Page 1
SPEKTROFOTOMETER
A. Pengertian
Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban
suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Sedangkan pengukuran
menggunakan spektrofotometer ini, metoda yang digunakan sering disebut dengan
spektrofotometri. Spektrofotometri dapat dianggap sebagai perluasan suatu
pemeriksaan visual dengan studi yang lebih mendalam dari absorbsi energi.
Absorbsi radiasi oleh suatu sampel diukur pada berbagai panjang gelombang dan
dialirkan oleh suatu perekam untuk menghasilkan spektrum tertentu yang khas
untuk komponen yang berbeda.
Spektrofotometri merupakan suatu metoda analisa yang didasarkan pada
pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada
panjang gelombamg spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau
kisi difraksi dengan detektor fototube.
Spektrofotometer dibagi menjadi dua jenis yaitu spektrofotometer single-
beam dan spektrofotometer double-beam. Perbedaan kedua jenis spektrofotometer
tersebut hanya pada pemberian cahaya, dimana pada single-beam, cahaya hanya
melewati satu arah sehingga nilai yang diperoleh hanya nilai absorbansi dari
larutan yang dimasukan. Berbeda dengan single-beam, pada spektrofotometer
double-beam, nilai blanko dapat langsung diukur bersamaan dengan larutan yang
diinginkan dalam satu kali proses yang sama. Prinsipnya adalah dengan adanya
chopper yang akan membagi sinar menjadi dua, dimana salah satu melewati
blanko (disebut juga reference beam) dan yang lainnya melewati larutan (disebut
juga sample beam.
Spektofotometri dikenal menjadi 2 kelompok utama, yaitu
spektofotometri atom dan spektofotometri molecular. Dasar dari spektofotometri
atom adalah tingkat energy electron valensi suatu atom atau unsur. Dasar
spektrofotometri molekul adalah tingkat molekul yang melibatkan energy
elektronik, energy vibrasi, dan energy rotasi. Spektra absorbansi dari
spektrofotometri atom lebih sederhana daripada spectra molekulnya karena
Page 2
keadaan energy elektrolit tidak mempunyai sub tingkatan vibrasi-rotasi. J a d i
spektra absorbansi atom terdiri dari garis-garis yang jauh lebih tajam
daripada pita-pita yang diamati dalam spektroskopi molekuler.
Teknik spektroskopi pada daerah ultra violet dan sinar tampak disebut
spektroskopi UV-VIS. Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara
spektrofotometri UV dan Visible. Spektrofotometer UV-VIS merupakan alat
dengan teknik spektrofotometer pada daerah ultra-violet dan sinar tampak. Alat ini
digunakan guna mengukur serapan sinar ultra violet atau sinar tampak oleh suatu
materi dalam bentuk larutan. Konsentrasi larutan yang dianalisis sebanding
dengan jumlah sinar yang diserap oleh zat yang terdapat dalam larutan tersebut.
B. Kegunaan Spektrofotometer UV-VIS
Spektroskopi UV/VIS merupakan metode penting yang mapan, andal dan
akurat. Dengan menggunakan spektroskopi UV/VIS, substansi tak dikenal dapat
diidentifikasi dan konsentrasi substansi yang dikenal dapat ditentukan. Pelarut
untuk spektroskopi UV harus memiliki sifat pelarut yang baik dan memancarkan
sinar UV dalam rentang UV yang luas. Selain itu spektroskopi UV/VIS juga
digunakan untuk cairan berwarna.
Adapun kegunaan lain dari spektrofotometer UV/VIS adalah alat yang
digunakan untuk mengukur transmitansi, reflektansi dan absorbsi dari cuplikan
sebagai fungsi dari panjang gelombang. Spektrofotometer digunakan untuk
mengukur energi cahaya secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan,
direfleksikan atau diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang. Suatu
spektrofotometer tersusun dari sumber spektrum sinar tampak yang sinambung
dan monokromatis. Sel pengabsorbsi untuk mengukur perbedaan absorbsi antara
cuplikan dengan blanko atau pun pembanding.
C. Instrumen (Bagian) Spektrofotometer
Spektrofotometer terdiri dari :
Sumber cahaya.
Page 3
Monokromator.
Kompartemen sampel
Detektor dan pengukur intensitas cahaya.
