Menemukan Jarum di Tumpukan Jerami:Membedakan Kembar ''Identik'' dalam Pengujian Paternitas dan Forensik oleh Sequencing ultra-dalam Generasi Berikutnya
ABSTRAKKembar monozigot (MZ) dianggap menjadi identik secara genetik, karena itu mereka tidak dapat dibedakan dengan menggunakan tes DNA standar forensik. Di sini kita menggambarkan bagaimana identifikasi mutasi sangat jarang oleh pultra-dalam pemetaan rangkaian genetik generasi berikutnya dapat memecahkan kasus tersebut. Kami pemetaan rangkaian genetik DNA dari sampel sperma dari dua kembar dan dari sampel darah dari anak kembar satu. Analisis bioinformatika mengungkapkan lima single nucleotide polymorphisms (SNPs) hadir dalam ayah kembar dan anak, tapi tidak di paman kembar. SNP dikonfirmasi oleh klasik Sanger pemetaan rangkaian genetik. Hasil penelitian kami memberikan bukti eksperimental untuk hipotesis bahwa mutasi langka akan terjadi awal setelah blastocyst manusia telah terpecah menjadi dua, asal kembar, dan bahwa mutasi tersebut akan dilakukan pada ke dalam jaringan somatik dan germline tersebut. Metode ini memberikan solusi untuk memecahkan ayah dan forensik kasus yang melibatkan kembar monozigot seperti yang dituduhkan ayah atau pencetus DNA jejak.
1. PendahuluanHari ini, pengujian paternitas dan identifikasi genetik di kerja kasus forensik dilakukan dengan menguji satu set 16-24 ulangi tandem pendek (STR) spidol. Namun, monozigot '' identik '' kembar memiliki profil mikrosatelit identik. Sehingga mereka tidak dapat dibedakan misalnya seperti yang dituduhkan ayah atau sebagai sumber DNA jejak di TKP dengan menggunakan teknologi saat ini. Ketidakmampuan ini menyebabkan masalah dalam kasus pidana atau ayah dengan kembar MZ sebagai tersangka, atau seperti yang dituduhkan ayah. Dengan probabilitas untuk Pasangan anak kembar monozigot dari sekitar 3 di 1000 kelahiran, sekitar 6 dari 1.000 laki-laki kembar identik. Oleh karena itu, kejahatan atau ayah kasus dengan Pasangan anak kembar monozigot tidak jarang terjadi dan kadang-kadang menerima tingkat tinggi perhatian. Perbedaan genetik atau epigenetik kecil antara kembar telah dijelaskan. Namun, studi ini memiliki fokus genetik medis dan hasilnya tidak berlaku di sidik jari genetik forensik.Dalam sebuah makalah teoritis berurusan dengan masalah ini, Krawczak dkk. negara '' yang> 80% dari keturunan satu saudara kembar akan membawa setidaknya satu mutasi germline yang akan terdeteksi di sperma dari ayah mereka, tetapi tidak dalam bahwa dari kembar lainnya ''. Penulis sangat menyarankan untuk melakukan pengujian DNA dalam konteks Pasangan anak kembar monozigot oleh seluruh genom pemetaan rangkaian genetik dan identifikasi langka de novo mutasi. Studi untuk membedakan kembar secara genetik telah dilakukan sebelumnya, misalnya Bruder et al., Tapi studi ini tidak punya tujuan forensik. Berglund dkk. menyarankan untuk memanfaatkan sequencing generasi berikutnya dari Y-DNA kromosom pada kasus forensik untuk mendeteksi perbedaan antara laki-laki jarang berhubungan erat. Namun, mencari perbedaan-perbedaan ini setara dengan mengejar jarum kecil di tumpukan jerami besar.Dalam beberapa artikel baru-baru ini, penerapan sequencing generasi berikutnya untuk pengujian mtDNA forensik telah dijelaskan. Brenig dkk. telah menunjukkan bahwa sequencing merupakan senjata generasi berikutnya dari DNA dari stain dapat memberikan wawasan dalam komposisi metagenomic dari stain
