-
Biochimie - Curs 12 - 2020
1
Structura acizilor nucleici În orice organism acizii nucleici
constituie o sursă care codează informaţia
biologică. Forma şi activităţile diverselor celule sunt în mare
măsură determinate de instrucţiunile genetice conţinute de ADN (sau
ARN în unele virusuri). În conformitate cu dogma centrală a
biologiei moleculare, secvenţa de baze nucleotidice din ADN codează
secvenţa aminoacizilor din proteine. Multe proteine din celulă sunt
enzime care participă în procesele metabolice. Alte proteine au rol
participa în menţinerea şi transmiterea informaţiei genetice.
Există două tipuri de acizi nucleici, ADN-ul și ARN-ul, care
sunt purtători ai informaţiei genetice şi determină ca această
informaţie să fie disponibilă pentru celulă. Structurile acestor
molecule trebuie să fie în concordanţă cu următoarele aspecte:
1. Informaţia genetică trebuie păstrată într-o formă stabilă
pentru o perioadă îndelungată.
2. Informaţia genetică trebuie sa fie decodată înainte de a fi
utilizată. Transcripţia este procesul în care secvenţa
nucleotidelor din ADN este copiată sub forma ARN-ului mesager în
aşa manieră încât să determine sinteza proteinelor (procesul de
translaţie care se desfășoară în ribozomi).
3. Informaţia conţinută pe ADN sau ARN trebuie să fie accesibilă
atât proteinelor cât şi acizilor nucleici. Aceşti agenţi pot
recunoaşte (se pot lega de) acizii nucleici astfel încât să poată
determina schimbări ale funcţiilor acestor molecule.
4. Progenitorii unui organism trebuie să fie echipaţi cu acelaşi
set de instrucţiuni ca ale părintelui. Astfel, ADN-ul este replicat
(copiat) astfel încât celulele nou formate să primească aceeaşi
informaţie genetică. În general, este acceptat faptul că pentru
exercitarea funcţiilor pe care le posedă acizii nucleici necesită
şi unele componente celulare.
Structura elicoidală a ADN-ului
Perioada de după anii 1900 până la cel de-al doilea Razboi
Mondial a fost considerată “vârsta de aur” a geneticii. Cu toate
acestea cercetătorii nu au reuşit să confirme faptul că ADN-ul şi
nu proteinele constituie materialul ereditar. Oricum, această
perioadă s-a distins printr-o serie de descoperiri genetice care au
permis stabilirea unor corelaţii între genetică şi evoluţie.
În 1869, F. Miescher a izolat ADN-ul din leucocite. Acesta a
colectat “puroiul” (care conţine o cantitate apreciabilă de
leucocite) din bandajele folosite la un spital, după care a
îndepărtat acest lichid de pe bandaje utilizând o soluţie salină.
După adăugarea unei soluţii slab alcaline peste celulele albe a
constat faptul că nucleele precipită din soluţie. Meischer a
observat faptul că aceasta substanţă din nucleu, numită nucleină,
are un raport constant fosfor:azot (P:N).
ADN-ul s-a dovedit a fi unul din principalii componenţi ai
nucleului (Mendel şi Darwin au publicat descoperirea lor în acelaşi
timp). Deoarece s-a izolat din nucleu, initial compusul (ADN-ul) a
fost numit nucleină. Mai târziu a fost denumit acid nucleic şi în
ultima instanţă acid deoxiribonucleic (ADN).
-
Biochimie - Curs 12 - 2020
2
Principalele baze din acizii nucleici
În 1914 R. Feulgen a arătat faptul că fuxina (colorant) poate
lega ADN-ul. Acestă proprietate a fost folosită pentru localizarea
ADN-ului în nucleul celulelor eucariote. În 1920, P.A. Levene a
analizat componentele moleculei de ADN. Studiile sale au dovedit
faptul că ADN-ul conține 4 baze purinice/pirimidinice (Figura 1)
legate de o deoxiriboză pe care este grefată o grupare fosfat
(Figura 2).