Secara sederhana Instrumen spektrofotometri yang disebut
spektrofotometer terdiri dari :
sumber cahaya – monokromator – sel sampel – detektor – read out(pembaca)
1. Sumber Cahaya
Sebagai sumber cahaya pada spektrofotometer, haruslah memiliki
pancaran radiasi yang stabil dan intensitasnya tinggi. Sumber energi
cahaya yang biasa untuk daerah tampak, ultraviolet dekat, dan inframerah
dekat adalah sebuah lampu pijar dengan kawat rambut terbuat dari
wolfram (tungsten). Lampu ini mirip dengan bola lampu pijar biasa,
daerah panjang gelombang (l ) adalah 350 – 2200 nanometer (nm).
Page 4
Gambar 1. Lampu wolfram
Di bawah kira-kira 350 nm, keluaran lampu wolfram itu
tidak memadai untuk spektrofotometer dan harus digunakan
sumber yang berbeda. Paling lazim adalah lampu tabung tidak
bermuatan (discas) hidrogen (atau deuterium) 175 ke 375 atau
400 nm. Lampu hidrogen atau lampu deuterium digunakan untuk
sumber pada daerah ultraviolet (UV).
Gambar 2. Lampu deuterium
2. Monokromator
Monokromator adalah alat yang berfungsi untuk menguraikan cahaya
polikromatis menjadi beberapa komponen panjang gelombang tertentu
(monokromatis) yang bebeda (terdispersi). Ada 2 macam monokromator
yaitu :
a. Prisma
Page 5
Cahaya monokromatis ini dapat dipilih panjang gelombang tertentu yang
sesuai untuk kemudian dilewatkan melalui celah sempit yang disebut slit.
Ketelitian dari monokromator dipengaruhi juga oleh lebar celah (slit
width) yang dipakai. Monokromator berfungsi sebagai penyeleksi
panjang gelombang yaitu mengubah cahaya yang berasal dari sumber sinar
polikromatis menjadi cahaya monokromatis.
3. Sel Sampel
Berfungsi sebagai tempat meletakan sampel, UV-VIS menggunakan kuvet
sebagai tempat sampel. Kuvet biasanya terbuat dari kuarsa atau gelas,
namun kuvet dari kuarsa yang terbuat dari silika memiliki kualitas yang
lebih baik. Hal ini disebabkan yang terbuat dari kaca dan plastik dapat
menyerap UV sehingga penggunaannya hanya pada spektrofotometer sinar
tampak (VIS). Kuvet biasanya berbentuk persegi panjang dengan lebar 1
cm. Cuvet harus memenuhi syarat- syarat sebagai berikut :
Tidak berwarna sehingga dapat mentransmisikan semua cahaya.
Permukaannya secara optis harus benar- benar sejajar.
Harus tahan (tidak bereaksi) terhadap bahan- bahan kimia.
Tidak boleh rapuh
Mempunyai bentuk (design) yang sederhana.
4. Detektor
Detektor berfungsi menangkap cahaya yang diteruskan dari sampel dan
mengubahnya menjadi arus listrik. Syarat-syarat sebuah detektor :
Kepekaan yang tinggi
Page 6
Perbandingan isyarat atau signal dengan bising tinggi
Respon konstan pada berbagai panjang gelombang.
Waktu respon cepat dan signal minimum tanpa radiasi.
Signal listrik yang dihasilkan harus sebanding dengan tenaga
radiasi.
Macam-macam detektor :
Detektor foto (Photo detector)
Photocell, misalnya CdS.
Phototube
Hantaran foto
Dioda foto
Detektor panas
5. Read Out
Read out merupakan suatu sistem baca yang menangkap besarnya isyarat
listrik yang berasal dari detector.
D. Cara Penggunaan Spektrofotometer
1. menyalakan mesin dan menunggu selama 15 menit.
Spektrofotometer dibiarkan selama 15 menit setelah dihidupkan
bertujuan untuk pemanasan lampu.
2. mengatur panjang gelombang/wavelength dan memilih mode yang
akan digunakan.
