(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 2007420 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 12.04.2007 07755417.8 (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 06.03.2013 Europejski Biuletyn Patentowy 2013/10 EP 2007420 B1 (13) (51) T3 Int.Cl. C07K 14/33 (2006.01) A61K 39/08 (2006.01) A61K 35/74 (2006.01) (54) Tytuł wynalazku: Rekombinowane, atenuowane organizmy Clostridium i szczepionka (30) Pierwszeństwo: 17.04.2006 US 792553 P (43) Zgłoszenie ogłoszono: 31.12.2008 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2009/01 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: 30.08.2013 Wiadomości Urzędu Patentowego 2013/08 (73) Uprawniony z patentu: INTERVET INTERNATIONAL B.V., Boxmeer, NL (72) Twórca(y) wynalazku: MARK D. COCHRAN, Carlsbad, US GARY PETERSEN, Omaha, US STEVEN V. LAIR, Temecula, US RICHARD SYNENKI, San Diego, US (74) Pełnomocnik: PL/EP 2007420 T3 rzecz. pat. Magdalena Tagowska PATPOL KANCELARIA PATENTOWA SP. Z O.O. ul. Nowoursynowska 162 J 02-776 Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).
51
Embed
RZECZPOSPOLITA TŁUMACZENIE PATENTU …public.sds.tiktalik.com/patenty/pdf/252760.pdf · miot rosnących obaw związanych z promowaniem oporności bakterii. [0005] Niedawno podjęto
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 2007420 RZECZPOSPOLITA POLSKA
Urząd Patentowy Rzeczypospolitej
Polskiej
(96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 12.04.2007 07755417.8 (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 06.03.2013 Europejski Biuletyn Patentowy 2013/10 EP 2007420 B1
Rekombinowane, atenuowane organizmy Clostridium i szczepionka
(30) Pierwszeństwo:
17.04.2006 US 792553 P
(43) Zgłoszenie ogłoszono:
31.12.2008 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2009/01
(45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:
30.08.2013 Wiadomości Urzędu Patentowego 2013/08
(73) Uprawniony z patentu:
INTERVET INTERNATIONAL B.V., Boxmeer, NL
(72) Twórca(y) wynalazku:
MARK D. COCHRAN, Carlsbad, US GARY PETERSEN, Omaha, US STEVEN V. LAIR, Temecula, US RICHARD SYNENKI, San Diego, US
(74) Pełnomocnik:
PL/E
P 20
0742
0 T3
rzecz. pat. Magdalena Tagowska PATPOL KANCELARIA PATENTOWA SP. Z O.O. ul. Nowoursynowska 162 J 02-776 Warszawa
Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).
EP 2 007 420 B1
1
Opis
ODNOŚNIKI DO ZGŁOSZEŃ POKREWNYCH
5
[0001] To zgłoszenie jest zgłoszeniem nie tymczasowym, które zastrzega pierwszeństwo, zgodnie z §
119(e) 35 U.S.C, zgłoszenia tymczasowego USA nr seryjny 60/792,553, złożonego 17 kwietnia 2006.
DZIEDZINA WYNALAZKU
10
[0002] Ten wynalazek dotyczy atenuowanych organizmów Clostridium, sposobów ich wytwarzania i stoso-
wania oraz mutein toksyny alfa i kodujących je kwasów nukleinowych.
TŁO WYNALAZKU15
[0003] Beztlenowe patogeny bakteryjne stanowią poważne obciążenie ekonomiczne dla przemysłu rolnego.
