RNA BIOLOGY 2007-12-15 (Manuel Santos) Exam preparation: The 5´and 3´ ends processing of Pre-mRNA 1. O que é a estrutura 5’-CAP do m RNA? Como é sintetizada? A estrutura 5’CAP pode ser encontrada na extremidade 5’ da molecula de RNA e consiste num nucleotido de guanina ligado ao mRNA atraves de uma ligação trifosfatidica. Esta guanosina é metilada na setima posição por uma metil transferase e designa-se por 7-metilguanosina cap 2. Further modifications include the possible methylation of the 2' hydroxy-groups of the first 3 ribose sugars of the 5' end of the mRNA. The methylation of both 2' hydroxy-groups is shown on the diagram. 3. Functionally the 5' cap looks like the 3' end of an RNA molecule (the 5' carbon of the cap ribose is bonded, and the 3' unbonded). This provides significant resistance to 5' exonucleases. The starting point is the unaltered 5' end of an RNA molecule. This features a final nucleotide followed by three phosphate groups attached to the 5' carbon. 1. One of the terminal phosphate groups is removed (by a phosphatase), leaving two terminal phosphates. 2. GTP is added to the terminal phosphates (by a guanylyl transferase), losing two phosphate groups (from the GTP) in the process. This results in the 5' to 5' triphosphate linkage. 3. The 7-Nitrogen of guanine is methylated (by a methyl transferase). 4. Other methyltransferases are optionally used to carry out methylation of 5' proximal nucleotides. Para ocorrer formação da CAP um fosfato da extremidade 5’ do RNA deve ser liberado por hidrólise, gerando uma extremidade 5’
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RNA BIOLOGY 2007-12-15
(Manuel Santos)
Exam preparation: The 5´and 3´ ends processing of Pre-mRNA
1. O que é a estrutura 5’-CAP do m RNA? Como é sintetizada?
A estrutura 5’CAP pode ser encontrada na extremidade 5’ da molecula de
RNA e consiste num nucleotido de guanina ligado ao mRNA atraves de
uma ligação trifosfatidica. Esta guanosina é metilada na setima posição
por uma metil transferase e designa-se por 7-metilguanosina cap
2. Further modifications include the possible methylation of the 2' hydroxy-groups of the first 3 ribose sugars of the 5' end of the mRNA. The methylation of both 2' hydroxy-groups is shown on the diagram.
3. Functionally the 5' cap looks like the 3' end of an RNA molecule (the 5' carbon of the cap ribose is bonded, and the 3' unbonded). This provides significant resistance to 5' exonucleases.
The starting point is the unaltered 5' end of an RNA molecule. This features a final nucleotide followed by three phosphate groups attached to the 5' carbon.
1. One of the terminal phosphate groups is removed (by a phosphatase), leaving two terminal phosphates.
2. GTP is added to the terminal phosphates (by a guanylyl transferase), losing two phosphate groups (from the GTP) in the process. This results in the 5' to 5' triphosphate linkage.
3. The 7-Nitrogen of guanine is methylated (by a methyl transferase).4. Other methyltransferases are optionally used to carry out methylation of 5' proximal
nucleotides.
Para ocorrer formação da CAP um fosfato da extremidade 5’ do RNA deve ser
liberado por hidrólise, gerando uma extremidade 5’ difosfato, Essa
extremidade difosfato deve então se ligar a um átomo de fósforo a de um
GTP, gerando uma ligação incomum 5’-5’ trifosfato. O nitrogênio que se
encontra na posição 7 da guanina da extremidade deve então sofrer uma
metilação, mediada pela enzima S-adenosil-metionina, formando o chamado
cap 0. As riboses dos dois primeiros nucleotídeos do RNA podem também ser
metiladas na extremidade 2'-OH, formando os chamados cap 1 e cap 2.
É uma modificação que ocorre na extremidade 5’ e que confere á molecula de
mRNA maior estabilidade, protége-a da acção de fosfatases e nucleases e
aumenta a probabilidade desse RNA ser capturado pelos ribossomas para
tradução, esta estrutura não está presente no tRNA e no rRNA acontecendo
principalmente nos mRNA e hnRNA.