Figura 1. Structura chimică a celor patru baze din componența
ADN-ului (cu excepția uracilului)
Acest amsamblu (baza+deoxiriboză+grupare fosfat) formează
deoxinucleotidele, mono-meri care intră în constituţia ADN-ului
(polimer). De remarcat este faptul că deoxi-nucleozidele au în
componenţă numai bază şi deoxiriboza. Într-o deoxinucleotidă baza
este ataşată prin intermediul unei legături N-glicozidice la atomul
de carbon 1 din deoxiriboză în timp ce gruparea fosfat este grefată
la atomul de carbon din pozitia 5. Deoxinucleotidele sunt legate
prin legături fosfodiesterice (Figura 2): o gruparea fosfat se
leagă de două zaharuri diferite prin intermediul grupărilor
hidroxil din poziţia C3 de la unul dintre carbohidraţi şi poziţia
C5 de la celălalt carbohidrat.
Deşi Levene a propus corect modul de legare a nucleotidelor, el
a lansat o ipoteză greşită în ceea ce priveşte distribuţia
deoxinucleotidelor în molecula de ADN, presupunând că nucleotidele
se află grupate în serii de câte patru, care au aceeaşi ordine în
lanţul polinucleotidic.
Erwin Chargaff a izolat ADN-ul din diverse surse şi a măsurat
ponderea fiecărei baze (purinice sau pirimidinice). Din datele sale
experimentale a reieşit faptul că ponderile adeninei şi timinei
(respectiv cele pentru guanină şi citozină) sunt egale, însă cele
ale adeninei şi guaninei sunt
Figura 2. Structura chimică a unei tetradeoxinucleotide
-
Biochimie - Curs 12 - 2020
3
Figura 3. Interacțiuni între bazele nucleotidice din lanțurile
ADN-ului dublu-catenar
diferite. Asftel, s-a infirmat teoria lui Levene conform căreia
tetradeoxinucleotida era unitatea structurală de bază a
ADN-ului.
După 1900 Garrod a propus o legătură între gene şi metabolismul
existent la naştere. Una din întrebările care au survenit în acea
perioadă a fost următoarea: ce este o genă? Răspunsul a venit după
20 de ani atunci când F. Griffith a studiat diferenţa dintre două
tipuri de bacterii (una care cauzează pneumonia-S şi alta care nu
cauzează pneumonia-R). Tipul S de bacterie era încapsulat, pe când
tipul R nu. Griffith a demonstrat (1928) faptul că un tip de
bacterie nepatogenic poate deveni patogenic prin intermediul unui
“factor de transformare”. Cercetătorul a injectat diferite tipuri
de bacterii în șoarece şi a constatat faptul că tipul S induce
moartea, în timp ce tipul R nu afectează organismul. Mai mult,
folosind tipul S al bacteriei care este distrus de temperatură a
observat faptul că organismul a supravieţuit. Combinarea ultimului
tip de bacterie (distrusă prin încălzire) cu tipul R (nepatogen) a
indus apariţia pneumoniei, respectiv a decesului. În anul 1944, O.
Avery, C. MacLeod și M. McCarty au concluzionat faptul că “factorul
de transformare” este de fapt ADN-ul. Dovada că ADN-ul este
materialul ereditar a fost adusă de M. DelBruck şi S. Luria.
Aceştia au analizat bacteriofagele, un tip de virus (conţinând un
inveliş proteic care încapsulează ADN-ul) care atacă bacteriile
E.Coli (din intestinul gros).
În 1952, A. D. Hershey şi M. Chase au demonstrat prin marcare cu
radioizotopi a bacteriofagelor (32P pentru ADN şi 35S pentru
proteină) faptul că ADN-ul (care s-a regăsit în celula infectată)
este “purtătorul fizic” al informaţiei genetice.
Structura ADN-ului
ADN-ul este un polimer care are două lanţuri de deoxinucleotide,
molecule care sunt legate prin legături fosfodiesterice. Cea mai
cunoscută formă a ADN-ului este aceea a B-ADN-ului, care are
trăsăturile structurale a ADN-ului descris de J. Watson şi F.
Crick, împreună cu R. Franklin şi colaboratorii acesteia: 1. Cele
două lanţuri antiparalele sunt rotite spre dreapta în
jurul unei axe comune rezultând o structură elicoidală al cărei
diametru este de aproximativ 20 Å.
2. Planele formate de bazele nucleotidice, care formează perechi
de legături de hidrogen, sunt aproximativ perpendiculare pe axa
centrală a helixului. În B-ADN, bazele ocupă ”miezul” helixului iar
resturile de fosfozaharid se regăsesc în afara acestuia, formând
adâncituri majore sau minore. Doar porţiuni mici din perechile de
baze sunt expuse spre exterior.