Bakterie z rodziny Clostridium są szczególnym obciążeniem, ponieważ bakterie te powodują poważne cho-
roby u drobiu i innych ekonomicznie wartościowych zwierząt domowych. Wcześniejsze wysiłki mające na
celu zwalczanie tych organizmów opierały się na środkach sanitarnych i podawaniu antybiotyków w paszy
dla zwierząt.20
[0004] Konkretnie, Clostridium perfringens („C. perfringens”) jest bakterią beztlenową, która znajduje się w
glebie, rozkładając substancję organiczną, a po części we florze jelitowej u ludzi i zwierząt. Różne szczepy
C. perfringens są oznaczone jakoe biotypy od A do E, w zależności od spektrum wytwarzanych toksyn [Ju-
stin i wsp., Biochemistry 41, 6253-6262 (2002); McDonel (1986) PHARMACOLOGY OF BACTERIAL
TOXINS ; F Domer and J Drews (Red.) Pergamon Press, Oxford]. Szczepy biotypu A są szczególnie ważne25
jako czynniki etiologiczne różnych typów zgorzeli i chorób jelitowych. Szczególnie poważną chorobą jelitową
wywoływaną przez C. perfringens jest nekrotyczne zapalenie jelit (znane również jako „martwicowe zapale-
nie jelit”), zgorzel jelit skutkująca martwicą, posocznicą i hemolizą, zarówno u ludzi, jak i u zwierząt domo-
wych [patrz, Pearson i wsp., J. Am. Vet. Med. 188(11):1309-10 (1986); Al-Sheikhy and Truscott, Avian Dis.
21(2):256-63 (1977)]. W przypadku ptaków, np. kur (Gallus gallus), zgorzelinowe zapalenie jelit to znaczą-30
cym problem. C. perfringens zarówno typu A, jak i typu C, może spowodować znaczne straty, zwłaszcza w
produkcji brojlerów [Ficken and Wages, Necrotic Enteritis, W Diseases of Poultry, wyd. 10., str 261-264
(1997)]. Oprócz strat związanych z wybuchem nekrotycznego zapalenia jelit, istnieją doniesienia o obniżeniu
produktywności w stadach z chorobą związaną z C. perfringens [Lovl and Kaldhusdal, Avian Pathology
30:73-81 (2001)]. Jak wspomniano powyżej, środki antybakteryjne dodawane do paszy są najczęściej sto-35
sowaną metodą kontroli. Jednak, środki przeciwbakteryjne, np. antybiotyki, są kosztowne i stanowią przed-
miot rosnących obaw związanych z promowaniem oporności bakterii.
[0005] Niedawno podjęto próby dostarczenia szczepionek przeciwko szkodliwym gatunkom Clostridium. Na
Niektórzy przedstawiciele rodziny SerranidaeNAZWA SYSTEMATYCZNA NAZWA ZWYCZAJOWACentropristis ocyurus ang. Bank sea bassCentropristis philadelphicus ang. Rock sea bassCentropristis striata strzępiel czarnyDiplectrum bivittatum ang. Dwarf sandperchDiplectrum formosum Strzępiel piaskowyEpinephelus flavolimbatus Granik strojnyEpinephelus morio Granik morioSerranus phoebe ang. TattlerSerranus tortuqarum ang. Chalk bass
Niektórzy przedstawiciele rodziny SparidaeNAZWA SYSTEMATYCZNA NAZWA ZWYCZAJOWAArchosarqus probatocephalus Sparus owczarzArchosarqus rhomboidalis Sparus jednoplamyCalamus penna ang. Sheepshead porgyLaqodon rhomboides ang. PinfishPagrus Major Pagrus japońskiSparus aurata DoradaStenotomus chrysops Skap
Niektórzy przedstawiciele rodziny CichlidaeNAZWA SYSTEMATYCZNA NAZWA ZWYCZAJOWAAequidens latifrons Akra błękitnaCichlisoma nigrofasciatum Pielęgnica zebaCrenichichla sp. ang. Pike cichlidPterophyllum scalare Skalar
Niektórzy przedstawiciele rodziny CentrarchidaeNAZWA SYSTEMATYCZNA NAZWA ZWYCZAJOWAAmbloplites rupestris Bass czerwonookiCentrarchus macropterus Bass pawik, okoń pawik
Okoń moczarowyElassoma okefenokee ang. Okefenokee pigmy sun-
fishElassoma zonatum Okończyk paskowanyEnneacanthus gloriosus Bassek diamentowyEnneacanthus obesus Bassek zielonyLepomis auritus Bass różowyLepomis cyanellus Bass zielonyLepomis cyanellus X L. qibbosus Bass zielony x bass słoneczny Lepomis gibbosus Bass słoneczny, słonecznica
pstraLepomis gulbsus ang. WarmouthLepomis humilis ang. Orange-spotted sunfishLepomis macrochirus Bass pręgowany, bass błękit-
noskrzelny, bass niebieski Lepomis megalotis ang. Longear sunfishMicropterus coosae ang. Shoal bassMicropterus dolomieui Bass małogębowyMicropterus punctulatus ang. Spotted bassMicropterus salmoides Bass wielkogębowy, oko-
jelitowego i może również działać konkurencyjnie zapobiegając następującej potem kolonizacji C. perfrin-5
gens typu dzikiego.