2. MetodeKami merekrut sepasang kembar laki-laki identik serta istri dan anak dari satu kembar sebagai relawan. Informed consent sesuai dengan persyaratan Undang-Undang Diagnostik Jerman Gene diperoleh dari semua peserta. Untuk menghindari bias disengaja atau tidak disengaja, tim laboratorium tidak diberitahu yang salah satu dari dua anak kembar adalah ayah kandung, sebelum mereka telah memecahkan kasus analitis. DNA diekstraksi dari sampel darah (ibu dan anak) dan dari darah, mukosa bukal dan sampel sperma (kembar) menggunakan QIAsymphony DNA Investigator Kit (Qiagen, Hilden, Jerman) dan robot ekstraksi QIAsymphony. Ayah dan monozygosity dari si kembar dikonfirmasi dengan mengetikkan semua individu dengan PowerPlex 21 PCR Kit (Promega, Mannheim, Jerman). Produk PCR dipisahkan pada kapiler rangkaian ABI3130xl dan dievaluasi dengan menggunakan Genemapper 3,7 (Terapan Biosystems Divisi Life Technologies GmbH, Darmstadt, Jerman). Perpustakaan NGS dibuat dari darah anak dan sperma sampel dari si kembar sesuai dengan pedoman umum untuk persiapan perpustakaan senapan. Secara singkat, DNA genom (dari sperma dari si kembar dan darah anak) adalah terfragmentasi untuk ukuran rata-rata 300 bp menggunakan Covaris Ultra perangkat sonikasi (Covaris, Woburn, MA, USA). Selanjutnya, perpustakaan senapan disusun menggunakan kimia yang tersedia secara komersial dari NEB (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA). Sequencing dilakukan pada Illumina HiSeq 2000 dengan kimia v3.0 dan menggunakan 2 100 bp pairedend membaca modus dan kimia asli dari Illumina sesuai dengan instruksi produsen. Analisis data awal dimulai langsung pada HiSeq 2000 Sistem selama menjalankan. The HiSeq Control Software 2.0.5 dalam kombinasi dengan RTA 1.17.20.0 (analisis real time) dilakukan awal analisis citra dan basis panggilan. Selain itu, casava-1.8.2 dihasilkan dan dilaporkan menjalankan statistik dan file FASTQ akhir yang terdiri dari informasi urutan yang digunakan untuk semua bioinformatika berikutnya analisis. Urutan itu de-multiplexing sesuai dengan kode indeks 6 bp dengan 1 mismatch diperbolehkan.Untuk kedua dari si kembar, serta untuk anak semua Illumina sesuai membaca data yang dipetakan ke urutan genom referensi manusia (GRCh37.p10). Pemetaan telah dilakukan menggunakan pipa pemetaan Eurofins di rumah didasarkan pada arsitektur perangkat keras Sampaikan FPGA (http://www.conveycomputer.com) dan Sampaikan perangkat lunak yang meniru pemetaan standar menggunakan software Burrows-Wheeler Alignment (BWA) . Pipa akselerasi perangkat keras termasuk perangkat lunak cnybwa (v0.6.2) dan BWA (v0.6.2). Menggunakan paket perangkat lunak SAMtools v0.1.18 hasil pemetaan yang diurutkan sesuai urutan referensi dan koordinat dan disaring dengan menerapkan ambang kualitas pemetaan 20. Setelah prosedur ini file BAM yang berisi kualitas hanya baik pemetaan unik berbunyi diperoleh untuk masing-masing kembar dan anak. Hasil