3. Fiecare pereche de baze are aproximativ aceeaşi înclinaţie,
ceea ce conferă o simetrie moleculei de ADN. Perechile de baze A-T
şi G-C (Figura 3) pot fi interschimbabile fără să afecteze poziţia
resturilor de zahar din afara helixului. Guanina formează 3
legături de hidrogen cu citozina, iar adenina 2 legături de
hidrogen cu timina. Alte perechi de baze perturbă semnificativ
dispunerea de tip bielicoidal.
4. B-ADN helixul are 10 perechi de baze (eng. “base pairs” = bp)
pentru o rotaţie completă şi pasul de 34 Å.
-
Biochimie - Curs 12 - 2020
4
Pentru a demonstra trăsăturile structurale ale ADN-ului Watson
şi Crick s-au bazat pe informaţiile provenite din modul de
difracţie al razelor X de către această moleculă. În practică un
fascicul de raze X este direcţionat spre un cristalul unei
substanţe. După bombardarea cristalului unele raze sunt împraştiate
sau reflectate în momentul în care întâlnesc atomi. Razele X
împrăştiate pot interfera între ele şi produc spoturi de diferite
intensităţi, care pot fi înregistrate sub forma unei hărţi.
Difractograma (harta rezultată) este asemenea unei semnături
caracteristice fiecărei molecule. R. Franklin şi W. Maurice au
obţinut difractogramele specifice ADN-ului. Din aceste fotografii
reieşea faptul că molecula de ADN este simetrică. Distribuţia sub
forma literei “X”, din fotografie, este o dovadă a structurii
elicoidale a ADN-ului. Într-o difractogramă de raze X cu cât
spoturile sunt mai apropiate, cu atât distanţa este mai mare.
Astfel “barele orizontale” corespund de fapt cu pasului helixului.
Distanţa verticală dintre bare, 34 Å, este o măsură a înălţimii
pasului. Distanţa de la mijlocul difractogramei la partea de sus a
acesteia, 3,4 Å, este echivalentă cu distanţa dintre două baze
suprapuse. Dat fiind faptul că înălţimea pasului era de 34 Å iar
distanţa dintre baze 3,4 Å cercetătorii au dedus numărul de baze pe
pas - 10 nucleotide. Pasul helixului poate fi calculat din unghiul
pe care “X-ul” îl face cu axa orizontală. Astfel, dacă unghiul este
mai mare pasul este mai mic, iar ADN-ul mai compact. Din
difractograma obținută s-a dedus faptul că ADN-ul prezintă o
modalitate de împachetare dublu-elicoidală cu grupările fosfat
orientate spre exterior, iar bazele în interior.
Watson şi Crick erau în concurenţă cu Pauling în rezolvarea
structurii tridimen-sionale a ADN-ului. Ultimul, după ce a rezolvat
structura -helixului din proteine, încerca să deslușească şi
structura ADN-ului. Aproape în acelaşi timp Pauling a trimis o
publicaţie în care propunea un model pentru structura ADN-ului.
Watson şi Crick au verificat structura lui Pauling cu ajutorul unui
model cu bile şi bețe, structura care s-a dovedit a fi un
triplu-helix. Distribuţia grupărilor fosfat era în centrul
helixului, iar bazele în exteriorul acestuia. Această orientare a
grupărilor fosfat în interiorul helixului era practic imposibilă
datorită repulsiilor electrostatice dintre sarcinile negative,
lucru care ar fi îngreunat împachetarea moleculei.
Figura 4. Cele mai cunoscute variante de împachetare ale
ADN-ului dublu catenar (A, B şi Z)
-
Biochimie - Curs 12 - 2020
5
5S-rARNul Phe-tARNul (118 nucleotide) (77 nucleotide)
Figura 5. Tipuri de structuri ale ARN-ului
Figura 6. Conformerii sin și anti ai adenozinei diferă prin
rotația în jurul legăturii N-glicozidice
Structura dublu-elicoidală poate avea câteva împachetări
distincte în funcție de compoziţia solventului şi secvenţa de baze.
Varianta de ADN propusă de Watson și Crick era aceea B-ADN-ului
(Figura 4). Mai târziu au fost propuse și alte variante structurale
ale ADN-ului: A-ADNul şi Z-ADN-ul.