3. mengkalibrasi dengan menggunakan blank sample seperti
aquades. Dalam mengkalibrasi, pastikan kuvet/sel dalam keadaan
bersih, pastikan tidak ada sidik jari (fingerprint) atau kotoran yang
menempel sehingga hasil yang didapat akurat. Setelah yakin jika
kuvet bersih, maka masukan kuvet yang berisi aquades tersebut
kedalam spektrofotometer. Jika nilai absorbansi yang didapat
belum menunjukan angka .00 maka disesuaikan dengan memutar
Page 7
tombol yang ada dibagian depan spektrofotometer sehingga nilai
yang didapat menunjukan angka 0. Setelah didapat nilai absorbansi
.00 maka alat tersebut siap digunakan (ready to use).
4. masukan sampel dan baca T% atau nilai A (absorbansi). Sebelum
memasukan sampel yang akan diukur nilai absorbansi nya,
pastikan kuvet bersih, dan pastikan larutan sampel tersebut juga
bersih dari kotoran, atau sedimen yang mengendap dengan cara
mengocok secara perlahan. Jika sudah yakin bersih, masukan
sampel kedalam spektrofotometer dan baca nilai absorbansinya.
Dalam video ini terlihat nilai absorbansi sampel tersebut
sebesar .23
Page 9
MEMBRAN PLASMA
Perkembangan membran plasma merupakan tahap sangat pentingnya
dalam terjadinya bentuk kehidupan yang paling awal. Tanpa membran
plasma, sebuah sel tidak mungkin melangsungkan kehidupannya.
Semua membran organisme hidup, termasuk membran plasma dan
membran internal sel eukariotik, memiliki susunan umum yang sama, yaitu
terdiri dari himpunan molekul lipid dan protein yang terikat secara non-
kovalen.
Fungsi membran plasma
Membran plasma sangat penting untuk menjaga kehidupan sel. Fungsi
membran plasma adalah sebagai berikut.
Melindungi isi sel
Membatasi isi sel dari lingkungan luarnya.
Mengatur keluar masuknya molekul-molekul
Sebagai reseptor (penerima) rangsangan dari luar sel
Membran sel juga berfungsi sebagai Protein membrane
Perkembangan Model Membran Sel
Sebelum diajukan teori membran plasma oleh Singer dan Nicolson dalam
tahun 1972, teori-teori tentang strukur membran plasma dapat disimpulkan
dalam 3 kelompok.
a. Teori lembaran (leaflet theory), yang pada dasarnya menyatakan
bahwa membran plasma tersusun oleh lapisan-lapisan.
b. Teori bola-bola (globular theory), menyatakan bahwa komponen lipid-
protein berbentuk sebagai bola-bola yang tersusun membentuk
lembaran.
Page 10
c. Teori dinamis, yang menyatakan bahwa struktur membran plasma
dapat berbentuk lembaran berlapis dan dapat berubah menjadi susunan
bola-bola mengikuti keadaan dan kebutuhan.
Pada tahun 1972, S.J. Singer & G. Nicolson mengusulkan model membran
sel bahwa protein membran tersisip pada lapis bilayer fosfolipid. Model
membran ini disebut dengan model mosaik fluida. Perhatikan gambar berikut.
Lapisan Lipid
Petunjuk pertama yang mengisyaratkan bahwa membran dalam organisme
hidup tersusun dari molekul-molekul lipid dalam dua lapisan berasal dari
percobaan yang dilakukan dalam tahun 1925. Lipid yang diesktraksi dengan
aseton dari membran sel darah merah diapungkan pada permukaan air.
Molekul-molekul lipid dari membran sel ternyata tersusun dari 3 jenis,
yaitu:
1. Fosfolipid, yang terbanyak
2. Kolesterol
3. Glikolipid
Page 11
Ketiga jenis lipid tersebut amfipotik, artinya molekulnya memiliki ujung
hidrofobik atau nonpolar (menjauhi air) dan ujung hidrofilik atau polar
(menyenangi air).
Protein Membran
Jika molekul-molekul lipid yang membentuk dwi-lapisan merupakan
kerangka dasar membran plasma, maka pada kerangka tersebut terdapat jenis
molekul lain yaitu dalam bentuk berbagai jenis molekul protein. Hubungan
antara molekul protein dengan molekul lipid dapat dibandingkan dengan
molekul-molekul protein yang berada dalam pelarutnya. Perbedaannya
terletak pada situasi pelarutnya yaitu bahwa molekul protein dalam membran
plasma seakan-akan larut dalam molekul-molekul lipid yang berada dalam
ukuran 2 dimensional.