pemetaan untuk setiap individu dipisahkan menurut kromosom. Duplikat telah dihapus dari kromosom tertentu file BAM dengan menerapkan Picard v1.87. Untuk setiap kromosom software VarScan2 digunakan untuk mengidentifikasi mutasi somatik. Posisi dengan skor VarScan tertinggi dibandingkan dengan mutasi diwariskan dan diperiksa secara visual menggunakan IGV. Potensi mutasi somatik disaring dan dibandingkan dengan hasil pemetaan anak.SNP diidentifikasi dikonfirmasi oleh Sanger sequencing sesuai dengan metode standar dan sesuai dengan pedoman NCCLS. Primer terletak 50-100 bp hulu dan hilir digunakan untuk memperkuat daerah bunga. Semua urutan yang dihasilkan menggunakan BigDye kimia terminator (versi 3.1) Terapan Biosystems (Foster City CA, AS) berikut protokol standar. Untuk reaksi sekuensing Primus 96 HPL Cyclers Thermal (MWG AG, Ebersberg, Jerman), peqStar 96 HPL (PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Jerman) atau mesin DNA Tetrad 2 cyclers (Bio-Rad, Munich, Jerman) digunakan. Reaksi sekuensing bersih-bersih dilakukan pada Hamilton Starlet workstation robot (Hamilton Robotika GmbH, Martinsried, Jerman) dengan filtrasi gel Sephadex melalui matriks terhidrasi diisi ke dalam tepat 96 pelat filter juga diikuti dengan langkah sentrifugasi berikutnya. Akhirnya semua reaksi dijalankan pada rangkaian ABI3730xl kapiler dilengkapi dengan 50 cm kapiler dan POP7 polimer.3. HasilAyah dan pasangan anak kembar monozigot dikonfirmasi menggunakan standar STR forensik mengetik dengan PowerPlex 21 PCR Kit (data tidak ditampilkan). Berikutnya, DNA yang diperoleh dari sampel sperma dari si kembar dan dari darah anak digunakan untuk ultra mendalam sequencing generasi berikutnya untuk mengidentifikasi mewarisi germline / peristiwa mutasi somatik yang terjadi setelah kembar dan karena itu hanya hadir dalam ayah kembar dan tidak di paman kembar .Sampel sequencing menggunakan teknologi Illumina HiSeq 2000. Secara total, 600 Giga-byte data sequencing mentah yang dihasilkan. Untuk kembar A, 283 Giga-base-pasangan disekuensing yang sesuai dengan cakupan genom rata-rata 91 kali lipat. Untuk kembar B 292 Gigabase-pasangan yang dihasilkan yang sesuai dengan cakupan genom rata-rata 94 kali lipat. Anak itu diurutkan dengan jumlah of175 Giga-base-pasangan (berarti cakupan genom dari 56 kali lipat). Gambar. 1 menunjukkan jumlah non-berlebihan dan unik dipetakan membaca untuk setiap kromosom. Suplemen elektronik Tabel 1 mencantumkan jumlah basis referensi tertutup untuk setiap kromosom dan untuk setiap sampel.
Produksi data urutan baku keseluruhan yang dihasilkan diperlukan jangka waktu sekitar tiga sampai empat minggu. Ini termasuk isolasi DNA, persiapan perpustakaan serta sequencing dan analisis data awal. Waktu untuk semua langkah analisis selanjutnya sangat tergantung pada infrastruktur TI komputasi yang tersedia. Menggunakan server pemetaan sangat diparalelkan (Sampaikan FPGA arsitektur perangkat keras) langkah pemetaan dari ketiga sampel itu sendiri mengambil 72,5 jam waktu yang setara dengan rata-rata 28.751 dipetakan membaca per detik komputasi. Namun, perlu dicatat bahwa langkah ini hanya mewakili sebagian kecil dari seluruh pipa