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 ACADEMIE  DE  PARIS  

Année  2011  

MEMOIRE  pour  l’obtention  du  DES  d’Anesthésie-­‐Réanimation  

Coordinateur  :  Monsieur  le  Professeur  Didier  Journois  

Par    

Jeanne  Chatelon  

Présenté  et  soutenu  le  18  octobre  

Rôle  de  la  stimulation  des  cellules  immunitaires  sur  

l’expression  des  calgranulines  S100A8  et  S100A9  

intracellulaires  et  extracellulaires  

Travail  effectué  sous  la  direction  du  Professeur  Didier  Payen                                                                                                                            

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SOMMAIRE

REMERCIEMENTS................................................................................................................4  INTRODUCTION…………………………………………………………………………………………………………………5  MATERIELS  ET  METHODES…………………………………………………………….....................................8  

1. Préparation  cellulaire……………………………………………………………………………………………….8  a. Choix  des  échantillons  b. Choix  et  concentration  des  agoniste  c. Cinétique  d’activation  des  leucocytes    soumis  à  différents  agonistes  d. Cinétique  nécrose  e. Mortalité  cellulaire  

2. Immunohistochimie  et  analyse  par  cytométrie  en  flux…………………………………………….9  a. Principe  de  la  cytométrie  en  flux  b. Choix  des  anticorps  c. Calibration  du  signal  d. Marquage  des  protéines  membranaires  e. Marquage  des  protéines  intracellulaires  f. Marquage  des  cellules  apoptotiques  

3. Enzyme-­‐Linked  Immunosorbent  Assay  :  ELISA………………………………………………………13  4. Analyse  statistique  des  données………………………………………………………………………….…14  

 RESULTATS………………………………………………………………………………………………………………….....15  

1. Validation  du  modèle……………………………………………………………………………………………..15  a. Cinétique  de  l’expression  membranaire  des  marqueurs  d’activation  cellulaires  

à  H1,  H3  et  H6  après  stimulation  par  du  LPS,  du  fMLP,  du  GMCSF  et  de  l’IFNγ  b. Pourcentage  de  cellules  apoptotiques  après  stimulation  par  la  cycloheximide  

2. Fraction  de  calgranulines  en  fonction  du  type  cellulaire………………………………………..17  a. Répartition  des  monomères  S100A8  et  S100A9  et  de  leur  complexe  dans  les  

cellules  immunitaires  avant  et  après  stimulation  b. S100A8,  S100A9  et  S100A8/S100A9  membranaires  

3.      Modification  de  l’expression  des  calgranulines  intracellulaires  en  fonction  du  type  cellulaire  et  de  l’agoniste  ……………………………………………………………………………………………..18  

a. Variation  intracellulaire    des  protéines  S100A8,  S100A9  et  du  complexe  S100A8/S100A9  après  stimulation  par  du  LPS,  du  fMLP,  du  GM-­‐CSF  et  de  l’IFNγ  dans  le  monocyte  

b. Variation  intracellulaire  des  protéines  S100A8,  S100A9  et  du  complexe  S100A8/S100A9  après  stimulation  par  du  LPS,  du  fMLP,  du  GM-­‐CSF  et    de  l’IFNγ  dans  le  PMN  

c. Variation  intracellulaire  des  protéines  S100A8,  S100A9  et  du  complexe  S100A8/S100A9  après  stimulation  par  de  la  CHX  dans  le  PMN  et  le  monocyte  

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4.      Relation  entre  l’expression  intracellulaire  de  calgranulines  et  le  niveau  de  protéine  extracellulaire………………………………………………………………………………………………………...23  

a. Variation  de    la  protéine  S100A8  dans  le  surnageant  de  sang  total  stimulé  par  du  LPS  et  du  fMLP  

b. Variation  de  la  protéine  S100A8  dans  le  surnageant  de  sang  total  stimulé  par  un  agoniste  apoptotique  et  après  nécrose  cellulaire  

DISCUSSION…………………………………………………………………………………………………………………….24  CONCLUSION…………………………………………………………………………………………………………………..29  REFERENCES......................................................................................................................30  RESUME………………………………………………………………………………………………………………………….32  

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REMERCIEMENTS        «  La  terre  nous  en  apprend  plus  long  sur  nous  que  les  livres.  Parce  qu’elle  nous  résiste.  L’homme  se  découvre  quand  il  se  mesure  avec  l’obstacle  »    «  Ce  qui  sauve  c’est  de  faire  un  pas.  Encore  un  pas.  »  

Antoine  de  Saint-­‐Exupéry    Parlait-­‐il  du  choc  septique  ?    Il  me  reste  donc  les  mercis…  Monsieur  Payen,  pour  cet  enthousiasme  si  rare  qui  éclate  comme  un  ballon  d’enfant  et  porte  haut  vers  le  ciel,  pour  son  temps  Copperfield,  qui  apparaît  soudainement  pour  vous  Valérie,  sans  qui  la  maison  serait  dure  et  bancale  Anne-­‐Claire,  qui  n’est  pas  d’accord  et  qui  a  raison,  qui  a  raison  et  n’est  pas  d’accord,  qui  soulève  Et  puis,    Ces  oiseaux  de  passage  qui  ont  battu  du  sourire  dans  le  ciel  parfois  gris  :  Christelle,  Laurence,  Angélique…  Sarah,  parce  que  t’es  belle  en  plein,  les  soupes,  le  café,  le  bureau,  les  rayons.  Et  puis  ceux  sans  qui  rien  ne  serait  :  Arnaud,  Fabien,  Matthieu,  et  Romain  G.  Bien  à  vous  