[0082] Dla ptaków, takich jak drób, w tym kur, kaczek, gęsi, itp., najbardziej przydatnymi drogami szczepie-
nia są sposób doustny lub wstrzykiwanie in ovo. Droga in ovo jest podana jako przykład tu poniżej i daje
aktywną immunizację i ochronę przed prowokacją u wyklutych kurcząt.
10
Ekspresja obcych genów przez C. perfringens
[0083] Stosując techniki opracowane w poprzednich przykładach, dowolny gen niewystępujący naturalnie,
tj., obcy dla C. perfringens, może być ewentualnie wstawiony do chromosomowego DNA C. perfringens. Dla
ekspresji obcych białek, można wytworzyć fuzje genowe, które zabezpieczają sekwencje flankujące gen15
toksyny alfa, promotor toksyny alfa i jej sekwencję sygnałową. W jednym wykonaniu, większość sekwencji
kodującej genu plc jest zastąpiona przez obcy gen. Pozostałe nukleotydy genu plc poniżej wstawionego
genu są poza ramką odczytu, a zatem nie jest wytwarzana funkcjonalna toksyna alfa. Alternatywnie, obcy
gen można wprowadzić w ramce do sekwencji nukleotydowej kodującej muteinę toksyny alfa, tworząc fuzję
białkową toksyna alfa-obce białko.20
[0084] Startery oligonukleotydowe dla obcego genu można zsyntetyzować np. z N-końcową sekwencją
znacznika FLAG i odpowiednimi miejscami restrykcyjnymi. Produkty PCR można wklonować do wektora
samobójczego; znacznik FLAG i obcy gen są wstawione w ramce z sekwencją sygnałową toksyny alfa. Obce
białko ulega ekspresji pod kontrolą promotora toksyny alfa i jest kierowane do sekrecji przez sekwencję sy-
gnałową plc. Wydzielane obce białko można wykryć w supernatancie hodowlanym przez analizę Western 25
przy użyciu przeciwciała anty-FLAG.
[0085] W ten sposób można wstawić do genomu C. perfringens dowolny odpowiedni obcy gen. Obejmuje
to, na przykład, DNA kodujący antygeny z patogenów przewodu żołądkowo-jelitowego, w tym, np. białka
antygenowe z bakterii, takich jak E. coli, gatunki Salmonella, gatunki Campylobacter, gatunki Lawsonia i tym
podobne; białka antygenowe pasożytów, takich jak gatunki Eimeria, gatunki Isospora, gatunki Cryptospori-30
dium i tym podobne oraz białka antygenowe wirusów, takich jak rotawirusy, koronawirusy i tym podobne, w
celu immunizacji zwierząt traktowanych takim rekombinowanym C. perfringens. Inne białka, które mogą być
wyrażone przez taki rekombinowany C. perfringens obejmują białka lub peptydy terapeutyczne. Ewentualnie,
obejmują one peptydy, które są endogenne dla przewodu żołądkowo-jelitowego, obejmując czynnik trójlistny
lub dowolny typ cytokiny znany w tej dziedzinie, np. kurzą IL-18 i tym podobne.35
[0086] Jeden z takich konstruktów C. perfringens wyraża kurze białko IL-18. Podawanie żywych bakterii
zawierających fuzję genową umożliwi dostarczenie terapeutycznych dawek IL-18 do jelita, będąc jednak
stosunkowo nieszkodliwymi dla zwierzęcia-gospodarza ze względu na brak wytwarzania toksyny alfa. Za
pomocą tego systemu można również uzyskać ekspresję innych środków leczniczych.
[0087] Poniższe konkretne przykłady są włączone dla celów ilustracji i nie mają na celu ograniczenia zakre-40
su wynalazku, o ile nie wskazano, że jest inaczej.
