Teză de doctorat UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA FACULTATEA DE HORTICULTURĂ ING. CALBOREANU (căs. Badea) CARMEN REZUMAT TEZĂ DE DOCTORAT SUMMARY DETERMINAREA VARIABILITATĂŢII LA NIVEL FENOTIPIC ŞI LA NIVEL MOLECULAR A LINIILOR DE PORUMB ZAHARAT, COMPONENTE ALE PRINCIPALILOR HIBRIZI COMERCIALI CREAŢI LA SCDA TURDA, ÎN VEDEREA STABILIRII EFICIENŢEI SELECŢIEI ASISTATE DE MARKERI A LINIILOR CONSANGVINIZATE PHENOTYPIC AND MOLECULAR VARIABILITY OF SWEET CORN INBRED LINES, COMPONENT OF MOST IMPORTANT COMERCIAL HYBRIDS CREATED AT ARDS TURDA, IN ORDER TO ESTABLISH THE EFFICIENTCY OF MARKER ASSISTED SELECTION OF INBRED LINES Conducător ştiinţific: Prof. univ. dr. MARIN ARDELEAN 1
23
Embed
Teză de doctorat - usamvcluj.ro · 2.2.3.1. Metode de extracţie a ADN-ului . Pentru analiza RAPD a ADN-ului, la porumbul zaharat (bogat în glucide), s-a încercat extracţia acestuia
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
Teză de doctorat
UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA
FACULTATEA DE HORTICULTURĂ
ING. CALBOREANU (căs. Badea) CARMEN
REZUMAT TEZĂ DE DOCTORAT
SUMMARY
DETERMINAREA VARIABILITATĂŢII LA NIVEL FENOTIPIC ŞI LA NIVEL MOLECULAR A LINIILOR DE PORUMB
ZAHARAT, COMPONENTE ALE PRINCIPALILOR HIBRIZI COMERCIALI CREAŢI LA SCDA TURDA, ÎN VEDEREA
STABILIRII EFICIENŢEI SELECŢIEI ASISTATE DE MARKERI A LINIILOR CONSANGVINIZATE
PHENOTYPIC AND MOLECULAR VARIABILITY OF
SWEET CORN INBRED LINES, COMPONENT OF MOST IMPORTANT COMERCIAL HYBRIDS CREATED AT ARDS
TURDA, IN ORDER TO ESTABLISH THE EFFICIENTCY OF MARKER ASSISTED SELECTION OF INBRED LINES
Conducător ştiinţific:
Prof. univ. dr. MARIN ARDELEAN
1
Teză de doctorat
INTRODUCERE
Porumbul zaharat este o varietate în cadrul speciei Zea mays, şi anume var.
rugosa (Bonaf), convar. Saccharata (Sturt.), (după SĂVULESCU şi ZAHARIDI,
1957) şi se diferenţiază de porumbul normal prin prezenţa uneia sau mai multor gene
mutante, care afectează metabolismul glucidelor din endosperm.
În ţara noastră, cercetările legate de ameliorarea porumbului zaharat au început
la I.C.C.P.T. Fundulea, în anul 1957 (MUREŞAN şi colab., 1966). Porumbul zaharat
apare menţionat în lucrarea “Porumbul - Studiu monografic” publicată de către
SĂVULESCU şi ZAHARIDE în 1957. Primul hibrid de porumb zaharat obţinut în
România, la Fundulea, a fost hibridul simplu Delicios, omologat în anul 1969.
În anul 1971, la Staţiunea de Cercetări Agricole Turda, s-a iniţiat programul de
creare a liniilor consangvinizate şi a hibrizilor timpurii de porumb zaharat, iar în anul
1988 a fost omologat hibridul triliniar Dulcin (CĂBULEA şi colab., 1994; HAŞ şi
colab., 1994; HAŞ, 2002a). Linii valoroase sugary se regăsesc în prezent ca forme
parentale ale hibrizilor omologaţi Dulcin, Prima, Estival şi Deliciul Verii (HAŞ şi
CĂBULEA, 1998, HAŞ, V. şi colab., 1999).
Identificarea polimorfismului liniilor consangvinizate cu ajutorul
polimorfismului la nivel de ADN este extrem de utilă, datorită faptului că rezultatul
obţinut reflectă direct genotipul şi nu este influenţat de condiţiile de mediu (LODHI şi
colab.1994, POP şi colab., 2003).
Pe baza celor constatate mai sus, în teza de doctorat prezentată ne-am propus să
ducem mai departe cercetările naţionale menţionate mai sus, prin evidenţierea
variabilităţii liniilor consangvinizate de porumb zaharat, nu numai la nivel fenotipic ci
şi la nivel molecular şi stabilirea legăturilor statistice între aceste două tipuri de
manifestare. Astfel de legături ar putea fi folosite la iniţierea unui program de selecţie
asistată de markeri moleculari ai liniilor componente ale hibrizilor comerciali de
porumb zaharat.