1. Regulation of nuclear export.2. Prevention of degradation by exonucleases.3. Promotion of translation (see ribosome and translation).4. Promotion of 5' proximal intron excision.
3. O que é a poliadenilação do pre-mRNA?
É a adição de uma cauda de poliadenilato ao mRNA na sua extremidade 3’, esta
cauda é composta por múltiplas adenosinas monofosfatadas (só com adeninas),
tem a função de actuar como acentuadora da tradução, proteger o mRNA da
digestão por nucleases presentes no meio e proporcionar uma maior
estabilidade à molécula. Especula-se que ela também tenha um papel importante
no transporte do mRNA para o citoplasma.
É interessante notar que o nucleotídeo que se encontra logo antes da cauda poli-
A não é o último que será traduzido e podem haver mais centenas de
nucleotídeos além da extremidade 3’ de um RNA maduro.
4. O que é o sinal de poliadenilação? Para que serve?
O mRNA é clivados através de uma endonuclease específica que reconhece a
seqüência AAUAAA, no entanto, apenas essa seqüência não é suficiente para que
ocorra o corte, é também necessário que haja um contexto ainda desconhecido
de nucleotídeos próximos que caracterizem a região.
Após o corte, uma enzima polimerase poli-A, dependente de ATP, acrescenta os
nucleotídeos contendo a base adenina na extremidade 3’ do RNA. Serve para
acentuadora da tradução, proteger o mRNA da digestão por nucleases presentes
no meio e proporcionar uma maior estabilidade à molécula.
5. O que é um forte sinal de poliadenilação? O que é um sinal fraco de
poliadenilação?
Um sinal forte de poliadenilação é a sequencia AAUAAA (NNUANA).
Um sinal fraco de poliadenilação é a sequencia AAUAAG
6. O que é um sinal DSE? Descreve o sinal de poliadenilação. Indica os
elementos cis.
Dois sinais directos indicam á RNA polymerase II para parar a transcrição: os
sinais localizados junto á polyA e um elemento adicional a jusante (DSE-
downstream element) localizado na região de termino. O sinal de DSE
(135pb) actua pausando a elongação da polymerase.
7. Quais são as funções mais importantes da poliadenilação do mRNA?
A poliadenilação do mRNA adiciona a este uma cauda que protégé a
molecula de mRNA de degradação enzimatica, adiciona uma terminação
transcripcional, ajuda na translação do mRNA do nucleo para o
citoplasma.
Mecanismo da poliadenilação:
A maquinaria da poliadenilação no nucleo dos eucariotas trabalha em productos
da RNA polymerase II como o mRNA. Neste um complexo de multi-proteinas
23. Comment the sentence: “the 5´-UTR is an important control point of mRNA
translation”
24. Comment the sentence: “The interaction of the 5´-UTR and the 3´-UTR is
important
for translation efficiency.”
25. How do the ends of mRNAs interact?
RNA BIOLOGY 2007
(Manuel Santos)
Exam preparation: Splicing
1. O que é um intrão? Define o conceito de splicing nos termos gerais?
Um intrão é uma zona do gene não codificada. O splicing apenas ocorre em
celulas eucarioticas e remove os intrões juntando os exões durante a transcrição.
A estrutura que cliva essas ligações nucleotidicas é o spliceossoma.
2. O que é um sinal de splicing? Descreve os varios elementos de um sinal de
splicing?
A maioria dos intrões começa com GU - dador de splice - e acaba com AG – splice
acceptor site.
A sequencia de consenso na extremidade 5’ é AGGUAAGU e na extremidade 3’
são 10 C ou U, seguidos de uma base qualquer, de um C e de AG.
O splicing ocorre em duas estapas: duas transesterificações. A transesterificação
é a transferência da ligação fosfodiester. A primeira reação ocorre pelo ataque
nucleofílico da adenina do sítio de ramificação à Guanina no sítio de splice 5'.
Com a transferência da ligação fosfodiéster, é formada uma estrutura de alça. A
segunda reação se dá pela ligação de um éxon com o outro, soltando assim o
íntron, que será degradado e reciclado na célula.
3. What is a strong splicing signal? How does it differ from a weak signal?
As sequencias GU e AG não são suficientes para se denotar a presença de um
intrão, outra sequencia importante é o branch site localizado 20 a 50 bases á
frente do sitio de aceitador. A sequencia de consenso deste sitio é a
CU(A/G)A(C/U) onde A é conservado em todos os genes.