EP 2 007 420 B1
19
Przykład 1WEKTOR W OPARCIU O HOMOLOGIĘ DLA TOKSYNY ALFA C. PERFRINGENS Z DELECJĄ [0088] Wytworzono wektor plazmidowy 1162-55-20 w oparciu o homologię, przydatny w konstrukcji toksyny
alfa C. perfringens z delecjami. Plazmid zawiera wiele ważnych elementów; region replikacji z plazmidu E.
coli pUC18; geny oporności na chloramfenikol (catP) i erytromycynę (ermBP) C. perfringens (obydwa podle-5
gają również ekspresji w E. coli); i gen toksyny alfa (plc) C. perfringens inaktywowany przez konkretną dele-
cję 9 aminokwasów. Plazmid 1162-55-20 został wytworzony w kilku etapach, jak następuje.
[0089] Najpierw sklonowano gen plc z ostatniego ptasiego izolatu C. perfringens (szczepu CP6). Do zapro-
jektowania starterów oligonukleotydowych do zastosowania w klonowaniu genu plc wykorzystano sekwencję
szczepu 13 C. perfringens (GenBank NC 003366, SEK. ID. NR: 2). Te i wszystkie kolejne startery otrzymano10
komercyjnie z Sigma Genosys, Woodlands. Starter sensowny’, położony w obrębie genu yplc (CPE0035),
5’AGCTGCATAAGCAAAAGTTCCAACTC 3' (SEK. ID. NR: 14), odpowiada nukleotydom 47675-47700
szczepu 13 (SEK. ID. NR: 2). Starter antysensowny, położony w obrębie genu cobW (CPE0037),
5'GCAGAAACTCTTCTTAGACCTATTCTTTTAGGC 3' (SEK. ID. NR: 15), jest komplementarny do nukleoty-
dów 50597-50629 szczepu 13. Startery te zastosowano wraz z genomowym DNA ze szczepu CP6 C. per-15
fringens w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) o szerokim zasięgu. Produkt o długości 2955 par zasad, od
leżącego po stronie 5’ genu yplc do leżącego po stronie 3’ genu cobW, przewidziano ze znanej sekwencji
szczepu 13 (jak pokazano na Fig. 1). Promotor toksyny alfa, sekwencja sygnałowa i sekwencja kodująca
genu plc (CPE0036) są zawarte w tym fragmencie, tj. między leżącym powyżej genem yplc i leżącym poniżej
3’ genem cob W. Fragment PCR złożony z 2955 par zasad wklonowano następnie do wektora do klonowa-20
nia, pCR-Blunt (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA), otrzymując plazmid 1162-52.1. Z tego fragmentu
określono sekwencję nukleotydową regionu kodującego plc złożonego z 2955 par zasad ze szczepu CP 6
(SEK ID NR: 22, a odpowiedni polipeptyd to SEK. ID. NR: 23) i wykazano, że jest zasadniczo homologiczny
do tego w genie plc ze szczepu 13 C. perfringens (SEK. ID. NR: 2).
[0090] Następnie sklonowano region replikacji E. coli i geny oporności C. perfringens z plazmidu wahadło-25
106 transformantów/µg DNA plazmidu pJIR418. Szczep ten został wybrany jako szczep rodzicielski do kon-
strukcji szczepu z delecją CPERF001. Szczep 29 został wybrany jako szczep rodzicielski dla CPERF002.
40
EP 2 007 420 B1
21
Tabela 1Wydajność transformacji dla ptasich izolatów C. perfringens
Szczep A C. perf. Transformanty/µg pJIR418
29 3,6 x 104
23 5,6 x 102
1220 4,0 x 108
1240 9,2 x 106
CP-2 Żadnych1230 7,1 x 103
5227 Żadnych5230 Żadnych
Źródłem wyżej wymienionych szczepów typu dzikiego była dr J. Glenn Songer, Dept. of Veterinary Scien-ces and Microbiology,University of Arizona, Tucson, Arizona 85721
[0096] Komórki szczepu 1240 C. perfringens z całonocnej hodowli beztlenowej w pożywce TSYC (30 g/l
ła z białkiem o wielkości oczekiwanej dla białka anatoksyny alfa.
