OZON TERAPİ PARASETAMOL HEPATOTOKSİSİTESİNİN ÖNLENMESİNDE DOST MU, DÜŞMAN MI? Selin AKYÜZ, Berkan KARABUĞA, Ekin KONCA, DoğuĢcan KURULAR, Özer TUÇ Danışman: Yrd. Doç. Dr. Tolga ReĢat AYDOS ÖZET ÇalıĢmanın amacı, ozon terapinin parasetamol hepatotoksisitesi üzerine koruyucu etkisini araĢtırmak ve bu etkiyi parasetamol hepatotoksisitesini antioksidan özelliğiyle önlediği bilinen taurin ile kıyaslamaktır. ÇalıĢmamızda 30 eriĢkin Swiss albino fare (15 erkek, 15 diĢi) (38.9±0.71 g) kullanıldı. ÇalıĢma, her birinde rastgele seçilmiĢ 6 fare (3 erkek, 3 diĢi) bulunan 5 grupta gerçekleĢtirildi: 1. Kontrol grubu (0,05 ml/gr ılık serum fizyolojik [SF] verildi) 2. Parasetamol grubu (400 mg/kg i.p. [SF’de çözüldü]) 3. Taurin (%10’luk sulu çözeltide, 7.5 ml/kg i.p.) ve 30 dk sonra parasetamol uygulanan grup 4. Ozon terapi (1 mg/kg i.p., %5 O 3 -%95 O 2 ) ve 30 dk sonra parasetamol uygulanan grup 5. Taurin+Ozonterapi ve 30 dk sonra parasetamol uygulanan grup SF ve parasetamol uygulamasından 4 saat sonra anestezi altında tüm deney gruplarından karaciğer ve intrakardiyak kan örnekleri alındı. Kan örneklerinde serum ALT, AST, LDH düzeyleri; karaciğer örneklerinde ise elektron mikroskobu ile histolojik değiĢiklikler araĢtırıldı. Biyokimya sonuçları değerlendirildiğinde, tüm gruplarda parasetamol uygulamasının karaciğer enzim değerlerini anlamlı düzeyde artırdığı saptandı. ALT düzeylerine bakıldığında taurin ve/veya ozon terapi uygulamasının parasetamol etkisiyle olan yükselmeyi istatistiksel anlamlı düzeyde engellediği ve tek baĢına ozon uygulamasının koruyucu etkisinin daha belirgin olduğu görüldü (p<0.01). AST ve LDH düzeylerindeki değiĢiklikler incelendiğinde ise taurin ve/veya ozon terapinin enzim düzeyleri üzerinde anlamlı bir etkisinin olmadığı saptandı. Histolojik değerlendirmede ise, parasetamolle belirgin hücre hasarı oluĢumu yanı sıra mitokondri zar bütünlüğünün ve krista yapısının bozulduğu; sinüzoid dilatasyonu, safra kanallarında eritrosit ve apoptotik hücre varlığı saptanmıĢ olup taurin ve/veya ozon uygulanan gruplarda hepatosit sitoplazmalarında belirgin vakuol oluĢumu ve bağlantı birimlerinde açılmalar gözlendi. Tek baĢına ozon uygulanan grupta ise hasar oluĢumunun nispeten daha az olduğu tespit edildi.
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
OZON TERAPİ PARASETAMOL HEPATOTOKSİSİTESİNİN
ÖNLENMESİNDE DOST MU, DÜŞMAN MI?
Selin AKYÜZ, Berkan KARABUĞA, Ekin KONCA, DoğuĢcan KURULAR, Özer TUÇ
Danışman: Yrd. Doç. Dr. Tolga ReĢat AYDOS
ÖZET
ÇalıĢmanın amacı, ozon terapinin parasetamol hepatotoksisitesi üzerine koruyucu etkisini araĢtırmak ve bu etkiyi parasetamol hepatotoksisitesini
antioksidan özelliğiyle önlediği bilinen taurin ile kıyaslamaktır.
