MAKALAH FARMAKOLOGI MOLEKULERRESEPTOR DARI DNA REKOMBINAN
OLEH :KELOMPOK 4 1. MUH. ADHA
(F1F1110 )
2. YULI ANGGREANI LENA
(F1F112009)3. RIFANDI AZIS TEBA
(F1F112018)
4. CHICHI FAUZIYAH
(F1F112028)5. ST. RAODAH NURULJANNAH(F1F112041)
FAKULTAS FARMASIUNIVERSITAS HALU OLEO
KENDARI
2015KATA PENGANTAR
Puji syukur kami panjatkan kehadirat Allah SWT atas rahmat
kesehatan dan kesempatan yang dilimpahkan-Nya sehingga kami dapat
menyelesaikan makalah ini dengan baik. Doa keselamatan kami
panjatkan pula pada pembawa risalah kebenaran, nabi Muhammad SAW
beserta segenap keluarga, sahabat dan seluruh manusia yang
mengikuti ajarannya sampai akhir zaman.
Ucapan terima kasih diberikan kepada semua pihak yang telah
mendukung penyusunan makalah ini. Semoga makalah ini, dapat
memberikan manfaat dan sumbangan yang berarti bagi dunia
pendidikan.
Penyusun menyadari bahwa dalam penyusunan makalah ini masih jauh
dari kesempurnaan. Oleh karena itu, sangat diharapkan kritik dan
saran yang membangun dari pembaca agar dapat menyempurnakan makalah
ini.
Kendari, 7 Juni 2015
Penyusun
DAFTAR ISI2KATA PENGANTAR
3DAFTAR ISI
BAB I 4PENDAHULUAN
4A.LATAR BELAKANG
4B.RUMUSAN MASALAH
5C.TUJUAN
BAB II 6PEMBAHASAN
6A.SISTEM REKOMBINAN
9B.KLONING GEN RESEPTOR UNTUK MANUSIA
21C.EKSPRESI KLONING RESEPTOR
24D.DNA TC PROTEIN ATAU KODE GENETIKA
30E.POLIMERASI CHAIN REACTION (PCR)
BAB IV 44PENUTUP
44A.KESIMPULAN
44B.SARAN
45DAFTAR PUSTAKA
BAB IPENDAHULUANA. LATAR BELAKANG
Penggunaan biologi molekuler salah satunya digunakan untuk
penciptaan sistem reseptor manusia. Dalam beberapa tahun mendatang,
kurangnya akses terhadap reseptor manusia telah mengharuskan
penggunaan sistem reseptor hewan dalam farmakologi dan penemuan
obat. Dengan munculnya tehnik memungkinkan pengenalan materi
genetik manusia pengkodean untuk reseptor dalam baris sel pengganti
telah datang era baru dalam farmakologi. Materi genetik
diperkenalkan, melalui operator (vektor), ke dalam sel bakteri, di
mana bahan yang dipisahkan menjadi koloni murni (klon) dan ulangan.
Produk genetik yang dihasilkan kemudian tranfeksi ke sel pengganti
untuk membentuk sel klon mengandung reseptor manusia yang cocok
untuk penelitian farmakologi. Sehingga, dibutuhkan suatu
pembelajaran mengenai penciptaaan reseptor manusia dengan
menggunakan DNA rekombinan. B. RUMUSAN MASALAH
Rumusan masalah pada makalah ini adalah sebagai berikut.
1. Mengapa menggunakan sistem rekombinan ?2. Apa yang dimaksud
dengan kloning gen reseptor untuk manusia ?3. Apa yang dimaksud
dengan ekspresi kloning dari reseptor ?4. Bagaimana kode genetik
pada urutan protein DNA ? 5. Apa yang dimaksud dengan Polymerase
chain reaction (PCR) ?6. Bagaimana sistem reseptor rekayasa
genetika ?C. TUJUAN
Tujuan pada makalah ini adalah sebagai berikut.
1. Untuk memahami tentang penggunaan sistem rekombinan. 2. Untuk
mengetahui kloning gen reseptor untuk manusia.3. Untuk mengetahui
ekspresi kloning dari reseptor.4. Untu mengetahui kode genetik pada
urutan protein DNA. 5. Untuk memahami tentang Polymerase chain
reaction (PCR).6. Untuk memahami sistem reseptor rekayasa genetika.
BAB IIPEMBAHASAN
A. SISTEM REKOMBINANKemajuan dalam bidang biologi molekuler
telah dilengkapi kemampuan fisik untuk membangun sistem reseptor
untuk pengujian obat-obatan serta untuk pembelajaran rinci reseptor
manusia. Sebelumnya, farmakologi dibatasi untuk mempelajari sistem
reseptor hewan, alasan untuk korespondensi dengan sistem manusia
bahwa banyak molekul mediasi tanggapan melalui reseptor tersebut
(misalnya, neurotransmitter seperti asetilkolin, hormon seperti
epinefrin) adalah sama pada hewan dan pada manusia. Oleh karena
itu, korespondensi diantisipasi antara situs pengakuan untuk
molekul-molekul (reseptor) dalam dua spesies. Meskipun sebagian
besar obat terapi yang dikenal digunakan saat ditemukan menggunakan
sistem tersebut, jelas bahwa mereka adalah faksimil dari sistem
target terapi. Tabel 4.1 menunjukkan berbagai sistem reseptor obat
yang dapat digunakan untuk penemuan obat. Pengembangan obat baru
jauh dikemukakan oleh kemampuan untuk menggunakan reseptor target
manusia dalam sistem pengujian terkontrol.Dengan munculnya kloning
dari bacteriorhodopsin pertama kali pada 1980-an telah muncul
kemampuan untuk memperkenalkan materi genetik yang mengkode
reseptor manusia ke dalam sel inang pengganti yang sesuai untuk
studi dalam isolasi. Selain itu, sistem host pengganti dapat
menjadi sel manusia, untuk menyediakan lingkungan yang lebih
fisiologis. Namun, dalam banyak kasus, jenis sel tertentu dimana
reseptor manusia berada di alam memberikan pengaruh penting pada
perilaku dan reseptor ini hilang dalam sistem pengganti. Selain
itu, proses patologis penting dan dalam beberapa kasus, pengaruh
yang dominan pada fungsi reseptor manusia. Oleh karena itu,
meskipun rekayasa genetika dapat membantu dalam memperbaiki desain
sistem reseptor, masih sering berbeda dari tujuan yaitu
menghasilkan reseptor manusia dalam sel manusia yang asli di bawah
kontrol patologis.Pada dasarnya ada tiga alasan untuk membangun
sistem reseptor dengan biologi molekuler. Yang pertama adalah akses
yang jelas untuk manusia, bukan hewan, bahan reseptor. Yang kedua
adalah bahwa banyaknya desain sistem fisiologis. TABEL 4.1
Kronologi Sistem Obat Reseptor yang Digunakan dalam Penemuan
Obat
Kontrol pengembalian dari sistem reseptor untuk respon terhadap
bahan kimia. Dengan demikian, banyak sel yang mengekspresikan
campuran dari subtipe reseptor yang berbeda secara halus satu sama
lain sehubungan dengan pengakuan dan terjemahan informasi
farmakologis dan fisiologis. Hal ini menjadi masalah praktis bagi
mereka yang ingin mempelajari interaksi obat-reseptor, karena
respon yang dimediasi oleh beberapa hal, bukan tunggal, populasi
reseptor. Rekayasa genetika dari sistem reseptor dapat
menghilangkan ini dengan mengekspresikan populasi reseptor tunggal
dalam sel pengganti yang dinyatakan tidak mengandung reseptor,
sehingga memungkinkan studi tentang efek obat pada populasi
reseptor tunggal.