Perechile de baze ale A-ADN-ului sunt inclinate în raport cu axa
helixului
În condiții de deshidratare B-ADN-ul suferă schimbări
conformaționale reversibile și este transformat în A-ADN o
macromoleculă a cărei structură este mai aplatizată și mai largă
decât aceea a B-ADN-ului. A-ADNul are 11,6 bp pe rotație și pasul
de 34 Å. Diferenta majoră dintre B-ADN și A-ADN este aceea că
perechile de baze sunt inclinate cu un unghi de 20º în raport cu
axa helixului. Mai mult, A-ADN-ul are adâncituri majore mai
profunde comparativ cu B-ADN-ul.
Z-ADN-ul formează un helix orientat spre stânga
La 25 de ani de la descoperirea B-ADN-ului, studiul structurii
deoxi(CGCGCG) de către A. Wang și A. Rich a evidenţiat o altă
modalitate de împachetare a ADN-ului. Lanțurile acestui tip de ADN
s-au dovedit a fi orientare spre stânga (Z-ADN). Acest tip de ADN
are 12 bp pe rotaţie şi pasul de 44 Å, adâncitura minoră mai
profundă, iar adâncitura majoră se distinge mai puţin. Difracţia
fibrelor şi studiile RMN au arătat faptul că polinucleotidele
complementare cu purinele şi pirimidinele (de exemplu poli
d(GC)·poli d(GC) sau poli d(AC)·poli d(GC)) adoptă conformaţia Z la
o concentraţie mare de sare. Stabilizarea Z-ADN-ului de către
săruri se explică prin faptul că repulsiile dintre gruparile fosfat
vecine sunt mai atenuate în prezenţa sărurilor.
ARN-ul formează un A-helix
ARN-ul dublu-helix este materialul genetic al unor virusuri, dar
este sintetizat numai sub forma unui singur lanţ. Acest lanţ poate
forma punţi de hidrogen intramoleculare formând un lanţ dublu,
respectiv bucle (Figura 5). Segmente scurte din lanţul ARN-ului
sunt implicate în multiplicarea unor gene. În mod uzual ARN-ul
formează con-formații de tip A-ADN şi are 11 bp pe rotaţie şi pasul
de 30,9 Å, iar perechile de baze sunt înclinate cu aproximativ
16,7º în raport cu axa elicoidului.
-
Biochimie - Curs 12 - 2020
6
Flexibilitatea conformaţională a ADN-ului este limitată
Conformaţia unei unităţi de nucleotidă indică prezenţa a 6
unghiuri de torsiune pentru partea de fosfo-zahar şi un unghi de
torsiune atribuit legăturii glicozidice. Rotaţia în jurul legăturii
glicozidice este impiedicată. Rezidurile purinice posedă două
conformaţii, sin şi anti, ultima dintre acestea fiind mai stabilă
(Figura 6). În marea majo-ritate a acizilor nucleici, toate bazele
adoptă conformaţia anti. Numai în cazul Z-ADN-ului apar resturi de
purină şi pirimidină a căror conformaţie alternează (anti și
sin).
Conformaţiile plic ale ribozei sunt esenţiale în acizii
nucleici, determinând orientarea relativă a substituienţilor fosfat
la fiecare rest de riboză. În B-ADN conformaţia este C2’-endo, pe
când în A-ADN conformaţia este C3’-endo. În schimb în nucleotidele
purinice din Z-ADN au conformaţia de tip 3’-endo iar nucleotidele
pirimidice au conformaţia 2’-endo.
Proprietăţile ADN-ului în soluţie
Moleculele de ADN de diferite dimensiuni pot fi studiate prin
diverse metode fizico-chimice. Dimensiunile genomului
bacteriofagilor și virușilor variază de la câteva mii de baze
(kilobaze) la câteva sute de kilobaze. Genomul bacterian poate
varia de la 0,5 Mb la 10 Mb. Genomul eucariotelor este divers și
variază de la aproximativ 10 Mb în unele ciuperci la mai mult de
100000 Mb în anumite plante.
Proprietăţile acido-bazice
Grupările fosfat din legăturile diesterice ale ADN-ului, care se
repetă periodic în fiecare nucleotidă, au valori scăzute ale
pKa-ului şi din acest motiv sunt ionizate în condiții de pH care
depășesc valoarea 4, fapt care conferă ADN-ului un caracter acid.