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INTRODUCTION    Le   choc   septique   reste   l’une   des   principales   causes   de   mortalité   dans   les   services   de  réanimation   [1].   Les   dernières   décennies   n’ont   pas   apporté   de   grandes   avancées  thérapeutiques,   ou   du  moins   souvent   décevantes,   et   ce  malgré   les   progrès     faits   dans   la  compréhension  de  sa  physiopathologie,  notamment  sur  le  rôle  de  l’inflammation  systémique  et  des  divers  médiateurs  inflammatoires  dans  les  défaillances  d’organe.    Pourtant,   très   récemment,   les   avancées   techniques   dans   le   domaine   de   la   recherche   ont  permis  une  nouvelle  approche,  plus  large,  sur    de  nombreuses  pathologies  :  c’est  ainsi  que    la  génomique,  en  définissant  une  véritable  «  carte  transcriptionnelle  »  de  gênes  sur  ou  sous-­‐  exprimés  au  cours  du    choc  septique  a  fait  émerger  deux  protéines  de  l’inflammation  comme  pouvant  jouer  un  rôle  majeur  dans  cette  pathologie  :  les  protéines  S100A8  et  S100A9,  dont  les  gênes  comptent  parmi  les  plus  sur-­‐exprimés  au  cours  du  choc  septique  [2]  [3].    Ces   deux   protéines   également   connues   sous   le   nom   de  Myeloid-­‐inhibatory-­‐factor   Related  Protein  8  (MRP8)  et  14  (MRP14)  ou  calgranuline  A    et  B  respectivement  ont  été  décrites  pour  la   première   fois   dans   les   années   80,   puis   exclusivement   étudiées   dans   les   pathologies  inflammatoires   subaiguës   et   chroniques,   du   fait   de   leur   augmentation   plasmatique  constante   dans   ces   désordres.   Il   a   ainsi   été  montré   que   dans   la   polyarthrite   rhumatoïde,  l’arthrite   idiopathique   juvénile,   les   maladies   inflammatoires   chroniques   de   l’intestin,   la  mucoviscidose  et  la  bronchite  chronique,  le  complexe  S100A8/S100A9  local  ou  plasmatique  était  très  fortement  lié  à  l’activité  de  la  maladie  et  constituait  ainsi  un  meilleur  marqueur  du  suivi  que  d’autres  marqueurs  plus  classiques  (CRP,  Vitesse  de  sédimentation).  Le  complexe  a  également  montré  son  intérêt  en  tant  que  marqueur  pronostique  de  ces  pathologies.[4].    Les   protéines   S100A8   et   S100A9   appartiennent   toutes   deux   à   la   famille  multigénique   des  protéines  S100,  constituant  elle-­‐même  la  plus  importante  sous-­‐famille  des  protéines  liant  le  calcium   ayant   une   extrémité   de   type   «  domaine   EF  »   (calcium-­‐binding   protein  with   an   EF  hand.),  au  même  titre  que  les  troponines,  ou  la  calmoduline.  Comme  toutes  les  protéines  S100,  ces  2  protéines  peuvent  se  polymériser,  mais  alors  que  les  membres   de   cette   famille   s’assemblent   en   homodimère,     S100A8   et   S100A9   forment   un  hétérodimère,  le  complexe  S100A8/S100A9  (également  connu  sous  le  nom  de  calprotectine)  qui  semble  être  la  forme  biologiquement  active  [5].  Une  des   particularités   de   ces   protéines   est   qu’elles   ont   rapidement   été   spécifiées   comme  protéines  de  la  lignée  myélo-­‐monocytaire.  Elles  ont  en  effet  été  exclusivement  décrites  dans  les  monocytes  circulants,  les  macrophages  peu  différentiés  et  les  granulocytes,  mais  seraient  absentes  des   lymphocytes   [6]   [7].  Elles  semblent  également  être  des  marqueurs    précoces  de   différentiation  myéloïde.   Et   il   est     intéressant   de   noter   que     les   phagocytes   exprimant  S100A8  et  S100A9  font  partie  des  toutes  premières  cellules  sur  le  site  inflammé  [8].  Si  de  multiples  fonctions  ont  été  assignées  à  ces  deux  protéines  et  à  leur  complexe,  leur  rôle  exact   reste   largement   incompris.   On   leur   a   ainsi   attribué   des   fonctions   à   la   fois   intra   et  extracellulaires.  Dans   la   cellule,   elles   semblent   impliquées   dans   de   nombreuses   fonctions   vitales   pour   le  fonctionnement   et   la   survie   cellulaire   (homéostasie   calcique,   régulation   de   la  phosphorylation  protéique,    transport  intracellulaire  des  acides  gras  ,  métabolisme  de  l’acide  arachidonique)   [9].   De   plus,   corroborant   leur   expression   restreinte   à   la   lignée   myélo-­‐monocytaire   elles   semblent   participer     à   des   fonctions   clés   indispensables   à   la   défense  immunitaire  comme  la  migration  cellulaire  via  le  réarrangement  du  cytosquelette  [10].    

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Lorsqu’elles  sont  présentes  en  extracellulaire,  elles  participeraient  également  à  la  défense  de  l’hôte.   Elles   auraient   ainsi   un   rôle   antibactérien   et   antifongique,   et   semblent   de   plus  véhiculer  un  message  pro-­‐inflammatoire.  Ainsi,  le  complexe  jouerait  un  rôle  essentiel  dans  la  diapédèse   et   l’adhésion   leucocytaire   [8].   Il   induirait   une   réponse   endothéliale   de   type    prothrombotique   et   proinflammatoire,   augmentant   la   transcription   de   chémokines  proinflammatoires,   de   molécules   d’adhésion   ainsi   que   la   perméabilité   vasculaire   en  relâchant    les  jonctions  entre  cellules  endothéliales  [11].  Mais  de  même  que  leur  rôle  physiopathologique  exact  n’est  pas  complètement  compris,  les  mécanismes   aboutissant   à   leur   augmentation   dans   le   plasma   restent   à   ce   jour  incomplètement  élucidés.  Ainsi,  les  protéines  S100  n’ont  pas  le  domaine  transmembranaire  permettant   une   sécrétion   «  classique  ».   La   façon   dont   elles   traversent   la  membrane   reste  donc   quelque   peu   énigmatique.   Toutefois,   en   1997,   Rammes   a   décrit   un   mécanisme   de  sécrétion     actif,   faisant   intervenir   la   protéine   kinase   C   (PKC)   et   nécessitant   un   réseau  microtubulaire   intact   [12].   In   vivo,   il   semble   que   deux   signaux   soient   nécessaires   à   la  sécrétion  du  complexe  :  outre  l’activation  de  la  voie  de  la  PKC,  il  faut  également  une  liaison  à  l’endothélium   activé   ou   aux   éléments   de   la   matrice   extracellulaire   inflammée   (collagène,  fibronectine..),  responsable  d’une  augmentation  de  calcium  intracellulaire.  Ceci  permet  donc  un  relarguage  du  complexe  localisé  spécifiquement  au  site  inflammatoire,  et  met  en  exergue  le   rôle   extracellulaire   pro-­‐inflammatoire   de   ces   protéines   [13][12].   A   contrario,     d’autres  auteurs  montrent  que  la  nécrose  cellulaire  serait  responsable  de  la  présence  extracellulaire  du  complexe  à  des  concentrations  importantes  dans  les  phénomènes  inflammatoires  [14].      Alors   que   ces   protéines   sont   connues   depuis   une   trentaine   d’années   et   exclusivement  décrites  dans   les  désordres  dysimmunitaires,   ce  n’est  que   très   récemment  que   leur  étude  s’étend  à  d’autres  pathologies,  notamment  cancéreuses,  et   infectieuses,  où  elles  semblent  jouer  un  rôle  majeur.  C’est  ainsi  que  l’on  commence  à  s’y  intéresser  dans  le  choc  septique.  En   effet,   en   2007,   Vogl   décrivait   chez   l’animal   que   l’absence   de   ces   protéines   améliore   la  survie   de   souris   dans   un  modèle   de   choc   endotoxinique   et   de   sepsis   abdominal.   De   plus,  pour  la  première  fois   il  mettait  en  évidence  que  les  effets  pro-­‐inflammatoires  et   létaux    de  ces   deux   protéines   étaient  médiés   par   leur   liaison   au   Toll-­‐like   récepteur   4,   faisant   de   ces  deux   protéines   des   activateurs   endogènes   de   cette   voix   de   signalisation   [15].   De   même,  Boyd,   dans   une   autre   étude,   montrait   que   la   présence   de   ces   protéines   participaient   à  l’apparition   d’une   défaillance   cardiaque   au   cours   du   choc   septique   chez   le   rat,   et  mettait  également  en  évidence  que  ces  effets  étaient  médiés  par  une   liaison  aux  récepteurs  RAGE  [16].   C’est   ainsi   que   certains   auteurs   commencent   à   les   décrire   comme   des     Damage  Associated   Molecule   Patterns   ou   DAMPS,   molécules   capables   de   véhiculer   un   signal   de  danger  endogène  et  d’entraîner  une  réponse  de  défense  en  activant  le  système  immunitaire  [17].  Enfin,  en  2008,  Payen  mettait  chez  des  patients  en  état  de  choc  septique,  avec  des  scores  de  gravités  comparables,  que  dès  J0,  les  patients  qui  allaient  mourir  avaient  une  concentration  significativement   plus   élevée   de   protéine   S100A8   circulante,   et   ce,   sans   aucun  chevauchement  avec   les   survivants.   Il  montrait  également  que   la  guérison  était  associée  à  une  diminution  de  cette  protéine  dans  le  sang  [3].  Ceci  fait  donc  de  ces  deux  protéines,  si  ce  n’est  encore  une  cible  thérapeutique,  au  moins  un  marqueur  pronostique  unique,  et  d’un  intérêt  majeur  dans  la  recherche  clinique  associée  au  choc  septique.        