4. O que é um spliceossoma? Qual a sua função?
Um spliceossoma é um complexo que remove introes de mRNA transcrito, é
composto por 5 pequenas snRNPs ou seja pequenas unidades proteicas de RNA
nuclear, que são a U1, U2, U4, U5 e a U6 que participam em diversas interacções
entre RNA-RNA ou RNA-proteina. O RNA que as compoe é rico em U.
- Assegura a conservação da sequencia reconhecendo os splicing sites
- Precisão nucleotidica na junção de exões
- Condensa os exões (informação importante)
5. O que é um snurp? Quantos snurps existem? Descreve os seus components.
São as subunidades do spliceossoma ou snRNPs – small nuclear RNA proteins, ou
seja pequenas unidades proteicas de RNA nuclear, que são a U1, U2, U4, U5 e a
U6 que participam em diversas interacções entre RNA-RNA ou RNA-proteina.
6. Comenta a frase: O spliceossoma é uma maquina molecular.
7. Qual é a função dos factores de splicing não-snRNP?
E Complex-U1 binds to the GU sequence at the 5' splice site, along with
accessory proteins/enzymes ASF/SF2, U2AF (binds at the Py-AG site),
SF1/BBP (BBP=Branch Binding Protein);
A Complex-U2 binds to the branch site and ATP is hydrolyzed;
B1 Complex-U5/U4/U6 trimer binds, and the U5 binds exons at the 5' site,
with U6 binding to U2;
B2 Complex-U1 is released, U5 shifts from exon to intron and the U6 binds
at the 5' splice site;
C1 Complex-U4 is released, U6/U2 catalyzes transesterification, that make
5'end of introns ligate to the A on intron and from a lariat ,U5 binds exon
at 3' splice site, and the 5' site is cleaved, resulting in the formation of the
lariat;
C2 Complex-U2/U5/U6 remain bound to the lariat, and the 3' site is
cleaved and exons are ligated using ATP hydrolysis. The spliced RNA is
released and the lariat debranches.
8. Describe the mechanism of splice site selection?
The model for formation of the spliceosome active site involves an ordered, stepwise assembly of discrete snRNP particles on the hnRNA substrate. The first recognition of hnRNAs involves U1 snRNP binding to the 5' end splice site of the hnRNA and other non-snRNP associated factors to form the commitment complex, or early (E) complex in mammals.[8][9] The commitment complex is an ATP-independent complex that commits the hnRNA to the splicing pathway.[10] U2 snRNP is recruited to the branch region through interactions with the E complex component U2AF (U2 snRNP auxiliary factor) and possibly U1 snRNP. In an ATP-dependent reaction, U2 snRNP becomes tightly associated with the branch point sequence (BPS) to form complex A. A duplex formed between U2 snRNP and the hnRNA branch region bulges out the branch adenosine specifying it as the nucleophile for the first transesterification.[11]
The presence of a pseudouridine residue in U2 snRNA, nearly opposite of the branch site, results in an altered conformation of the RNA-RNA duplex upon the U2 snRNP binding. Specifically, the altered structure of the duplex induced by the pseudouridine places the 2' OH of the bulged adenosine in a favorable position for the first step of splicing.[12] The U4/U5/U6 tri-snRNP (see Figure 1) is recruited to the assembling spliceosome to form complex B, and following several rearrangements, complex C (the spliceosome) is activated for catalysis.[13][14] It is unclear how the triple snRNP is recruited to complex A, but this process may be mediated through protein-protein interactions and/or base pairing interactions between U2 snRNA and U6 snRNA.The U5 snRNP interacts with sequences at the 5' and 3' splice sites via the invariant loop of U5 snRNA[15] and U5 protein components interact with the 3' splice site region.[16]
Upon recruitment of the triple snRNP, several RNA-RNA rearrangements precede the first catalytic step and further rearrangements occur in the catalytically active spliceosome. Several of the RNA-RNA interactions are mutually exclusive; however, it is not known what triggers these interactions, nor the order of these rearrangements. The first rearrangement is probably the displacement of U1 snRNP from the 5' splice site and formation of a U6 snRNA interaction. It is known that U1 snRNP is only weakly associated with fully formed spliceosomes[17], and U1 snRNP is inhibitory to the formation of a U6-5' splice site interaction on a model of substrate oligonucleotide containing a short 5' exon and 5' splice site.[18] Binding of U2 snRNP to the branch point sequence (BPS) is one example of an RNA-RNA interaction displacing a protein-RNA interaction. Upon recruitment of U2 snRNP, the branch binding
