Subiecte-Sanda Andrei

Chimie fizica si coloidala1. Principiul de baza al separrilor cromatografice, concepte fundamentale.Metoda cromatografic se bazeaz pe echilibrul de repartiie a componentelor unui amestec ntre o faz mobil i una staionar. Datorit diferenelor n repartiie are loc deplasarea, cu vitez diferit, a componentelor purtate de faza mobil de-a lungul fazei staionare. Principalele avanteje pe care le prezinta cromatografia ca metoda de separare sunt:- Permite separarea, identificarea si dozarea cantitativa simultana a componentelor unui amestec.- Se poate aplica unui numar foarte mare de produse, practic orice compus organic putnd fi separat printr-o metoda cromatografica- Sensibilitatea metodelor cromatografice este extrem de ridicata, ceea ce nseamna ca necesita doar cantitate foarte mica de proba. n acelasi timp nsa se pot aplica si la scara preparativa.- Durata analizei este redusa, comparativ cu alte metode de analiza ale amestecurilor complexe.Cromatografia pe coloane cu gel a fost utilizat pentru prima dat n 1959 de Porath si Flodin, iar cea de bioafinitate se utilizeaza din 1967. Cromatografia de lichide moderna pe coloana, numita de nalta performanta sau de nalta presiune (HPLC) poate fi datata la nceputul anilor 1960 si se bazeaza pe lucrarile lui Csaba Horvth, efectuate la Univesitatea Yale.Principiul de baza al oricrei separri cromatografice consta n distributia inegala a componentelor unui amestec ntre faza mobila si faza stationara. Acest amestec strabate sistemul cromatografic, fiind antrenat de catre faza mobila. Distributia inegala este determinata fie de afinitatea diferita a componentelor amestecului fata de cele doua faze, fie de capacitatea diferita de a difuza n acestea. Acest principiu este ilustrat n figura de mai jos, pe un exemplu din cromatografia de gaze pe coloane capilare. Aceste coloane se caracterizeaza prin faptul ca faza stationara se gaseste depusa n strat foarte subtire pe peretii coloanei.O analiz cromatografic se rezum n general la urmtoarele concepte fundamentale: proba este dizolvat n faza mobil; faza staionar este cel mai frecvent un lichid adsorbit la suprafaa unor particule de solid utilizate pentru a mpacheta coloana; faza mobil este trecut peste faza staionar nemiscibil; aceasta se numete eluie; solutul care are o mare afinitate fa de faza mobil se va mica prin coloan foarte ncet; componenii probei se vor separa n benzi discrete vizibile la detector, i rezult cromatograma.

2. Cromatografia TLC aluminaCromatografia plana cuprinde doua tehnici experimentale:- cromatografia pe strat subtire (TLC)- cromatografia pe hartien cromatografia TLC se folosesc drept faze stationare o serie de materiale pulverulente, dintre care cele mai utilizate sunt alumina si silicagelul. n masura mai mica se folosesc silicatul de magneziu, pamntul de diatomee, ct si o serie de alti adsorbenti: amidon, inulina, fosfat de calciu, carbonat de calciu, hidroxid de calciu. Acestea din urma se utilizeaza numai pentru cazuri speciale si deoarece se prezinta sub forma de pulberi fine trebuie amestecate cu pamnt de diatomee pentru a permite trecerea fazei mobile. Alumina se poate obtine n functie de temperatura de preparare si activare n mai multe forme. Daca activarea se face la temperatura mai mica de 700C se obtine alumina , n amestec cu alte forme. Daca activarea se face la o temperatura mai mare dect 1000C, se obtine alumina inactiva. Sorturile de alumina cromatografica au n general suprafete specifice cuprinse intre 100-200 m2/g. Diametrul particulelor sortimentelor comerciale de alumina este cuprins ntre 50-200 m (70-290 mesh). Aceste dimensiuni permit o asezare uniforma a umpluturii n coloana, atingerea unui debit rezonabil de faza mobila sub influenta doar a gravitatii si atingerea rapida a echilibrelor de distributie ale solutilor ntre adsorbent si faza mobila.Alumina normala contine si diferite cantitati de apa, fie provenita din forma hidratata a aluminei, fie sub forma de apa adsorbita. n ce priveste structura poroasa, s-a observat ca ea contine un sistem de macropori de forma cilindrica avnd un diametru de 27 , la care se adauga pori neregulati cu diametre mai mari. Activitatea de adsorbtie a aluminei depinde se sortimentul realizat. Exista trei forme de baza de alumina, bazica (pH 10), neutra (pH 7) si acida (pH 4) si este importanta folosirea tipului corect ntr-o anumita aplicatie din cauza unui posibil efect catalitic. Astfel, alumina bazica poate cataliza hidroliza unor esteri, iar cea acida dehidrogenarea unor alcooli, n special a celor tertiari. Activitatea tuturor celor trei forme de alumina este clasificata n cinci grade (scala Brockmann), pe baza continutului de apa. Gradul I, cel mai activ, se obtine prin activare la 300-400C timp de mai multe ore, iar celelalte grade prin adaugare de diverse proportii de apa, dupa racire: 3-4% (gradul II), 5-7% (gradul III), 9-11% (gradul IV), respectiv 15-19% (gradul V). Faptul ca gradul I este cel mai activ nseamna ca va retine cel mai puternic compusii polari.

3. Cromatografia TLC silicagelSilicagelul reprezinta adsorbentul cel mai mult utilizat. Ca structura chimica, este un produs de policondensare al acidului ortosilicic. Silicagelul cromatografic se obtine la pH 7, adica n forma neutra. Si acest adsorbent se poate obtine n diferite grade, n conformitate cu continutul sau de apa. Gradul I se obtine prin ncalzire la 250C timp de mai multe ore, iar celelalte prin adaugarea unor cantitati diferite de apa dupa racire: 5% (gradul II), 15% (gradul III), 25% (gradul IV) si 38% (gradul V). n cazul sortimentelor cu continut ridicat de apa se formeaza un film consistent de apa la suprafata adsorbentului, deci aceste separari pot fi considerate mai curnd pe baza de repartitie dect de adsorbtie.Pe suprafata silicagelului se gasesc o serie de grupari silanolice Si-OH. O parte dintre acestea se pot transforma n grupari siloxanice prin eliminarea apei. Suprafata specifica a silicagelului este cuprinsa ntre 200-800 m2/g. Se considera ca singurele centre de adsorbtie pe care le contine silicagelul sunt gruparile hidroxil de la suprafata. ntre aceste grupari si moleculele componentelor adsorbite se stabilesc legaturi de hidrogen, moleculele adsorbite avnd rol de donori de electroni. Exista trei tipuri de grupari silanolice superficiale: vicinale dar nelegate prin legaturi de hidrogen, legate si izolate (figura de mai jos). De asemenea, mai pot exista la suprafata silicagelului grupari silanolice hidratate. Daca temperatura de uscare depaseste 400C, se produce o sinterizare a particulelor, determinnd reducerea activitatii specifice si a capacitatii de adsorbtie.Asadar mecanismul adsorbtiei este diferit n cazul silicagelului fata de alumina, unde activitatea de adsorbtie nu se datoreste gruparilor hidroxilice superficiale ci unor interactiuni de natura electrostatica. Acest lucru s-a confirmat prin faptul ca n urma ncalzirii la temperatura ridicata, cnd are loc pierderea gruparilor hidroxilice superficiale, activitatea silicagelului scade iar cea a aluminei creste.Pentru obtinerea unui adsorbent de o anumita activitate reproductibila trebuie sa fie parcurse urmatoarele etape:- alegerea tipului de adsorbent;- ndepartarea apei prin ncalzire timp de 8-16 ore la aer (125-250C pentru silicagel, 200-400C pentru alumina);- adaugarea unei anumite cantitati de apa dupa racire, cu care se lasa timp de 8-16 ore pentru echilibrare.Din punct de vedere a aspectului, adsorbentii utilizati n cromatografia TLC se pot prezenta sub doua forme:- granule poroase neregulate, numite faze stationare poroase si sfere solide compacte acoperite cu un strat de adsorbent poros, care se numesc faze stationare superficial poroase sau peliculare.