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Ainsi  les  calgranulines  apparaissent  de  façon  indéniable  comme  des  médiateurs  essentiels  de  l’inflammation:     de   part   leur   taux   cytosolique   si   important   dans   les   cellules   phagocytaires  (40%     et   1%  des   protéines   cytosoliques   du   polymorphonucléaire   neutrophile   (PMN)   et   du  monocyte  respectivement)  [7],  cellules  pivots  du  système  immunitaire  inné    et  ayant  un  rôle  crucial   dans   l’initiation   et   la   diffusion   de   la   réponse   inflammatoire,   de   part   leur   présence  augmentée   de   façon   systématique   dans   tous   les   états   inflammatoires   et   ce   avec   des  concentrations   corrélées   à   la   gravité   de   la  maladie,   notamment   dans   le   choc   septique   où  elles  semblent  être  un  marqueur  pronostique  majeur,  de  part  leurs  fonctions  extracellulaires  et  intracellulaires  et  enfin,  de  part  les  récepteurs  sur  lesquelles  elles  agissent.    Ainsi,  voulant  mieux  comprendre  le  rôle  de  ces  protéines  dans  la  pathologie  septique  nous  nous   sommes   demandés   quelles   étaient   les   fractions   de   calgranulines   dans   les   cellules  immunitaires,  quelles  étaient  les  modifications  d’expression  de  ces  protéines  en  fonction  du  type  cellulaire  et  de  leur  activation  par  des  agonistes  choisis,  et  s’il  y  avait  une  relation  entre  l’expression  intracellulaire  et  le  niveau  d’expression  extracellulaire  de  ces  protéines.  Notre  projet  va  donc  s’attacher  à  étudier  les  calgranulines  dans  les  cellules  immunitaires  et  les  conséquences  d’une  activation  de  ces  cellules  sur   la  variation  des  calgranulines   intra  et  extracellulaires.    Nous  avons  choisi  de  travailler  sur  du  sang  total  de  sujet  sain,  et  d’étudier  en  particulier  les  PMNs  et   les  monocytes.  En  effet,   les  protéines  S100A8  et  S100A9  sont,  dans   l’état  de  nos  connaissances,   très   spécifiques   de   ces   types   cellulaires,   qui   par   ailleurs   jouent   un   rôle  primordial  dans   le   choc   septique  en  étant  à   la   fois   les  premiers  acteurs   sur   le   site   infecté,  ainsi   que   les   vecteurs,    au   même   titre   que   le   système   nerveux,   de     l’agression   septique.  Notre   modèle   nous   a   également   permis   d’étudier   l’expression   des   calgranulines   dans   les  lymphocytes.   Ainsi,   c’est   en   suivant   les   taux   intracellulaires   et   extracellulaires   de   ces  protéines  et  du  complexe,  dans  les  cellules  immunitaires  circulantes,  exposées  ou  non  à  des  agonistes  classiques,  et  selon  une  cinétique  rapide  que  nous  nous  proposons  de  répondre  à  ces  questions.                      