protein SF1 in the commitment complex is displaced since the binding site of U2 snRNA and SF1 are mutually exclusive events.Within the U2 snRNA, there are other mutually exclusive rearrangements that occur between competing conformations. For example, in the active form, stem loop IIa is favored; in the inactive form a mutually exclusive interaction between the loop and a downstream sequence predominates.[14] It is unclear how U4 is displaced from U6 snRNAm, although RNA has been implicated in spliceosome assembly, and may function to unwind U4/U6 and promote the formation of a U2/U6 snRNA interaction. The interactions of U4/U6 stem loops I and II dissociate and the freed stem loop II region of U6 folds on itself to form an intramolecular stem loop and U4 is no longer required in further spliceosome assembly. The freed stem loop I region of U6 base pairs with U2 snRNA forming the U2/U6 helix I. However, the helix I structure is mutually exclusive with the 3' half of an internal 5' stem loop region of U2 snRNA.
Mechanism of Splicing
U1 snRNP binds specifically to the 5′ splicing site sequences in the RNA
and also binds to conserved residues on the 3′ splice site
U2 snRNP binds to the branch point , helped by the U2 snRNP
auxiliary factor (U2AF).
(U2AF binds to the polypyrimidine U-C rich region adjacent to the 3′
splice site and positions the U2 snRNP on the branch point.)
Tri-snRNP complex (U4+U5+U6) joins in. The 5′ splice site has an
adjacent conserved sequenceof exon to which the U5snRNA binds,
forming the spliceosome sites where the catalysis can occur
For initiation, nucleophilic substitution occurs at the 5′ splice junction by
the 2′-hydroxyl group of the branch point adenosine.
Pairimg between U1 and intromn sequence is destabilized and U5 SnRNA
bonds more strongly with 5' site
Bond between U4 and U6 atrophies and U6 now bonds with both 5'site
and branch point
U1 (used for identification of 5' splice site) and U4 quits(needed for
bringing U6 to catalytic site)
Newly freed 5'exon replaces the 3' splice junction y by 3'OH group
U5 retains contact with 5'end and free exon but also contacts with 3'
splice junction
Eventually the introns are removed and the exons form the mature mRNA
9. What is an ESE? What is a ESS? What is an ISE? What is an ISS?
10. Qual a função das proteinas SR no splicing?
Estas proteinas são ricas em serina e arginina e estão envolvidas na regulação e
selecção dos sitios propicios a splicing no mRNA.
Tambem o splicing alternativo requer estas proteinas uma vez que seleccionam
os sitios alternativos de splicing a usar.
11. Describe the Spliceosome assembly cycle?
12. Quanto spliceossomas existem nos eucariotas? Quais as principais diferenças
entre eles?
Existem 3 tipos de spliceossoma:
- O maior que divide os introes com GU a 5’ e AG a 3’, é composto pelos
snRNPs U1, U2, U4, U5 e U6 e está activo no nucleo.
- O menor que é similar ao maio embora remova introes raros com sequencias
de splice diferentes, é composto por snRNP U5, U11, U12, U4atac e U6atac,
pode ser encontrado no nucleo.
- Trans-splicing que é uma forma de splicing que junta dois exoes que não
estão no mesmo RNA a ser transcrito.
13. Porque é que alterações no splicing causam doenças?
Alterações no splicing implicam alterações nas proteinas traduzidas, erros
comum de splicing passam pela perda de função de um sitio de splice resultando
na exposição permatura de um codao de stop, perda de um exão ou inclusão de
um intrão; mutação de um sitio de splice reduzindo a sua especificidade
causando deleções ou inserções de aminoacidos,; inclusão ou exclusão de mais
RNA que o esperado resultando em exões maiores ou mais pequenos.