2
Teză de doctorat
1. OBIECTIVELE CERCETĂRII, MATERIALUL ŞI METODA
1.1. SCOPUL CERCETĂRILOR
Orice program de ameliorare îşi propune crearea unei noi variabilităţi genetice
care să poată fi folosită ulterior prin selecţie pentru obţinerea de genotipuri noi mai,
performante.
Sporul de producţie, la porumbul zaharat, reprezintă un câştig modest comparativ
cu cel realizat la porumbul normal, după aprecierea făcută de către TRACY (1990b),
datorită bazei genetice mai înguste a porumbului zaharat, care limitează posibilităţile
câştigului genetic pentru producţie.
Scopul principal al cercetărilor noastre a constat în caracterizarea şi stabilirea
relaţiilor filogenetice între cele 18 linii consangvinizate şi cei 49 de hibrizi de porumb
zaharat, cu ajutorul metodologiei RAPD, precum şi compararea rezultatelor obţinute
prin formule de hibridare elaborate pe baza testării liniilor şi hibrizilor comerciali prin
metode convenţionale şi prin metode neconvenţionale (markeri moleculari).
Cercetările iniţiate de noi, constituie, probabil, primele încercări de identificare
a variabilităţii la porumbul zaharat prin metoda RAPD, în România.
1.2. OBIECTIVELE URMĂRITE ÎN CERCETĂRILE AFERENTE TEZEI DE DOCTORAT
În cercetările iniţiale ne-am propus ca, prin experienţele efectuate la 18 linii
consangvinizate şi 49 de hibrizi de porumb zaharat, să identificăm şi să selectăm un
material biologic adecvat pentru obţinerea unor combinaţii performante, care presupun
manifestarea la maxim în cadrul hibrizilor a celor mai valoroase caractere ale liniilor
parentale.
Având ca repere fundamentale cunoştiinţele privind importanţa şi actualitatea
cercetărilor cu privire la difersitatea fenotipică şi genetică a liniilor consangvinizate şi
a hibrizilor simpli, la metodele de analiză, obiectivele urmărite în această lucrare sunt
prezentate după cum urmează, pe două categorii de caracterizare a liniilor
consangvinizate şi a hibrizilor de porumb zaharat studiaţi: fenotipic şi molecular.
3
Teză de doctorat
La nivel fenotipic s-a urmărit:
caracterizarea liniilor consangvinizate de porumb zaharat pe baza valorii
„per se”a lor dar şi pe baza indicelui fenotipic de diferenţiere;
evaluarea diversităţii genetice a caracterelor cantitative a liniilor
consangvinizate de porumb zaharat forme parentale ale hibrizilor studiaţi
pe baza capaciţăţii generale şi specifice de combinare.
stabilirea gradului de diversitate genetică dintre formele parentale prin
nivelul de intensitate al heterozisului hibrizilor de porumb zaharat;
precizarea influenţei condiţiilor de mediu asupra mecanismelor genetice
implicate în exprimarea caracterelor la porumbul zaharat.
Pentru caracterizarea moleculară a liniilor consangvinizate şi a hibrizilor de
porumb zaharat studiaţi ne-am îndreptat cercetările în direcţia următoarelor aspecte:
stabilirea protocolului de extracţii de ADN şi utilizarea tehnicii RAPD (Random
Amplified Polymorphic DNA) în vederea identificării polimorfismului genetic
in vivo la 18 linii de porumb zaharat şi 49 de hibrizi simpli;
identificarea primerilor capabili să determine polimorfismul la nivel molecular
între liniile consangvinizate şi între hibrizii analizaţi;
depistarea diversităţii genetice şi a gradului de înrudire între cele 18 linii
consangvinizate, precum şi între hibrizii de porumb zaharat studiaţi, prin
amprenta ADN obţinută cu ajutorul tehnicii RAPD;
De asemenea, urmărim să evidenţiem tipul de legătură existentă între
capacitatea generală şi specifică de combinare calculată la nivel fenotipic pe de o parte
şi amprenta genetică a liniilor consangvinizate de porumb zaharat, pe de altă parte
2. MATERIALE ŞI METODE DE LUCRU
2.1 MATERIALUL BIOLOGIC
Materialul biologic utilizat în cercetările realizate a fost reprezentat de 18 linii
consangvinizate de porumb zaharat (T152 su, T193A su, T209 su, T339R su, LC153
su , LC154 su, TD101 su, T345R su, T346 su, TA25 su, TA26 su, TA27 su, TA28 su,
TA22 su, TA21 su, T233 su, T244 su, TC209 su) forme parentale şi 49 hibrizi simpli
4
Teză de doctorat
realizaţi în cadrul unui sistem ciclic (factorial) de încrucişare de tipul m x n destinat
analizei genetice cantitative, liniile tester fiind liniile T233 su, T244 su şi TC209 su.