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MATERIELS  ET  METHODES      1.  Préparations  cellulaires       a.  Choix  des  échantillons  Notre   travail  a  été   réalisé  sur  du  sang   total  de  volontaires  sains  prélevés  à   l’Etablissement  Français  du  Sang,  Centre  de  l’hôpital  Saint-­‐Louis,  dans  le  cadre  d’une  convention  de  cession  de  produits  issus  du  sang  à  but  non  thérapeutique.  (C  CPSL  UNT-­‐N°  09/SL/019).  Le  sang  a  été  prélevé  sur  tubes  héparinés  (Becton  Dickinson  Vacutainer,  Plymouth,  UK)  et  traité  dans   les  deux  heures  suivant  son  prélèvement.       b.  Choix  et  concentration  des  agonistes  Nous   avons   ainsi   choisi     le   lipopolysaccharide   (LPS,   Sigma,   St   Quentin   Fallavier,   France),  agoniste   d’origine   bactérienne   classique,   le   Formyl-­‐Methionyl-­‐Leucyl-­‐Phenylalanine   (fMLP,  Sigma),  chémoattractant  d’origine  bactérienne  n’activant  pas  la  voie  du  récepteur  Toll-­‐4    ,2  cytokines  :   le   Granulocyt   Macrophage   Colony-­‐Stimulating   Factor   (GMCSF,   R&D   Systems,  Abington,  UK),  et   l’interféron  gamma  (IFNγ,  R&D  system)  et  un  mitogène,   la  concanavaline  A,   plus   spécifiquement   orienté   vers   une   activation   lymphocytaire.   En   effet   d’une   part   la  littérature   rapporte   un   effet   de   ces   molécules   sur   la   sécrétion   de   S100A8,   S100A9,   et  S100A8/S100A9   par   les   cellules   immunitaires   [12][18]   et   d’autre   part   ces   molécules   sont  présentes   au   cours   de   l’orage   inflammatoire   d’origine   septique.   Notre   choix   s’est  spécifiquement  porté  sur   le  GMCSF  et   l’IFNγ  qui  ont  été  testés  comme  traitement  du  choc  septique.[19].  Pour  chaque  agoniste,  les  concentrations  choisies  correspondent  soit  à  des  descriptions  de  la  littérature   comme   entraînant   une   activation   des   cellules   immunitaires   associée   à   une  sécrétion   des     calgranulines   [12],   soit   à   des   résultats   de  mises   au   point   testant   plusieurs  concentrations.  Nous  avons  ainsi  testé   le  LPS  à  10µg/ml  et  100ng/ml,   la  concanavaline  A  à  100  et  500  µg/ml,  le  fMLP  à  10-­‐8  M  et  10-­‐7  M,  la  cycloheximide  à  10,  50,  100  et  1000µg/ml.  Par  la  suite  les  expériences  ont  été  réalisées  avec  les  doses  minimales  efficaces.         c.  Cinétique  d’activation  des  leucocytes  soumis  à  différents  agonistes  3  ml  de  sang  total  a  été    incubé  dans  des  tubes  en  polypropylène  (BD  Biosciences,  Le  Pont  De  Claix,   France)   dans   les   deux   heures   suivant   le   prélèvement   à   37°C,   5%   de   CO2,   et   95%  d’humidité  pendant  1  heure,  3  heures  et  6  heures  avec  les  agonistes  suivants  :    

- deux  agonistes  bactériens  classiques  :  le  LPS  (100ng/ml),  et  le  fMLP  (10-­‐8  M)  - deux  cytokines  :  le  GMCSF  (  100UI/µl  ),  et  l’IFNγ  (50UI  /ml)  - un  mitogène  :  la  concanavaline  A  - un  agoniste  apoptotique  :  la  cycloheximide  (CHX)  (100  µl  /ml).  

Pour  chaque  temps  de  chaque  stimulation  un  contrôle  a  été  effectué.    Les  leucocytes  ont  également  été  analysés  au  temps  H0  (condition  baseline).  Ainsi,  pour  chacun  des  6  agonistes  choisis  7  conditions  ont  été  analysées  :    

- baseline  (H0)  - agoniste  1  heure  (H1)-­‐  contrôle  H1  - agoniste  H3  –  contrôle  H3    - agoniste  H6  –  contrôle  H6.  

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Pour   chaque   condition,   un   marquage   des   protéines   membranaires   et   intracellulaires  d’intérêt  a  été  réalisé  suivi  d’une  analyse  en  cytométrie  de  flux  comme  décrit  ci-­‐dessous.  De   plus,   pour   chaque   condition,   2ml   de   sang   total   a   été   prélevé,   et   le   surnageant   a   été  recueilli    après  centrifugation  pendant  10  minutes  (1800  tours  par  minute)  puis  conservé  à  –  20°C  en  attente  d’un  dosage  par  Enzyme-­‐Linked  Immunosorbent  Assay  (ELISA).  Pour   chacun   des   temps,   nous   avons   donc   réalisé   une   quantification   intracellulaire   des  protéines   S100A8,   S100A9   et   S100A8/S100A9   en   cytométrie   de   flux,   ainsi   qu’une  quantification  extracellulaire  de  la  protéine  S100A8  en  ELISA.         d.  Cinétique  nécrose  L’analyse  de  la  survenue  d’une  éventuelle  nécrose  cellulaire,  potentiellement  à  l’origine  de  la  libération   de   calgranulines   dans   le   milieu   extracellulaire,   a   été   réalisé   en   soumettant   les  échantillons   à   la   cinétique   habituelle   d’incubations,   en   condition   contrôle   et   après  stimulation  par  le  LPS  (100ng/ml)  Une  condition  baseline  a  également  été  analysée.  Pour  chaque  temps  de  chaque  condition,   l’échantillon  a  d’abord  été  centrifugé  (1800  tours  par  minutes,  10  minute).  Le  surnageant  a  été  récupéré  et  conservé  à  –20°C  en  attente  d’une  analyse  par  ELISA.  La   survenue   d’une   nécrose   cellulaire   massive   a   été   reproduite   par   immersion   du   culot  cellulaire   pendant   quelques   minutes   dans   de   l’azote   liquide   jusqu’à   congélation,   puis  décongélation   au   bain-­‐marie   à   37°C   (technique   de   freezing-­‐thawing[20]).   Ce   cycle   a   été  répété  6   fois.  Le   lysat  cellulaire  obtenu  été  recueilli  et  conservé  à  –  20°C  en  attente  d’une  analyse   par   ELISA.   Une   partie   de   l’échantillon   a   été   coloré   au   bleu   Trypan   (Sigma)   et   la  nécrose  cellulaire  a  été  vérifiée  sur  lame  observée  au  microscope.       e.  Mortalité  cellulaire  La  viabilité  des   leucocytes  a  été  vérifiée   sur   lame  après   coloration  May-­‐Grünwald  Giemsa,  pour  chaque  temps  et  après  stimulation  par   fMLP  et  LPS  au  Laboratoire  d’Hématologie  de  l’Hôpital   Lariboisière.   Le   nombre   de   cellules   nécrotiques   n’était   pas   significativement  augmenté   par   nos   conditions   expérimentales,   à   part   lors   de   la   cinétique   nécrose,   comme  attendu.  De  plus  la  cytométrie  en  flux  n’a  pas  montré  de  baisse  significative  du  pourcentage  de  monocytes  ou  de  PMNs  entre  les  temps  H0    et    H6.      2.  Immunohistochimie  et  analyse  par  cytométrie  en  flux         a.  Principe  de  la  cytométrie  en  flux  :  Pour   la   quantification   intracellulaire   des   protéines   S100A8,   S100A9   et   du   complexe  S100A8/S100A9,   nous   avons   choisi   d’utiliser   la   cytométrie   en   flux.   Le   principe   de   cette  technique   repose   sur   le   marquage   par   une   molécule   fluorescente,   ou   fluorochrome,   de  l’élément   cellulaire   d’intérêt,   en   particulier   les   protéines  membranaires   et   intracellulaires.  Lors  du  passage  au  cytomètre,  les  cellules  sont  entraînées  dans  un  flux  liquide  traversé  par  un   rayon   laser  de  488nm  de   longueur  d’onde.   Le  passage  d’une  particule  devant   le   rayon  laser   est   appelé   «  évènement  »,   et   généralement   assimilé   au   passage  d’une   cellule   isolée.  Lors  de  chaque  évènement,  la  lumière  est  à  la  fois:    

- transmise   à   la   même   longueur   d’onde   en   fonction   des   caractéristiques  morphologiques  de  la  cellule,  et  

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- ré-­‐émise  à  une  ou  plusieurs  longueur(s)  d’onde  différente(s),  après  excitation  du(es)  fluorochrome(s)  utilisé(s).  