analisis. Karena banyak penyelidikan petunjuk tambahan (termasuk validasi temuan menggunakan pendekatan independen) seluruh prosedur dapat memakan waktu hingga berminggu-minggu.Menyimpan data mentah dan analisis adalah aspek lain. Sekitar 2,8 Tera-byte ruang disk yang digunakan untuk menyimpan semua file data pemetaan dan analisis.Setelah pemetaan dihasilkan urutan membaca dengan urutan genom manusia (GRCh37.p10), perangkat lunak VarScan2 digunakan untuk menentukan mutasi potensial. VarScan2 mencakup kemampuan untuk mengidentifikasi mutasi somatik pada tumor, tetapi juga mendukung deteksi mutasi germline. Ayah diwariskan mutasi novo de muncul seperti mutasi somatik ketika membandingkan kedua kembar. Oleh karena itu kami ditugaskan kembar A menjadi '' normal '' dan B kembar menjadi '' tumor '' dan sebaliknya dan Aset dipastikan potensi mutasi somatik. Mutasi diwariskan kepada keturunannya yang terdeteksi oleh menganggap kembar A atau twin B menjadi '' normal '' dan anak menjadi '' tumor ''. Menggunakan integratif genomik viewer (IGV) potensi mutasi somatik yang secara visual diperiksa dan dibandingkan dengan mutasi diwariskan potensi anak dimulai dengan skor tertinggi yang disediakan oleh skema scoring Varscan2 untuk mutasi somatik. Dengan pendekatan ini, kami mengidentifikasi 12 potensi calon SNP somatik hadir di kedua ayah kembar dan anak, tapi tidak di paman kembar. SNP termasuk 100 bp hilir dan informasi sequencing mengapit hulu dibandingkan dengan referensi genom manusia (menggunakan BLASTN). Tujuh kandidat SNP dibuang setelah pencarian BLAST, karena urutan sekitarnya menunjukkan lebih dari satu hit signifikan pada genom. Sisa lima kandidat SNP terletak pada kromosom 4 (pos 188.267.982, SNP C / T), 6 (pos 41.885.722, SNP A / G), 11 (pos 68.781.324, SNP C / T), 14 (pos 103.545.720, G SNP / A) dan 15 (pos 57.884.799, SNP G / A) (lihat Tabel 1). Gambar. 2 menunjukkan salah satu SNP diamati dalam data NGS divisualisasikan oleh IGV [18,19]. Tak satu pun dari lima kandidat SNP terkait dengan SNP dijelaskan di dbSNP. Temuan NGS jelas dikonfirmasi dengan PCR dan double-stranded Sanger sequencing dari posisi masing-masing untuk lima kandidat SNP dalam DNA sperma berasal si kembar '. PCR dan sekuensing Sanger juga digunakan untuk menyelidiki posisi masing-masing DNA ibu serta darah dan mukosa bukal DNA dari kembar bersama-sama dengan DNA darah anak. Sesuai Sanger hasil untuk data SNP NGS dari Gambar 2 ditunjukkan pada Gambar 3, tidak termasuk kemungkinan teoritis bahwa ibu mewarisi SNP untuk anak. Menariknya, empat dari lima mutasi terlihat pada DNA sperma dari ayah kembar juga hadir dalam DNA mukosa bukal nya. Hanya satu dari empat mutasi juga terlihat di DNA darah. Satu mutasi secara eksklusif hadir dalam sampel sperma (Tabel 1). Rasio antara dasar asli dan dasar bermutasi adalah antara 50% sampai 50% dan 80% sampai 20%, dengan rasio identik dalam sperma dan DNA mukosa bukal, dan deviasi dalam SNP ditemukan dalam DNA darah berasal (Tabel 1) . Oleh karena mosaicism tidak hanya hadir dalam sperma ayah kembar, di mana kita awalnya bertanya, tetapi juga di jaringan lain dengan kemiripan yang kuat antara sperma dan mukosa bukal.