Berdasarkan hubungan dan kedudukan terhadap dwi-lapisan molekul lipid
dapat dibedakan menjadi,
1. Molekul protein menembus kedua lapisan molekul lipid, sehingga ujung-
ujung molekul dapat menonjol pada kedua permukaan membran plasma.
2. Sebagian dari molekul protein terdapat di antara molekul lipid dari bagian
dwi-lapisan; ujung molekul protein menonjol pada salah satu permukaan
membran plasma.
3. Sebagian molekul protein berikatan secara kovalen dengan molekul lipid,
sebagian ujung molekul protein menonjol pada permukaan membran
plasma.
4. Molekul protein dengan perantaraan molekul protein lain berada pada
permukaan membran plasma.
Berbagai jenis kedudukan protein tersebut tergantung pada struktur
molekul protein. Berdasarkan pada hubungan dengan air di lingkungannya,
maka molekul protein dapat pula dibedakan menjadi daerah polar yang
hidrofilik dan daerah hidrofobik.
Page 12
Molekul karbohidrat membran
Semua sel eukariotik memiliki karbohidrat pada permukaannya yang
sebagian besar berbentuk sebagai rantai oligosakarida yang terikat dengan
protein membran (glikoprotein) dan sebagian kecil terikat pada lipid
(glikolipid).
Selubung sel (Cell coat)
Seperti kita ketahui bahwa sel-sel tumbuhan selalu diselubungi oleh
dinding sel yang tebal yang tersusun terutama oleh selulosa, yang juga
merupakan molekul karbohidrat.
Fungsi glikokaliks tersebut diantaranya:
1. Pengenalan sel terhadap sekitarnya termasuk sel-sel tetangganya
2. Sifat antigenisitas dari sel bersangkutan.
3. Membantu filtrasi zat-zat yang disesuaikan dengan besarnya molekul.
4. Mengandung enzim
5. Mengubah konsentrasi berbagai zat pada permukaan sel.
Transport molekul-molekul kecil membran
Permeabilitas membran plasma mempunyai sifat-sifat khas, misalnya:
1. Makromolekul protein tidak dapat melintasi membran, maka sitoplasma
yang sebagian besar merupakan protein akan tetap tinggal terkurung oleh
membran plasma.
2. Adanya mekanisme yang disebut Pompa natrium (sodium pump)
3. Demikian pula diduga bahwa untuk transport glukosa, asam amino dan
asam lemak ke dalam sel dibutuhkan energi yang tergantung pada adanya
“pembawa” yang terdapat dalam membran. Mekanisme transport aktif.
4. Adanya perbedaan tekanan osmose dalam sel dan di luarnya akan
menimbulkan transportasi air ke arah tekanan osmose yang lebih tinggi.
Page 13
5. Zat-zat yang tidak larut dalam lipid tetapi dapat menembus membran
plasma dapat diterangkan, bahwa membran plasma mempunyai pori atau
gerbang sehingga dapat dilalui air ataupun ion-ion kecil.
Dari sifat-sifat membran tersebut dapat disimpulkan bahwa membran
plasma tidak merupakan suatu membran yang mati atau kaku, melainkan
bersifat sangat labil dan dinamis.
Page 14
DAFTAR PUSTAKA
Gardjito, 1992. Buku Materi Pokok Kimia. UT. Depdikbud RI. Jakarta (diakses melalui books.google.co.id)
Hendayana 1994. Kimia Analitik Instrumen Edisi I. IKIP Semarang Press.
Semarang (diakses melalui books.google.co.id)
Ronald A. Sacher, Richard A. McPherson 2002, Tinjauan Klinis Hasil
Pemeriksaan, Laboratorium. EGC (diakses melalui books.google.co.id)
Erlangga 2003. Analisis Kimia Kuantitatif Edisi Keenam. (diakses melalui
books.google.co.id)
Campbell, Reece – Mithcel 2006. Biologi Jilid I Edisi V. Erlangga (diakses
melalui books.google.co.id)
Page 15
SPEKTROFOTOMETER
& MEMBRAN BIOLOGI
OLEH :
FITHA WARDANIK1A112119
PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER
FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS HALUOLEO
KENDARI