Alasan ketiga untuk membangun sistem genetik reseptor adalah
untuk mendapatkan kemampuan dalam menjawab pertanyaan tentang
reseptor itu sendiri. Salah satu daerah yang jelas adalah produksi
bahan reseptor untuk isolasi dan karakterisasi dengan cara biokimia
(reseptor yang ditemukan dalam jumlah menit di alam). Alasan lain
adalah kontrol rasio stoikiometri antara reseptor dan interaksinya
yang terikat membran. Dengan biologi molekuler, komponen dari
sistem heterotrimerik dapat dimanipulasi, sehingga menyediakan
informasi yang belum pernah diakses. Hal ini dapat membantu
menentukan sejauh mana aktivitas obat adalah karena interaksinya
dengan komponen sistem dan sampai sejauh mana sifat unik molekul
reseptor dan obat. Hal ini penting karena hanya fitur yang terakhir
(dinyatakan sebagai afinitas reseptor terkait dan kemanjuran) dapat
ditransfer antara sistem. Karena sistem yang digunakan untuk
skrining obat tentu berbeda dalam terapi, kejutan lebih sedikit
akan menghasilkan peningkatan pengetahuan sistem karakteristik
obat.
B. KLONING GEN RESEPTOR UNTUK MANUSIAInformasi genetik disimpan
dalam bentuk kode dalam heliks terstruktur asam deoksiribonukleat
(DNA). Urutan tertentu dari nukleotida yang membentuk molekul DNA
dibaca oleh mekanisme inti dalam sel, dan transkripsi dan translasi
informasi kode ini menghasilkan sintesis protein. Untuk keperluan
farmakologi molekuler obat dan reseptor, fokus diskusi ini akan
menjadi penggunaan gen (bagian dari kromosom yang berisi informasi
yang cukup untuk membuat protein tertentu) yang kode untuk reseptor
manusia. Gen-gen ini dapat dikloning (produksi gen identik dari
satu individu dengan proses aseksual) dan transfer ke sel inang
untuk menghasilkan sistem reseptor manusia yang layak sesuai untuk
pengujian.
Langkah pertama adalah kloning gen reseptor. Secara umum,
perpustakaan materi genetik terbuat dari sel target, dan komponen
perpustakaan ini dimanipulasi menjadi bentuk yang sesuai untuk
penanganan. Secara khusus, materi genetik ditempatkan ke dalam
vektor DNA dengan sifat khusus. Reseptor DNA gen dan DNA rekombinan
bentuk DNA vektor, yaitu cocok untuk kloning sel (biasanya bakteri
seperti Escherichia coli). DNA rekombinan diperbanyak sebagai
sel-sel membentuk klon (koloni). Setiap sel dalam koloni operator
salinan identik dari DNA rekombinan; sehingga gen dikatakan
kloning. Koloni disaring untuk pemilihan DNA rekombinan yang
menarik, dan ini digunakan selanjutnya untuk menghasilkan sistem
reseptor seluler. Prosedur umum secara skematis diperlihatkan pada
gambar 4.1.
GAMBAR 4.1. Skema diagram yang menggambarkan proses kloning gen.
Baik DNA genomik atau mRNA (yang dikonversi menjadi cDNA) yang
diisolasi dari jaringan dan diikat menjadi vektor. DNA rekombinan
yang dihasilkan ditempatkan ke dalam sel bakteri, dan bakteri
sehingga berubah dipilih dari sel bukan tranformasi.1.
PerpustakaanDNA lengkap dari suatu organisme dapat diukur dalam hal
pasangan basa asam nukleat, anak tangga pada kode tangga DNA untuk
protein. Jumlah pasangan basa untuk organisme bervariasi dari 4
juta untuk E.coli. 700 juta untuk tomat, dan 3 miliar untuk
manusia. Dalam hal kloning gen reseptor manusia terdiri dari satu
bagian dalam 2 juta. Kunci untuk mendapatkan gen tertentu adalah
untuk memastikan populasi besar bagian DNA yang mewakili setiap gen
dari organisme (atau setidaknya setiap ditranskripsi gen) dalam
jaringan target. Langkah pertama dalam proses ini adalah
pembangunan perpustakaan (fragmen DNA) dari materi genetik dari sel
yang tepat. Sebagai contoh, jika suatu reseptor tertentu untuk
diabetes pada manusia adalah target, daripada sel yang sesuai dari
yang membuat perpustakaan mungkin sel pankreas manusia (sekresi
insulin). Gen DNA terdiri dari DNA lengkap dari sel terputus dalam
potongan-potongan acak dengan endonuklease restriksi. Meskipun kode
genetik lengkap dari organisme yang terkandung di perpustakaan ini
(genom), gen yang diinginkan mungkin sulit untuk diisolasi.
Ada beberapa alasan praktis untuk membuat jenis lain dari
perpustakaan DNA komplementer (cDNA) perpustakaan dari materi
genetik sel inang. Pembahasan perpustakaan memerlukan diskusi
tentang proses transkripsi DNA. Sintesis protein terjadi ketika
kode genetik dari sebagian heliks DNA yang digunakan oleh enzim RNA
polimerase untuk membuat molekul kode yang sesuai disebut asam
ribonukleat (RNA). Karena kode berasal dari coding gen tertentu
untuk protein tertentu dan RNA mentranskripsi kode ini dan operator
ke mesin molekul subselular besar dan kompleks yang dikenal sebagai
ribosom untuk diterjemahkan ke dalam urutan protein, RNA ini
disebut sebagai RNA messenger (mRNA). Dari catatan, terdapat fakta
bahwa untuk setiap protein disintesis dalam sel (termasuk
reseptor), ada juga mRNA. Dalam sel-sel yang sangat dibedakan, mRNA
untuk protein tertentu dapat mewakili sampai 10% atau lebih dari
total RNA, sedangkan pesan mungkin ada dalam rasio hanya 1 dalam 1
juta.
Hanya sebagian kecil dari total genom ditranskripsi menjadi RNA.
Namun, ada keuntungan untuk kloning perpustakaan cDNA untuk isolasi
reseptor tertentu. Pertama, ada mRNA untuk protein aktif disintesis
oleh sel. Oleh karena itu, jika reseptor yang menarik diketahui ada
secara alami dalam sel dari mana perpustakaan akan dilakukan, maka
mRNA untuk protein yang mungkin ada dalam jumlah tinggi (lebih
besar dari gen tunggal dalam genom). Selain itu, ada pertimbangan
praktis, seperti kemudahan pemurnian dan isolasi mRNA, yang
mendukung produksi perpustakaan cDNA.Salinan potongan DNA dimana
mRNA ditranskripsikan dapat dibuat dari mRNA. Pertama, untai
tunggal DNA dibuat dari mRNA oleh enzim reverse transkriptase.