4. Solventi utilizati in cromatografia TLC, serii eluotropeClasificarea solventilor n functie de taria legaturii lor cu adsorbentul se face n serii eluotrope, care pot fi utilizate pentru gasirea unui eluent cu o tarie potrivita pentru realizarea unei anumite separari. Este nsa indicat sa se faca si o testare a eluentului ales si acest lucru se poate face mai rapid prin cromatografie in strat subtire dect prin cromatografie pe coloana. Seria eluotropa reprezinta o serie de solventi cu putere de elutie crescatoare. n cazul adsorbentilor nepolari, taria eluentului se datoreste existentei unor interactiuni nespecifice de tip Van der Waals si creste aproximativ cu masa moleculara a eluentului. Astfel, pentru carbune activ, seria eluotropa n ordinea cresterii puterii de elutie este: apa, metanol, etanol, acetona, propanol, eter etilic, butanol, acetat de etil, hexan. n cazul adsorbentilor polari, taria eluentului creste odata cu polaritatea solventului, deci aproximativ invers dect la adsorbentii nepolari. Astfel, n cazul aluminei, seria eluotropa este data n tabelul urmtor:SolventulTaria relativa 0

Pentan0,0

Tetraclorura de carbon0,18

Toluen0,29

Benzen0,32

Cloroform0,40

Acetona 0,56

Dioxan0,56

Acetat de etil 0,58

Acetonitril0,65

Etanol0,88

Metanol 0,95

Exista serii eluotrope formate din amestecuri de mai multi solventi de polaritati diferite, care pot fi folosite pentru a realiza serii de eluenti de o anumita tarie.

5. Etapele parcurse n separarea cromatografic TLC Aplicarea probeiPentru a se putea demara procesul de eluie, n prealabil pe placa cu strat subire se aplic proba. Acest lucru se realizeaz cu seringi sau micro-pipete, dar i alte dispozitive specializate , astfel nct s se obin aliniate, pe linia de start , mai multe spoturi de probe, respectiv de amestecuri etalon - supuse simultan separrii. Deoarece probele se aplic din soluii diluate (1-2%), n anumii solveni, pentru a se evita interferena acestoran procesul de eluie, plcile se usuc nainte de introducerea n amestecul de solveni. Astfel se pot supune separrii probe care se concentreaz pe zone nguste (de lungime i limepreselectate) asigurndu-se o eficien mrit separrii. Migrarea eluentuluiAre loc sub aciunea forelor capilare i provoac migrarea difereniat a componentelor amestecului de separat. Acest lucru se realizeaz n urma simplei scufundri (manuale) a plcii cromatografice n eluentul potrivit. Din acest moment, eluentul irignd prin capilaritate stratul poros migreaz ascendent prin stratul subire, provocnd separarea. Timpul de separare variaz ntre 3 i 60 min.Pentru realizarea separrii (eluiei) se utilizeaz camere de developare. Formele preferate sunt cele paralelipipedice sau cilindrice (pahare), prevzute cu un capac i eventual cu un dispozitiv de fixare a plcii plane (hrtie sau strat subire) i pot fi saturate cu amestecul de solveni din tanc, pentru a se mri viteza de eluie. Camerele paralelipipedice (fig. N) se numesc camere de tip N (normale) iar cele subiri (fig. S) poart numele de camere de tip S (sandwich). Ultimele prezint avantajul unui volum mai redus al fazei gazoase avnd o vitez de saturare mai mare i o durat a procesului de separare cu ceva mai mic.Eluia are loc dup introducerea plcii n camera cromatografic, pn cnd amestecul de solveni atinge o nlime final, fixat de obicei ntre 5 i 18 cm, sau un anumit timp stabilit, n prealabil, prin ncercri preliminare. Solvenii utilizai se aleg n funcie de proprietile de eluie ale substanelor supuse separrii (analizei). Natura acestora depinde nu numai de substanele implicate dar i de mecanismul de separare propus, respectiv de faza staionar avut la dispoziie. Vizualizarea cromatogramelorDup eluie, placa se scoate, se usuc i dac spoturile nu se vd, se trece la vizualizarea acestora (operaie numit uneori revelare). Pentru aceasta, placa fie se scufund ntr-un reactiv, fie se pulverizeaz cu acesta sau se introduce ntr-o atmosfer coninnd gaze reactive i chiar ntr-o etuv, la cald, cnd spoturile devin vizibile n urma unor reacii chimice. Doar apoi se poate trece la etapa analizei propriu-zise. Reactivii de culoare pot fi generali, ca de exemplu acidul sulfuric la cald (120C), care determin carbonizarea majoritii substanelor organice, sau specifici, cnd acetia reacioneaz doar anumite substane sau funciuni organice.O alt variant de a face spoturile vizibile, preferat tot mai mult n ultimul timp, este folosirea unor straturi subiri fluorescente (spre exemplu materialul pulverulent conine ZnS - fluorescent). Prin examinarea cromatogramelor eluate i uscate n lumin UV, se vor observa spoturi nchise la culoare sau colorate, pe fond fluorescent - luminos. Atunci cnd chiar substanele separate sunt fluorescente nu mai este nevoie de fondul fluorescent i este suficient o plac obinuit, observat n lumin UV, spoturile devenind luminoase pe un fond ntunecat.O variant i mai modern, foarte eficace de vizualizare, folosind tot lumin UV, const n utilizarea unor plci cu straturi subiri coninnd amestecuri de luminofori. n acest caz plcile au o culoare compus (de regul lumina emannd din trei substane luminescente avnd culori diferite). Cum fiecare luminofor emite la o alt lungime de und, iar substanele separate absorb diferit lumina, fiecare component de pe plac va avea, n consecin, o alt culoare. n acest caz detecia este mai sigur pentru c nu difer doar poziia relativ a spotului respectiv pe plac ci i culoarea.

6. Analiza calitativa in cromatografia TLC Analiza calitativFiecare compus separat prin cromatografia planar este caracterizat (calitativ) de parametrul de retenie denumit Rf (o prescurtare de la termenul din l. engl.: retardation factor). Acesta se calculeaz astfel:Rf = (Distana parcurs de componentul dat, i)/(Distana parcurs de frontul solventului) Unde: xI, respectiv cu x0 = distanele parcurse de componentul dat, respectiv de frontul solventului, pn la oprirea cromatogramei.Comparndu-se valorile Rf ale spoturilor etaloanelor / standardelor cu cele ale substanelor din proba de analizat (lucru realizat de cele mai multe ori vizual) se spune c se face analiza calitativ. Aceasta este cea mai util aplicaie a acestor metode cromatografice. Se pot identifica pesticide din ape, sol dar i alte substane pentru scopuri tiinifice i tehnice cu o sensibilitate mult mai bun dect n eprubet.Tot n scopul realizrii analizei calitative se poate practica i cromatografia bidimensional. n aceast variant, se utilizeaz o plac ptrat, iar spotul (unul singur) se aplic ntr-unul dintre coluri, de exemplu: n dreapta-jos. Se elueaz cu un amestec de solveni 1, avnd loc o prim separare. Apoi, dup oprire se usuc placa. Se rotete placa cu 90 i se ncepe o nou irigare a acesteia folosind un alt amestec de solveni, 2. Doar apoi placa se vizualizeaz i se compar cu o plac etalon - pe care avem un amestec similar dar cunoscut.

7. Analiza cantitativa in cromatografia TLC Analiza cantitativ poate ncepe dup efectuarea separrii i vizualizrii sau prin executarea unei msurtori asupra unui parametru fizic (radioactivitate) proporional cu concentraia substanei din spotul de interes analitic. Metodele practicate pe scar larg sunt densitometria prin transmisie sau reflexie a spotului (spoturilor), respectiv mai recent scanarea. Densitometria se poate realiza n lumin vizibil sau UV, n ultimul caz fiind posibil i msurarea radiaiei de fluorescen. Semnalul msurat servete la construirea unei curbe de etalonare din semnalele msurate pentru diferitele spoturi, coninnd cantiticresctoare de component, aplicate, alturi de proba necunoscut, pe aceeai plac. Dup nregistrare, densitogramele se evalueaz cantitativ, fie prin msurarea nlimii picurilor, fie a suprafeei acestora. Oricare dintre mrimile msurate poate constitui semnalul analitic. Trasarea graficului semnal analitic n funcie de cantitatea de substan din spot, duce la o curb de etalonare. n cazul determinrilor de fluorescen acest grafic este liniar.Metoda PC este simpl i ieftin dar, ca precizie i exactitate, este adesea inferioarHPLC. n calitate de metod semicantitativ, PC este o metod competitiv i n lipsa uneiaparaturi performante (de exemplu HPLC) rmne uneori singura alternativ. O analiz semicantitativ poate rspunde la ntrebarea: Este prezent specia X ntr-o concentraie mai mare dect o concentraie limit, C? De foarte multe ori rspunsul la aceast ntrebare este suficient n practica curent. Dar pentru monitorizarea automat a coninutului de poluani din ape sau sol, pentru expertize sau pentru controlul alimentelor, doar metoda PC nu este suficient.