4. HasilAyah dan pasangan anak kembar monozigot dikonfirmasi menggunakan standar STR forensik mengetik dengan PowerPlex 21 PCR Kit (data tidak ditampilkan). Berikutnya, DNA yang diperoleh dari sampel sperma dari si kembar dan dari darah anak digunakan untuk ultra mendalam sequencing generasi berikutnya untuk mengidentifikasi mewarisi germline / peristiwa mutasi somatik yang terjadi setelah kembar dan karena itu hanya hadir dalam ayah kembar dan tidak di paman kembar .Sampel sequencing menggunakan teknologi Illumina HiSeq 2000. Secara total, 600 Giga-byte data sequencing mentah yang dihasilkan. Untuk kembar A, 283 Giga-base-pasangan disekuensing yang sesuai dengan cakupan genom rata-rata 91 kali lipat. Untuk kembar B 292 Gigabase-pasangan yang dihasilkan yang sesuai dengan cakupan genom rata-rata 94 kali lipat. Anak itu diurutkan dengan jumlah of175 Giga-base-pasangan (berarti cakupan genom dari 56 kali lipat). Gambar. 1 menunjukkan jumlah non-berlebihan dan unik dipetakan membaca untuk setiap kromosom. Suplemen elektronik Tabel 1 mencantumkan jumlah basis referensi tertutup untuk setiap kromosom dan untuk setiap sampel.Produksi data urutan baku keseluruhan yang dihasilkan diperlukan jangka waktu sekitar tiga sampai empat minggu. Ini termasuk isolasi DNA, persiapan perpustakaan serta sequencing dan analisis data awal. Waktu untuk semua langkah analisis selanjutnya sangat tergantung pada infrastruktur TI komputasi yang tersedia. Menggunakan server pemetaan sangat diparalelkan (Sampaikan FPGA arsitektur perangkat keras) langkah pemetaan dari ketiga sampel itu sendiri mengambil 72,5 jam waktu yang setara dengan rata-rata 28.751 dipetakan membaca per detik komputasi. Namun, perlu dicatat bahwa langkah ini hanya mewakili sebagian kecil dari seluruh pipa analisis. Karena banyak penyelidikan petunjuk tambahan (termasuk validasi temuan menggunakan pendekatan independen) seluruh prosedur dapat memakan waktu hingga berminggu-minggu.Menyimpan data mentah dan analisis adalah aspek lain. Sekitar 2,8 Tera-byte ruang disk yang digunakan untuk menyimpan semua file data pemetaan dan analisis.Setelah pemetaan urutan membaca yang dihasilkan untuk urutan genom manusia (GRCh37.p10), perangkat lunak VarScan2 digunakan untuk menentukan mutasi potensial. VarScan2 mencakup kemampuan untuk mengidentifikasi mutasi somatik pada tumor, tetapi juga mendukung deteksi mutasi germline. Ayah diwariskan mutasi novo de muncul seperti mutasi somatik ketika membandingkan kedua kembar. Oleh karena itu kami ditugaskan kembar A menjadi '' normal '' dan B kembar menjadi '' tumor '' dan sebaliknya dan Aset dipastikan potensi mutasi somatik. Mutasi diwariskan kepada keturunannya yang terdeteksi oleh menganggap kembar A atau twin B menjadi '' normal '' dan anak menjadi '' tumor ''. Menggunakan integratif genomik viewer (IGV) potensi mutasi somatik yang secara visual diperiksa dan dibandingkan dengan mutasi diwariskan potensi anak dimulai dengan skor tertinggi yang disediakan oleh skema scoring Varscan2 untuk mutasi somatik. Dengan pendekatan ini, kami mengidentifikasi 12 potensi calon SNP somatik hadir di kedua ayah kembar dan anak, tapi tidak di paman kembar. SNP termasuk 100 bp hilir dan informasi sequencing mengapit hulu dibandingkan dengan referensi genom manusia (menggunakan BLASTN). Tujuh kandidat SNP dibuang setelah pencarian BLAST, karena urutan sekitarnya menunjukkan lebih dari satu hit signifikan pada genom. Sisa lima kandidat SNP terletak pada kromosom 4 (pos 188.267.982, SNP C / T), 6 (pos 41.885.722, SNP A / G), 11 (pos 68.781.324, SNP C / T), 14 (pos 103.545.720, G SNP / A) dan 15 (pos 57.884.799, SNP G / A) (lihat Tabel 1). Gambar. 