Dihasilkan DNA beruntai tunggal membentuk struktur jepit rambut,
sehingga memberikan primer untuk sintesis untai komplementer DNA
yang akan dibuat oleh DNA polimerase. Cara lain untuk membuat cDNA
dari mRNA adalah dengan enzim R nase H, dari E.coli, yang RNA-DNA
dan RNA dicerna menjadi potongan-potongan pendek. Potongan-potongan
ini tetap dihibridisasi ke untai DNA pertama dan berfungsi sebagai
hibrida untuk E.coli DNA polimerase I, yang mensintesis DNA
beruntai ganda dari template DNA asli. Hasil baik dari proses ini
adalah bagian dari cDNA beruntai ganda yang mengandung materi
genetik untuk menghasilkan protein yang menarik.2. Vektor DNA
Setelah cDNA diproduksi maka harus dimasukkan ke dalam carrier,
atau vektor, yang akan menyebabkan masuk ke inti sel inang.
Penemuan endonuklease restriksi dan ligases, dua enzim yang
memotong dan menyisipkan masing-masing segmen DNA, telah
memungkinkan fragmen DNA yang akan dimanipulasi dan menyatu dengan
DNA lain untuk menghasilkan porsi kecil melingkar DNA untai ganda
yang disebut plasmid. Dengan demikian, fregment DNA yang menarik
(yang akan disebut DNA penumpang) terkait dengan pembawa vektor DNA
(yang sendiri memiliki sejumlah gen) untuk membentuk unit (DNA
rekombinan) dengan sifat khusus untuk kloning DNA penumpang. Vektor
yang berguna mengandung wilayah DNA mampu berfungsi sebagai asal
replikasi yang akan memungkinkan untuk berkembang biak secara
mandiri dalam host. Vektor juga mengandung promotor, yaitu urutan
DNA yang mengarahkan sintesis dalam jumlah besar mRNA sesuai dengan
gen. Selain itu, mereka dapat mencakup urutan untuk meningkatkan
efisiensi penggunaan mRNA yang diterjemahkan. Akhirnya, mereka
mengandung satu atau lebih gen untuk resistensi antibiotik untuk
host. Ini properti terakhir yang berfungsi sebagai penanda untuk
sel yang mengandung plasmid diisolasi (yaitu, sel-sel budaya
diperlakukan dengan antibiotik dan hanya sel-sel berhasil
transfeksi akan hidup karena mereka memiliki resistensi
antibiotik). Idealnya, mereka harus mengandung gen dipilih kedua
yang tidak aktif oleh penyisipan DNA penumpang, karena hal ini
sangat membantu dalam proses seleksi. Ini memungkinkan untuk
pemisahan sel diubah oleh plasmid yang tidak memiliki DNA penumpang
berhasil dimasukkan (gambar4-2a).
3. Transformasi Sel Bakteri dan SeleksiLangkah berikutnya dalam
prosedur kloning plasmid yang mengandung DNA penumpang ke dalam sel
yang akan memungkinkan untuk direplikasi. Sel bakteri, dan
khususnya E. coli, secara ideal cocok untuk ini karena mereka mudah
untuk dimanipulasi dan dapat tumbuh dengan cepat di media yang
murah. Kebanyakan bakteri mengambil hanya dalam jumlah terbatas
dari DNA; Oleh karena itu, mereka harus diperlakukan secara fisik
atau kimia untuk memberikan sifat ditingkatkan untuk penyerapan DNA
(yaitu, sel-sel harus diubah). Sel-sel yang dibuat kompeten untuk
mengambil DNA dengan merendam dalam, 50-mM kalsium klorida (atau
rubidium klorida) solusi dingin. Hal ini menyebabkan DNA untuk
mematuhi dinding sel luar. Sebuah kejutan panas singkat (misalnya,
42oC selama 2 menit) menyebabkan DNA yang akan diangkut kedalam
sitoplasma.Sel ditransfer dengan coliection plasmid dari
perpustakaan cDNA pada konsentrasi tersebut untuk memungkinkan
hanya satu plasmid untuk memasukkan sel singel. pada dasarnya, DNA
penumpang sekarang di pabrik kecil sendiri di mana, karena itu sel
tertentu membagi menjadi koloni, banyak salinan penumpang akan
membagi dengan itu dan tiruan dari DNA rekombinan akan dibuat
dengan koloni. Dengan demikian, beberapa nanogram DNA rekombinan
dapat menjadi beberapa mikrogram (ribuan kali lipat kenaikan) dari
bakteri tunggal. Namun, meskipun 1.000-10,000 transfor dapat dibuat
dalam suatu kultur, ini hanya mewakili sebagian kecil dari populasi
total sel. Langkah selanjutnya adalah amplifikasi sel berubah lebih
sel tidak berubah, yang dicapai dengan gen seleksi dibangun ke
dalam vektor kloning. Dengan demikian, sel-sel yang mengandung
vektor yang memiliki gen untuk memberikan resistensi terhadap obat
antibakteri (misalnya, RP4 plasmid mengandung gen untuk memberikan
resistensi terhadap ampisilin, kanamisin, dan tetrasiklin) akan
kebal terhadap obat ini. Oleh karena itu, pengobatan kultur lengkap
dengan tetrasiklin akan membunuh sel-sel tidak yang kontaminasi
dengan plasmid, dimana akan meninggalkan rekombinan (yang berhasil
ditransformasi dengan plasmid) untuk berkembang.Fitur lain dari
vektor, yang dikenal sebagai inaktivasi insersional, dapat dipilih
lebih lanjut untuk rekombinan. Hal ini berguna untuk memilih keluar
sel-sel yang mengambil plasmid hanya dengan tidak ada yang sesuai
(dimana DNA, plasmid menghapus berubah dibandingkan DNA rekombinan
berubah). Untuk mencapai hal ini, vektor dapat memiliki lebih dari
satu gen untuk resistensi antibiotik, dengan salah satu gen yang
memiliki situs restriksi yang unik cocok untuk membuka dan
memasukkan DNA penumpang. Jika hal ini dilakukan, maka rekombinan
DNA penumpang dengan plasmid akan kehilangan resistensi tertentu
sesuai dengan gen terganggu, yang memungkinkan untuk pemilihan
tidak hanya sel-sel yang diubah oleh plasmid tetapi juga sel-sel
yang membawa DNA penumpang berhasil dimasukkan ke dalam plasmid
dengan proses yang dikenal sebagai pengulangan (Gambar 4-2B).
GAMBAR 4.2. Clone Selection4. Transfeksi Sel
Dalam hal memproduksi sistem reseptor manusia rekombinan cocok
untuk pengujian obat-obatan dan untuk investigasi mekanisme
reseptor, gen reseptor harus dikloning ke host selular pengganti.
Langkah pertama dalam proses ini adalah transfeksi DNA rekombinan
ke dalam sel inang. Kebanyakan vektor transfeksi mamalia
menggunakan cDNA fragmen sebagai lawan DNA genom. Vektor berguna
berisi beberapa elemen untuk asal amplifikasi, promotor yang
efisien untuk tingkat tinggi transkripsi, dan warna yang cocok
untuk seleksi. Vektor juga dapat berisi sistem ekspresi diinduksi
yang dapat dikendalikan oleh rangsangan eksternal. Dalam keadaan
ini, rangsangan seperti -interferon, kejutan panas, ion logam
berat, dan steroid dapat digunakan untuk mengontrol tingkat
ekspresi protein dikodekan oleh gen penumpang. Sejumlah metode yang
ada untuk memperkenalkan vektor transfeksi ke dalam sel mamalia
seperti pengobatan sel dengan kalsium fosfat, transtek
DEAE-dekstran, elektroporasi (tegangan tinggi medan listrik yang
membentuk lubang sementara di membran), dan liposom dimediasi
transfeksi.