Grupările fosfat sunt orientate spre exteriorul dublu-helixului şi
pot fi interacţiona cu moleculele de apă, ioni divalenţi (Ca2+,
Mg2+) sau amine policationice (spermidina şi spermina-sunt asociate
cu moleculele de ADN virale sau bacteriene). Stabilitatea
legăturilor de hidrogen din perechile de baze din ADN depinde de
gradul de ionizare al grupărilor amino (pH 4-11). Vâscozitatea
Rigiditatea şi lungimea apreciabilă a lanţului conferă ADN-ului
o vâscozitate apreciabilă. Măsurătorile de vâscozitate sunt
folosite pentru a urmări gradul de denaturare al ADN-ului şi
implicit gradul de împachetare al duplexului. Coeficientul de
sedimentare Coeficientul de sedimentare şi masa moleculară a
tipurilor de ADN pot fi deter-minate prin ultracentrifugare. Masa
moleculară a ADN-ului poate fi determinată prin compararea vitezei
de sedimentare într-un gradient de densitate de zaharoză cu o probă
de ADN cu dimensiuni şi coeficient de sedimentare determinate în
prealabil. Sedimentarea la echilibru în gradient de CsCl este
folosită pentru determinarea densităţii de plutire a ADN-ului.
Moleculele de ADN se concentrează într-o banda stabilă la nivelul
care densitatea de plutire este egală cu densitatea CsCl din acea
zonă. Proteinele prezintă o densitate mai mică față de ADN-ul
cromozomial care la rândul său decât are o densitate mai mică decât
ADN-ul dublucatenar (superîmpachetat). ARN-ul poate fi diferenţiat
de ADN (mono sau bicatenar) prin faptul că primul are o densitate
mai mare. Densitatea de plutire a ADN-ului poate furniza informaţii
referitoare la ponderea perechilor G-C şi A-T din moleculă. Mai
mult, ADN-urile virale intacte, omogene,
-
Biochimie - Curs 12 - 2020
7
Figura 7. Denaturarea (desfacerea) ADN-ului dublu-catenar în
mono-catenar
prezintă benzi înguste, în timp ce fragmentele heterogene de ADN
din celulele eucariotelor apar sub forma unor benzi (grupuri de
benzi) mai largi.
Denaturarea și renaturarea
În cazul în care o soluţie care conţine duplex-ADN-ul este
încălzită peste o anumită temperatură, structura nativă a acestuia
este alterată rezultând separat cele două lanţuri complementare
care au conformaţii aleatorii (Figura 7). Astfel procesul de
denaturare este însoţit de schimbări calitative în cazul
proprietăţilor fizice ale ADN-ului (modificarea vâscozităţii şi
creşterea absorbanţei în UV în cazul formei denaturate).
Denaturarea ADN-ului este un fenomen cooperativ în care alterările
dintr-o parte a moleculei destabilizează celelalte legături (dintre
cele două lanţuri rămase). Această denaturare are loc într-un
interval îngust de temperatură. Mijlocul acestui interval este
cunoscut
sub denumirea de temperatură de topire, Tm (m = eng.
melting-topire). Stabilitatea duplex-ADN-ului (ilustrată de Tm)
depinde de o serie de factori: natura solventului, tăria ionică,
conţinutul de perechi G-C (care conţin o legătură de hidrogen
suplimentară în comparaţie cu perechea A-T) sau de pH. În 1960, J.
Marmur a arătat faptul că ADN-ul denaturat poate fi renaturat (să
revină la starea iniţială) în condiţiile în care temperatura este
menţinută cu 25 mai jos decât Tm.
Perechile de baze
Interacțiunea între bazele nucleotidelor constituie un factor
cheie în cazul “relipirii” celor două lanţuri din acizii nucleici.
În cazul modelului propus de Watson și Crick aceste perechi de baze
se formează între oligonucleotide complementare. Există însă şi
situaţii diferite. De exemplu, perechea de baze A-T poate avea
atomul de azot din poziția 7 (perechea Hoogsteen) drept acceptor şi
nu cel din poziția 1 care corespunde situaţiei clasice (modelului
Watson-Crick). Oricum, măsurătorile experimentale au arătat faptul
că numai perechile de baze Watson-Crick au o stabilitate mai mare
față de celelalte perechi. Există şi situaţii diferite în care
segmentele ce se împachetează dublu-elicoidal, din diverse ARN-uri,
conţin perechi de baze de tipul G-U care au rol în stabilizarea
structurii terţiare a acestora.