Le  signal  obtenu  est  amplifié  et  converti  pour  analyse  informatique.  L’analyse   parallèle   des   caractéristiques   morphologiques   (taille   et   structure   plus   ou  moins  granuleuse  du  cytoplasme)  et  de  la  présence  de  protéines  membranaires  ou  intracellulaires  permet   donc   de   sélectionner   une   population   cellulaire   au   sein   d’un   échantillon,   et   de  mesurer   le   niveau   d’expression   d’une   molécule   d’intérêt.   Nous   avons   pu   ainsi  spécifiquement   et   en   parallèle   à   la   fois   dans   les   PMNs   et   les  monocytes,   étudier   les   taux  intracellulaires  des  protéines  S100A8,  S100A9  et  de  leur  complexe  et  contrôler  la  réalité  de  l’activation   cellulaire   par   les   agonistes   choisis   en   quantifiant   l’expression  membranaire   de  marqueurs  d’activation  (CD11b/CD18  pour  le  PMN,  HLA-­‐DR  pour  le  monocyte,  CD69  pour  le  lymphocyte).         b.  Choix  des  anticorps    

- Sélection  des  populations  :  Le  CD14,  marqueur  de  différentiation  myéloïde,  a  été  choisi  pour  la  sélection  des  monocytes  humains,  qui   l’expriment  à   leur  surface  de  façon  constitutive  avec  une   intensité  élevée.  La  population  monocytaire  au  sein  d’un  échantillon  de  sang  total  peut  donc  être  sélectionnée  sur  la  base  de  son  expression  de  CD14,  et  de  ses  caractéristiques  morphologiques  propres:  taille   supérieure   et   granulosité   intermédiaire   comparées   aux   lymphocytes   et   aux   cellules  granuleuses  De   même,   le   CD16   a   été   choisi   pour   la   sélection   des   PMNs   [21].   C’est   un   récepteur   de  surface  pour  le  fragment  Fc  des  immunoglobulines  G.  Il  est  exprimé  de  façon  constitutive  par  les   PMNs   et   est   absent   des   polynucléaires   éosinophiles   et   basophiles.   La   population   des  PMNs   d’un   échantillon   de   sang   total   a   donc   pu   être   caractérisée   comme   étant   une  population   exprimant   le   CD16     et   avec   une   granulosité   supérieure   par   rapport   aux  lymphocytes  et  aux  monocytes.    Le   CD3,   complexe   d’immunoglobulines   transmembranaires   appartenant   au   récepteur   des  cellules  T  (TCR)  a  été  choisi  pour    sélectionner  les  lymphocytes  T.  Le   CD   19,   glycoprotéine  membranaire   spécifique   des   lymphocytes   B   a   été   choisi   pour   les  sélectionner  [22].    

- Sélection  des  marqueurs  d’intérêt  :  Des  anticorps  anti  S100A8  (=  anti  calgranuline  A),  anti  S100A9  (=  anti  calgranuline  B)  et  anti  S100A8/S100A9   (=   anti   calgranuline   A/B)   ont   été   choisi   pour   détecter   les   calgranulines   et  leur   complexe   en   intracellulaire.   L’analyse   d’un   éventuel   marquage   membranaire   de   ces  protéines   a   été   vérifiée   dans   nos   conditions   expérimentales.   Après   contact   avec   les  fournisseurs,   il   nous   a   été   précisé   que   les   anticorps   anti   S100A8   et   anti   S100A9   étaient  respectivement   spécifiques  de   ces  2  protéines.   L’anticorps  anti   S100A8/S100A9  pouvait   se  fixer,  avec  une  proportion  non  connue  aux  monomères  en  plus  du  complexe.  Le  CD11b  et  le  CD18,  appartenant  à  la  famille  des  intégrines  et  formant  un  hétérocomplexe  transmembranaire   permettant   l’adhésion   leucocytaire   ont   été   choisis   comme   marqueurs  membranaires  de  l’activation  des  PMNs.  [23]  Le  HLA-­‐DR,   isoforme  du  complexe  majeur  d’histocompatibilité  de  classe   II  est  exprimé  à   la  surface   des  monocytes   et   permet   de   présenter   les   antigènes   aux   cellules   T.   Chez   le   sujet  sain,    son  expression  augmente  avec  l’activation  monocytaire  et  lors  de  la  différentiation  en  

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cellules   dendritiques   ou   en  macrophages.   Il   a   été   choisi   comme  marqueur   de   surface   de  l’activation  monocytaire.  Le  CD  69,  glycoprotéine  transmembranaire  exprimée  de  façon  précoce  au  cours  de  l’activation  lymphocytaire  a  été  choisi  comme  témoin  de  leur  activation.    Ainsi,   après   activation   des   leucocytes   par   incubation   du   sang   total   avec   les   différents  agonistes,   l’induction  de   l’activation  cellulaire  a  pu  être  vérifiée  par   l’augmentation  de  ces  marqueurs  à  la  surface  des  PMNs,  des  monocytes  et  des  lymphocytes  respectivement.  Pour   la   reconnaissance  des  cellules  apoptotiques,  nous  avons  choisi   l’annexine  V.  En  effet,  précocement   au   cours   de   l’apoptose,   et   contrairement   à   la   nécrose,   la   membrane   des  cellules  ne  se  rompt  pas,  mais  elle  perd   la  distribution  asymétrique  de  ses  phospholipides.  Les   cellules   exposent   alors   des   phosphatidyl-­‐sérines,   spécifiquement   détectable   par   la  cytométrie  en  flux  grâce  à  leur  liaison  à  l’annexine  V.[24].      

Figure  1  :  exemple  de  marquage  intracellulaire  du  complexe  S100A8  dans  les  monocytes  et    les  PMNs.  A  :  marquage  CD14  et  CD16  permettant  de  différentier  les  PMNs  (CD16  high,  CD14  low  =  population  1  ou  P1  en  rouge)    et  les  monocytes  (CD14  high  =  population  2  ou  P2,  en  vert).    B:  dans  P1,  dot  plot  de  l’expression  de  S100A8  des  cellules  CD16+.  C  :  médiane  de  fluorescence  calculée  à  partir  de  la  représentation  en  histogramme  de  l’expression  de  S100A8  dans  P1.  D  :  dans  P2,  dot  plot  de  l’expression  de  S100A8  des  cellules  CD14+.  E  :  médiane  de  fluorescence  calculée  à  partir  de  la  représentation  en  histogramme  de  l’expression  de  S100A8  dans  P2.  