Selain plasmid transfeksi DNA rekombinan ke dalam sel, transfer
virus juga dapat dicapai. Virus seperti virus SV40 rekombinan,
retrovirus, dan virus vaccinia dapat menginfeksi berbagai jenis sel
dan dengan demikian memungkinkan kesempatan untuk menyuntikkan gen
asing secara efisien. Beberapa sistem ini (baculovirus, virus
vaccinia) memproduksi ekspresi protein yang lebih dan sehingga
dapat digunakan untuk mencapai tingkat ekspresi yang tinggi.
Baculovirus, khususnya adalah berguna karena menggunakan sel-sel
serangga yang memproses protein dalam banyak cara yang sama seperti
sel-sel eukariotik yang lebih tinggi (myristylation,
palmitoylation, glikosilasi, dll). Termasuk dalam genom virus ini,
yang tidak menginfeksi vertebrata, adalah gen untuk protein yang
ada di host di Boodles kristal besar, yang membentuk 50% dari sel.
Penggantian gen ini dengan yang asing memungkinkan produksi yang
sama dari protein dengan relatif mudah.
Secara umum, proses kloning gen selesai ketika sebuah gen
tunggal telah diidentifikasi, terisolasi, dan diperkuat. Kloning
gen tertentu dapat dianggap sebagai isolasi bagian tertentu dari
DNA (penyerapan DNA penumpang diligasi ke vektor kloning ke dalam
sel tunggal), replikasi gen tertentu dalam lingkungan yang
terisolasi, dan identifikasi dari klon tertentu yang menarik
melalui seleksi.5. Translent dan Clones StabilDua jenis transfeksi,
sementara dan stabil, biasanya dilakukan dalam sistem mamalia.
Transfeksi sementara memungkinkan analisis produk protein dalam 1
sampai 4 hari transfeksi. Efisiensi transfeksi sementara tergantung
pada jumlah sel-sel yang teke atas DNA asing, jumlah copy gen, dan
tingkat ekspresi gen per. Secara umum, sebanyak 50% dan sesedikit
50% dari sel-sel mengambil DNA rekombinan secara sementara. Karena
sel-sel yang mengambil DNA asing tumbuh lebih lambat dari sel-sel
lain, akhirnya mereka hilang dari populasi. Oleh karena itu, bahwa
sel-sel transiently transfected membawa sinyal DNA rekombinan untuk
periode beberapa hari sampai maksimal beberapa minggu. Transfeksi
sementara sulit untuk meningkatkan produksi dalam jumlah besar
protein, tetapi metode yang nyaman untuk menguji fungsi plasmid
dan, sangat relevan untuk mempelajari reseptor obat manusia,
digunakan untuk ekspresi kloning (vide infra).
GAMBAR 4.3. Kloning gen. Fragmen DNA A hingga E disisipkan ke
dalam vector dan digunakan untuk merubah sel bakteri. Setiap sel
mengambil plasmid tunggal. Sel cloning mengandung plasmid membuat
banyak salinan plasmid dan bereplikasi ke dalam koloni. Proses
seleksi isolate koloni sel mengandung banyak sekali kopian DNA. Gen
ini sehingga terisolasi dan direplikasi.
Sekitar 1 dari 104 sel (dalam beberapa sistem, sebanyak 1 dari
1000) dalam transfeksi yang stabil akan mengintegrasikan DNA asing
ke dalam DNA kromosom mereka dan dengan demikian mengekspresikan
protein sebagai natif sepanjang siklus hidupnya. Tidak seperti
ekspresi transien di mana efisiensi tergantung pada penyerapan DNA,
efisiensi transfeksi stabil tergantung pada frekuensi integrasi
DNA. Jika seleksi untuk sel-sel secara stabil transfek dibuat, maka
koloni mengekspresikan gen yang diinginkan dapat diperoleh setelah
sekitar 10 kali; koloni individu dapat dipilih dan tumbuh menjadi
garis sel stabil. Garis sel ini kemudian akan secara konsisten
mengungkapkan produk dari gen kloning sebagai bagian dari riasan
alami. Seleksi menggunakan prinsip konferensi resistensi obat untuk
host kekurangan dalam kegiatan tertentu yang dipilih. Oleh karena
itu, jika gen penanda yang kontras ke dalam sel dengan gen
rekombinan kepentingan dalam rasio 1:5 (satu bagian penanda dan
lima bagian gen rekombinan), ini secara efektif memastikan bahwa
setiap sel yang mengandung gen penanda juga akan berisi gen yang
diinginkan. Hal ini juga dapat dicapai dengan membangun gen penanda
ke dalam plasmid yang mengandung gen yang diinginkan.Penanda
seleksi dapat sangat bervariasi. Sebagai contoh, gen penanda dapat
kode untuk enzim adenosin deaminase (ADA), yang mendetoksifikasi
Xyl-A (9-bp-xylofuranosyl adenin) ke inosin turunannya. Jika Xyl-A
tidak didetoksifikasi, waktunya akan diubah ke Xyl-ATP, yang
merupakan racun bagi sel. Oleh karena itu, ADA-defient sel CHO
dapat digunakan untuk memilih untuk transfeksi. Demikian pula, gen
untuk aminoglikosida phosphotransferase (APH) dapat menghasilkan
sel resisten terhadap protein sintesis blocker G418. Dalam keadaan
ini, sel-sel transfected tumbuh di G418 akan bertahan hidup,
sedangkan sel bukan transfeksi akan mati.Sel transfek dan berkultur
melalui fase transien. Dengan kultur lanjut, sel transien transfek
mati meninggalkan pelengkap jauh lebih rendah dari sel-sel (1-104)
yang telah memasukkan DNA asing ke dalam kromosom mereka (stabil
transfek). Kemudian, media seleksi (Xyl-A untuk penanda ADA, G418
untuk penanda APH, dll.) ditambahkan, yang membunuh sel-sel bukan
transfek, meninggalkan sel-sel secara stabil transfek untuk
berkembangbiak.
GAMBAR 4.4. Garis sel stabil yang mengandung reseptor manusia
adalah tujuan akhir dari biologi molekuler yang dijelaskan dalam
bab ini. Namun, sejumlah isu yang terkait dengan farmakologi
reseptor dapat diatasi dengan biologi molekuler.C. EKSPRESI KLONING
RESEPTORPembahasan sebelumnya melibatkan kloning gen dan penciptaan
sistem selular pengangkutan jumlah murni produk dari gen tersebut.
Namun, jika kode untuk reseptor tertentu tidak diketahui,
satu-satunya penanda yang tersedia untuk mendeteksi kloning gen
yang tepat adalah aktivitas reseptor itu sendiri. Dengan kondisi
tersebut, perpustakaan cDNA ditransfer ke sel yang kemudian menjadi
sasaran analisis farmakologis untuk fungsi reseptor; hal ini
disebut sebagai ekspresi kloning. Sebagai contoh, reseptor untuk
hormon otak saraf hipotetis dapat diketahui sangat lokal di daerah
tertentu dari otak (misalnya, hipotalamus). Dalam hal ini, akan
masuk akal untuk mengasumsikan bahwa sel-sel hipotalamus akan
memiliki jumlah tertentu dari mRNA untuk reseptor itu, sebagai
reseptor diketahui dilokalisasi dalam sel-sel. Oleh karena itu,
perpustakaan cDNA bisa dibuat dan digunakan untuk transfect sel
inang. Perpustakaan kemudian bisa dibagi ke dalam kolam dari cDNA
dan digunakan untuk transfect beberapa kultur seluler mamalia. Pada
gilirannya, dapat disaring untuk reseptor oleh radioligan mengikat
atau fungsi reseptor. Untuk tujuan diskusi ini, proses ini hanya
salah satu pilihan dari kolam positif. Penentuan sinyal reseptor
positif dalam salah satu piring berarti bahwa hanya satu dari
ribuan atau lebih gen itu adalah benar. Proses ini diulang untuk
mempersempit pilihan ke sinyal gen. Plasmid cDNA yang dikumpulkan
dari pelat kultur positif dan digunakan untuk kultur. Agen plat
positif terisolasi, dan proses ini diulang sehingga satu kali
dibagi menjadi daerah koloni dan kemudian menjadi koloni tunggal
sampai klon diperoleh (Gambar 4-5). Plasmid cDNA dari klon tunggal
ini berisi gen untuk reseptor tertentu yang menarik. Dari sini,
dapat diperkenalkan ke sejumlah host selular untuk penelitian
eksplorasi dan ke baculovirus untuk produksi tinggi protein
reseptor. Selain itu, DNA dapat diurutkan dan urutan asam amino
reseptor reseptor ditentukan.