-
Biochimie - Curs 12 - 2020
8
Figura 8. Tipuri de perechi de baze
Interacţiunile de tip van der Waals
Purinele şi pirimidinele din interiorul structurii dublu
elicoidale au tendinţa de a se orienta într-o manieră paralelă prin
intermediul interacţiunilor de tip van der Waals (interacţiuni
electronice de tip -) sau hidrofobe. Aceste interacţiuni contribuie
în mod esenţial la stabilizarea structurii ADN-ului.
Interacţiunile ionice
Interacţiunile electrostatice care au loc între grupările fosfat
trebuie considerate, alături de legăturile de hidrogen şi
interacţiunile hidrofobe din acizii nucleici, factori care
contribuie la stabilizarea structurii acizilor nucleici. De
exemplu, Tm a duplex-ADNului creşte dacă concentraţia ionilor de
Na+ este mărită. Acest fapt se datorează intercalării acestor ioni
între grupările fosfat. Analog ionii divalenţi, Mg2+, Mn2+ şi Co2+
se leagă specific de grupările fosfat şi astfel constituie agenţi
de protecţie a acizilor nucleici. Ionii de Mg2+ joacă de asemenea
un rol esenţial în stabilizarea structurilor complexe adoptate de
diverse molecule de ARN.
Reacția de polimerizare în lanț (PCR-The polymerase chain
reaction)
Geneticienii au înțeles faptul că sunt necesare mai multe
componente pentru a realiza replicarea ADN-ului. În acest scop este
nevoie de enzimă denumită ADN polimeraza și de deoxinucleotide care
constituie “cărămizile” de bază ale ADN-ului.
Reacția de polimerizare în lanț (PCR) este o reacție enzimatică
de amplificare mediată de primeri (secvențe scurte de ADN)
specifici(e) secvențelor de ADN genomic sau clonat. Metoda PCR a
fost inventată de Kary Mullis în 1983 și implică utilizarea unor
primeri (a căror lungime este de obicei 20-25 pb) și a unei ADN
polimeraze termostabile, cele mai utilizate fiind Taq, Pfu sau Pwo
polimeraza. ADN-ul matriță conține secvența țintă, care poate avea
de la zeci la zeci de mii de nucleotide lungime. Tehnica PCR
standard realizează amplificarea unei singure secvențe de ADN care
are o lungime de cel puțin 5 kb (5000 de baze). Long PCR este
tehnica prin care se pot “amplifica” fragmente mai lungi de ADN (de
până la 40 kb). A treia variantă de PCR, multiplex, este utilizată
pentru amplificarea unor secvențe multiple care au o lungime sub 5
kb. Taq polimeraza catalizează reacția într-un sistem tampon, în
care există un exces de perechi de primeri și cele patru
fosfat-deoxinucleotide (dNTP), generându-se astfel milioane de
copii ale secvenței țintă. PCR poate fi utilizat și pentru
amplificarea secvenței de ARN, care trebuie convertită inițial în
ADN de enzima transcriptaza inversă. Spre deosebire de ADN trebuie
luată în considerare instabilitatea și susceptibilitatea ARN-ului
la degradare.
-
Biochimie - Curs 12 - 2020
9
ADN-ul utilizat ca matriță pentru PCR poate proveni din diferite
surse: sânge liofilizat, salivă, țesut parafinat, păr. De asemenea
reacția PCR poate fi utilizată pentru amplificarea ADN-ului din
materiale degradate: mumii sau fosile.
Replicarea ADNului in vitro - reactia PCR
Reacția PCR este constituită din serii de trei pași esențiali
care definesc un ciclu PCR: denaturarea ADN-ului matriță dublu
catenar, alinierea perechilor de primeri la matrițele de ADN
monocatenar și extinderea enzimatică a primerilor, prin care se
produc copii care servesc drept matrițe în ciclurile ulterioare.
ADN-ul matriță este suspendat într-un amestec alcătuit din apă
distilată sterilizată (fără ARN), soluție tampon (ce conține
clorura de magneziu), polimeraza (Taq, Pfu sau Pwo polimeraza
respectiv un amestec de polimeraze) și cele patru dNTP. De asemenea
există o pereche de primeri (oligonucleotide) a căror secvențe sunt
complementare cu cele ale ADN-ului care flanchează regiunea
țintă.