14. What is alternative splicing? What is its main function?
Splicing alternativo é a recombinação de diferentes exoes, tem como função
possibilitar uma maior diversidade genetica nos eucariotas.
15. Does alternative splicing exist in all eukaryotes? Where is it prevalent?w
16. How does alternative splicing switch off gene expression?
17. How does a cell choose a splice site during alternative splicing?
18. What are alternative splicing regulators? Give examples of each type?
19. Why is the concentration of splicing factors so critical during alternative
splicing?
20. Comment the sentence: “alternative splicing is co-transcriptional and
sometimes
depends on speed of transcription”.
21. What is the exon junction complex (EJC)? What does it do?
22. Why is the EJC relevant to mRNA nonsense mediated decay?
23. Comment the sentence “splicing is an ancient biological process”. If you agree
with
the sentence describe the molecular evidence for early evolution of splicing?
24. Comment the sentence: “Identical pre-mRNAs are differentially spliced in
different
organs”.
25. Comment the sentence: “In vertebrates, in particular in humans, the number
of
proteins is much higher than the number of genes”.
RNA BIOLOGY 2007
(Manuel Santos)
Exam preparation: mRNA stability and Decay.
1. What are the main functions of the CAP and polyA in mRNA stability?
2. What is a premature termination codon?
3. Describe in general terms the concept on mRNA quality control, referring to
mRNA
surveillance mechanisms?
4. What is the exosome? How does it work? And how is it constituted?
5. Describe the mechanism of 5´to 3´ mRNA degradation? Identify the
ribonucleases
involved in this process.
6. What is mRNA decapping? What is its main function?
7. What is mRNA deadenylation? What is its main function?
8. Why is the interaction between 5´and 3´ mRNA ends relevant for mRNA
stability?
9. How do the 5´ and 3´ ends of mRNA interact? How does the interaction
becomes
disrupted? What happens when it is disrupted?
10. What is an Exon Junction complex (EJC)? What is its function (s)?
11. What is NMD? Describe in general terms how it works?
12. What is the functional relevance of NMD?
13. Describe the roles of UPF1, UPF2 and UPF3 in NMD?
14. What is the role of the eRFs in NMD?
15. How does the NMD machinery recognize a premature termination codon
(PTC)?
16. Explain how the iron metabolism is regulated at the translational level?
17. What is an ARE and how does it work?
RNA BIOLOGY 2007
(Manuel Santos)
Exam preparation: Biology of microRNAs.
1. o que é o microRNA (miRNA)?
MicroRNAs (miRNAs) are short ribonucleic acid (RNA) molecules, on average only 22 nucleotides long and are found in all eukaryotic cells. miRNAs are post-transcriptional regulators that bind to complementary sequences on target messenger RNA transcripts (mRNAs), usually resulting in translational repression and gene silencing.[1][2] The human genome may encode over 1000 miRNAs,[3]
[4] which may target about 60% of mammalian genes[5] and are abundant in many human cell types.[6]
miRNAs show very different characteristics between plants and metazoans. In plants the miRNA complementarity to its mRNA target is nearly perfect, with no or few mismatched bases. In metazoans on the other hand miRNA complementarity is far from perfect and one miRNA can target many different sites on the same mRNA or on many different mRNAs. Another difference is the location of target sites on mRNAs. In metazoans the miRNA target sites are in the three prime untranslated regions (3'UTR) of the mRNA. In plants targets can be located in the 3' UTR but are more often in the coding region itself.[7] MiRNAs are well conserved in eukaryotic organism and are thought to be a vital and evolutionary ancient component of genetic regulation.[8][9][10][11]
2. Describe the biogenesis of miRNAs and siRNAs in detail?
3. What are the main differences between Pri-mRNAs, pre-miRNAs and mature
miRNAs?
4. What is the main function of miRNAs and siRNAs?
Os miRNAs regulam a expressão génica regulando a quantidade de proteinas
produzidas por genes eucarioticos.
Os siRNA defendem e ajudam a proteger a integridade do genoma. Estes RNAs de
interferencia inibem a produção de virus e impedem a dispersão de elementos
de trasnposição para outros loci cromossomicos.
5. What is the main difference between miRNAs and siRNAs?
Os miRNAs regulama expressão génica e os siRNAs defendem o genoma