GAMBAR 4.5, Proses pengeluaran kloning. Sebuah perpustakaan
dibangun dari jaringan target, dibuat menjadi DNA rekombinan, dan
dibagi kedalam kelompok. Pembagian kelompok digunakan untuk
transfect memisahkan kultur sel, dan masing-masing diuji untuk
produk gen (yaitu kehadiran reseptor oleh radio ligand mengikat,
respon fungsional untuk agonis). DNA dari kultur aktif digunakan
untuk transfect kultur segar, yang kemudian dibagi menjadi beberapa
bagian dan di uji kembali. Proses berlanjut sampai koloni sel
tertentu yang mengandung sel-sel mengeluarkan produk gen yang
diisolasi. D. DNA TC PROTEIN ATAU KODE GENETIKA
Seperti disebutkan dalam bab sebelumnya, DNA berisi urutan kode
dari asam nukleat yang memberikan resep untuk penggabungan asam
amino menjadi protein. DNA terdiri dari empat asam nukleat, timin,
adenin, sitosin, dan guanin bahwa dari pasangan hybrid stabil satu
sama lain (timin dengan adenin dan sitosin dengan guanin,
Gbr.4-6A). Urutan yang tepat dari asam amino menentukan sifat
struktur protein, dan urutan yang tepat terkandung dalam susunan
asam nukleat dari molekul DNA heliks (lihat Gambar 4-6B). Basa
harus mengkode 20 asam amino yang berbeda. Hal ini dapat dilihat
dari pengaturan bahwa asam nukleat tunggal tidak bisa mengkode 1
protein (hanya dapat mengkode 4), pasangan asam nukleat hanya bisa
mengkode 16 asam amino, dan 3 asam amino dapat mengkode 64 asam
amino. Kode tersebut adalah triplet (ditunjukkan pada Gambar 4-7),
dan dapat dilihat bahwa sejumlah triplet dikode lebih dari satu
asam amino, sedangkan beberapa triplet adalah kodon stop (signal
akhir sintesis). Relevansi untuk penelitian reseptor pada kenyataan
bahwa pengetahuan tentang urutan asam nukleat dari cDNA reseptor
dapat digunakan untuk menerjemahkan kembali asam amino urutan
reseptor. Oleh karena itu, pengetahuan tentang urutan gen reseptor
mengarah ke pengetahuan tentang urutan protein.
Aspek penting lain dari korespondensi antara nukleat dan asam
amino dalam penggabungan probe oligonukleotida untuk mengisolasi
penggabungan dan mencari subtipe dan mutans dari reseptor. Sebuah
metode yang kuat untuk mengisolasi dan mengidentifikasi klon
tertentu yang menarik adalah dengan hibridisasi asam nukleat
(hibridisasi koloni). Koloni sel, tersebar di piring agarosa, yang
dicetak dengan nitroselulosa atau membran nilon sedemikian rupa
sehingga replika piring dibuat dengan beberapa sel. Membran
diperlakukan untuk menghapus semua materi tetapi DNA, yang
terhubung dengan membran dalam posisi axact koloni dari proses
pemanasan. Penyelidikan kemudian digunakan untuk mengidentifikasi
koloni yang mengandung rekombinan. Beberapa probe bersifat
radioaktif dan dapat dideteksi oleh autoradiografi, tetapi probe
jenis lain menggunakan biotin, yang dapat dideteksi dengan ketat
mengikat ke avidin protein (dideteksi dengan pewarna fluorescent
seperti Texas red).
Prinsip dasar bahwa struktur asam nukleat komplementer akan
mengikat lain dan dari struktur hibrida seperti dalam DNA heliks
(vide infra). Oleh karena itu, jika sebagian dari urutan asam
nukleat dari gen yang diinginkan diketahui, maka koleksi koloni sel
bakteri dapat dipilih (yaitu, baik yang mengandung radioaktif atau
biotin) Probe complementarry dan memungkinkan identifikasi koloni
yang mengandung gen. Elemen kunci dalam proses ini adalah memiliki
probe yang benar, hibridisasi koloni membutuhkan urutan nukleotida
radioaktif yang unik yang akan berhibridisasi ke bagian unik dari
cDNA dan memungkinkan isolasi. Sebagai contoh, Gambar 4-8A
menunjukkan urutan DNA dari gen reseptor dan urutan asam amino yang
sesuai untuk dikode. Dengan mmempertimbangkan masalah sebaliknya,
bentuk probe asam nukleat untuk urutan ini asam amino tertentu.
Karena degenerasi dalam kode genetik (misalnya, banyak asam amino
yang dikodekan oleh lebih dari urutan triplet), urutan asam nukleat
yang mungkin ditampilkan (lihat Gambar 4-8B); dalam kasus ini,
empat. Hibrida terbentuk antara adenin asam nukleat dan timin dan
juga antara guanin dan sitosin. Keempat probe yang akan
berhibridisasi ke empat urutan ditunjukkan pada Gambar 4-8C. Untuk
hibridisasi koloni, campuran dari empat oligonukleotida akan dibuat
dan digunakan untuk screen untuk gen reseptor tertentu. Clearly,
degenerasi dalam kode genetik dapat menyebabkan ambiguitas yang
cukup besar jika urutan asam amino yang dipilih banyak kemungkinan
kode asam nukleat. Contoh, urutan -VAL-LEU-ARG-LEU- memiliki 864
urutan oligonukleotida. Secara umum, urutan mengandung asam amino
yang dikodekan untuk histidin atau asparagines berguna karena hanya
kode triplet tunggal untuk asam amino ini.
Probe bisa kurang ketat untuk urutan oleh desain. Sebagai
contoh, daerah bagian reseptor yang berbeda dari homologi (urutan
asam amino yang sama). Sehingga kesempatan untuk menggunakan
oligonukleotida untuk satu jenis reseptor untuk menyelidiki untuk
gen untuk jenis lain dari reseptor. Demikian pula, urutan asam
amino yang terbatas dapat memilih gen untuk subtipe reseptor, satu
diproduksi oleh sel yang hilang, yang memiliki asam amino yang
sedikit berbeda dari reseptor normal (Gambar 4-9). Reseptor
tersebut dapat dihasilkan oleh proses patologis (misalnya, kanker
atau penyakit lainnya). Penemuan-penemuan semacam ini bisa sangat
penting karena dapat memberikan kesempatan untuk merancang obat
selektif untuk reseptor baru.