Pentru construirea primerilor se iau în considerare următoarele
criterii: - trebuie să aibă un conținut de baze în jur de 50% GC; -
lungimea trebuie sa fie între 15-30 pb; - cei doi primeri trebuie
să nu formeze duplexuri între ei; - trebuie evitați primerii care
conțin bucle; - capătul 3’ trebuie să prezinte o complementaritate
perfectă cu a ADN-ului țintă; - temperatura de aliniere a
primerilor sa fie între 50-64 ºC; - temperatura la care jumătate
din molecule sunt monocatenare și cealaltă jumă-
tate bicatenare este temperatura de topire (Tm). Temperatura de
topire poate fi aproximată după formula:
Tm = 2 • (număr de baze A/T) + 4 • (număr de baze C/G)
Temperatura de aliniere a primerilor este de obicei aleasă cu 5
ºC mai scăzută decât temperatura de topire a ADN-ului. Din acest
motiv este foarte importantă alegerea temperaturii de topire a
celor doi primeri.
Amestecul de reacție este mai întâi încălzit la temperatura de
94 ºC pentru denaturarea (separarea) celor două catene de ADN
(Figura 9, pagina 10) și apoi răcit la o temperatură optimă care
facilitează alinierea primerilor (alipirea acestora la secvența de
ADN).
Primerii sunt orientați unul în amonte și unul în aval față de
regiunea ce urmează a fi amplificată, ambii cu capătul 3’ spre
interiorul secvenței țintă. Poziția relativă a regiunilor
complementare ale acestor primeri determină lungimea secvenței de
ADN care va fi copiată.
În timpul extinderii primerilor ADN polimeraza adaugă progresiv
dNTP-urile complementar cu secvența matriță, la capătul 3’ al
fiecărui primer, generându-se asftel o nouă copie. Astfel prin
cicluri repetate de răcire și încălzire se poate forma o cantitate
semnificativă de ADN a cărui secvență este identică cu aceea a
ADN-ului matriță. Rezultatul, după 20 de cicluri de amplificare,
este producerea a 220 (peste un milion) copii ale ADN-ului
matriță.
-
Biochimie - Curs 12 - 2020
10
Figura 9. Etapele reacției PCR Inițial exista un impediment
legat de stabilitatea polimerazei care era utilizată la
replicarea ADN-ului. Enzima respectivă se degrada în momentul
încălzirii amestecului la temperatură optimă neceară pentru
separara lanțurilor ADN-ului dublu-catenar. Din fericire, biologii
au extras diverse polimeraze din bacterii termofile, care trăiau în
medii la temperaturi extreme. Prin această strategie s-au izolat
polimeraze rezistente la temperaturi mari. Taq polimeraza este o
polimerază termostabilă care a fost extrasă din bacteria Termus
acvaticus (bacterie care trăiește în izvoarele calde). Unul dintre
dezavantajele folosirii Taq polimerazei este acela al fidelității
scăzute (o eroare de copiere la aproximativ 9000 de nucleotide),
fapt datorat lipsei activității exonucleazice. În schimb Pfu
polimeraza, o polimerază termostabilă (enzima care are în
componență tungsten) numită după specia hipertermofilă anaerobă
Pyrococcus furiosus (acest organism se dezvoltă la temperaturi de
100 ºC), posedă și activitate de verificare a corectitudinii
polimerizării realizând astfel o amplificare cu o acuratețe
ridicată a secvenței ADN dorite. Pwo polimeraza a fost izolată din
archeobacteria hipertermofilă Pyrococcus woesei.
Cele aproximativ 30 de cicluri sunt realizate într-un aparat
optimizat să oscileze temperatura pe diferite intervale de timp,
numit thermal cycler. Numărul de cicluri PCR trebuie optimizat în
functie de numărul de copii țintă dorit. Pornindu-se de la o
singură copie, cea mai eficientă reacție de PCR atinge în câteva
ore un platou după 40 de cicluri
-
Biochimie - Curs 12 - 2020
11
de amplificare. Acest proces este denumit PCR deoarece în
decursul fiecărui ciclu cantitatea de ADN se dublează. Mărimea
fragmentului de ADN copiat rezultat în urma PCR este controlată
prin intermediul unei tehnici de separare numită electroforeză în
geluri de agaroză.