8. Etapele parcurse in cromatografia lichid-solid clasica pe coloana- umplerea si pregatirea coloanei;- ncarcarea probei;- elutia componentelor probei- detectarea componentelor separateUmplerea coloanei se poate face prin doua tehnici: uscata si umeda. Tehnica umplerii uscate se utilizeaza mai puin, deoarece necesita cantitati mai mari de adsorbent. Pentru a realiza separari cu o coloana umpluta prin tehnica umeda, este necesara o cantitate de adsorbent de 20-50 de ori mai mare fata de cantitatea de proba care va fi supusa separarii. Daca componentele separate au polaritate apropiata, acest raport trebuie marit la 100-200. Diametrul particulelor de adsorbent utilizate n separarile LSC este cuprins ntre 0,05-0,5 mm. Particule mai mici duc la o viteza de curgere mult prea redusa prin coloana, n timp ce particule mai mari determina o separare necorespunzatoare. Viteza optima de elutie depinde de multi factori, cum este natura si diametrul particulelor de adsorbent, lungimea coloanei si natura compusilor care trebuie separati. Pentru a realiza umplerea prin tehnica umeda, se realizeaza o suspensie de o parte adsorbent la cinci parti faza mobila si aceasta suspensie este introdusa n coloana. Coloana trebuie sa fie uscata si sa aiba n partea inferioara un opritor din sticla sinterizata, vata de sticla sau nisip, ct si un robinet pentru se a putea regla debitul de elutie. n timpul umplerii coloana trebuie sa se gaseasca n pozitie verticala, iar introducerea suspensiei este dirijata cu ajutorul unei baghete de sticla pentru ca asezarea ei n coloana sa fie uniforma. Dupa introducerea primei portiuni de suspensie, se deschide robinetul pentru evacuarea solventului cu viteza mica si numai dupa aceea se adauga urmatoare portiune. Aceasta adaugare trebuie efectuata nainte ca portiunea precedenta sa se fi asezat complet, altfel umplutura se va aseza n straturi. De asemenea, nu este permis ca nivelul lichidului sa scada sub nivelul stratului de adsorbent, acesta trebuind sa se gaseasca permanent n lichid. Dupa umplere, coloana nu are voie sa prezinte goluri, canale, crapaturi sau alte neuniformitati. Dupa terminarea umplerii, peste partea superioara a stratului de adsorbent se pune n general un disc de htrie de filtru cu diametrul egal cu diametrul interior al coloanei sau un strat de nisip de 0,5 cm grosime, pentru a preveni dislocarea sa n momentul introducerii probei. Apoi se scurge solventul din coloana pna cnd nivelul lichidului ajunge chiar deasupra nivelului umpluturii. n acest moment coloana este pregatita pentru utilizare.Introducerea probei se face prin aplicarea ei n partea superioara a coloanei, cel mai bine cu ajutorul unei pipete Pasteur. Proba trebuie sa se gaseasca ntr-un volum minim de solvent, de preferinta acelasi cu cel folosit pentru eluare. Pentru o coloana de 40 cm lungime si 2 cm diametru volumul ideal de solutie de proba este de 1-2 ml. Dupa aplicarea probei se deschide robinetul de la partea inferioara a coloanei si proba este lasata sa intre complet n adsorbent. Apoi cu un volum ct mai mic de solvent se spala peretii coloanei si aceasta portiune de solvent este de asemenea lasata sa intre n adsorbent. Intrarea completa a probei n stratul de adsorbent nainte de nceperea elutiei este necesara pentru a preveni diluarea probei. Apoi coloana se umple complet cu eluent si n partea sa superioara se ataseaza rezervorul de eluent. Dupa nceperea eluarii, fluxul de solvent prin coloana nu mai este permis sa fie oprit, deoarece ar duce la dispersia excesiva a componentelor.Uneori proba nu este complet solubila n solventul sau amestecul de solventi folosit pentru eluare, dar se dizolva ntr-un solvent mai polar. Nu este permisa introducerea unei probe incomplet dizolvate, dar nici dizolvate ntr-un alt solvent mai polar, deoarece ar duce la separari necorespunzatoare. n aceste situatii se recomanda dizolvarea probei n solventul mai polar, adaugarea la aceasta solutie a unei cantitati de adsorbent de 2-10 ori mai mare dect greutatea probei si evaporarea solventului (la un evaporator rotativ) astfel ca proba sa ramna adsorbita. Acest material se introduce apoi n partea superioara a coloanei si va fi desorbita n timpul trecerii eluentului.Eluia componentelor se poate realiza n trei moduri:- Elutie izocratica, cu un singur eluent sau cu un amestec de eluenti de compozitie constanta;- Elutie n trepte, utiliznd o serie eluotropa de solventi cu putere de elutie crescatoare sau o serie eluotropa de amestecuri de doi solventi, avnd n general valori 0 apropiate, pentru separari mai fine.- Elutie cu gradient, utiliznd un amestec de doi solventi a carui compozitie este modificata continuu n timpul elutiei.n cazul n care adsorbentul este polar, alumina sau silicagel, componentele nepolare vor avea o interctiune mai slaba cu adsorbentul si vor elua primele. Elutia izocratica este recomandata mai ales atunci cnd se urmareste separarea unei componente nepolare dintr-un amestec cu altele mai polare. n acest caz se foloseste un eluent cu polaritate apropiata de cea a componentei urmarite, care va elua doar compusul respectiv, ceilalti compusi, mai polari, ramnnd adsorbiti n partea superioara a coloanei. Daca dupa eluarea componentei sau componentelor mai putin polare vrem sa eluam si componentele mai polare, avem nevoie de un eluent cu tarie mai mare. O asemenea elutie se poate face n trepte, folosind o serie eluotropa de polaritate crescatoare. Nu se recomanda o variatie prea brusca a compozitiei fazei mobile, mai ales daca se face o trecere de la solventi aprotici la solventi protici. Astfel, daca se face trecerea de la pentan la toluen, aceasta se face secvential cu amestecuri de 10%, 50% si 70% toluen n pentan, iar n cazul trecerii de la acetona la metanol numarul treptelor trebuie sa fie mai mare, de exemplu 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 70 si n final 100% metanol.Eluarea cu gradient este utilizata atunci cnd se urmareste schimbarea compozitiei eluentului ntr-o maniera constanta si uniforma, nu abrupta dect n cazul elutiei n trepte.Regula cea mai importanta n cromatografia de adsorbtie lichid-solid este ca polaritatea (taria) fazei mobile este fie mentinuta constanta n timpul analizei (n cazul elutiei izocratice) fie este crescatoare, dar niciodata ea nu este descrescatoare.Detectarea componentelor separate n coloana se poate face prin diferite metode. Pentru aceasta, se colecteaza n general fractiuni de volume egale, manual sau utiliznd un colector de fractiuni. Aceste fractiuni se analizeaza prin cromatografie n strat subtire, cromatografie de gaze sau spectrofotometrie n UV, apoi fractiunile cu compozitie identica se reunesc si se supun evaporarii pentru indepartarea solventului. Aceasta evaporare se face n general la un evaporator rotativ de vid. Exista si posibilitatea utilizarii unor detectoare UV-VIS automate care se conecteaza la iesirea din coloana si permit monitorizarea componentelor eluate, cu conditia ca acestea sa absoarba n domeniul UV sau vizibil, iar eluentul utilizat sa nu aiba absorbtie.

