UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE QUÍMICA BIOLÓGICA Y FISIOLOGÍA ANIMAL BIOQUÍMICA T1: Introducción a las enzimas. Poder catalítico. Especificidad. Regulación de la actividad enzimática. La energía libre y la cinética enzimática. El estado de transición en las reacciones enzimáticas. T2: Formación del complejo enzima-sustrato. Características de los centros activos. Grupos funcionales de los centros activos. T3: Modelo de Michaelis – Menten. Medición de K M y Vmax. Significado de los valores de K M y Vmax . Criterio Kcat/ K M . Prof. Patricia Torres P.
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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLOFACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE QUÍMICA BIOLÓGICA Y FISIOLOGÍA ANIMAL
BIOQUÍMICA
T1: Introducción a las enzimas. Poder catalítico. Especificidad. Regulación de la actividad enzimática. La energía libre y la cinética enzimática. El estado de transición
en las reacciones enzimáticas.T2: Formación del complejo enzima-sustrato. Características de los centros activos.
Grupos funcionales de los centros activos.T3: Modelo de Michaelis – Menten. Medición de KM y Vmax. Significado de los
valores de KM y Vmax . Criterio Kcat/ KM.
Prof. Patricia Torres P.
ENZIMAS
ENZIMAS. Características Generales
Casi todos son de naturaleza proteica, excepto moléculas de RNA catalíticamente activas (ribosimas).
1. Composición:
En los viroides de plantas, como los que producen la mancha de los paltos y la mancha de la planta del tabaco. Estas ribozimas contienen secuencias de RNA, que tienen esta posibilidad de cortar otras cadenas RNA, en secuencias de nucleótidos bien determinadas.
2. Poder catalítico
3. Especificidad
ENZIMAS. Características Generales
Aumentan las velocidades de las reacciones hasta 106 veces, sin afectar el equilibrio de la reacción.
El enzima no se modifica tras su actuación catalítica.
Radica en el centro activo del enzima (responsable de la interacción).
Pepsina 1.5
Tripsina 7.7
Catalasa 7.6
Arginasa 9.7
Fumarasa 7.8
Ribonucleasa 7.8
Enzima pH óptimo
ENZIMAS. Características Generales
4. Requieren de condiciones ambientales: pH
Mamíferos 37
Bacterias y algas apróx. 100
Bacterias Árticas apróx. 0
Enzima Temp. Óptima. (oC)
Bacterias en muestra de hielo antigua
5. Requieren de condiciones ambientales: Temperatura
La actividad catalítica de muchos enzimas depende de la presencia de pequeñas moléculas llamadas cofactores.
Metales Moléculas orgánicas pequeñas deriv. vitaminas: coenzimas
COFACTORES
Grupo Prostético Cosustrato
ENZIMAS. Características Generales
Unión fuerte Unión débil
Enzimas que requieren elementos inorgánicosCitocromo oxidasa
Catalasa, peroxidasaFe2+, Fe+,
Citocromo oxidasa Cu2+
DNA polimerasaAnhídrasa carbónica
Alcohol deshidrogensaZn2+
HexoquinasaGlucosa 6-fosfatasa
Mg2+
Arginasa Mn2+
Piruvato quinasa K+, Mg2+
Ureasa Ni2+
Nitrato reductasa Mo2+
Transformación de Alimentos
Fermentaciones Quesos Vinos
Medicina Transaminasas
Industria Química Penicilina
Agricultura Rhyzobium
DIVERSAS APLICACIONES:
ENZIMAS. Clasificación
La UIB: sistema de nomenclaturas sin ambigüedad. Cada enzima: nombre y número de código singular que identifican el tipo de reacción catalizada y los sustratos comprendidos.
Anteriormente, los nombres: tipo de reacción catalizada, seguido por sufijo –asa. Deshidrogenasas, proteasas e isomerasas.
Descubrimiento de más y más enzimas surgieron ambigüedades inevitables.
1. Oxidorreductasas
Catalizan reacciones de oxidorreducción, transferencia de hidrógeno (H) o electrones (e-) de un sustrato a otro.
De acuerdo al tipo de reacción catalizada, los enzimas se agrupan en seis clases:
2. Transferasas:
Transfieren grupos funcionales entre dadores y aceptores. Transfieren grupos amino, acilo, fosfato, glucosilo y los grupos monocarbonados.