CD16

CD14

S100A8

S100A8

CD16

CD14

S100A8

S100A8

270

400

A

B C

D E

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  c.  Calibration  du  signal  PE  Le   niveau   d’expression   d’HLA-­‐DR,   de   CD11b,   CD18,   S100A8   (calgranulin   A),   S100A9  (calgranulin  B)  et   S100A8/S100A9   (calgranulin  A/B)  est  mesuré  à  partir  de   l’intensité  de   la  fluorescence   (Mean   Fluorescence   Intensity,  MFI)   émise   par   la   PE,   fonction   du   nombre   de  molécules   d’anticorps   et   donc   du   nombre   de  molécules   d’intérêt   à   la   surface   de   chaque  cellule.  La  MFI  dépend  des  réglages  de  l’appareil  et  de  l’intensité  du  laser.  La  déviation  liée  à  l’usure  du  laser,  ou  les  ajustements  de  réglages  nécessaires  en  cours  d’étude,  par  exemple  après  une  intervention  technique  sur  l’appareil,  imposent  donc  l’utilisation  d’un  système  de  calibration   du   signal.   Dans   cette   étude,   un   système   commercialisé   a   été   choisi   (BD  Quantibrite   PE   Beads,   BD   Biosciences,   San   Jose,   CA,   USA).   Il   repose   sur   l’analyse   par   le  cytomètre   d’un   mélange   de   4   types   de   billes,   toutes   de   même   taille,   et   couplées   à   des  quantités   connues   de   molécules   PE.   Les   4   niveaux   de   fluorescences   qui   en   résultent  correspondent   à   4   quantités   précises   de  molécules   PE   fixées   sur   les   billes.   Une   droite   de  régression  relie  donc  ces  valeurs  de  MFI  à  des  valeurs  de  «  nombre  de  molécules  PE  ».  Le  couplage  de  l’anticorps  avec  le  fluorochrome  PE  en  proportion  1/1  pour  tous  les  anticorps  utilisés   dans   ce   travail   et   son   utilisation   en   concentration   saturante   (selon   les  recommandations  du  fabricant)  permettent  donc  de  convertir  finalement  la  MFI  mesurée  en  «  nombre  de  sites  »  ou  «  nombre  d’anticorps  »  par  cellule  (Antibodies  Bound  per  Cell,  AB/C).  Chaque   lot   de   billes   est   fourni   par   le   fabricant   accompagné   de   ses   caractéristiques  quantitatives   (nombre   de  molécules   PE   par   type   de   bille).   La   conversion   du   signal   par   ce  système   rend   donc   possible   la   comparaison   des   résultats   obtenus,   indépendamment   des  différences  techniques  qui  peuvent  influencer  la  mesure.       d.  Marquage  des  protéines  membranaires  L’ensemble  de  la  procédure  a  été  réalisée  à  température  ambiante.  50  µl  de  sang  a  été  incubé  30  min  dans  des  tubes  en  polystyrène,  à  l’obscurité,  en  présence  des  anticorps  suivants:    -­‐  anti  CD14-­‐Fluorescéine  iso  Thio  Cyanate  (FiTC)  (5µl),  anti  CD16-­‐Phycocyanine  5  (PC5)(1µl),  anti  CD3-­‐FiTC  (5µl),  anti  CD19-­‐FiTC  (5µl)  (Beckman  Coulter  Immunotech,  Marseille,  France),    -­‐   anti   HLA-­‐DR-­‐Phycoérythrine   (PE),     (clone   L243),   anti   CD11b-­‐PE,   anti   CD18-­‐PE,     (BD  Biosciences,  San  Jose,  CA),  anti  CD  69-­‐  PE  -­‐  anti  S100A8-­‐PE,  anti  S100A9-­‐PE  et  anti  S100A8/S100A9-­‐PE  (Santa  Cruz  Biotechnology  Inc.,  Santa  Cruz,  CA,  USA)  (pour  l’analyse  de  l’éventuel  marquage  membranaire  de  ces  protéines).  Un   anticorps   dirigé   contre   une   immunoglobuline   "irrelevante"   couplée   à   la   PE   (BD  Biosciences,  San  Jose,  CA)  a  été  utilisée  pour  évaluer  le  signal  dû  à  la  liaison  non  spécifique  des   anticorps   couplés   à   la   PE,   en   particulier   au   récepteur   Fc   présent   à   la   surface   des  monocytes.  Puis  les  érythrocytes  ont  été  lysés  par  une  incubation  de  10  minutes  à  l’obscurité  dans  1  ml  d’une  solution  de  lyse  (FACS  Lysing  Solution,  BD  Biosciences).  Les  leucocytes  ont  ensuite  été  lavés  en  ajoutant  3  ml  d’une  solution  tampon  phosphate  (PBS)  ajustée  à  un  pH  =  7,4.  Le  culot  cellulaire  a  été  récupéré  après  centrifugation  (5  minutes,  1800  tours  par  minute)  et  fixé  par  une  solution  de  paraformaldéhyde  1%  pour  les  tubes  n’ayant  qu’un  marquage  de  protéines  membranaires.   Les   leucocytes   ont   ensuite   été   conservés   à   4°C,   à   l’obscurité,   jusqu’à  l’analyse.      