[0104] CPERF001 jest uzyskanym na drodze inżynierii genetycznej szczepem C. perfringens typu A z dele-
cją. Szczep ten wydziela inaktywowaną postać anatoksyny dla toksyny alfa C. perfringens. Ponieważ szczep
ten nie wyraża już aktywnej toksyny alfa, ale zachowuje znaczną część antygenowości toksyny, będzie
przydatny jako szczepionka do ochrony przed chorobą powodowaną przez C. perfringens.20
PRZYKŁAD 3KONSTRUKCJA REKOMBINOWANEGO CLOSTRIDIUM PERFRINGENS CPERF002[0105] W celu skompensowania niższej wydajności transformacji szczepu 29 C. perfringens (patrz Tabela 1,
powyżej) skonstruowano nowy wektor w oparciu o homologię. Nowy wektor zawierał sekwencje C. perfrin-25
gens sklonowane bezpośrednio z genomu szczepu 29. Przewidywano, że będzie to skutkowało bardziej
wydajnym etapem rekombinacji. Nowy wektor, 1192-38.3, wytworzono jak następuje.
[0106] W pierwszym etapie region replikacyjny E. coli i geny oporności C. perfringens sklonowano z plazmi-
du wahadłowego pJIR418 (Sloan i wsp., Plasmid 27, 207 (1992); GeneBank M77169). Plazmid pJIR418
temu brakuje początku replikacji C. perfringens, ale w przeciwieństwie do plazmidu 1162-45.1, który został
skonstruowany w Przykładzie 1, zachowuje całe miejsce wielokrotnego klonowania z pJIR418.
[0107] W następnym etapie, C-końcową połowę genu plc wklonowano do plazmidu pośredniego 1192-23.1.
Genomowy DNA ze szczepu 29 zastosowano jako matrycę do PCR o szerokim zasięgu. Amplifikowano
region genu plc (toksyny alfa) od miejsca BamHI przez część genu CPE0038. Starter sensownydla plc, 5’35
CTGGGATCCTGATACAGATAATAATTTCTCAAAGGAT 3' (SEK. ID. NR: 18), odpowiada nukleotydom
48880-48916 szczepu 13 (GenBank NC003366). Starter antydensowny w obrębie genu CPE0038, 5’
actctgcagTTGTCATATCAATTAAATTAACTATAATCCC 3’ (SEK. ID. NR: 19) jest komplementarny do nukle-
otydów 51244-51275 szczepu 13 i zawiera nukleotydy flankujące, obejmujące miejsce restrykcyjne PstI (ma-
łe litery). Otrzymano produkt złożony z 2402 par zasad i strawiono enzymami restrykcyjnymi BamHI i PstI. 40
Fragment ten poddano ligacji z dużym fragmentem 1192-23.1 strawionego BamHI i PstI, z wytworzeniem
plazmidu 1192-36.10.
EP 2 007 420 B1
23
[0108] W końcowym etapie, N-końcową połowę genu plc sklonowano przez PCR. Starter sensowny, 5’ act-
gagctcCTAGACACTTTGCTTCAATATTTGGGAA 3’ (SEK. ID. NR: 20) jest komplementarny do nukleotydów
46513-46540 szczepu 13 i zawiera nukleotydy flankujące i miejsce SacI (małe litery). Starter antysensowny,
5’ actggatccGCATTCTTATCATAATCTGGATAAGTAGAACC 3’ (SEK. ID. NR: 21) jest komplementarny do
nukleotydów 48824-48855 szczepu 13 i zawiera nukleotydy flankujące i miejsce BamHI. Wytworzono pro-5
dukt złożony z 2363 par zasad i strawiono go enzymami restrykcyjnymi SacI i BamHI. Strawiony fragment
poddano ligacji z dużym fragmentem 1192-36.10 strawionego SacI i BamHI, z wytworzeniem plazmidu
1192-38.3. Przeprowadzone następnie sekwencjonowanie regionu flankującego miejsce BamHI w plc w
1192-38.3 potwierdziło delecję dziewięciu aminokwasów od Tyr 62 do Trp 70.
[0109] Plazmid 1192-38.3 użyto do elektroporacji komórek szczepu 29 C. perfringens. Wykazano uprzed-10
nio, że szczep 29 daje się transformować z wydajnością 3,6 x 104 transformantów/µg DNA plazmidu
pJIR418. Szczep 29 hodowano i poddano elektroporacji, jak w Przykładzie 2, z tą różnicą, że zastosowano
technikę selekcji płynnej po okresie trzech godzin regeneracji. Zamiast wysiewania, 0,67 ml próbki komórek
rozcieńczano w 12 ml TSYC + 25 µg/ml chloramfenikolu i hodowano przez noc w 37°C w beztlenowym słoju.