2 menunjukkan salah satu SNP diamati dalam data NGS divisualisasikan oleh IGV [18,19]. Tak satu pun dari lima kandidat SNP terkait dengan SNP dijelaskan di dbSNP. Temuan NGS jelas dikonfirmasi dengan PCR dan double-stranded Sanger sequencing dari posisi masing-masing untuk lima kandidat SNP dalam DNA sperma berasal si kembar '. PCR dan sekuensing Sanger juga digunakan untuk menyelidiki posisi masing-masing DNA ibu serta darah dan mukosa bukal DNA dari kembar bersama-sama dengan DNA darah anak. Sesuai Sanger hasil untuk data SNP NGS dari Gambar. 2 ditunjukkan pada Gambar. 3, tidak termasuk kemungkinan teoritis bahwa ibu mewarisi SNP untuk anak. Menariknya, empat dari lima mutasi terlihat pada DNA sperma dari ayah kembar juga hadir dalam DNA mukosa bukal nya. Hanya satu dari empat mutasi juga terlihat di DNA darah. Satu mutasi secara eksklusif hadir dalam sampel sperma (Tabel 1). Rasio antara dasar asli dan dasar bermutasi adalah antara 50% sampai 50% dan 80% sampai 20%, dengan rasio identik dalam sperma dan DNA mukosa bukal, dan deviasi dalam SNP ditemukan dalam DNA darah berasal (Tabel 1) . Oleh karena mosaicism tidak hanya hadir dalam sperma ayah kembar, di mana kita awalnya bertanya, tetapi juga di jaringan lain dengan kemiripan yang kuat antara sperma dan mukosa bukal.
5. DiskusiDiferensiasi antara Pasangan anak kembar monozigot telah menjadi batasan dalam genetika forensik, karena '' identik '' kembar ditemukan menunjukkan profil STR identik. Kami telah mengembangkan metode baru untuk mengidentifikasi SNP disebabkan oleh de novo mutasi yang terjadi hanya dalam satu twin menggunakan ultra-dalam sequencing generasi berikutnya. SNP seperti memungkinkan membedakan Pasangan anak kembar monozigot. Pendekatan ini dapat digunakan untuk menjelaskan sejauh terpecahkan ayah forensik dan kriminal kasus yang melibatkan kembar identik.Krawczak dkk. meramalkan hasil tersebut, ia mengharapkan rata-rata> 1,3 SNP membedakan DNA germline dari Pasangan anak kembar monozigot. Namun, yang lain gagal menemukan SNP tersebut, mungkin karena cakupan selama NGS terlalu rendah untuk membedakan SNP nyata dari artefak sequencing atau mereka disaring dengan chip SNP. Pendekatan kami adalah untuk mengatasi masalah tersebut dan mengungkapkan mosaicistic de novo mutasi dengan menggunakan cakupan yang sangat tinggi lebih dari 90fold untuk si kembar dan lebih dari 50fold untuk anak, diikuti oleh disesuaikan filter bioinformatika. Umumnya, tanpa melibatkan kembar identik, perkiraan jumlah tingkat substitusi SNP per rentang generasi 1-3 108 per manusia pasangan basa tunggal, sama dengan sekitar 10-40 diharapkan SNP per generasi ayah. Jumlah lima SNP warisan kami menemukan dari posting-split tahap embrio awal sesuai cukup baik dengan estimasi tersebut. Perbandingan awal kami si kembar mengungkapkan lebih SNP, tapi kami fokus pada mereka yang hadir pada anak juga. Krawczak dkk. berharap lesi (penghapusan, sisipan, indels) terjadi pada rasio sekitar satu dari tiga relatif terhadap SNP. Kami belum bisa memverifikasi jelas mutasi seperti di NGS urutan dataset kami. Kami menganggap hal ini menjadi efek stokastik berdasarkan infrequency relatif peristiwa ini, atau mencerminkan