3. Hidrolasas:
La reacción generalizada implica la rotura hidrolítica de enlaces C-C, C-O, C-N, O-P y C-S; la rotura del enlace peptídico es un buen ejemplo de esta reacción.
4. Liasas:
Añaden o eliminan los elementos del agua, amoniaco o dióxido de carbono.Las descarboxilasas eliminan unidades de CO2 de y -cetoácidos o aminoácidos.
5. Isomerasas:
Catalizan isomerizaciones de diversos tipos dentro de una molécula.Interconversiones cis – trans y aldosa – cetosa.
6. Ligasas:
Catalizan la unión de dos moléculas acopladas a la hidrólisis de ATP. El término sintetasa se reserva para este tipo de enzimas.
La energía libre (G) es una función termodinámica útil para la comprensión de los enzimas.
Energía libre: La primera ley de la Termodinámica establece que la energía total de un sistema y su entorno permanece constante.
Para comprender el funcionamiento de los enzimas, es necesario conocer:
La diferencia de la energía libre (ΔG) entre los productos y los reactantes
La energía que se requiere para iniciar la conversión de los reactantes en productos (energía de activación ΔG++.).
Si ΔG es negativo: Reacción espontánea.si ΔG es cero: Equilibrio.si ΔG es positivo: Reacción no espontánea
Determina la velocidad de la reacción
Intervienen los enzimas, favoreciendo La formación del estado de transición.
A+B
C+D
Los enzimas alteran la velocidad de una reacción pero no el equilibrio
Por lo tanto:De S a P: estado de transición X++ que tiene mayor energía libre.
ΔG entre X++ y el S: energía libre de Gibbs o energía de activación: ΔG++.
Energía liberada por interacciones débiles entre el E y el S (energía de unión) permite que la energía de activación disminuya.
La esencia de la catálisis es la estabilización específica del estado de transición .
Formación del complejo Enzima - SustratoLa mayor parte de la capacidad catalítica de los enzimas procede de yuxtaponer sus sustratos en condiciones favorables dentro de los complejos ES para facilitar la formación de los estados de transición. Los sustratos quedan unidos a una región específica del enzima denominado centro activo.
CATÁLISIS ENZIMÁTICA:
El Centro Activo, al ser la región que se une al sustrato, contiene los residuos que participan directamente en la producción y roturas de enlaces (grupos catalíticos). La función del centro activo es:
Fijar específicamente al sustratoTransformarlo catalíticamente.
Los centros activos de las diversas enzimas poseen ciertas características comunes:
Centro activo, porción pequeña del volumen del enzima
Es una entidad tridimensional
Los sustratos se unen por fuerzas débiles: Interacciones electrostát., hidrofóbicas, Van der Waals, puentes de H.
Los centros activos son hoyos o hendiduras
La especificidad del enlace depende de la disposición definida de los átomos del centro activo.
Modelo llave - cerradura
Modelo del ajuste inducido
CINÉTICA ENZIMÁTICA
La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por los enzimas, así como también los factores que intervienen.
Concentración de enzima, sustratos y productos (incluyendo inhibidores y/o activadores)
pH
Temperatura
¿Qué significa “velocidad” cuando hablamos de una reacción química? Si tenemos la siguiente reacción:
La velocidad (V) es la cantidad de A que desaparece en una unidad de tiempo concreta; es igual a la velocidad de aparición de P, es decir, la cantidad de P que aparece en una unidad de tiempo completo.
La velocidad de la reacción está relacionada directamente con la concentración de A mediante una constante de proporcionalidad k, denominada constante de velocidad:
Muchas reacciones bioquímicas importantes incluyen dos reactantes:
Primer orden
V = k[A][B]Bimolecular
Pseudo primer orden
Orden cero
La concentración del sustrato afecta la velocidad de reacción catalizada por enzimas
Para investigar la velocidad de reacción el método más sencillo es seguir el incremento del producto de la reacción en función del tiempo.
Sin embargo, las cinéticas enzimáticas son más fácilmente comprendidas si se considera solamente la reacción directa (conversión del S a P).
Se alcanza un equilibrio, el enzima esactivo y transforma el P en S y vicev.
Velocidad de catálisis (V0) : número de moles de producto formado por segundo cuando la reacción acaba de empezar (t = 0).