ÇalıĢmamızda 30 eriĢkin Swiss albino fare (15 erkek, 15 diĢi) (38.9±0.71 g) kullanıldı. ÇalıĢma, her birinde rastgele seçilmiĢ 6 fare (3 erkek, 3 diĢi)
bulunan 5 grupta gerçekleĢtirildi: 1. Kontrol grubu (0,05 ml/gr ılık serum fizyolojik [SF] verildi)
2. Parasetamol grubu (400 mg/kg i.p. [SF’de çözüldü]) 3. Taurin (%10’luk sulu çözeltide, 7.5 ml/kg i.p.) ve 30 dk sonra
parasetamol uygulanan grup
4. Ozon terapi (1 mg/kg i.p., %5 O3-%95 O2) ve 30 dk sonra parasetamol uygulanan grup
5. Taurin+Ozonterapi ve 30 dk sonra parasetamol uygulanan grup SF ve parasetamol uygulamasından 4 saat sonra anestezi altında tüm
deney gruplarından karaciğer ve intrakardiyak kan örnekleri alındı. Kan örneklerinde serum ALT, AST, LDH düzeyleri; karaciğer örneklerinde ise
elektron mikroskobu ile histolojik değiĢiklikler araĢtırıldı.
Biyokimya sonuçları değerlendirildiğinde, tüm gruplarda parasetamol uygulamasının karaciğer enzim değerlerini anlamlı düzeyde artırdığı
saptandı. ALT düzeylerine bakıldığında taurin ve/veya ozon terapi uygulamasının parasetamol etkisiyle olan yükselmeyi istatistiksel anlamlı
düzeyde engellediği ve tek baĢına ozon uygulamasının koruyucu etkisinin daha belirgin olduğu görüldü (p<0.01). AST ve LDH düzeylerindeki
değiĢiklikler incelendiğinde ise taurin ve/veya ozon terapinin enzim
düzeyleri üzerinde anlamlı bir etkisinin olmadığı saptandı.
Histolojik değerlendirmede ise, parasetamolle belirgin hücre hasarı oluĢumu yanı sıra mitokondri zar bütünlüğünün ve krista yapısının
bozulduğu; sinüzoid dilatasyonu, safra kanallarında eritrosit ve apoptotik hücre varlığı saptanmıĢ olup taurin ve/veya ozon uygulanan gruplarda
hepatosit sitoplazmalarında belirgin vakuol oluĢumu ve bağlantı birimlerinde açılmalar gözlendi. Tek baĢına ozon uygulanan grupta ise
hasar oluĢumunun nispeten daha az olduğu tespit edildi.
Sonuç olarak, yüksek doz parasetamolün karaciğer dokusunda oluĢturduğu oksidatif hasar, intraperitoneal ozon ön-uygulaması ile kısmen
Toplumumuzda yaygın kullanılan bir analjezik ilaç olan parasetamol
(Asetaminofen [APAP])’ün terapötik dozlarının karaciğerde detoksifikasyonu kolaylıkla gerçekleĢebilmektedir. Bu detoksifikasyon
karaciğerin faz 2 ilaç metabolize eden sistemleri ile sülfasyon ve glukuronidasyon aracılığıyla sağlanır (4, 8). Bu sistem N-asetil-p-
benzokinonimin (NAPBQI)’in indirgenmiĢ glutatyon (GSH) ile spontan
olarak veya glutatyon-S-transferaz (GST) aracılı GSH ile konjugasyonuyla sağlanır. Ancak parasetamolün aĢırı dozda kullanımı sitokrom p450
mikrozomal enzimleri aracılığıyla aĢırı reaktif elektrofilik arilleyici ara ürün NAPBQI’nın deriĢiminin artmasına neden olarak hepatik nekrozise ve ileri
aĢamalarda karaciğer yetmezliğine sebep olabilmektedir (1, 2). Hücre içinde NAPBQI deriĢiminin artması hücreyi birçok mekanizma ile ölüme
götürür. Bu mekanizmalar aĢağıda verilmiĢtir:
- NAPBQI, GST’nin aktivitesini bloke ederek GSH sentezini baskılar. Ayrıca serbest GSH’ı bağlayarak hücredeki mevcut GSH’ı tüketir.