9. Coloanele cromatografice HPLCn mod obisnuit, coloanele cromatografice utilizate n analizele HPLC sunt confectionate din otel inoxidabil, au lungimea cuprinsa ntre 10-30 cm si diametrul interior de 4 sau 5 mm. Pentru retinerea fazei stationare n coloana, la capetele acesteia se gasesc doua frite din otel inoxidabil cu ochiuri de 2 m sau mai putin. Umpluturile folosite in cromatografia de lichide moderna au dimensiuni mici, sunt rigide si uniforme. Ele pot fi clasificate n urmatoarele categorii:- Particule polimerice pe baza de copolimer stiren-divinilbenzen. Acestea se folosesc pentru cromatografia de schimb ionic si cromatografia de excluziune sterica, nsa au fost nlocuite pentru o serie de aplicatii de umpluturi pe baza de silicagel care sunt mai eficiente si mai stabile mecanic.- Particule superficial poroase (peliculare), cu diametrul cuprins ntre 30-55 m, care constau dintr-un nvelis subtire (1-3 m) de silicagel, dispus pe un nucleu dintr-un material inert, de exemplu granule sferice de sticla. Asemenea umpluturi peliculare se mai folosesc n anumite aplicatii de cromatografie de schimb ionic, nsa utilizarea lor a nregistrat un puternic regres odata cu dezvoltarea umputurilor total poroase.- Particule total poroase de silicagel, cu diametre mai mici dect 10 m care sunt cele mai folosite la ora actuala pentru coloanele analitice HPLC. Comparativ cu umpluturile peliculare, ele ofera o serie de avantaje n ce priveste eficienta coloanei, capacitatea de ncarcare cu proba si viteza analizei.Dezvoltarea fazelor stationare chimic legate a avut de asemenea o mare importanta pentru pentru cromatografia lichid-lichid pe coloane de silicagel. n general se prefera achizitionarea unor coloane gata umplute de la firmele de specialitate, avnd caracteristici definite n cataloagele acestor firme. Lungimea coloanelor este standardizata, fiind de 300, 250, 150, 100 si 75 mm. Coloanele mai lungi vor avea un numar mai mare de talere teoretice, ele fiind considerate standard. Coloanele mai scurte au avantajul unei viteze de separare mai mari si a unui timp de analiza mai redus.Diametrul standard al umpluturilor folosite n HPLC este de 5 m. Umpluturile mai fine sunt mai eficiente (reducerea la jumatate a diametrului particulelor determina dublarea eficientei de separare), nsa mai scumpe. Se fabrica o gama larga de coloane analitice, avnd diametrele interioare cuprinse n intervalul de la 4,6 mm la mai putin de 0,2 mm. Coloanele preparative au diametrul mai mare de 50 mm. n principiu, cu ct diametrul coloanei este mai mare, ncarcarea cu proba va fi mai mare, deci se va putea injecta o cantitate mai mare de proba. Pe de alta parte, exista o serie de elemente care fac coloanele mai nguste mai atractive pentru separarile analitice. Astfel, coloanele mai nguste vor necesita un consum mai mic de solvent, determinnd economii importante. Un alt avantaj important este ca picul solutului va elua ntr-un volum mai mic si ntruct raspunsul majoritatii detectoarelor depinde de concentratie rezulta ca naltimea picului va fi mai mare iar limita de detectie va fi redusa. Aceste avantaje au dus la dezvoltarea unor coloane capilare cu diametrul interior redus pna la 0,1 mm, nsa folosirea acestora creeaza o serie de alte probleme, cum ar fi cele generate de necesitatea de a lucra cu debite foarte mici de faza mobila sau de a reduce foarte mult volumele moarte, de exemplu cele care apar la conexiunea dintre diferitele componente ale aparatului. n general, pentru coloanele nguste cu diametre ntre 2 si 0,5 mm se foloseste termenul microbore, n timp ce coloanele cu diametre mai mici dect 0,5 mm sunt denumite microcoloane. Microcolanele, la rndul lor, se submpart n coloane capilare umplute (diametre ntre 0,04-0,3 mm) si coloane capilare deschise, cu diametre ntre 3-50 m. Acestea din urma sunt construite din sticla speciala si din punct de vedere constructiv sunt similare cu coloanele capilare folosite n cromatografia de gaze. Desi folosirea lor necesita o aparatura speciala n ce priveste constructia pompei si a detectorului, care sa opereze la debite de faza mobila foarte mici, de pna la 1l/min, ele permit realizarea unor separari cu o eficienta mai mare de 100.000 talere teoretice ntr-un timp de analiza mai mic de 30 de minute, cu un consum foarte scazut de faza mobila.Pentru cresterea duratei de utilizare a unei coloane de analiza HPLC se recomanda introducerea unei coloane de protectie (precoloana, guard column). Aceasta este o coloana mica ce se amplaseaza ntre injector si coloana analitica si previne pierderea eficientei coloanei analitice datorita prezentei anumitor impuritati prezente n proba sau solvent, de exemplu a celor care se adsorb foarte puternic. Un alt rol posibil al acestei coloane este de a satura solventul cu faza stationara si a preveni astfel antrenarea fazei stationare din coloana analitica. Coloanele de protectie sunt umplute cu faza stationara microporoasa sau peliculara. Cele peliculare sunt mai usoare de manipulat la umplere nsa trebuie schimbate mai frecvent deoarece capacitatea lor de retinere este mai scazuta.

10. Sistemul de alimentare cu faza mobila in cromatografia HPLCCuprinde urmatoarele dispozitive, care pot fi asamblate n diferite configuratii:- rezervoarele de solventi;- dispozitivul pentru degazarea solventilor;- dispozitivul pentru realizarea gradientului de solventi. Dispozitivul pentru degazare este necesar pentru ndepartarea din solventi a gazelor dizolvate, mai ales a oxigenului, care n timpul trecerii prin coloana ar putea reactiona cu faza stationara, sau ar putea forma bule de gaz cu influenta nefavorabila att asupra separarii ct mai ales a detectiei, tinnd cont de volumul foarte mic al celulelor detectoarelor moderne. Degazarea se realizeaza n doua moduri:- prin barbotare de heliu n rezervorul de solvent;- prin trecerea solventului printr-o unitate de degazare cu vid, unitate prevazuta cu o tubulatura de teflon care permite difuzarea prin pereti a gazelor prezente n solvent, dar nu si a moleculelor solventului. Dispozitivul pentru alimentarea cu solventi poate fi foarte diferit ca si complexitate, de la un simplu rezervor de solventi n cazul elutiei izocratice pna la un programator de eluent pentru doi sau trei solventi. Prin elutia cu gradient de solvent se poate realiza separarea componentelor care nu se separa prin elutie izocratica. Este foarte eficienta mai ales daca polaritatea componentelor analizate difera foarte mult. Multe cromatografe de lichide moderne poseda sisteme pentru vehicularea solventilor care pot amesteca doi sau mai multi solventi, progresiv, ntr-un raport cuprins ntre 0 si 100% pentru oricare solvent. Se obtine o diagrama de compozitie n functie de timp care poate avea forma liniara, convexa sau concava. Programerea compozitiei eluentului ndeplineste acelasi rol in cromatografia de lichide ca programarea de temperatura n cromatografia de gaze, permitnd separarea picurilor neseparate corespunzator, fara a afecta rezolutia celorlalte picuri. Gasirea programului optim necesita timp si elutia cu gradient poate avea si anumite inconveniente. De exemplu, este nevoie de un timp la sfrsitul fiecarei analize pentru a reveni la compozitia initiala a eluentului, iar daca unul din solventi are un semnal mai puternic n detector dect ceilalti, se va nregistra o deriva a liniei de baza (drift). Din acest motiv, pentru separarea unor amestecuri mai simple, se prefera elutia izocratica desi timpul de analiza este mai mare, nsa nu se mai consuma timp pentru gasirea programului ideal pentru elutia cu gradient.Avantajul acestui sistem de gradient este ca se foloseste o singura pompa, desi pna la urma sistemul de programare cu ventile de proportionare este aproape tot asa de complicat si de scump ca si utilizarea unei a doua pompe.Sistemul cu gradient de nalta presiune, care opereaza cu cte o pompa pentru fiecare solvent. n general, aceste pompe sunt deservite de motoare pas cu pas, iar debitul pompei este controlat de frecventa de alimentare a motorului respectiv. Acest sistem este mai scump dect celalat, nsa reproductibilitatea rezultatelor este mai buna.