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  e.  Marquage  des  protéines  intracellulaires  L’ensemble  de  la  procédure  a  été  réalisée  à  température  ambiante.  Pour  les  tubes  avec  un  marquage  de  protéines  intracellulaires,  après  la  lyse  des  érythrocytes,  le   lavage   et   la   centrifugation   (cf  marquage   des   protéines  membranaires)   la   fixation   a   été  réalisée   par   15   minutes   d’incubation   dans   une   solution   de   paraformaldéhyde   2%   à  l’obscurité.    Les  leucocytes  ont  ensuite  été  lavés  en  ajoutant  2ml  de  PBS  et  récupérés  après  centrifugation  (5  minutes,  1800  tours  par  minute).  Les  cellules  ont  ensuite  été  perméabilisées  pendant  20  minutes  par  une  solution  de  PBS  à  0,1%  de  saponine   (Sigma,  St  Quentin  Fallavier,  France)  et  0,2%  de  sérum  albumine  bovine  (BSA,  Sigma).   Le  culôt   cellulaire  a  été   récupéré  après  centrifugation   (5minutes,  1800   tours  par   minute)   et   les   cellules   ont   été   incubées   30   minutes   à   l’obscurité   en   présence   d’anti  S100A8-­‐PE,  d’anti  S100A9-­‐PE  et  d’anti  S100A8/S100A9-­‐PE,     (Santa  Cruz  Biotechnology   Inc.,  Santa   Cruz,   CA,   USA).   Après   lavage   avec   3   ml   de   solution   de   perméabilisation   et  centrifugation  (5  minutes,  1800  tours  par  minute),  les  cellules  ont  été  remises  en  suspension  dans   une   solution   de   paraformaldéhyde   1%,   et   conservés   à   4°C,   à   l’obscurité,   jusqu’à  l’analyse.    Bien  que  ce  type  de  fixation  permette  un  stockage  de  48  heures  maximum,  les  échantillons  ont  été  analysés  le  plus  tôt  possible,  au  maximum  dans  les  12  heures  (FacsCanto  et  logiciel  FacsDiva,   Becton   Dickinson),   au   Laboratoire   d’Hématologie   Biologique   de   l’Hôpital  Lariboisière.       f.  Marquage  des  cellules  apoptotiques  L’ensemble  de  la  procédure  a  été  réalisée  à  température  ambiante.  L’analyse  de   l’expression  des  calgranulines   lors  de   l’induction  de   l’apoptose  a  été   réalisée.  Pour  valider   le  modèle  choisi,   les  cellules  apoptotiques  ont  été  marquées  par  un  anticorps  reconnaissant  l’annexine  V  (cf  choix  des  marqueurs  membranaires)  Pour   chaque   temps   et   chaque   condition   de   la   cinétique   apoptose,   50µl     de   sang   a   été  prélevé   et   placé   dans   des   tubes   en   polystyrène.   Les   érythrocytes   ont   été   lysés   par   une  incubation  de  10  minutes  à  l’obscurité  dans  1  ml  d’une  solution  de  lyse,  (BD  Biosciences).  Les  leucocytes  ont    été  lavés  en  ajoutant    3  ml  de  PBS  et  le  culôt  cellulaire  a  été  récupéré  après  centrifugation    (5  minutes,    1800  tours  par  minute).  Les  leucocytes  ont  ensuite  été  incubés  pendant  10  minutes  à  l’obscurité  avec  500µl  d’une  solution  de  binding  buffer  et  avec  ou  sans  5   µl   d’anti   Annexin   V   –FITC   (Sigma),   selon   les   recommandations   du   fournisseur.   Les  échantillons  ont  ensuite  immédiatement  été  analysés  en  cytométrie  de  flux.  Pour  chaque  temps  et  chaque  condition,  après  le  prélèvement  des  50µl    de  sang,  le  reste  de  l’échantillon  a  été  centrifugé  pendant  10  minutes,  à  1800  tours  par  minute.  Le  surnageant  a  été  récupéré  et  conservé  à  –20°C  en  attendant  une  analyse  par  ELISA.      3.  Enzyme-­‐Linked  Immunosorbent  Assay  :  ELISA    La  mesure  de  la  protéine  S100A8  dans  le  surnageant  a  été  effectuée  par  ELISA  comme  décrit  précédemment   [3],   au   Laboratoire   de   Biochimie   et   Biologie   Moléculaire   de   l’Hôpital  Lariboisière,  Paris  10ème,  sous  la  direction  du  professeur  Launay.    

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   4.  Analyse  statistique  des  données    Les  données  de  cytométrie  en  flux  ont  été  exprimées  en  nombre  de  sites  par  cellule  et   les  valeurs  des  données  de  l’ELISA    en  pg/ml.  Les   résultats   sont   présentés   sous   forme   de   graphe   en   boîte   à  moustache   (box   plots)   Les  barres  horizontales  extrêmes  représentent  les  5ème  et  95ème  percentiles,  la  barre  centrale  la  médiane  et  les  barres  de  part  et  d’autre  de  la  barre  médiane  représentent  les  25ème  et  75ème  percentiles.  L’analyse   statistique   des   données   de   la   cytométrie   en   flux   et   de   l’ELISA   a   été   réalisée   en  utilisant  un  test  non  paramétrique  de  Mann-­‐Whitney  (logiciel  Statview).  La  valeur  du  seuil  de  significativité  a  été  fixée  à  0,05.  Ainsi,  les  quantités  de  S100A8/S100A9,  S100A8,  S100A9    intracellulaires,  et  de  CD11b,  CD18  et  d’HLA-­‐DR  membranaires  exprimées  en  nombre  de  sites  par  cellule,  à  H1,  H3  et  H6  après  stimulation  ont  été  comparées  aux  valeurs  contrôles  des  temps  correspondants.  De  même  les   quantités   de   S100A8  extracellulaires   à  H1  H3  et  H6   après   stimulation   et   exprimées   en  pg/ml  ont  été  comparées  aux  valeurs  contrôles  des  temps  correspondants.  De  plus  les  valeurs  contrôles  à  H1,  H3  et  H6  ont  été  comparées  entre  elles  et  au  temps  0.          

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RESULTATS    Les  valeurs  intracellulaires  sont  exprimées  en  nombre  de  site  par  cellules,  et  sont  comparées    aux  valeurs  contrôles  des  temps  correspondants  (sauf  précision).  Les  valeurs  de  S100A8  dans  le  surnageant  sont  exprimées  en  pg/ml  et  sont  également  comparées  aux  valeurs  des  temps  contrôles  correspondants.    

1. Validation  du  modèle         a.  Cinétique  de  l’expression  membranaire  des  marqueurs  d’activation  cellulaire  à  H1,  H3  et  H6  après  stimulation  par  du  LPS,  du  fMLP,  du  GMCSF  et  de  l’IFNγ    (Figure  3)    

- Monocyte  et  HLA-­‐DR  :  La  stimulation  par  le  LPS  entraîne  une  augmentation  significative  de  l’HLA-­‐DR  monocytaire  à  H1,   H3   et   H6.   Le   GMCSF     entraîne   une   augmentation   significative     plus   tardive   de   son  expression,  à  partir  de  H3  et  l’IFNγ  uniquement  à  H1.  Il  n’y  a  pas  de  variation  significative  de  l’expression  de  HLA-­‐DR  à  la  surface  du  monocyte  après  stimulation    par  du  fMLP  par  rapport  aux  valeurs  des  temps  contrôles  sur  cette  cinétique.    