GAMBAR 4.6. Molekul DNA. A) pasangan basa komplemen tertentu
pada untai DNA. Timin mengikat adenin, dan sitosin mengikat guanin.
B) pasangan basa individual di dua untai DNA mengarah ke struktur
alphahelix.
Gambar 4.7. Kode genetik. Basa triplet sepanjang untai DNA kode
untuk asam amino tertentu. Degenerasi terjadi (yaitu, empat triplet
semua kode untuk prolin) dan sinyal kodon langkah ketika terjemahan
selesai.
Gambar 4.8. Probe oligonukleotida. Sebuah urutan 12 kode dasar
untuk empat asam amino dalam gen yang diinginkan. B. urutan protein
ini dapat dikodekan untuk empat urutan oligonukleotida yang berbeda
sesuai dengan kode genetik (bukan degenerasi untuk ALA). C. Probe
pelengkap yang dapat mengikat urutan kepentingan disintesis dan
dapat digunakan untuk mendeteksi gen asli.
GAMBAR 4.9. Kegunaan urutan homologi untuk mendeteksi reseptor
yang sama. Dua reseptor yang berbeda kecuali untuk peregangan
tertentu asam amino yang sama (daerah homolog). Oligonukleotida
Probe mengkode untuk daerah ini dapat digunakan untuk mengisolasi
reseptor asli (A) dan reseptor lain yang mengandung urutan yang
sama (reseptor B).
E. POLIMERASI CHAIN REACTION (PCR)
Teknik lain dalam biologi molekuler, polymerase chain reaction
(PCR), sangat berguna untuk mendeteksi gen di perpustakaan dan,
oleh karena itu, untuk pemetaan gen untuk reseptor pada jaringan
yang berbeda. Seperti disebutkan sebelumnya, DNA ada sebagai double
helix pasangan basa hibridisasi (adenin dengan timin dan guanin
sitosin untuk). Namun, alur tersebut dapat terdenaturasi kimia atau
dengan panas menjadi untai tunggal. Dari alur tunggal, salinan baru
DNA yang sesuai dapat dibuat oleh DNA polimerase enzim. Alur
melengkapi setiap helai terpisah dibuat, sehingga ketika ini
terdenaturasi lagi, salinan hasil untai DNA asli. Pengulangan
reaksi dapat menghasilkan salinan yang luar biasa dari satu bagian
dari DNA. Teknik ini membuat kita dari fakta bahwa DNA polimerase
enzim memerlukan primer (string kecil nukleotida) yang dapat
menambah basis harus diperkuat, dan sintesis DNA baru dimulai dari
titik ini. Oleh karena itu, jika titik awal yang tepat dari urutan
gen yang diketahui, maka primer dapat disintesis untuk mengikat ke
titik yang tepat untuk memulai sintesis. Jadi, dengan denaturasi
sampel DNA dan penambahan jumlah kelebihan dua primer yang mewakili
urutan membingkai gen yang diinginkan, beberapa salinan gen dapat
diproduksi (ditunjukkan secara skematis dalam Gambar 4-10). Jumlah
salinan gen sama (2) / 4, di mana n adalah jumlah kali pcr
dijalankan. Sebagai contoh, gen dapat dibuat menjadi 1 juta kopi
dengan melakukan reaksi 22 kali. Ini memberikan kekuatan yang luar
biasa dari deteksi gen karena pcr dapat dijalankan dengan primer
yang tepat untuk reseptor yang berbeda dan adanya gen yang sama
dalam jaringan apapun dapat dideteksi.
PCR adalah teknik yang sangat kuat, mampu mendeteksi satu bagian
dari DNA di perpustakaan yang lengkap. Salah satu aplikasi dari
teknologi ini adalah deteksi reseptor mutan. informasi genetik
tentang mutans seperti itu sering jarang karena mutasi dapat
membatasi produksi tuan rumah. Namun reseptor mutan dapat menjadi
penting dalam perubahan struktural dan fungsional yang menyertai
beberapa penyakit, dan pengujian entitas obat baru pada reseptor
mutan yang diinginkan. Dengan PCR, pengkodean daerah pembatas untuk
reseptor dapat didefinisikan, dan semua DNA sesuai dengan kode
antara mereka mulai kodon akan diperkuat. Jika mutasi titik
reseptor hadir, ini akan diperkuat, sehingga jumlah besar dapat
dibuat dan diikuti (gambar 4-11). Ekspresi kloning dari reseptor
mutan maka akan mungkin dengan pengujian farmakologis
berikutnya
GAMBAR 4.10. Reaksi rantai polymerase. DNA didenaturasi untuk
memisahkan kelebihan rantai primer yang akan mengikat dua wilayah
pada DNA yang menentukan gen dari kepentingan ditambahkan. Primer
mengikat ke daerah batas gen dan berfungsi sebagai cetakan untuk
polimerase DNAuntuk memulai sintesis untai komplementer. Rantai
dipisahkan dengan pemanasan dan prosesnya diulangi sehingga setiap
DNA disintesis menjadi untaian yang baru berfungsi sebagai cetakan
untuk salinan lanjut. Dengan setiap proses berulang, DNA baru
terakumulasi.
GAMBAR 4.11. Menggunakan reaksi rantai polymerase (PCR) untuk
mendeteksi mutasi reseptor. Primer menentukan gen yang mungkin
memiliki titik mutasi. Gen bermutasi ini masih akan diperkuat oleh
tehnik PCR.F. SISTEM REKAYASA GENETIK RESEPTOR
Kemampuan mengungkapkan produk gen dalam berbagai jenis sel
telah menciptakan sebuah revolusi pada penelitian reseptor. hal ini
karena reseptors tidak berfungsi secara tersendiri melainkan
merupakan bagian dari sistem saling bergantung kompleks (yaitu,
meninjau model kompleks kubik terner, Bab 3). Dalam situasi seperti
ini, sifat molekul komponen dan stoichiometries relatifnya
mempengaruhi perilaku serta perilaku obatnya. sistem reseptor yang
dikontrol ketat sesuai dengan kebutuhan sel dan kekuatan input
kimia untuk sel-sel. Oleh karena itu, sedikit lintang telah
memungkinkan peneliti yang harus bergantung pada pilihan bijaksana
sistem alam untuk kondisi optimum untuk pengujian obat. dengan
munculnya biologi molekuler, sistem pengujian dapat dibuat untuk
memenuhi kebutuhan para peneliti. Manipulasi genetik komponen
seluler menawarkan metode baru menyelidiki sistem pengujian
1. Aplikasi sistem reseptor dikendalikan secara genetik
Ada tiga aplikasi yang berbeda dari kontrol genetik sistem
reseptor karena berkaitan dengan reseptor penelitian. Yang pertama
adalah untuk mengontrol sistem tanggap untuk mendeteksi khasiat
obat. Hal ini terkenal bahwa obat dengan efikasi rendah mungkin
tidak menghasilkan respon dalam sistem reseptor efisien
digabungkan. Hal ini dapat distimulasi jika obat ini dimaksudkan
untuk digunakan sebagai antagonis dan menghasilkan respon agonis
pada jaringan yang digabungkan dalam tubuh manusia. Salah satu
metode untuk mengendalikan respon sistem reseptor adalah untuk
mengontrol stoikiometri reaktan. Dengan demikian, promotor yang
berbeda dapat digunakan untuk mengekspresikan berbagai tingkat
protein reseptor atau protein-G. coexpression kedua reseptor dan
protein-G dapat digunakan untuk membuat sistem reseptor responsif.