11. Pompele HPLCPompa este considerat una dintre cele mai importante componente ale HPLC deoarece permite realizarea unui debit constant al eluentului prin ntreg sistemul: injector, coloan, detector mrind deosebit de mult viteza separrii. ntr-un cromatograf de lichide pot exista una sau mai multe pompe, fiecare furniznd opresiune care poate atinge 20mii kPa (cca. 200atm). Presiunea deosebit este necesar deoarece coloana are o umplutur de finee mare i, n lipsa presiunii, debitul ar fi nepractic de mic.Exist n uz dou tipuri principale de pompe, clasificate astfel n funcie de debit: pompe cu presiune constant (i debit variabil) n umite i pompe pneumatice i pompe cu debit constant numite i pompe mecanice. Pompele cu presiune constant sunt mai simple (a se citi ieftine) i nu prezint pulsaii n funcionare (care nu ar permite obinerea unei linii de baz netede). Acestea, prezint dezavantajul c debitul trebuie frecvent modificat pentru a se menine ct mai constant, ceea ce la separri de durat pune probleme, deoarece prin obturarea coloanelor debitul se modific continuu. Se nelege c orice modificare de debit (datorit viscozitii sau temperaturii eluentului i a structurii umpluturii) afecteaz timpul de retenie i totodat semnalul detectorilor, n majoritate sensibili la concentraie.

12. Dispozitivele pentru injectarea probei in cromatografia HPLCIntroducerea probelor poate fi realizata n doua moduri: prin injectie cu ajutorul unei seringi sau prin folosirea unei valve (robinet) de injectie cu mai multe canale. Injectia cu seringi se aplica mult mai putin dect n cromatografia de gaze pentru ca ea necesita seringi rezistente la presiune ridicata si un septum construit dintr-un material care sa nu permita extragerea unor compusi de catre faza mobila, care sa dea nastere unor picuri-fantoma.Valvele de injectie permit introducerea reproductibila a probelor n coloanele cromatografice aflate sub presiune, fara ntreruperea curgerii fazei mobile. Proba este incarcata la presiune atmosferica ntr-o bucla exterioara a valvei de injectie si este apoi introdusa n faza mobila printr-o simpla rotire a valvei. Volumul de proba introdusa variaza ntre 2l si mai mult de 100 l si poate fi modificat prin schimbarea buclei de injectie sau folosind valve speciale cu volum variabil de proba. Pentru analize n serie se recomanda folosirea unor dispozitive de introducere automata a probelor.

13. Prezentarea generala a detectorilor utilizati in cromatografia HPLCFuncia detectorului este de a monitoriza faza mobila pe masura ce ea iese din coloana. Clasificarea detectorilor se poate face n doua categorii:- Detectori care msoar modificarea unei proprietati fizice a efluentului coloanei. Asemenea detectori nregistreaza modificarea unei proprietati fizice a fazei lichide constituite din eluent si componenta separata n coloana comparativ cu eluentul, de exemplu detectoarele de indice de refractie sau de conductivitate. Desi au o aplicabilitate destul de larga, au sensibilitate scazuta si sunt afectai de schimbarea compozitiei fazei mobile, deci nu pot fi folosite daca elutia se face cu gradient.- Detectori care msoar modificarea unei proprietati a solutului. Din aceasta categorie fac parte detectorii spectrofotometrici, cu fluorescen si electrochimici. Au proprietatea de a raspunde la o proprietate fizica caracteristica numai solutului si n principiu sunt independeni de eluent. Au sensibilitate ridicata si un domeniu larg de raspuns liniar, dar datorita specificitatii lor n general este nevoie de mai mult dect un detector pentru a realiza o analiza mai complexa. Principalele cerinte pe care trebuie sa le ndeplineasca un detector sunt n buna masura identice cu cerintele pentru detectoarele folosite n cromatografia de gaze:- Sensibilitate ridicata- Domeniu de raspuns liniar ct mai extins- Raspunsul detectorului sa depinda ct mai putin de conditiile de lucru: temperatura si debitul fazei mobile.La ora actuala exista un mare numar de detectori utilizai n cromatografia de lichide. Exista peste 30 de tipuri de detectori, cei mai numeroi fiind cele spectrofotometrici, urmai de cei electrochimici. Un aspect important la alegerea detectoarelor este compatibilatatea lor cu colanele nguste sau cele capilare, deorece acestea impun anumite conditii pentru utilizarea detectoarelor. mai importani, mpreuna cu caracteristicile lor, sunt prezentate n tabelul urmator.14. Detectori UV-Vis utilizati in cromatografia HPLCDetectorul spectofotometric UV-VISSe bazeaza pe masurarea transmitantei celulei de masura atunci cnd aceasta este strabatuta de eluentul care contine componentele separate n coloana cromatografica. Conditia necesara este ca aceste componente sa aiba absorbtie suficient de mare n domeniul spectral n care functioneaza detectorul, iar eluentul sa fie transparent n domeniul respectiv. Detectoarele spectrofotometrice n UV-VIS se pot utiliza pentru analiza compusilor aromatici si a celor care poseda legaturi conjugate: olefine, compusi carbonilici, derivati azoici, nitroderivati, dar si a proteinelor, enzimelor, acizilor nucleici si steroizilor. Ele se pot folosi n elutia cu gradient si sunt aproape insensibile la variatiile de flux date de pulsatiile provocate de pompe. Dezavantajul lor major, alaturi de acela ca substantele analizate trebuie sa absoarba n UV sau vizibil, este ca solventii utilizati trebuie sa fie de puritate deosebita, pentru ca absorbtia lor n UV sa fie nula. Lipsa de absorbtie a solventului este o conditie esentiala mai ales n cazul elutiei cu gradient, deorece nerespectarea acestei conditii ar duce la o deviere continua a liniei de baza. n aceste circumstante, detectorul spectrofotometric poate fi considerat un detector cu raspuns la modificarea proprietatilor solutului. Detectorul spectrofotometric n UV-VIS este caracterizat de sensibilitate ridicata, limita detectie fiind 110-9 g/ml pentru compusii cu absorbtie puternica si este relativ putin sensibil la variatiile de temperatura si debit ale fazei mobile.Trebuie mentionat faptul ca aceste detectoare se pot utiliza si n cazul substantelor care nu prezinta absorbtie sau au absorbtie slaba n domeniul de lungimi de unda al detectorului, daca ele se pot transforma n derivati care sa aiba o asemenea absorbtie. Acest lucru se face prin procedeul numit derivatizare postcoloana, n care efluentului coloanei i se adauga un reactiv corespunzator si reactia de derivatizare are loc nainte ca efluentul sa ajunga n detector. Astfel unii aminoacizi, care nu prezinta dect o absorbtie slaba n UV datorata gruparii carbonilice, se pot detecta mult mai usor dupa transformarea n derivati colorati prin reactie cu ninhidrina. Exista trei tipuri de detectoare n UV-VIS:- Detectorul cu lungime de unda fixa- Detectorul cu lungime de unda variabila- Detectorul cu sir de diode.Detectorul cu sir de diode utilizeaza o lampa de deuteriu sau de xenon care emite pe tot domeniul spectrului de UV. Lumina acestei lampi este focalizata cu ajutorul unui sistem de lentile prin celula de masura si apoi ajunge pe o retea de difractie (Figura). Lumina dispersata de aceasta retea cade pe un sir de diode. Fiecare dioda masoara cte o banda ngusta a spectrului (aproximativ 2 nm), iar masuratoarea are loc ntr-un timp extrem de scurt (mai putin de 10 milisecunde). Astfel, practic la interval de milisecunde se obtine cte un spectru UV. Utilizarea acestui detector are urmatoarele avantaje importante:- Se obtin spectrele tuturor componentelor separate, care pot fi utilizate pentru identificarea calitativa a acestora.- Prin alegerea unei anumite lungimi de unda se obtine cromatograma n care apar doar compusii care absorb la lungimea de unda respectiva.Rezultatele unei asemenea analize pot fi prezentate sub forma unor grafice tridimensionale absorbanta-timp-lungime de unda. Sensibilitatea detectoarelor cu sir de diode ajunge la 1,510-7 g/ml.