Aplicații ale tehnicii PCR
Unul din exemplele elocvente ale aplicabilității PCR-ului are
rezonanță istorică. Această tehnică a permis demascarea unui
impostor care pretindea a fi membru al familiei imperiale ruse. În
anul anul 1918, Nicolae Romanov II, ultimul țar al Rusiei, împreună
cu familia au fost asasinați în timpul revoluției bolșevice. Ei au
fost înhumați într-un loc nemarcat. În 1993, oasele acestora au
fost supuse testului de identificare a ADN-ului. Acest lucru a fost
posibil prin comparerea secvențelor de ADN ale soției țarului
Romanov cu acelea ale prințului Philip de Edinburg, soțul regiei
Elizabeta II. Interesant, la scurt timp după asasinarea familiei
regale, au circulat zvonuri referitoare la supraviețuirea unei
fiice a țarului, Anastasia, în urma asasinatului. O persoană a
convins o parte din nobilimea rusă din Berlin de apartenența sa la
familia regală. Mai târziu, această persoană a emigrat în SUA unde
a decedat în 1984. Prin intermediul unei probe de țesut care era
depozitată într-un spital unde aceasta a fost supusă unei
intervenții, ADN-ului acesteia a putut fi amplificat. În urma
investigațiilor s-a demonstrat faptul că împărăteasa Alexandra și
printul Filip nu sunt rude cu această persoană.
Pe lângă posibilitatea stabilirii unor relații de rudenie,
aplicațiile metodei PCR sunt diverse:
- în criminalistică; - manipularea genetică; - detecția HIV
(ADN-ul este izolat din celulele roșii și amplificat cu primeri
corespunzători secvențelor HIV); - detecția infecțiilor viale
(utilizarea RT-PCR pentru SARS-Cov-2 unde RT
reprezintă transcriptaza inversă) - diagnosticare prenatală a
bolilor genetice.
Balizele moleculare (BM)
Tehnologia balizelor moleculare a fost introdusă începând cu
anul 1996 de către Tyagi şi Kramer. În această tehnică o probă
fluorescentă (etichetată la unul din capete cu un fluorofor și la
altul cu un stingător) a fost utilizată pentru a dovedi prezenţa
unor secvenţe complementare atribuite unor acizi nucleici din
soluţie. O baliză moleculară este o oligonucleotidă sub formă de ac
conţinând o secvenţă ţintă specifică flancată de două secvenţe
complementare care pot hibridiza pentru a forma o tijă. Majoritatea
probelor au 25-40 nucleotide; tija poate conţine 5-10 pb. Un
fluorofor şi un stingător adecvat sunt plasaţi la capetele 3’ şi 5’
ale tijei şi semnalul fluorescenţei este mediat de transferul de
energie prin rezonanţă. În absenţa secvenţei complementare,
fluorescenţa fluoroforului de pe tija balizei (BM) este stinsă de
către stingătorul adiacent. Legarea unei BM la secvenţa ţintă
induce o disociere a tijei, fapt care determină o creştere a
distanţei dintre fluorofor şi stingător, conducând la o creştere a
intensităţii fluorescenţei. O BM se poate lega reversibil sau să
disocieze de secvenţa ţintă, şi acestă reversibilitate poate afecta
sensibilitatea si selectivitatea detecţiei. Performanţa tehnicii
este dictată de o serie de factori (temperatură, pH sau conţinutul
secvenţei tijei şi buclei).
-
Biochimie - Curs 12 - 2020
12
La o temperatură scăzută, o BM este caracterizată prin
stabilitate ridicată a intra-duplexului chiar în prezenţa secvenţei
ţintă. Din acest motiv fluorescenţa este scăzută datorită stingerii
intramoleculare a BM care nu hibridizează cu secvenţa ţintă (Figura
10).
Figura 10. Tehnica hibridizării ADN-ului
La o temperatură optimă, BM va fi instabilă şi va hibridiza cu
secvenţa de interes, rezultând un semnal puternic pentru
fluorescenţă. În final, la o temperatură mai mare, porţiunile de pe
tija BM şi complexul BM-ADN ţintă sunt instabile dat fiind faptul
că BM rămâne într-o conformaţie liniară.
BM pot fi folosite în numeroase aplicaţii: detecţia agenţilor
patogeni şi la stabilirea genotipului alelelor (forme sub care
poate exista o genă ce ocupă același locus în cromozomii
omologi).