Reaksi antara reseptor (R) , protein-G (G), dan obat (A) dapat
disederhanakan sebagai berikut.
di mana kmaju dan kkembali mengacu pada konstanta laju untuk
reaksi maju dan mundur kimia, masing-masing. respon agonis
dimediasi oleh pembentukan kompleks terner ARG yang pada gilirannya
diatur oleh produksi ARG oleh kmaju (A) (R) dan bahwa ARG oleh
kmaju (G) (AR). dapat dilihat dari reaksi-reaksi kinetik yang
meningkatkan dalam jumlah reaktan (R) dan (G) akan meningkatkan
produksi respon memproduksi elemen ARG. Angka 4.12 menunjukkan efek
peningkatan baik reseptor tingkat ekspresi atau tingkat G-protein
dalam sistem ekspresi pada (ARG) kemampuan respon pembentuk suatu
agonis. dua tahap, dalam hal perubahan yang dihasilkan oleh
manipulasi tersebut, dapat diamati. yang pertama adalah peningkatan
asimtot maksimal kurva dosis-respons (tahap I). perlu dicatat
bahwa, tergantung pada sifat dan jumlah intervensi langkah antara
respon yang diamati dan produksi ARG, mungkin atau mungkin tidak
perubahan parameter lokasi (konsentrasi afektif median (EC50I) dari
kurva pada fase I. di tahap kedua, asimtot maksimal mencapai
dataran tinggi dan dosis-respons, kurva bergeser ke kiri, dengan
meningkatkan ekspresi reseptor baik atau G-protein. hal ini karena
satu atau lebih komponen dari sistem jenuh. Misalnya, jika tingkat
G-protein yang meningkat melebihi setara stoikiometri dari
reseptor, maka tidak ada maksimal A-R-G lanjut dapat dibentuk
(jumlah R Batas ini), tetapi kemungkinan membentuk meningkat
kompleks karena peningkatan ketersediaan dosis-respons kurva.
Contoh dari perubahan kepekaan terhadap agonis dengan meningkatnya
konsentrasi G-protein dalam sistem dengan jumlah yang tetap dari
reseptor diberikan dalam bab 3 (lihat gbr 3-5).
GAMBAR 4.12. Efek dari peningkatan kemampuan respon dalam sistem
fungsional. Pengamatan pertama adalah peningkatan respon asimtot
maksimal, yang mungkin atau mungkin tidak disertai dengan
pergeseran ke kiri EC50 kurva dosis-respons (tahap 1). Setelah
kejenuhan satu atau lebih komponen dari sistem, pergeseran
sinistral kurva dosis-respons dengan tidak ada perubahan dalam
respon maksimal diamati (fase II).
Alasan lain untuk memanipulasi stoikiometri sistem reseptor
adalah untuk membuatnya konstitutif aktif. Reseptor adalah protein
reaktif dengan banyak konformasi tersier. Beberapa konformasi ini
G-protein aktif, dengan demikian, mereka telegraf kehadiran mereka.
Dalam sistem alami yang paling, jumlah reseptor spontan diaktifkan
sangat rendah, sebagai sinyal tunduk terhadap rangsangan eksternal
lebih terkontrol dalam keadaan fisiologis normal. Namun, jika
stoikiometri dari reseptor dan G-protein yang ditinggikan cukup,
melampaui batas alam atau dalam sel inang khusus, maka tingkat
diamati dari reseptor spontan diaktifkan akan diproduksi. Ini akan,
pada gilirannya, menghasilkan sinyal yang terukur dalam sel karena
tingkat abnormal tinggi reseptor secara spontan aktif. Dengan
demikian, sistem disederhanakan untuk koeksistensi yang tidak aktif
(Ri) dan aktif (Ra) reseptor di hadapan G-protein (G) dinyatakan
sebagai berikut:
KG
[Ri]+[G]
[RiG]
L
[Ra]+[G]
[RaG]
KDi mana L adalah alosterik konstan asosiasi didefinisikan oleh
[Ra]/[Ri], KG asosiasi konstan untuk reseptor dan protein-G dan b
adalah faktor penggali yang menunjukkan perbedaan dalam afinitas
aktif dengan bentk tidak aktif dari reseptor untuk protein-G.
diasumsikan bahwa tidak ada respon seluler berasal dari kompleks
nonproduktif reseptor inaktif dan protein-G (R,G) , hanya dari
reseptor aktif kompleks protein-G (RaG).Level RaG (dari beberapa
reseptor sistem dan karena aktivasi konstitutif) dari setiap sistem
reseptor terganting pada seberapa baik reseptor membentuk keadaan
aktif (nilai L) dan rasio relatif protein-G. Gambar 4.13
menunjukkan tingkat spontan membentuk RaG untuk reseptor tertentu
(dengan karakteristik nilai L). Seperti yang bisa dilihat dari
kurva yang berkaitan kepadatan reseptor untuk aktivasi spontan,
peningkatan reseptor/ protein-G rasio dalam konstitutif aktif. Pada
tingkat reseptor rendah, tidak ada diamati aktivitas basal dan
obat-obatan tidak merespon atau respon positif (lihat gambar 4.13).
Pada tingkat reseptor hasil aktivasi konstitutif lebih tinggi.
Sistem tersebut memiliki potensi untuk menyaring ligan karena
secara teoritis, bahan kimia yang berinteraksi dengan reseptor akan
mengubah kesetimbangan mikroskopis antara tempat reseptor dan
mengubah basal (tetapi stabil) tinggi level RaG. Karenanya setiap
gangguan kimia kesetimbangan stabi didirikan dalam sistem
konstitutif aktif akan dideteksi. Deteksi interaksi reseptor ligan
dapat digunakan sebagai alat skrining dalam mencari obat baru.
Ligan yang mengikat deferensial ke susunan reseptor baik dapat
menurunkan atau meningkatkan aktivasi reseptor konsitutif (lihat
gambat 4.13).Aplikasi kedua dari sistem kontrol reseptor genetik
adalah untuk mendeteksi obat yang mengganggu spontan reseptor yang
sama. Obat tersebut memiliki khasiat negatif dan disebut sebagai
agonis terbalik. Dampak agonis terbalik belum diketahui, namun
mereka memiliki potensi untuk menenangkan spontan aktif fokus
patologis seperti bidang berlebih reseptor dopain ditemukan di
daerah otak pada pasien dengan schizopherenia.
GAMBAR 4.13 Efek dari aktivitas reseptor konstitutif pada profil
respon pada profil respon obat. Saling ketergantungan kepadatan
reseptor ([R]) dan Konsentrasi protein-G ([G]) pada jumlah spontan
kompleks reseptor aktif/ protein-G yang dihasilkan dalam sistem
reseptor ditampilkan di panel tengah. Untuk menetapkan jumlah
protein-G, peningkatan kadar reseptor menyebabkan konstitutif
respon spontan terhadap berbagai jenis obat dalam sistem dengan dan
tanpa (diam) aktivitas konstitutif. Agonis terbalik dan antagonis
yang bisa dibedakan dalam sistem diam, sedangkan mereka
menghasilkan efek berbeda dalam sistem konstitutif aktif.Sebuah
aplikasi ketiga sistem reseptor rekayasa genetika dalam
pengendalian pasangan reseptor/G-protein. Hal ini diketahui bahwa
reseptor yang kacau sehubungan dengan G-protein yang mereka
berinteraksi. Dengan demikian, salah satu diaktifkan reseptor
mungkin beberapa dua atau lebih G-protein di membran dalam
menanggapi aktivasi oleh agonis. Tidak jelas apakah semua agonis
meningkatkan produksi negara diaktifkan tunggal. Sebaliknya ada
bukti bahwa beberapa negara diaktifkan untuk reseptor mungkin ada.