15. Detectori cu fluorescenta utilizati in cromatografia HPLCEste probabil cel mai sensibil detector folosit in cromatografia de lichide, cantitatea minima detectabila fiind de pna la 100 de ori mai mica dect n cazul detectoarelor UV-VIS. El poate detecta compusii care prezinta fluorescenta sau pe aceia care pot fi transformati n compusi flourescenti. Prin fluorescenta se ntelege proprietatea unor molecule de a emite o radiatie n momentul n care au atins o stare electronica excitata n urma absorbtiei unei radiatii. Un proces de fluorescenta cuprinde doua etape. n prima etapa, absorbtia unui foton determina trecerea moleculei respective ntr-o stare electronica excitata. Revenirea ntr-o stare energetica stabila are loc de asemenea prin emisia unui foton, adica prin ceea ce este numit fluorescenta. Energiile fotonilor absorbiti, respectiv emisi pot varia n functie de nivelele energetice ntre care are loc tranzitia. n general, emisia se face la lungimi de unda mai mari (adica energii mai mici) dect excitatia. Intensitatea fluorescentei este proportionala cu concentratia compusului respectiv. Numarul compusilor care manifesta proprietatea de fluorescenta naturala este destul de redus, n aceasta categorie ntrnd compusii aromatici, mai ales cei polinucleari condensati. O serie de compusi care nu manifesta fluorescenta naturala pot fi nsa transformati n derivati fluorescenti. Aceasta transformare se poate face naintea separarii cromatografice, numindu-se derivatizare precoloana, sau dupa separarea cromatografica, adica prin derivatizare postcoloana. Derivatizarea precoloana prezinta avantajele ca se pot alege conditiile de reactie pentru derivatizare fara a se tine cont de sistemul de eluent, se poate elimina fara probleme excesul de reactiv de derivatizare, iar n unele cazuri selectivitatea separarii cromatografice pentru compusul derivatizat este mai mare dect pentru cel nederivatizat. De asemenea, nu reprezinta un impediment daca reactia de derivatizare are loc mai lent. Avantajul principal al derivatizarii postcoloana este ca se poate realiza automat, prin dozarea reactivului de derivatizare n efluentul coloanei, fara a fi necesara efectuarea acestei reactii n afara sistemului cromatografic.Reactivul de derivatizare cel mai mult folosit este clorura de dansil (5-dimetil-amino-naftalin-1-sulfoclorura). Acest reactiv se poate utiliza si n cromatografia n strat subtire, de exemplu pentru analiza aminoacizilor, sau n cromatografia HPLC pentru analiza compusilor farmaceutici. Un alt reactiv de fluorescenta utilizat este dansil-hidrazina, care s-a utilizat cu succes pentru analiza aldehidelor si cetonelor.Lampa de UV care emite radiatia de excitatie este n general o lampa de mercur de presiune redusa care emite la 253,4 nm. O serie de substante fluorescente sunt excitate de lumina emisa la aceasta lungime de unda. Radiatia este dirijata cu ajutorul unor lentile prin celula de masura, iar radiatia fluorescenta emisa este focalizata cu ajutorul altor lentile pe o fotocelula.Exista detectoare de constructie mai complexa, care permit detectarea selectiva a radiatiei fluorescente de o anumita lungime de unda, sau chiar obtinerea unui spectru de fluorescenta al substantei respective.16. Principalele caracteristici ale unei cromatograme HPLCCromatograma - reprezinta rezultatul unei separari cromatograme si este generata de procesul de detectare a analiilor, in ordinea elutiei acestora (figura). Cromatograma reprezinta deci o dependen functional, reprezentabila intr-un sistem bidimensional de coordonate. Pe abscisa este reprezentat timpul scurs din momentul injectiei probei in sistemul cromatografic si pana in momentul elutiei ultimei specii de analiti (cea mai puternica retinuta in faza stationara). Pe ordonata se va reprezenta proprietatea masurata.O cromatogram: ilustreaz rspunsul detectorului la un compus de analizat din prob la ieirea acestuia din coloan ca funcie de timp sau de volum de faz mobil adugat; este util att pentru determinrile cantitative ct i calitative; furnizeaz o serie de picuri, unde aria de sub picuri furnizeaz informaia cantitativ despre cantitatea de component iar poziia picului servete pentru identificarea compusului din prob;

17. Clasificarea metodelor de separare HPLC in functie de mecanismul de separareIn functie de mecanismul de separare, principalele tipuri de cromatografie de lichide sunt:- cromatografia de adsorbtie lichid-solid (LSC)- cromatografia de repartitie lichid-lichid (LLC)- cromatografia ionica (IC)- cromatografia prin excluziune (SEC)

18. Cromatografia HPLC in faza normala (NP-HPLC)Cea mai important faz staionar n cromatografia de lichide n faz normal este silicagelul (SiO2). Acesta este considerat un adsorbant foarte polar, datorit gruprilor silanol reziduale din matricea sa. Silicagelul (SiO2) este considerat materialul cel mai important utilizat ca faz staionar. Acesta a devenit, n ultimii 20 de ani, doar suportul adevratelor faze fazele chimic legate - ceea ce nu schimb importana sa. Silicagelul s-a obinut la nceput n form granular, neregulat, apoi n form sferic. Fazele staionare polare legate sunt derivate din silicagel; acestea conin grupri funcionale polare X, precum hidroxil, nitro, cian, sau amino, legate printr-un lan hidrocarbonat scurt R.Dintre acestea, aminopropil-silicagelul sau dihidroxipropil-silicagelul sunt cele mai utilizate faze staionare legate n separrile LC prin acest mecanism.

19. Cromatografia HPLC in faza inversa (RP-HPLC)In cromatografia de lichide n faz invers (RP-LC) fazele staionare sunt hidrofobe. Acestea se pot obine prin modificarea chimic a silicagelului (sau chiar aluminei) sau pot fi de natur polimeric. De aceea, aceste faze staionare se mai numesc i faze chimic legate (bonded phases). Principiul de sintez a fazelor chimic legate se bazeaz pe reacia gruprilor silanol reziduale din matricea silicagelului tratat termic cu un agent de silanizare. In figura urmtoare, prin reacia de derivatizare, n una din cele dou modaliti menionate, s-a introdus radicalul hidrocarbonat octadecil legat de matricea silicagelului. In funcie de natura radicalului R grefat prin intermediul reactivului de derivatizare de tip silanic se disting urmtoarele faze staionare (redate n ordinea descresctoare a hidrofobicitii lor):Fazele staionare modificate din silicagel au o mare aplicabilitate n cromatografiade lichide, dar prezint i unele inconveniente. Dou dintre inconvenientele cele mai serioase ale acestor faze staionare sunt:- domeniul de pH al componentei apoase utilizate este relativ restrns (2-8); la pH-uri sub 2 are loc hidroliza gruprilor O-Si(CH3)2-R, iar la pH-uri mai mari de 8 are loc dizolvarea silicagelului;- acestea nu pot fi utilizate n separri cromatografice pentru concentraii ale componentei apoase n faza mobil apropiate de 100%. In acest caz lanurile hidrocarbonate legate de structura silicagelului colapseaz, ele neputnd a reveni la conformaia iniial dup utilizarea de faze mobile total sau aproape total apoase (mai mari de 98%).

20. Cromatografia de schimb ionicCromatografia ionic (de schimb ionic), care se petrece pe o faz staionar solid, poroas, format din materiale specifice - schimbtorii de ioni - substane cu o reea solid afnat, de natur organic sau anorganic, pe care se gsesc grefate, prin procesul de obinere, nite centre de schimb ionic. Cele mai rspndite sunt rinile schimbtoare de ioni - organice - la care scheletul-suport este unul organic - un polimer poros. Pe aceste centre are loc o reacie ionic sau o interaciune ntre substana din soluie (electrolit sau neelectrolit) i funciunea legat chimic de suportul solid, numit reacie de schimb ionic.Dac pe o coloan umplut cu un cationit se introduce un amestec de doi ioni, s zicem cel format din sodiu i potasiu, acetia vor fi fixai pe rin, elibernd o cantitate echivalent de ioni hidroniu. Fenomenul chimic care are loc se poate scrie: Pompnd un eluent prin coloan, de exemplu o soluie diluat de acid clorhidric, ionii H+ din acid, fiind n concentraie mai mare, vor deplasa ionii fixai, prin echilibre ionice similare spre o poriune inferioar, iar acetia se vor putea fixa din nou, puin mai jos, pe alte centre de schimb din coloan.Procesul se repet ionii migrnd de sus n jos prin coloan. Deoarece gruprile funcionale -SO3 - au o afinitate ceva mai mare pentru ionii de potasiu dect fa de cei de sodiu, primul grup de ioni (sau prima zon) care va iei din coloan va fi cel format din ionii de sodiu i abia dup un timp va iei grupul coninnd ionii de potasiu. Astfel se realizeaz separarea celor doi ioni.La ieirea din coloan compuii sunt detectai cu ajutorul unui detector conductometric (se mai pot utiliza i alte tipuri de detectori cum ar fi cei amperometrici sau voltametrici).Una din cele mai importante aplicaii este analiza speciilor anorganice, cum ar fi analiza cationilor i anionilor din ape, soluii sau fluide biologice dar i pentru analiza unor poluani (cum ar fi ionul NH4 + din apele naturale). Alte aplicaii imediate sunt analiza bilor de galvanizare sau a lichidelor de natur apoas coninnd sruri: sucuri de fructe, fluide industriale, alimente etc. Metoda permite i analiza unor specii organice polare cum ar fi acizii sau aminele, aminoacizii i proteinele.Cromatografia prin schimb ionic n cazul amestecurilor complexe de proteine presupune utilizarea de grupri schimbtoare de ioni ataate pe un suport solid inert (silicai sau polistiren). Schimbul de ioni se bazeaz pe echilibrul ionic ntre amestecul tampon utilizat ca faz mobil. moleculele amestecului de separat i ionii fazei staionare. n funcie de natura lor proteinele prezint o afinitate mai mare sau mai mic fa de ionul schimbtor, pe baza acestei afiniti diferite realizndu-se de fapt separarea lor. De exemplu dac utilizm o faz staionar de tip celuloz bazic putem fraciona/separa uor proteinele acide i neutre n timp ce pe celuloza acid le separm pe cele bazice. n urmtorul tabel sunt prezentate diverse tipuri de faze staionare utilizate n astfel de separri:

