Teknologi DNA Rekombinan

Teknologi DNA

Rekombinan

Yuyun Maryuningsih

ENZIM RESTRIKSI

Fungsi: melindungi bakteri dari DNA asing (seperti virus).

DNA organisme penghasil enzim mengalami metilasi

sehingga tidak dapat dipotong

Enzim restriksi tipe I: memotong DNA pada jarak 1000 bp

atau lebih dari sisi pengenalan

Enzim restriksi tipe II: memotong pada bagian tengah sisi

pengenalan.

Memotong DNA untai ganda pada titik yang sama

menghasilkan ujung tumpul (blunt end)

Memotong DNA pada titik yang berbeda menghasilkan

ujung lancip (sticky end)

Jumlah bp menentukan kemungkinan untuk

menemukan sisi pemotongan.

Untuk menghasilkan fragmen DNA yang lebih

panjang digunakan enzim restriksi dengan sisi

pengenalan enam atau lebih bp

DNA Ligase

DNA ligase dari T4 bacteriophage.

Mengkatalisis pembentukan ikatan antara 3’-OH dari

satu untai dan 5’-PO4 dari untai DNA lain

Ligase bekerja lebih efisien pada ujung lancip

dibanding dengan ujung tumpul.

Restriction

Fragment

Length

Polymorphism

(RFLP)

Deteksi Asam Nukleat

Ultraviolet

DNA menyerap sinar UV karena struktur cincin

pada basa

RNA dan juga nukleotida menyerap sinar UV

Konsentrasi DNA ditentukan pada panjang

gelombang 260 nm

Penandaan DNA dengan

RadioaktifSinar UV dapat mendeteksi DNA, tetapi tidak

dapat membedakan molekul DNA yang

berbeda.

Prekursor nukleotida radioaktif 32P atau 35S

ditambahkan dalam medium pertumbuhan.

Autoradiografi digunakan untuk mendeteksi

DNA bertanda.

Peluruhan radioaktif menghasilkan radiasi

yang dapat menyebabkan film fotografi

menjadi hitam

• DNA radioaktif dapat dideteksi dengan

scintillation counting.

• Peluruhan isotop radioaktif menghasilkan

partikel beta.

• Cairan scintillation akan mengalami eksitasi

dan kemudian mengemisikan sinar

• Scintilation counter akan mendeteksi sinar

yang diemisikan .

Deteksi DNA dengan

Fluoresens

• Fluoresecence tags menyerap cahaya pada

satu panjang gelombang .

• Atom mengalami eksitasi yang selanjutnya

akan memancarkan cahaya dengan panjang

gelombang berbeda ketika kembali ke

keadaan dasar.

• Foton yang diemisikan akan dideteksi oleh

detektor

Biotin dan Digoxigenin

• Biotin adalah vitamin

• Digoxigenin adalah hormon steroid dari

tumbuhan foxglove.

• Biotin atau digoxigenin berikatan dengan urasil

• DNA hasil sintesis mengandung dUTP-

biotin/digoxigenin, menggantikan dTTP

DNA bertanda dengan senyawa yang

dapat berfluoresens

Visualisasi DNA bertanda:

DNA: Melting dan Reannealing

• DNA dapat mengalami ‘melting’ dan bergabung kembali

‘reanneal’

• Pemanasan dapat merusak ikatan hidrogen.

• Pada pendinginan perlahan dapat terbentuk ikatan

hidrogen antar kedua untai DNA yang saling komplemen.

Southern Blot

(Ed Southern)

• SB digunakan untuk menentuk kedekatan DNA dari satu

sumber dengan DNA dari sumber lain.

• Isolasi DNA target

• Pemotongan dengan enzim restriksi

• Pemisahan fragmen DNA dengan elektroforesis

• Pemisahan DNA untai ganda dengan cara menginkubasi

gel dengan asam kuat.

• Transfer DNA untai tunggal ke membran

• Pembuatan probe/pelacak

• Denaturasi DNA pelacak.

• Hibridisasi DNA target dengan DNA pelacak

• High stringency: Temperatur tinggi dan

konsentrasi garam rendah. DNA templat dan

pelacak berhibridisasi sempurna

• Low stringency: temperatur rendah dan kadar

garam tinggi. DNA templat dan pelacak

mempunyai mismatches.

Nothern Blot

• Target molekul: RNA

• Variasi teknik hibridisasi: dot blot

Zoo Blot: Kemiripan urutan nukleotida antara

beberapa spesies yang berbeda

Fluorescene In Situ

Hybridization

• Hibridisasi pelacak dengan DNA/RNA di dalam

sel.

• Sumber DNA: sayatan jaringan, kultur

mamalia, kultur serangga, darah (sel darah

putih).

• Pemanasan sampel DNA

• Hibridisasi dengan pelacak bertanda

(fluoresens)

Analisis FISH gen RUNX1 yang mengalami

peningkatan jumlah kopi pada penderita leukemia

akut karena polisomi pada kromosom 21.

RUNX1: Merah; TEL: Hijau

Vektor Kloning

• Herbert W Boyer: enzim restriksi dan

pemodifikasi

• Stanley N. Cohen: Plasmid resistan antibiotik

dan teknik transformasi dengan CaCl2.

Vektor Kloning

• Ukuran kecil, mudah dimanipulasi

• Dapat ditransfer dari sel ke sel

• Mudah diisolasi

• Mudah dideteksi dan diseleks

• Plasmi multi kopi (membantu utk mendapatkan

DNA dalam jumlah besar)

• Mempunyai beberapa sisi pengenalan enzim

restriksi

• Ada metode untuk mendeteksi keberadaan

DNA insert

Vektor Kloning Umum