Scopo delle tecniche di separazione per … Una centrifuga è uno strumento progettato per produrre una forza centrifuga superiore alla forza di gravità terrestre Le particelle in

CENTRIFUGAZIONE

Una centrifuga è uno strumento progettato per produrre una forza centrifuga superiore alla forza di gravità terrestre

Le particelle in soluzione se lasciate in condizioni di quiete tenderanno a sedimentare per effetto della gravità.

Per ogni particella la velocità alla quale essa sedimenta è proporzionale alla forza applicata, conseguentemente macromolecole in soluzione sedimentano più velocemente quando la forza applicata è maggiore di quella di gravità esercitata dalla terra

Scopo delle tecniche di separazione per centrifugazione

Esercitare una forza maggiore del campo gravitazionale terrestre aumentando la velocità di sedimentazione delle macromolecole, col fine di separare macromolecole che differiscono per densità, forma e dimensioni e quindi sedimentano con velocità diversa sotto l’influenza di un campo centrifugo applicato

CENTRIFUGA

Accelerazione centrifuga

L’ accelerazione centrifuga è definita campo centrifugo relativo (RCF)

r = raggio di rotazione

n = velocita del rotore definita come numero di ivoluzioni per minuto

RCF = 1.118r (n/1000)2

r.p.m = 945.7 RCF/r

Metodi di separazione

Sedimentazione differenziale la centrifugazione di una sospensione di particelle ad un RCF specifico per un tempo determinato provoca la formazione di un sedimento e di un sovranatante

Schema di un frazionamento di un omogenato di fegato di ratto nelle diverse frazioni subcellulari

Omogenato di fegato in saccarosio 0,25 M

Centrifugazione in gradiente di densità

Si utilizza una soluzione la cui densità aumenta in gradiente

Contiunuo (a)

Discontinuo (b)

Una barriera di densità a gradino singolo per sedimentare selettivamente una particella (c)

Gradienti

Centrifugazione Zonale

Si crea un gradiente poco ripido e le macromolecole si separeranno in funzione della massa ( quelle più grandi si muoveranno più velocemente)

Centrifugazione Isopicnica

Si basa sulla formazione di un gradiente ripido (molte sostanze come il saccarosio, il ficoll, creano dei gradienti durante la centrifugazione)

Si mescola il campione da separare con la sostanza appropriata e si centrifuga per il tempo necessario per la formazione dei gradienti

Le particelle sedimentano in funzione della loro densità.( si posizionano dove la loro densità è uguale a quella del mezzo

MATERIALI PER GRADIENTI MAGGIORMENTE IMPIEGATI E APPLICAZIONI

Densità e coefficiente di sedimetazione di componenti cellulari

TIPI DI CENTRIFUGHE (refrigerate e non refrigerate)

Centrifughe a bassa velocià (max 3000-6000 g.) si usano per raccogliere arganelli i grandi dimensioni e precipitati grossolani

Microcentrifughe (10000 g.) sono capaci di accelerazioni rapide

Centrifughe a flusso continuo utili per raccogliere grandi volumi di cellule. Durante la centrifugazione le particelle sedimetano mentre il liquido scorre attraverso il rotore

Centrifughe ad alta velocità (max 60000g) utili per frazionamento cellulare

Ultracentrifughe (MAX 600000 g) possiedono sistemi di vuoto e refrigerazione sofisticati e vengono usate per isolare piccoli organelli come i ribosomi e le vescicole di membrana

Tipi di rotore

Rotore basculante

Rotore ad angolo fisso

Rotore con provette verticaliSono usati per la separazione isopicnica in gradiente di densità nelle centrifughe ad alta velocità e nelle ultracentrifughe

IMP: Non si possono utilizzare per particelle in sospensione perché non si forma sedimento

Note

- E’ importante utilizzare provette di materiale idoneo a resistere alle sollecitazioni che si generano durante la centrifugazione

-E’ importante bilanciare le provette in centrifuga per evitare pericolose vibrazioni del rotore.