Denumirea fazeiNatura chimicGruparea ionizat

Dowex 1Polistiren bazic-CH2-N+(CH3)3

Dowex 50Polistiren acid- SO3H

DEAE celulozaBazicDietilaminoetil

ECTEOLA celulozaBazicAmine

CM celulozaAcidCarboximetil

DEAE SephadexDextran gel bazicDietilaminoetil

CM SephadexDextran gel acidCarboximetil

21. Cromatografia de excluziune (gel filtrare)Cromatografia de excluziune se desfoar pe faze staionare poroase dar cu porozitatea selecionat astfel nct s corespund dimensiunilor moleculelor supuse separrii. O parte dintre molecule intr prin pori, reuind s interacioneze cu suportul solid, prin fore de adsorbie foarte slabe, iar altele sunt excluse deplasndu-se practic nereinute odat cu faza mobil. Se obine astfel un soi de sit la scar molecular separarea moleculelor fcndu-se n funcie de dimensiune. Tehnica se mai ntlnete i sub denumirea de filtrare prin geluri sau permeaie prin geluri n funcie de natura apoas sau organic a fazei mobile.Cromatografia prin gel filtrare este utilizat frecvent n analiza proteinelor. Soluii apoase de proteine sunt trecute pe aceste coloane. Separarea are loc pe baza excluderii moleculelor cu dimensiuni mai mari dect a porilor i acceptarea pe suportul solid doar a moleculelor mici, ce pot ptrunde n interiorul porilor. n urmtorul tabel sunt prezentate diverse tipuri de faze staionare utilizate n astfel de separri:Denumirea fazeiNatura chimicDimensiune (kD)

Sephadex G-10Sephadex G-25Sephadex G-50Sephadex G-100DextranDextranDextranDextran0,05-0,71-51-304-150

Bio-Gel P-2Bio-Gel P-10Bio-Gel P-100Bio-Gel P-300PoliacrilamidPoliacrilamidPoliacrilamidPoliacrilamid0,1-1,81,5-205-10060-400

Sepharose B6Sepharose B2AgarozAgaroz10-400070-40000

O metod asemntoare, bazat pe acelai principiu, este dializa. Prin dializ se poate realiza separarea moleculelor de dimensiuni diferite prin utilizarea unor membrane semipermeabile, ce conin pori mai mici dect macromoleculele proteice.

22. Faze mobile utilizate in cromatografia HPLCn cromatografia pe coloane, alegerea naturii si compozitiei fazei mobile are o importanta deosebit pentru a obtine o separare eficienta. Alegerea fazei mobile se face aici n perfect concordan cu faza staionar. Astfel faza mobil difer destul de mult n funcie de tipul interaciunilor componentelor separate cu faza staionar din coloan. Singurele caracteristici generale sunt urmtoarele: (1) faza mobil trebuie s aib o viscozitate cobort(2) aceasta trebuie s dizolve bine componentele(3) nu trebuie s afecteze funcionarea coloanei(4) trebuie s permit funcionarea detectorului.Puritatea solventilor utilizati este esentiala. n cazul utilizarii de detectoare n UV, solventii trebuie sa fie lipsiti chiar si de urme de substante care pot s absoarb n UV. De asemenea, prezenta unor particule solide in faza mobila poate determina distrugerea pompei sau injectorului sau nfundarea coloanei. Din aceste motive, solventii cromatografici sunt scumpi si costul lor reprezinta cea mai mare parte a costului unei analize cromatografice.Unii elueni provoac migrarea unui anumit component mai repede prin coloan. Se spune c acetia au o trie relativ mai mare sau, altfel spus, au o putere de eluie mai ridicat. Aceast denumire provine de la faptul c factorul de capacitate, k, este mai mare i de aceea componentul migreaz mai repede. Dar totul depinde de trio-ul component faz mobil - faz staionar. Astfel, pe o faz staionar polar, folosind o faz mobil nepolar, se vorbete de cromatografie de repartiie normal (sau cu faze directe). Din contr, pe o faz staionar nepolar utilizndu-se o faz mobil polar se vorbete de cromatografie de repartiie cu faze inverse (sau inversate). n acest ultim caz au devenit uzuale fazele mobile formate din amestecuri metanol - ap care n cromatografia de repartiie sunt considerate printre fazele mobile mai puin tari.Proprietatea cea mai importanta a solventilor utilizati n cromatografia de lichide este polaritatea. Puterea de eluie a unei faze mobile depinde de polaritatea sa totala, polaritatea fazei stationare si natura componentilor analizati. n cazul separarilor pe faze normale, puterea de elutie creste odata cu cresterea polaritatii solventului, iar n cazul separarilor pe faze inverse ea scade cu cresterea polaritatii solventului. Popularitatea cromatografiei pe faze inverse este determinata n mare parte de avantajele utilizarii unor faze mobile polare ca apa si metanolul: ele sunt mai ieftine, n general mai pure si mai putin toxice dect solventii nepolari. n cromatografia ionic (IC) se folosesc soluii diluate de electrolii ca: NaOH, NaHCO3, HCl, iar n cea de excluziune steric solveni simpli - evident compatibili cu polimerii, separai unii de alii dup dimensiuni.

23. Analiza calitativa in cromatografia HPLCANALIZA CALITATIVA (IDENTIFICAREA SUBSTANTELOR SEPARATE) se realizeaza la iesirea din coloana cu ajutorul detectorului. Cromatograma reprez succesiunea de picuri cromatografice produsa de detector. Identificarea componentilor corespunzatori picurilor cromatografice se poate face in doua moduri:- prin compararea timpilor de retentie ai componentilor cu al unor etaloane cunoscute in aceleasi conditii experimentale; aceasta metoda nu asigura certitudinea identitatii unei substante;- prin retinerea componentilor eluati pentru o analiza ulterioara prin alte tehnici analitice, cum ar fi spectometria in IR sau spectometria de masa, contribuind astfel la cresterea procentelor de certitudine.Daca pentru caracterizare sunt utilizate datele de retentie este necesar s se controleze cu grija parametrii de curgere si de temperatura, deoarece comparaia dintre proba necunoscuta si standard se face tocmai pe baza acestor date. Intruct foarte multi compusi diferiti pot avea acelasi timp (sau volum) de retentie este necesar sa se utilizeze mai multe coloane cu selectivitati diferite.