Leonor Michaelis y Maud Menten propusieron un modelo sencillo que explica estas características cinéticas mediante la formación de un complejo E-S intermediario en la catálisis.
E + S ES E + Pk-1
k1
K-2
k2
Modelo de Michaelis - Menten
E + S ES E + Pk-1
k1 k2
Teniendo en cuenta la velocidad de reacción cercana a 0:
En el estado estacionario la [ES] permanece invariable y las concentraciones del S y P van cambiando. Se obtiene una constante que relaciona las constantes de velocidad de destrucción y formación del complejo [ES]
Si K1 >> K2, Km = cte disociación del complejo ES, es decir es una medida de la estabilidad del complejo ES: Una Km baja indica una unión fuerte.Una Km alta indica una unión débil.
Km es diferente para cada enzima y depende del sustrato, pH, temperatura y fuerza iónica.
Obteniendo la ecuación de Michaelis – Menten:
Baja concentración de sustrato
ALTA concentración de sustratoSATURACION
Si [S] es >>> que Km, Vo = Vmax
Si [S] es <<< que Km, Vo = (Vmax/Km) [S]
Si [S] es igual a Km, Vo = Vmax/2
En resumen, los valores de Km y Vmax significan:
Km:
Es aquella concentración de sustrato a la cual la velocidad de reacción se hace la mitad de su valor máximo o aquella concentración a la cual la mitad de los centros activos están ocupados.
Es la medida de la estabilidad del complejo ES, es decir indica la afinidad del E por el S.
Vmax:
Revela el número de recambio de un enzima, que es el número de moléculas de sustrato convertidas en producto por unidad de tiempo por una molécula de enzima totalmente saturada de sustrato. Es igual a la cte cinética K2 o Kcat.
Determinación de los valores de Km y Vmax
Representación recíproca doble(Lineweaver - Burk)
1/s-0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6
1/v
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
NUMERO DE RECAMBIO: Kcat
K cat = Vmax/ [E]T
Kcat = numero de moléculas de sustrato convertidas en producto por unidad de tiempo por una molécula enzimática en condiciones óptimas ( saturada por el sustrato).
[ E]T = concentración total de la enzima
Kcat/Km
Es una medida de la eficiencia catalítica:
Cuando la [S] >>> Km, la V = Kcat.
Cuando la [S] <<< Km, la V <<<Kcat y [E] es parecida a [E]T .
La mayoría de las reacciones bioquímicas incluye múltiples sustratos
Las reacciones en los sistemas biológicos incluyen normalmente dos S y dos P. Reacción bisustrato:
A+B P+Q
La mayoría de estas reacciones supone la transferencia de un grupo funcional (fosforilo, amonio) o de electrones (reacc. Redox) de un sustrato a otro.
Las reacciones de múltiples sustratos, se dividen en dos clases:
Desplazamiento secuencial y desplazamiento doble.
DESPLAZAMIENTO SECUENCIAL
Todos los sustratos se unen al enzima antes de que se libere cualquier producto.Se forma un complejo ternario entre el enzima y ambos sustratos (o productos).Existen dos tipos: ordenado (S se une al E en una secuencia definida) y al azar.
Mecanismo secuencial ordenado:
Mecanismo secuencial al azar:El orden de adición de sustratos y la liberación de productos es al azar.
DESPLAZAMIENTO DOBLE O PING-PONG
Uno ó más productos se liberan antes de que todos los sustratos se unan al enzima.La característica de estas reacciones es la existencia de un intermediario del enzima sustituido (que modifica al enzima temporalmente).
Son ejemplo las reacciones de transaminación (transferencia de grupos amino de un Aa a un α-cetoácido).
Los enzimas alostéricos no siguen la cinética de Michaelis-Menten
Los enzimas alostéricos contienen múltiples subunidades y múltiples centros activos.Muestran curvas sigmoideas en vez de las hiperbólicas.
La interacción de las subunidades hace a la unión del sustrato cooperativa, es decir la unión del S a un centro activo del enzima facilita la unión a otros centros activos.Además la actividad de estos enzimas se puede modificar por la unión de moléculas reguladoras (que se unen reversiblemente a otros centros que no son los catalíticos). Estos enzimas son reguladores de las vías metabólicas.
GRACIAS POR SU ATENCIÓN
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