Zastosowano tę modyfikację ze względu na niższą wydajność transformacji i wysiewania szczepu 29 w sto-15
sunku do 1240. Po wzroście przez noc, komórki rozcieńczono ponownie w pożywce selekcyjnej. Komórki z
drugiej hodowli pasażowano następnie pięciokrotnie bez selekcji przed wysianiem na płytki agarowe z krwią.
Żadna z kolonii z płytek agarowych z krwią nie była niehemolityczna. Dwie płytki z krwią wysiano metodą
replik na płytki TSYC, TSYC + 25 µg/ml chloramfenikolu i TSYC + 50 µg/ml erytromycyny. Wszystkie kolonie
były wrażliwe na erytromycynę, ale tylko jedna z 130 kolonii była wrażliwa na chloramfenikol. Ta kolonia, 20
1192-45.4B została przemianowana na CPERF002. Analiza PCR genomowego DNA z CPERF002 ze starte-
rami specyficznymi dla toksyny alfa wykazały dodatni prążek dla toksyny alfa. Ten prążek był mniejszy niż
odpowiadający mu prążek z DNA szczepu 29 typu dzikiego. Startery specyficzne dla genów oporności na
chloramfenikol i na erytromycynę nie amplifikowały DNA CPERF002, ale wykazywały silne pozytywne prążki
z plazmidu 1192-38.3. Sekwencjonowanie alfa-toksyny CPERF002 potwierdziło dziewięcioaminokwasową25
delecję (patrz Fig. 3).
[0110] CPERF002 badano pod kątem ekspresji białka inaktywowanej anatoksyny alfa. Po 6 godzinach
wzrostu beztlenowego próbki 1 ml komórek zebrano i odwirowano. Piętnaście mikrolitrów niezatężonej po-
żywki z supernatantów analizowano przez elektroforezę w żelu poliakryloamidowym i poddano analizie We-
stern z zastosowaniem króliczego przeciwciała poliklonalnego skierowanego przeciwko rekombinowanemu30
białku toksyny alfa (Vaccine 11: 1253 (1993)). Wyniki wykazały swoistą reaktywność przeciwciała z białkiem
o wielkości oczekiwanej dla białka anatoksyny alfa.
[0111] CPERF002 jest uzyskanym na drodze inżynierii genetycznej szczepem C. perfringens typu A z dele-
cją. Szczep ten wydziela inaktywowaną postać anatoksyny dla toksyny alfa C. perfringens. Ponieważ szczep
ten nie wyraża już aktywnej toksyny alfa, ale zachowuje znaczną część antygenowości toksyny, będzie on 35
przydatny jako szczepionka do ochrony przed chorobą wywoływaną przez C. perfringens.
PRZYKŁAD 4SZCZEPIONKI Z C. PERFRINGENS Z DELECJĄ [0112] Szczepy szczepionkowe z delecją, CPERF001 i CPERF002, opisane w Przykładach 2 i 3, oceniano40
pod kątem ich zdolności do dostarczania ochrony przed prowokacją C. perfirngens typu dzikiego. Pierwszą
część badań zaprojektowano w celu określenia, czy podawanie żywych szczepów szczepionkowych ma
EP 2 007 420 B1
24
jakikolwiek negatywny wpływ na wykluwalność z jaj z zarodkami. Przyporządkowanie grup doświadczalnych
i wyniki bezpieczeństwa są opisane w Tabeli 2.