24. Analiza cantitativa in cromatografia HPLCPentru ANALIZA CANTITATIVA este foarte important standardizarea conditiilor de lucru si cunoasterea factorului de raspuns al detectorului pentru fiecare component determinat. Analiza cantitativa consta in trei etape:- obtinerea cromatogramei;- masurarea maximelor (picurilor) sau a suprafetelor- interpretare rezultatelorSuprafata integrate a unui pic este direct proporional cu cantiatea de solut eluat. Se poate utiliza si inaltimea picului, dar rezultatele sunt mai putin precise. Masurarea suprafetei se face prin urmatoarele metode: metoda triunghiului, metoda planimetrarii (care consta in determinarea ariei cu ajutorul unui planimetru), metoda decuparii si cantaririi, integrarea electronica. Calculul rezultatelor se poate face in mai multe moduri: normalizarea interna, standardizarea interna, metoda adaosului standard. In cadrul metodei de normalizare compozitia procentuala este determinat prin msurarea ariei fiecarui pic si mprirea ariilor individuale la toata aria totala. Acest lucru presupune ca au fost eluate toate picurile probei si ca raspunsul detectorului este acelasi pentru fiecare compus.STANDARDIZAREA INTERNA consta in adugarea la proba de analizat, inainte de a fi analizata, a unei cantitati cunoscute dintr-o substanta standard. Se determina apoi raportul dintre suprafetele picurilor substantei standard si cele ale substantei de analizat, pe baza caruia se poate determina cantiatea de substanta din proba. In cazul metodei adaosului standard se obtin cromatograme pentru proba ca atare si dupa ce s-a adaugat in proba o cantiate cunoscuta din substanta de analizat. Diferenta dintre suprafetele celor doua picuri cromatografice este suficienta pentru a determina cantiatea initiala de substanta din proba.

25. Enumerati principalele componente ale sistemului cromatografic GC-cilindru sub presiune-reductor-etuva-termostat-coloana-detector-ventilator-dispozitiv electric de incalzire-termostatare-conducta.

26. Coloane utilizate in gaz-cromatografieIniial au existat dou tipuri de coloane: (A) cu umplutur i (B) coloane capilare. Coloanele cu umplutur - primele coloane cunoscute n GC - sunt confecionate din tuburi (oel, sticl sau alte materiale), avnd diametre cuprinse ntre 2-8 mm - cel mai frecvent de 1/8 oli (3.18mm) sau oli (6.35mm) - i conin adsorbeni, site moleculare sau un suport inert pe care se gsete depus sau legat chimic un film subire dintr-o faz staionar. Raportul diametrelor coloanei i umpluturii trebuie s fie cuprins ntre 25 i 20. Umplutura coloanei const dintr-o anumit faz staionar - activ care se depune pe granulele umpluturii inerte i poroase, n afara coloanei (dup dizolvarea acesteia ntr-un solvent potrivit ales) prin amestecare urmnd apoi evaporarea solventului ntr-o etuv. Doar apoi umplutura se introduce n coloan i coloana se monteaz n cromatograf, prin intermediul unor racorduri filetate. Debitul gazului purttor la aceste coloane este cel mai mare, fiind cuprins ntre 10 i 40mLmin-1. Astfel de coloane sunt din ce n ce mai puin utilizate.Coloanele capilare sunt, la rndul lor, de cel puin dou tipuri: cu faz staionar depuse chiar pe peretele coloanei capilare (WCOT) sau cu faza staionar depus pe un suport solid, poros, aderent, format n prealabil pe peretele acesteia. Au diametre 0.1-0.35mm i lungimi ntre 5-100m, separarea durnd ceva mai mult dect la cele cu umplutur. Cu ct coloana este mai lung durata analizei crete. Coloanele capilare se confecioneaz n ultimul timp mai ales din sticl de cuar. n exterior acestea sunt mbrcate ntr-un polimer - poliamid - pentru a rezista mai bine la ocuri mecanice respectiv la coroziune (n acelai scop se mai folosete aluminiul). Coloanele sunt bobinate pe suporturi metalice avnd o form circular (fig. 10).Fazele staionare sunt i ele de mai multe feluri: polare, de exemplu polietilenglicoli,nepolare de exemplu cauciucuri siliconice, intermediare i n sfrit cele cu puni de hidrogensau cele specifice (de exemplu cele destinate separrii amestecurilor racemice). Fazele staionare sunt lichide sau solide. Fazele staionare lichide sunt formate din lichide nevolatileavnd o compoziie chimic foarte variat (peste 100 de tipuri). Pentru a se putea lega chimicnumrul acestora a fost restrns la cele care pot, prin sintez, s duc la un film grefat pepartea intern a coloanei. La ora actual se pot distinge dou tipuri de compui preferai:polisiloxanii i polietilenglicolii fiecare ntr-o varietate care s permit modificarea polaritiiacestora.Fazele staionare solide sunt constituite din diferii adsorbeni: silicagel sau alumin(dezactivate cu sruri minerale), sticle poroase, sau polimeri poroi iar n ultimul timp chiar carbon poros. Acestea au diferite denumiri comerciale: Site moleculare, Porapak, Carbopak, PoraPLOT etc i sunt folosite mai ales pentru separri de gaze permanente sau compui foarte volatili H2O, hidrocarburi etc. Astfel de materiale se pot depune i pe pereii interiori ai coloanelor capilare - coloane denumite n literatura internaional coloane PLOT (adic coloane deschise cu suport poros = Porous Layer Open Tubular, l. engl.).

27. Detectorul GC bazat pe ionizare n flacr (FID)Acesta este unul din cei mai folosii detectori, n special datorit sensibilitii sale ridicate la compuii cu carbon, practic nelipsii din orice tip de gaz-cromatograf dedicat analizei substanele organice. Dei distruge proba, a fost detectorul care a consacrat definitivcromatografia de gaze. Funcionarea sa are la baz modificarea conductibilitii electrice a gazelor n prezena unor particule ncrcate (de regul molecule ionizate). Dac la presiunea i temperatura ambiant un gaz aflat ntre doi conductori este un izolator foarte bun, n momentul cnd ntre cei doi electrozi apar particule ncrcate electric, n urma deplasrii acestora n cmpul electric creat, apare un curent electric. Ionizarea moleculelor probei este intensificat de prezena unei flcri de hidrogen, care arde n aer ntr-o incint, flacr ce atinge temperaturi ridicate (2000-2200C).Cele mai slabe semnale, care nu pot servi unei analize chimice, le dau substanele alctuite din moleculele covalente simple: N2, O2, CO, CO2, H2O, CS2, NH3, CCl4, SiCl4, oxizi de azot, He i alte gaze rare. De aceea gazul purttor n cromatografia de gaze este N2, He sau Ar, condiii n care detectorul d un semnal de baz minim, foarte stabil. n momentul apariiei in flacr a unor molecule organice, de exemplu hidrocarburi sau derivai, ionizarea duce la un semnal (curent) specific fiecreia dintre acestea. Curentul setransform n tensiune pe rezistena cu valoare ridicat R. FID este confecionat adeseori din oel inoxidabil iar ntre corpul metalic i placa cilindric pozitiv, de deasupra sa, se aplic un potenial de polarizare de 100-300V, continuu. Rspunsul detectorului, depinde de numrul de molecule ionizate ce apar n flacr.Cele mai stabile rezultate se obin pentru alcani. Pentru alte substane semnalul n general scade cu creterea numrului de heteroatomi din molecul. De aceea, aici este nevoie de un factor de corecie specific pentru fiecare compus analizat. De regul se folosesc factori de corecie relativi, adic raportul dintre arie i unitatea de mas a unui compus de referin irspunsul, pentru unitatea de mas a speciei chimice analizate.

28. Analiza calitativa in cromatografia GCn GC analiza calitativ se poate realiza fie pe baza utilizrii timpilor de retenie ajustai, tR' fie pe baza volumelor de retenie ajustate, VR' msurate experimental n cazul probei necunoscute i comparate cu valorile similare ale unor probe cunoscute. Deci pentru orice analiz calitativ este nevoie de substana pur, lucru nu ntotdeauna accesibil. De aceea cuplajul cu spectrometria de mas a depit acest neajuns, devenind una dintre cele mai bune tehnici de analiz calitativ.

29. Analiza cantitativa in cromatografia GCn anumite condiii (pe poriuni liniare ale rspunsului detectorului, condiii experimentale identice etc.), suprafaa dintre linia de baz i curba picului cromatografic - semnalul analitic - este proporional cu cantitatea de component injectat. Deci, pe domeniul liniar al detectorului, oricare ar fi acesta, exist relaia:Masa injectat = K (Aria picului)unde K este o constant numeric. Aceast proprietate poate servi pentru construirea unei curbe de etalonare fiind general valabil att n cazul GC ct i n celelalte tehnici cromatografice. Se poate i aici aplica metoda adausului standard, mai ales la domenii liniare largi. Pentru valori tR' mici, cnd picurile sunt i ascuite i nguste, se poate utiliza n locul ariei nlimea sa - cu rezerva unei pierderi din precizia determinrii. Amintim n cele ce urmeaz cteva practici de baz legate de analiza cantitativ folosind ariile picurilor.