Hücre içi GSH azalması hücre içinde oksidatif stres oluĢmasına neden olarak hücre içi GSH/GSSG (okside glutatyon) oranını düĢürür
O3-%95 O2) uygulaması gerçekleĢtirildi ve 30 dk sonra parasetamol i.p. olarak uygulandı.
5. Taurin+OzonTerapi+Parasetamol grubu: Önce taurin ardından
ozon terapi i.p. uygulandı ve bu iĢlemlerden 30 dk sonra parasetamol i.p. olarak uygulandı.
Parasetamol, taurin, ozon terapi dozları, her grup için ortalama ağırlıklar göz önünde bulundurularak hesaplandı.
Parasetamol uygulamasından 4 saat sonra tüm gruplara ketamin/ksilazin
anestezisi (100/10 mg/kg, i.m.) uygulamasını takiben toraks ve abdomen açılarak, tüm kan intrakardiyak olarak alındıktan sonra fareler sakrifiye
edildi. Kan örnekleri 20 dakikalık bekleme periyodunu takiben santrifüj edildikten sonra örneklerin serum fraksiyonları biyokimyasal olarak
incelendi; AST, ALT, LDH değerlerine bakıldı.
Ayrıca, farelerin karaciğerleri çıkartılarak 1mm3’lük parçalara bölündükten sonra 0.1M fosfat tamponlu %2.5’lik gluteraldehitte (pH 7.4) 2 saat tespit
edildi. Tespit süresi bitiminde tampon ile 3 kez yıkanan dokular 1 saat %1’lik osmium tetroksit ile etkin bırakılarak post fiksasyonları yapıldı. Süre
bitiminde dereceli alkol serilerinden geçirilen dokuların dehidrate olmaları sağlandı. Son olarak propilenoksite maruz bırakılan dokular Araldit CY212
kit ile hazırlanan gömme materyaline gömülerek bloklar hazırlandı. 56°C’lık etüvde 48 saat süreyle polimerize edilen bloklardan yarı-ince
kesitler alınarak toluidin mavisi ile boyandı ve ıĢık mikroskopta incelendi.
ĠĢaretlenen bölgelerden alınan yaklaĢık 0.5 ’luk ince kesitler “uranil asetat
– kurĢun sitrat” ile boyanarak Carl Zeiss 906 E geçirimli elektron
mikroskopta (TEM) değerlendirildi.
Ġntraperitoneal uygulanan ozon, EveozoneBasicPlus marka ozon üretim
cihazı kullanılarak üretildi.
Sonuçların istatistiksel değerlendirmesi SPSS® 17.00 istatistik paket programı ile parametrik olmayan Kruskal-Wallis testi ve ardından çoklu
karĢılaĢtırma yöntemlerinden Dunn testi kullanılarak yapıldı. P<0.05 istatistiksel anlamlı farklılık olarak kabul edildi. Sonuçlar ortanca değer, 1.
çeyrek ve 3. çeyrek olarak ifade edildi.
BULGULAR
Biyokimya Bulguları:
Biyokimya sonuçları değerlendirildiğinde, tüm gruplarda parasetamol
uygulamasının karaciğer enzim değerlerini anlamlı düzeyde artırdığı saptandı. ALT düzeylerine bakıldığında taurin ve/veya ozon terapi
uygulamasının parasetamol etkisiyle olan yükselmeyi istatistiksel anlamlı düzeyde engellediği ve tek baĢına ozon uygulamasının koruyucu etkisinin
daha belirgin olduğu görüldü (p<0.01). AST ve LDH düzeylerindeki değiĢiklikler incelendiğinde ise taurin ve/veya ozon terapinin,
parasetamolün artırdığı enzim düzeyleri üzerinde anlamlı bir etkisinin olmadığı saptandı (ġekil 1).
Şekil 1. Sıçan kan serum ALT, AST ve LDH düzeyleri.