Materialul biologic destinat izolării ADN-ului a fost reprezentat de embrionii
genotipurilor de porumb zaharat mai sus menţionate.
Pentru completarea grilajului patrat balansat s-au mai introdus în testare încă
patru hibrizi simpli de porumb zaharat, trei dintre ei omologaţi şi cuprinşi în „Lista
oficială a soiurilor şi hibrizilor” (Prima, Deliciul verii şi Delicios) şi încă un hibrid
simplu de porumb zaharat, forma maternă a hibridului Estival, linia componentă
acestui hibrid simplu SW87 su (a 19 linie), a fost şi ea analizată la nivel molecular prin
tehnica RAPD.
Pentru amplificare s-au utilizat 20 primeri decameri (UBC 281, UBC 241, UBC
Analiza genetică la nivel neaditiv pentru cele trei linii consangvinizate de
porumb zaharat, forme materne din cadrul sistemului factorial de încrucişări, reflectă
că cele mai pronunţate diferenţieri pentru valorile sumei efectelor calculate, pentru
caracterele ştiuletelui îl manifestă:
linia T233su în combinaţie cu T193Asu (105,91);
linia T244su în combinaţie cu liniile T339Rsu (37,64), TA27su (37,07),
TA22su (23,85), TA21su (19,35), TA28su (15,14);
Linia TC209su în combinaţie cu T193Asu (42,84), TA25su (20,62),
LC154su (16,21), TA22su (16,72), T345Rsu (9,72).
3.1.4. Exprimarea heterozisului la hibrizii simpli de porumb zaharat aflaţi
în studiu la SCDA Turda
Pentru greutatea ştiuletelui, în medie pe sistemul experimental, la liniile
parentale s-a înregistrat o greutate medie a ştiuletelui de 85,86 grame în timp ce la
combinaţiile hibride aceasta este de 168,45 grame. Amplitudinea valorilor înregistrată
la hibrizi este cuprinsă între 92,4 grame (T244su x T193Asu) şi 206,69 grame la
hibridul (TC209su x LC153su) în timp ce la linii se înregistrează valori cuprinse între
61,65 grame şi 115,78 grame. În toate cazurile, combinaţiile hibride depăşesc media
formelor parentale. Totuşi există şi cazuri în care diferenţele între valoarea medie a
părinţilor şi a hibrizilor este relativ redusă (T244su x T193Asu, 85,39 respectiv 92,4).
Ca urmare, heterozisul este şi el slab manifestat (8,2%).
15
Teză de doctorat
O explicaţie ar fi aceea că liniile forme parentale ale hibrizilor simpli sunt
obţinute prin autopolenizare şi selecţie din hibrizi simpli. Astfel, aceste linii au
încorporate blocuri poligenice aparţinând la grupe heterotice diferite, ceea ce le
conferă o valoare a caracterului „per se” dar există şi o probabilitate ridicată de lipsă
de diferenţiere (HAŞ, 1999).
Heterozisul producţiei cu cele mai ridicate valori procentuale s-a înregistrat în
general la hibrizii a căror mamă a fost TC209su: TC209su x LC153su (140,10%),
TC209su x TA26su (127,35%), TC209su x TA27su (125,14%), dar şi la hibrizii care
au avut ca formă maternă linia sugary T233 (T233su x T346su – 118,09%; T233su x
LC153su – 117,33%, T233su x T3339Rsu – 101,34%) sau linia T244su (T244su x
LC153su -108,5%; T244su x T339Rsu – 106,8%; T244su x TA26su – 103,03%).
Valori superioare ale heterozisului s-au înregistrat şi în cazul profunzimii
bobului (14,53% şi 138,57%).
3.1.5.Exprimarea unor caractere de producţie ale genotipurilor în relaţie cu
condiţiile de mediu la hibrizii simpli de porumb zaharat aflaţi în
studiu la SCDA Turda
Datele privind influenţa hibridului, a anului asupra greutăţii ştiuletelui au fost
prelucrate statistic. Din analiza statistică rezultă că ambii factori experimentali (an,
genotip), precum şi interacţiunile simple şi duble dintre aceştia au avut influenţe
semnificative asupra greutăţii ştiuletelui, greutăţii pănuşilor, lungimii ştiuletelui,
numărului de rânduri de boabe/ştiulete.