TABELA 2WYNIKI BEZPIECZEŃSTWA
Grupa* Szczepionka (dawka) ** Liczba jaj podlegających wykluciu (%)1 CPERF001 (0,8 x 102)X 18 (90%)2 CPERF001 (0,8 x 103) 17 (85%)3 CPERF001 (0,8 x 104) 11 (55%)4 CPERF001 (0,8 x 105) 16 (80%)5 CPERF002 (1,9 x 102) 16 (80%)6 CPERF002 (1,9 x 102) 17 (85%)7. CPERF002 (1,9 x 104) 14 (70%)8 CPERF002 (1,9 x 105) 12 (60%)9 Szczep 1240 (1,5 x 103) 16 (80%)10 Szczep 29 (3,7 x 103) 13 (65%)11 Kontrole dla pożywki 19 (95%)12 Kontrole niezainkulowane 18 (90%)
* 20 jaj na grup** Dawka 100 µl podawana in ovo w 18 dniu rozwoju zarodka (IM)x Miano na dawkę jest mierzone jako jednostki tworzące kolonie („cfu”)
[0113] Przy dawce 103 lub mniejszej (grupy 1, 2, 5 i 6), wykluwalność w tych grupach nie była znacząco 5
niższa niż w grupie zaszczepionej tylko pożywką (grupa 11) lub w grupie, która nie została zaszczepiona
(grupa 12). Przy najniższej dawce CPERF001 wykazywał tę samą wykluwalność co kontrola z pożywką i
lepszą niż niezaszczepiona grupa kontrolna.
[0114] Ponieważ wyższe dawki szczepów z delecją mogłyby mieć niekorzystny wpływ na wykluwalność jaj,
tylko dwie najniższe grupy dawkowania dla każdego szczepu z delecją włączono do części badania pod 10
kątem skuteczności. Te grupy, razem z ptakami z kontroli dla pożywki (grupa 11), prowokowano szczepem
CP6 C. perfringens (typu dzikiego), który był podawany doustnie w ilości 108 cfu/ml/ptaka, gdy ptaki były w
wieku 20, 21 i 22 dni. Wszystkie ptaki zostały poddane sekcji w 25 dniu życia i zmiany w jelicie cienkim oce-
niano przy zastosowaniu skali ocen dla martwiczego zapalenia jelit (NE, ang. necrotic enteritis) zestawionych
poniżej. 15
Wynik 0 Martwicze zapalenie jelit1+
Martwicze zapale-nie jelit
2+
Martwicze zapalenie jelit3+
Martwicze zapa-lenie jelit
4+Brak dużych zmian NE wjelicie cienkim;jelito ma pra-widłową ela-styczność (samo zwijasię z powro-tem na po otwarciu).
Cienka i wiotka ścia-na jelita (jelito pozo-staje płaskie po otwarciu i nie zwijasię z powrotem do normalnej pozycji);nadmiar lub zagęsz-czony śluz pokrywa-jący błonę śluzowąlub ogniskowe albowieloogniskowe ła-godne zaczerwienie-nie śluzówki lub przekrwienie naczyńbłony surowiczej.
Pojedyncze lub kilka wieloognisko-wych obszarówzaczerwienienia i obrzęku ściany jelita; jedno lub kilka wieloognisko-wych obszarów owrzodzenia lubmartwicy błony śluzowej jelita.
Rozległe wieloogni-skowe obszary mar-twicy i owrzodzenia błony śluzowej jelita ± znaczne krwawie-nie lub warstwa fibry-ny lub szczątkówmartwiczych na po-wierzchni błony ślu-zowej (wygląd ręcz-nika tureckiego).
Martwe zwierzę z dużymi zmianami NE z wynikiem 2+ lub wyższym.
Ocena wyniku z niewielkimi modyfikacjami jest według Charlesa Hofacre, DVM, MAM, Ph.D., University of Georgia, Poultry Diagnostic and Research Center, 953 College Station Road, Athens, GA 30602.
EP 2 007 420 B1
25
[0115] Pięć (5) ptaków z nieszczepionej grupy kontrolnej (nie prowokowanej) poddano sekcji na zakończe-
nie badania, aby potwierdzić, że nie było w ekspozycji na C. perfringens w trakcie badania. Wyniki są przed-
stawione w Tabeli 3.