bahwa fragmen DNA tersebut bermutasi tidak memenuhi kriteria keselarasan, atau keduanya.Kembar monozigot adalah hasil dari pemisahan morula selama pengembangan embryotic awal. Dalam sepertiga dari semua kasus morula membelah sebelum hari 5 setelah pembuahan dalam tahap 16-32 sel. Sekitar dua pertiga dari kota kembar monozigot terjadi setelah pemisahan morula antara hari ke-5 dan hari 9 (40-150 sel). Pengecualian langka kembar yang terbentuk setelah hari 9, berbagi satu plasenta. Mutasi yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi kembar tertentu harus terjadi setelah pemisahan morula, atau awal sebelum pemisahan dengan kehadiran eksklusif di sel milik kemudian hanya satu dari si kembar. Secara umum, hanya mutasi hadir dalam germline yang diwariskan. Peristiwa mutasi yang terjadi kemudian di garis keturunan somatik tidak akan ditransmisikan ke setiap keturunan potensial. Selama embriogenesis, sel germinal memasukkan serangkaian kompleks peristiwa yang berakhir dengan pembentukan ovum dan sperma. Karena tidak dapat diaksesnya embrio manusia untuk penyelidikan eksperimental di tahap awal, masih ada sedikit pengetahuan tentang pengembangan yang tepat dari sel germinal primordial manusia (PGCs). Menurut ringkasan De Felici kombinasi data dari studi manusia dan hasil terbaru yang diperoleh pada tikus mendukung skenario berikut. Secara singkat, PGCs adalah awal berkomitmen dan ditentukan dalam epiblast tersebut. Sebelum gastrulasi mereka dengan cepat pindah ke suatu daerah ekstra-embrio. Selanjutnya PGCs ditentukan dan masukkan kembali ke dalam embrio yang tepat selama gastrulasi awal untuk mencapai gonad berkembang. Selain itu, temuan yang sama mengkonfirmasi sejarah filogenetik umum mukosa dan sel sperma bukal, baik milik ektoderm lapisan kuman dan membantu untuk mempersempit sejarah acara mutasi somatik: mutasi yang hadir dalam sperma satu kembar 'dan mukosa bukal, tetapi tidak dalam darah, akan terjadi setelah gastrulasi, tapi sebelum pemisahan mukosa bukal dan prekursor sperma. Sebuah peristiwa mutasi hadir di semua tiga jaringan diuji harus telah terjadi sebelumnya, sebelum pemisahan lapisan kuman. Oleh karena itu mutasi yang secara eksklusif hadir dalam sperma adalah '' terbaru '' satu.Fakta bahwa sebagian besar mutasi kami mengidentifikasi yang hadir dalam dua jaringan ektodermal, mukosa bukal dan sperma, menyarankan penggunaan mukosa bukal sebagai bahan awal untuk identifikasi mutasi antara Pasangan anak kembar monozigot. Sampling dari penyeka bukal di ayah atau TKP kasus secara hukum dan etis lebih mudah daripada sampel sperma. Temuan menunjukkan bahwa metode yang dijelaskan untuk membedakan Pasangan anak kembar monozigot tidak hanya berlaku untuk kasus ayah, tetapi juga untuk kasus forensik dengan jejak ectodermal seperti stain kontak, sisik kulit, rambut, mukosa bukal atau air mani stain ditemukan di TKP, dan sangat mungkin juga akan bekerja dengan stain darah. Metodologi analisis kami memungkinkan juga kembali menganalisis-kasus dingin relevansi yang cukup dan mendekati kasus baru yang melibatkan Pasangan anak kembar monozigot sebagai donor bahan stain. Hanya sampel referensi untuk tersangka kembar MZ perlu dianalisis oleh NGS dalam semua kasus. DNA dari stain itu sendiri, yang mungkin kuantitas dan kualitas rendah, dapat dianalisis menggunakan PCR berdasarkan tes deteksi SNP standar sensitif dan spesifik dikembangkan sesuai dengan temuan NGS.17