După cum se remarcă din imaginea de mai sus (fig.4), greutatea pănuşilor este
mai mult influenţată de condiţiile pedoclimatice, anul având o pondere mai mare în
manifestarea acestui caracter.
Lungimea ştiuletelui este un caracter important în ceea ce priveşte producţia dar
şi aspectul ştiuletelui (foarte important pentru comercializare).
16
Teză de doctorat
Fig.4. Cota de participare (%) a unor factori implicaţi în exprimarea greutăţii ştiuletelui şi a greutăţii pănuşilor la cei 49 de hibrzi de porumb zaharat, studiaţi în anii 2005 şi 2006
Influenţa factorilor şi a interacţiunii simple şi duble dintre aceştia este
semnificativă. Din figura 5 putem observa că ponderea factorului B (genotipul) este ce
mai mare (61%), ceea ce denotă că anii au avut o influenţă mai puţin pregnantă în
manifestarea acestui caracter (lungimea ştiuletelui).
Fig.5. Cota de participare (%) a unor factori implicaţi în exprimarea lungimii ştiuletelui şi a numărului de rânduri de boabe pe ştiulete la cei 49 de hibrzi de porumb zaharat, studiaţi în anii 2005 şi 2006
Şi în cazul numărului de rânduri de boabe/ştiulete (fig.5), genotipul a avut
ponderea de influenţă cea mai mare (84%), faţă de an (7%) sau interacţiunea acestor
doi factori (3%).
Ponderea majoritară a contribuţiei genotipului în exprimarea caracterelor
analizate ne sugerează faptul că hibrizii de porumb zaharat au o comportare relativ
stabilă, în condiţii diferite de mediu, în privinţa caracterelor şi a genotipurilor analizate
(HAŞ, 1999).
17
Teză de doctorat
3.1.6. Caracterizarea liniilor consangvinizate pe baza analizelor RAPD
3.1.6.1. Rezultate privind extracţia şi cuantificarea ADN-ului
După extracţia ADN-ului s-au făcut cuantificările la spectofotometru Eppendorf
BioPhotometer, la lungimea de undă de A260/A280.
În cazul liniilor de porumb analizate se constată că cele mai bune rezultate, în
ceea ce priveşte cantitatea şi puritatea de ADN se obţin din embrioni prin aplicarea
protocolului după metoda Lodhi modificat de extracţie.
În ceea ce priveşte cantitatea de ADN obţinută, cele mai mari valori s-au
înregistrat în cazul utilizării ca material biologic embrionii, prin utilizarea primului
protocol de extracţie (Lodhi modificat). Astfel din embrioni s-au obţinut cantităţi de
7893 – 12000 ng/μl, în timp ce din endosperm valorile au fost mai mici respectiv între
3450-4370 ng/ μl. În acest caz puritatea a avut valori de 1,5 şi 2.
Extracţia realizată cu protocolul după metoda Barry Miller, din endosperm, a
reuşit obţinerea unui ADN a cărui puritate a avut valori între 1,45 - 1,5, iar din
extracţiile din embrioni puritatea ADN-ului s-a situat între valorile 1,2-1,7.
Ca urmare, extracţia de ADN s-a realizat la toate celelalte genotipuri numai din
embrioni şi utilizând protocolului elaborat de LODHI şi colab, modificat (POP şi
colab., 2003).
Cantitatea de ADN obţinută a fost corespunzătoare (1275 ng/μl şi 10593 ng/μl),
având în vedere că pentru amplificare s-au utilizat 50 ng. Puritatea ADN-ului a fost, de
asemenea, corespunzătoare fiind cuprinsă între 1,52 şi 2,01.
Extracţia de ADN s-a făcut, la liniile consangvinizate de porumb zaharat, din
embrioni, în tabelul 20 fiind prezentate rezultatele numerice privind cantitatea de ADN
şi puritatea acestuia.
3.1.6.2. Rezultate privind amplificarea şi electroforeza produşilor de reacţie
Pentru amplificarea probelor s-au folosit cei 20 primeri care au dat benzi
polimorfice în cazul extracţie de ADN doar 6 dintre ei (OPB10, OPAB11,
UBC241UBC 286, OPB 17, AB 11).
18
Teză de doctorat
Amplificarea probelor s-a făcut în trei repetiţii pentru fiecare primer.
Interpretarea gelurilor obţinute s-a făcut prin analiza statistică a imaginilor. În
analiza statistică s-au inclus doar benzile cu o intensitate luminoasă mare. ADN-ul
standard utilizat constă din 40 de fragmente cuprinse între 100 şi 4000 pb. În urma
comparării cu ADN-ul standard s-a putut stabili mărimea fiecărui fragment amplificat.