Oleh karena itu, muncul pertanyaan; Apakah agonis yang berbeda
mempromosikan spektrum yang berbeda dari negara-negara aktivasi
mengarah ke diferensial aktivasi G-protein? Ada bukti bahwa
stimulus beberapa agonis lalu lintas ke jalur G-protein yang
berbeda. Pertanyaan ini mungkin sangat penting dalam desain agonis
khusus untuk terapi. Untuk contoh, jika efek terapi agonis
tergantung pada satu jalur G-protein dan efek samping tergantung
pada yang lain, secara teoritis akan ada kemungkinan untuk
menghilangkan efek samping dengan merancang agonis serupa yang
memperdagangkan hanya untuk jalur menguntungkan. Rekayasa genetika
sistem reseptor memungkinkan untuk penciptaan sistem host selular
dengan bias populasi G-protein. Pengujian agonis dalam sistem
tersebut secara teoritis memungkinkan untuk mendeteksi perdagangan
agonis stimulus dan deteksi agonis lebih selektif. Gambar 4-14
menunjukkan wakil skematik
GAMBAR 4.4. Perdagangan agonis stimulus reseptor. Agonis a
menghasilkan keadaan aktif (atau berbagai negara aktif) yang
sembarangan mengaktifkan (s) dua G-protein, sehingga menimbulkan
efek yang berguna dan efek samping yang tidak diinginkan. Agonis B
lebih selektif dan menghasilkan keadaan aktif reseptor yang
mengaktifkan hanya jalur berguna. Dipilih tes rekayasa genetika
mampu membedakan di antara profil yang berbeda dari agonis.
2. Saturasi Mutagenesis AcakSebagaimana dicatat sebelumnya,
fakta bahwa reseptor bias eksis dalam berbagai negara konformasi
tersier dan bahwa beberapa negara ini konstitutif aktif memiliki
aplikasi praktis dalam pemutaran entitasobat baru. Ada juga bukti
bahwa bagian-bagian tertentu dari lingkaran intra seluler ketiga
reseptor tujuh trans membrane mengaktifkan G-protein dan bahwa
bentuk tidak aktif dari reseptor menghalangi akses kedaerah ini
(gambar 4-15). Sebaliknya, bentuk aktif dari reseptor ekspose
daerah kritis untuk aktivasi G-protein. Ada bukti bahwa mutasi
titik reseptor menghasilkan konformasi menyimpang yang abstrak
keadaan tidak aktif dan pada kenyataannya, cenderung untuk
membentuk keadaan aktif. Mutasi ini sering aktif dan dengan
demikian berharga dalam skrining obat.
GAMBAR 4.15. Reseptor tujuh transmembran di inaktif (Ri) dan
diaktifkan (Ra) bentuk. Hal ini diyakini bahwa sebagian dari
lingkaran intra seluler ketiga (yang ditunjuk oleh bar horisontal)
sangat penting dalam mengaktifkan G-protein bahwa daerah ini dari
reseptor tersembunyi dalam bentuk reseptor aktif dan terbuka dalam
bentuk aktif. Mutan reseptor (R) dengan sifat komposisi asam amino
diubahnya, lebih mudah membentuk keadaan aktif, dan system
pengolahan reseptor mutan ini konstitutif diaktifkan.Sebuah
prasyarat untuk penggunaan situs-diarahkan mutagenesis adalah
pengetahuan tentang wilayah mana reseptor sangat penting untuk
kopling G-protein. Namun, metode alternatif adalah dengan membuat
perpustakaan acak cDNA yang bermutasi di wilayah umum kopling
G-protein dan untuk memperkuat cDNA melalui PCR dan layar untuk
reseptor aktif konstitutif. Teknik ini, yang dikenal sebagai
saturasi mutagenesis acak, memperkenalkan mutasi asam amino di
daerah reseptor tanpa prasangka. Kemampuan untuk mendeteksi
aktivitas konstitutif (misalnya, melalui tes wartawan, vide infra)
memungkinkan pemilihan reseptor konstitutif. CDNA kemudian dapat
diperkuat melalui PCR dan reseptor sequencing untuk menentukan
urutan reseptor mutan.
G. SINOPSIS
Ide-ide berikut disajikan dalam bab ini:
Sistem Reseptor dapat dibuat dengan memasukkan reseptor manusia
ke dalam sistem sel pengganti, sehingga menghindari kekurangan
menggunakan jaringan hewan.
Gen untuk reseptor tertentu dapat dikloning menyebabkan banyak
salinan gen dalam dari yang dapat dimanipulasi.
Entah genom cDNA perpustakaan dapat dibangun, dan
potongan-potongan DNA penumpang dapat diperkenalkan ke vektor. Ini
dapat dilakukan untuk mereplikasi dalam sel bakteri. Klon yang
menarik dapat dipilih dan diperkuat.
Gen dapat transfected ke sel mamalia untuk menciptakan sistem
pengujian reseptor. Sistem ini dapat bersifat sementara (transient
transfeksi) atau permanen (transfections stabil).
Gen untuk produk yang tidak diketahui dapat dikloning dan produk
diuji untuk fungsi atau keberadaan (ekspresi kloning). Hal ini
dapat menghasilkan cukup bahan untuk ditandai.
Kode genetik untuk produk protein (yaitu, reseptor) dapat
digunakan untuk menentukan urutan asam amino reseptor. Atau,
penggunaan urutan homolog antara reseptor memungkinkan menyelidik
perpustakaan gen untuk mendeteksi reseptor terkait struktur yang
berbeda.
Reaksi berantai polimerase memungkinkan amplifikasi gen tunggal.
Hal ini dapat digunakan untuk mendeteksi gen reseptor dan gen
reseptor mutan dalam jaringan. Rekayasa genetika dapat digunakan
untuk sistem reseptor custom-membangun untuk skrining yang lebih
baik dari obat-obatan dan deteksi kegiatan obat lemah. BAB
IVPENUTUPA. KESIMPULAN
Berdasarkan pembahasan diatas, dapat disimpulkan bahwa :B.
SARANDAFTAR PUSTAKAGossel, T.A., dan J.D., Bricker, 2001,
Principles Of Clinical Toxicology Third Edition, Selwood Printing
Ltd., Burgess Hill, West Sussex.Gunawan, S. G., 2012, Farmakologi
dan Terapi, Balai Penerbit FKUI, Jakarta. Priyanto, 2010,
Farmakologi Dasar, Leskonfi, Jakarta.Gen reseptor kloning
Seleksi
E. coli
(Transformasi untuk E. Coli dalam in vitro)(Transformasi untuk
kemasan in vitro
DNA rekombinan
Vektor
Ligasi
Perpustakaan cDNA
Perpustakaan gen DNA
mRNA
Ektrak, mencerna DNA genom fractionale
Jaringan target (mengandung reseptor)
Reseptor Hewan, Jaringan Hewan
Hewan atau sel manusia dalam kultur
Materi reseptor genetik hewan, sel-sel pengganti
Materi reseptor genetik manusia, sel-sel pengganti
Reseptor manusia, sel target manusia
Reseptor manusia, sel target manusia (kontrol patologis yang
sesuai)
2