TABELA 3
GRUPY TRAKTOWANIA DLA OCHRONY* WYNIKIGrupa* Szczepionka Dawka szczepionki in-
ovo (cfu)Dni życia przy prowokacji C.
perfringens N Średnia
1 CPERF001 1x102 20, 21 i 22 9 0,672 CPERF001 1x103 20, 21 i 22 13 0,465 CPERF002 1x102 20, 21 i 22 12 1,336 CPERF002 1x103 20, 21 i 22 12 1,08
11 Kontrola dla po-żywki
Żadna 20, 21 i 22 15 1,80
12 Żaden Żadna Nie prowokowana 5 0,00* Sekcja zwłok w 25 dniu życia
5
[0116] Wyniki dla grup 1 i 2 były znacząco statystycznie niższe w porównaniu z grupą 11 (test kolejności par
Wilcoxona p≤0,0250). Średnie wyniki dla Grup 5 i 6 były niższe niż dla Grupy 11, ale nie różniące się staty-
stycznie (test sumy rang Wilcoxona p≥0,2177). Ocenę skuteczności szczepionki przeprowadzono zgodnie z
procedurą opisaną przez David Siev [Journal of Modern Applied Statistical Methods Tom. 4, nr 2, 500-508
(2005)]. Skuteczność szczepionki w zmniejszaniu ciężkości choroby oceniono na 54% dla Grupy 1, 65% dla 10
Grupy 2, 20% dla Grupy 5 i 27% dla Grupy 6, w porównaniu z Grupą 11.
Przykład 5KONSTRUKCJA ŚWIŃSKIEGO C. PERFRINGENS Z DELECJĄ
15
[0117] Strategie zastosowane w Przykładach 1 i 2, jak wyżej, stosuje się do konstruowania mutantów dele-
cyjnych toksyny alfa ze świńskich szczepów C. perfringens. Początkowo, izolaty polowe od chorych świń
poddaje się elektroporacji z plazmidem pJIR418, aby ocenić ich zdolność do transformacji. Izolaty dające
≥104 transformantów na mikrogram plazmidowego DNA i wrażliwe bądź na chloramfenikol, bądź erytromycy-
nę są kandydatami dla delecji.20
[0118] Genomowy DNA ze szczepów – kandydatów stosuje się jako matrycę dla PCR o dużym zasięgu dla
genu plc (toksyny alfa) i sekwencji flankujących. Po subklonowaniu produktów PCR, gen toksyny alfa i re-
giony flankujące sekwencjonuje się i mapuje restrykcyjnie. Syntetyzuje się nowe startery oligonukleotydowe
z flankującymi miejscami restrykcyjnymi i produkty dwóch oddzielnych amplifikacji klonuje się w plazmidzie
samobójczym 1192-23.1 w celu wytworzenia delecji 27 par zasad, jak w Przykładzie 1.25
[0119] Świński wektor samobójczy wprowadza się przez elektroporację do odpowiedniego świńskiego
szczepu C. perfringens i izoluje się mutanty delecyjne przy zastosowaniu metod opisanych w Przykładzie 2,
powyżej. Mutanty delecyjne potwierdza się brakiem hemolizy beta na płytkach agarowych z krwią i przez
sekwencjonowanie DNA genu toksyny alfa.
[0120] Ten konstrukt jest uzyskanym na drodze inżynierii genetycznej szczepem C. perfringens Typu A z 30
delecją. Szczep ten wydziela inaktywowaną postać anatoksyny dla toksyny alfa C. perfringens. Ponieważ
ten szczep ten nie wyraża już aktywnej toksyny alfa, ale zachowuje jeszcze znaczną część antygenowości
toksyny, jest przydatny jako szczepionka do ochrony świń przed chorobą powodowaną przez C. perfringens.
EP 2 007 420 B1
26
DEPOZYT BIOLOGICZNY
[0121] Hodowle z następujących materiałów biologicznych zostały zdeponowane w następującym między-
narodowym depozycie:
[0122] American Type Culture Collection (ATCC) 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, 5
USA, w warunkach, które spełniają wymogi Traktatu Budapeszteńskiego o międzynarodowym uznawaniu
depozytu drobnoustrojów dla celów postępowania patentowego.
Organizm Nr dostępu Daty złożenia depozytu
Clostridium perfringens CPERF/ΔαToxin 365-054 PTA7364 7 lutego 2006
Clostridium perfringens CPERF/ΔαtToxin 365-053 PTA7365 7 lutego 2006
Lista sekwencji10[0123]<110> Cochran, Mark Lair, Steven Synenki, Richard Petersen, Gary
<120> REKOMBINOWANE ATENUOWANE ORGANIZMY CLOSTRIDIUM I SZCZEPIONKA15