Histolojik Bulgular:
Kontrol Grubu: Santral ven çevresinde ıĢınsal yerleĢim gösteren
karaciğer hücreleri ve Disse aralığında normal yapısal özellikleri ile Kupffer hücresi ayırt edildi. Hepatosit sitoplazmasında hücre çekirdeği, elektron
yoğun matriksli mitokondri izlendi. Disse aralığı normal yapıdaydı. Büyük büyütmeli fotoğrafta (ġekil 2) hepatositlerin birbirine bakan yüzünde safra
kanaliküli ve bağlantı birimleri izlendi. Hepatosit sitoplazmasında az sayıda vakuol belirlendi.
Parasetamol Grubu: Küçük büyütmeli fotoğraflarda santral ven
çevresinde hepatosit çekirdeklerinin ökromatinden zengin olduğu saptandı. Mitokondri kristalizisine bağlı olarak oluĢtuğu düĢünülen çok sayıda
vakuolün Ģekillendiği görüldü. Hücrelerin Disse aralığına bakan yüzünde yapısal bütünlüklerini koruyamadıkları izlenirken sinüzoidal kapillerde
belirgin dilatasyon ve staz görüldü. GeniĢleyen sinozoitlerin çevresinde
kollajen lif birikimi belirgindi. Büyük büyültmeli fotoğrafta vakuoller ve açık renk sitoplazmalıdejeneratif hücreler görülürken safra kanalikülünde
normal yapısal özelliklerin kaybolduğu saptandı (ġekil 3).
Taurin ve Parasetamol Grubu: Küçük büyültmeli elektron mikroskop fotoğraflarında sinüzoitlerde dilatasyon, staz ve hücre sitoplazmasını
kaplayan dev vakuoller belirlendi. Hepatosit çekirdeklerinin yer yer heterokromatinden zengin olduğu ve normal yuvarlak Ģekillerini oluĢan
vakuoller nedeniyle yitirdikleri görüldü. Büyük büyültmeli fotoğraflarda iri
ve yoğun matriksli mitokondri ayırt edildi. Safra kanalikülünün oldukça geniĢlediği ve hepatositlerin bu alanlarda sıkı bağlantı birimlerini
yitirdikleri belirlendi (ġekil 4).
Ozon Terapi ve Parasetamol Grubu: Dejeneratif oluĢumlar ayırt
edilmesine karĢın yapının parasetamol uygulanan gruba göre biraz daha
korunmuĢ olduğu dikkati çekti. Sinüzoitler normal yapı sergilerken bazı alanlarda bu grupta da sinüzoit çevresinde kollajen lif birikimi gözlendi.
Hepatosit çekirdekleri ökromatinden zengin olarak görüldü. Kontrol grubunda olduğu gibi yoğun matriksli mitokondri görüldü. Disse aralığında
hepatosit mikrovillusları ve otofajik vakuoller içeren Kupffer hücreleri belirlendi. Safra kanaliküllerinin bazı alanlarda yapısal bütünlüğünü
korurken bazı alanlarda dilatasyon gösterdiği saptandı. Kontrol grubunda da görülen safra kanaliküllerinin her iki yanındaki sıkı bağlantı birimleri bu
grupta da belirgin olarak izlendi. Ayrıca vakuol oluĢumu da kısmen daha az olarak saptandı (ġekil 5).
Taurin, Ozon Terapi ve Parasetamol Grubu: Parasetamol kaynaklı
dejeneratif değiĢikliklerin diğer gruplara karĢın daha belirgin olduğu izlendi. Hücre çekirdeğinin heterokromatinden zengin olduğu izlendi. Bazı
alanlarda mitokondri kristalizisinin yeni vakuol oluĢumlarına neden olduğu saptandı. Safra kanaliküllerinde dilatasyon ve bağlantı birimlerindeki
açılma bu grupta da belirgin olarak izlendi. Herring kanalı çevresinde kollajen lif birikimi gözlendi (ġekil 6).
