(N=658) * n %
Ethnic group
Wolof
Fulani
Mandinka
201/643
234/643
208/643
31.26
36.39
32.35
Age
<5 years
5-15 years
> 15 years
133/637
270/637
234/637
20.88
42.39
36.73
CSP antibodies † negative
positive
146/628
482/628
23.25
76.75
MSP119 antibodies ‡
negative
positive
225/630
405/630
35.71
64.29
AMA1 antibodies §
negative
positive
315/630
315/630
50.00
50.00
Sex
male
female
280/654
374/654
42.81
57.19
Net ownership
no
yes
494/658
164/658
75.08
24.92
Net impregnated with insecticide
no
yes
651/658
7/658
98.94
1.06
Entomological inoculation rate (EIR)
0
≤ 50
> 50
90/606
409/606
107/606
14.85
67.49
17.66
G6PD deficiency ¶
Not deficient
A- heterozygote
A-
533/565
25/565
7/565
94.34
4.42
1.24
Sickle-cell disease
AA
AS
SS
467/592
118/592
7/592
78.89
19.93
1.18
Eaves gap in the household
no
yes
305/658
353/658
46.35
53.65
202
Malaria treatment in the 30 days before cross 1 ║
no
yes
408/606
198/606
67.33
32.67
Malaria treatment in the 30 days before cross 2 no
yes
401/587
186/587
68.31
31.69
* Number of subjects included in the analysis
† CSP: Circumsporozoite Surface Protein
‡ MSP119: Conserved C terminal region of Merozoite Surface Protein 1
§ AMA1: Apical Membrane Antigen 1
¶ G6PD: Glucose-6-phosphate dehydrogenase
║ This information is not strictly baseline data
203
Table 2. Baseline characteristics of the cohort study subjects at enrolment and malaria incidence in association with AMA1, MSP119 and CSP total IgG antibody levels adjusted for confounders
Characteristics N
Person months/100
Malaria cases
Rate/100 person months
Crude Rate ratio (95%CI)
Adjusted rate ratio (95%CI) P-values LR
<5years 133 7.16 94 13.14 1 1
Age group 5-15years 270 14.56 115 7.90 0.60 (0.46-0.79) 0.73 (0.52-1.02) 0.065