Ayrıca, deney gruplarındaki sıçanların karaciğerleri makroskopik olarak
incelendiğinde kontrol grubunda karaciğer normal yapıya sahip olarak gözlenirken (ġekil 7A) parasetamol grubundaki sıçanların karaciğerlerinde
büyümenin ve kanama odaklarının mevcut olduğu, renk ve Ģekil bozukluğunun oluĢtuğu görülmektedir (ġekil 7B, D, E). Ozon terapi
uygulanan gruptaki sıçanların karaciğerleri incelendiğinde ise kontrol grubu karaciğerlerine benzer normal yapıya ve renge sahip oldukları tespit
edilmiĢtir (ġekil 7C).
Tüm histolojik bulgular göz önünde bulundurulduğunda, yüksek doz
uygulanan parasetamolle belirgin hücre hasarı oluĢumu yanı sıra mitokondri zar bütünlüğünün ve krista yapısının bozulduğu;
sinüzoitdilatasyonu, safra kanallarında eritrosit ve apoptotik hücre varlığı saptanmıĢ olup taurin ve/veya ozon uygulanan gruplarda hepatosit
sitoplazmalarında belirgin vakuol oluĢumu ve bağlantı birimlerinde
açılmalar gözlendi. Tek baĢına ozon uygulanan grupta ise hasar oluĢumunun nispeten daha az olduğu tespit edildi.
Şekil 2. Kontrol grubu sıçan karaciğer dokusuna ait elektron mikroskobu
Sinüzoit, : Dejenere hepatosit, ; Sıkı bağlantı birimleri).
Şekil 7. Farklı deney gruplarına ait sıçan karaciğerlerinin makroskopik görünümleri (A: Kontrol grubu; B, D, E: Parasetamol grubu; C: Ozon-
Parasetamol grubu).
A)
E)
C) D)
B)
TARTIŞMA
ÇalıĢmamızda farelerde yüksek doz parasetamolün oluĢturduğu
hepatotoksisite üzerine ozon terapinin etkisi taurinin etkisiyle kıyaslanarak araĢtırıldı.
Yüksek doz parasetamol uygulaması diğer çalıĢmalarda gösterildiği Ģekilde
karaciğer enzim düzeylerinde belirgin artıĢa yol açtı (9). Taurin ve/veya ozon terapi uygulamaları ile ALT düzeyindeki artıĢ anlamlı olarak
önlenebildi. Tek baĢına ozon terapi uygulamasının önleyici etkisi daha belirgin olarak ortaya çıktı. Diğer çalıĢmalarda parasetamol ile olan AST ve
LDH düzeylerindeki artıĢın taurin ve diğer antioksidan ajanlarla önlendiği gösterilmiĢ olmasına rağmen (9) çalıĢmamızda taurin ve/veya ozon
terapinin AST ve LDH düzeyleri üzerine herhangi bir etkisi gözlenmedi. Bunun sebepleri Ģunlar olabilir:
1. Kan alımı sırasında eritrosit hemolizine yol açılması (10)
2. Parasetamolün oksidatif reaksiyonları artırmasına bağlı olarak eritrosit membran hasarı sonucu hemolize yatkınlık (10)
Histolojik inceleme sonuçlarında ise safra kanaliküllerinin mikrovillüs
yapılarının ve iki yanındaki sıkı bağlantı birimlerinin az olmakla birlikte, ozon terapi uygulanan grupta daha fazla korunduğu ve vakuol
oluĢumunun da daha az olduğu gözlendi.
ÇalıĢmamızda, bir non-steroidal antiinflamatuar, antipiretik ve analzejik ilaç olan ve dünya çapında yaygın olarak kullanılan parasetamolün yüksek
doz kullanımında oksidatif strese bağlı oluĢturduğu hepatotoksik etkilerinin antioksidan özellikli ozon ile önlenebilmesi için bir deney hayvanı modeli
üzerinde çözüm yolu geliĢtirilmesi hedeflenmiĢtir. Bulgularımız ıĢığında, özellikle ozon terapinin yüksek doz parasetamol uygulaması sonucu
meydana gelen karaciğer hasarı üzerine kısmen koruyucu etkilerinin olduğu sonucuna varılmıĢtır.
Kaynaklar:
1-Dahlin DC, Miwa GT, Lu AYH, Nelson SD. N-Acetyl-p-benzoquinone imine: A cytochrome P-450-mediated oxidationproduct of