- PMN,  CD11b  et  CD18  :  On  retrouve  une  augmentation  significative  du  CD11b  et  du  CD18  précoce  et  soutenue,  de  H1  à  H6  après  stimulation  des  PMNs  par  du  LPS,  du  fMLP,  et  du  GMCSF.  L’augmentation   de   ces   deux   molécules   est   un   peu   plus   tardive   après   stimulation   par   de  l’IFNγ,  à  partir  de  H3       b.   Pourcentage   de   cellules   apoptotiques   après   stimulation   par   la   cycloheximide    (figure  2)  Après  incubation  avec  de  la  cycloheximide  on  retrouve  une  augmentation  significative  de  la  quantité  de  PMNs  apoptotiques  à  H6   (42,8%  vs  5,5%)  et  de  monocytes  apoptotiques  à  H3  (11,2%  vs  3,9%)  et  H6  (15,1%  vs  4%).    

Figure  2  :  pourcentage  de  monocytes  et  de  PMNs  en  apoptose  ou  exprimant  l’annexine  V  n=3  *  p<0,05  (pourcentages  comparées  à  ceux  des  valeurs  contrôles  des  temps  correspondants)  

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HLA  DR  monocytes   CD  11b  PMN   CD  18  PMN  

IFNγ

fMLP  

LPS  

GM-­‐CSF  

Figure  3  :  cinétique  H0,  H1,  H3  et  H6  des  marqueurs  d’activation  cellulaire  :  HLA-­‐DR  (monocyte)  CD11b  et  CD18  (PMN)  après  stimulation  par  LPS,  fMLP,  GMCSF,  et  IFNγ .  Valeurs  exprimées  en  nombre  de  sites  par  cellules  (ordonnées)  en  fonction  du  temps  (abscisse).  Contrôle   (n=   13)   /   LPS   (100ng/ml)   n=   8   /     fMLP   (10-­‐8  M),   n=8   /   GMCSF   (100UI/µl)   n=5   IFNγ    (50UI/ml  )  n=  5  *:  p<  0,05    (valeurs  comparées  aux  valeurs  contrôles  des  temps  correspondants.  

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2.    Fraction  de  calgranulines  en  fonction  du  type  cellulaire       a.   Répartition   des   monomères   S100A8   et   S100A9   et   de   leur   complexe   dans   les  cellules  immunitaires  avant  et  après  stimulation.    

- Lymphocytes  Tout  d’abord,   en   cytométrie  de   flux,   et  dans  nos   conditions  expérimentales,   il   n’a  pas  été  retrouvé  de  protéine   S100A8  ou   S100A9,   ni   de   complexe     dans   le   lymphocyte,   à   l’état   de  base  et  après  activation  pendant  1h,  3h  ou  6h  par  du  LPS  et  du  fMLP.  Ceci  est  en  accord  avec  la  littérature  sur  le  sujet  [6].  De  plus  3  expériences  ont  été  réalisées  avec  un  agoniste  lymphocytaire  :  la  concanavaline  A.  Mais,   la   constatation   d’une   part,     de   l’absence   de   calgranulines   intracellulaires   dans   le  lymphocyte,  et  d’autre  part  de   l’absence  d’augmentation  de   l’expression  membranaire  des  marqueurs  d’activation   cellulaire   choisis  du   fait  d’une   cinétique  probablement   trop   courte  pour  permettre  une  activation  cellulaire  nous  a  conduit  à  ne  pas  poursuivre   (résultats  non  montrés)  Une  cinétique  a  également  été  réalisée  avec  une  incubation  de  24h  avec  du  LPS,  du  fMLP  et  de  la  concanavaline  A.  Nous  avons  constaté  une  mortalité  cellulaire  trop  importante  à  H24  pour  permettre  une  analyse  en  cytométrie  de  flux  (résultats  non  montrés)    

- Monocytes  et  PMNs  (figure  4)  Les  deux  protéines  et  leur  complexe  sont  présents  à  l’état  de  base  et  après  activation  dans  le  monocyte   et   le   PMN.   De   façon   très   intéressante,   la   répartition   des   2   protéines   et   du  complexe   est   différente   en   fonction   du   type   cellulaire.   Ainsi,   dans   le   cytoplasme   du  monocyte  le  complexe  est  la  forme  majoritairement  retrouvée,  alors  que  la  protéine  S100A9  est  la  forme  majoritaire  dans  le  cytoplasme  du  PMN.  Dans  les  2  types  cellulaires  la  protéine  S100A8   est   minoritaire.   Cette   répartition   n’est   pas   modifiée   par   l’activation   des   cellules  immunitaires,  et  ce    malgré  les  variations  intracellulaires  observées.      

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Figure  4  :  Histogramme  montrant  la  répartition  des  protéines  S100A8,  S100A9  et  S100A8/S100A9  dans  le  monocyte  et  le  PMN  à  H0,  H1,  H3  et  H6  en  condition  contrôle  et  après  stimulation  par  LPS,  fMLP,  GMCSF  et  IFNγ.  

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  b.    S100A8,  S100A9  et  S100A8/S100A9  membranaires  Dans  nos  conditions  expérimentales,  et  après  analyse  en  cytométrie  de  flux,     il  n’a  pas  été  retrouvé  de  monomère  ni  de  complexe  exprimé  à  la  membrane  des  monocytes  et  des  PMNs,  en   condition   contrôle   et   après   stimulation   par   du   LPS   et   du   fMLP,   quelque   soit   le   temps.  (données  non  montrées)      3.   Modification   de   l’expression   des   calgranulines   intracellulaires   en   fonction   du   type  cellulaire  et  de  l’agoniste       a.   Variation   intracellulaire     des   protéines   S100A8,   S100A9   et   du   complexe  S100A8/S100A9   après   stimulation   par   du   LPS,   du   fMLP,   du   GM-­‐CSF   et   de   l’IFNγ   dans   le  monocyte.(figure  5)  Les  valeurs  des  2  protéines  et  de  leur  complexe,  exprimées  en  nombre  de  site  par  cellule  ne  varient  pas  au  cours  du  temps  dans  les  conditions  contrôles.    Pour   la   protéine   S100A8,   après   stimulation   par   le   LPS,   on   note   une   augmentation  significative  à  H1    par  rapport  aux  valeurs  des  temps  contrôles  correspondants.   Il  n’y  a  pas  d’effet  des  autres  agonistes  sur   la  quantité   intracellulaire  de  S100A8  dans   le  monocyte  sur  cette  cinétique.  Quelque   soit   l’agoniste   utilisé,   il   n’y   a   pas   de   variation   de   la   quantité   intracellulaire   de  S100A9.  L’activation  du  monocyte  par   le   LPS  entraîne  une  augmentation   significative  du  complexe,  uniquement  à  H1.  Cette  augmentation  est  plus  tardive,  (H3  et  H6),    après  stimulation  par  du  GMCSF.  A  contrario,   il  y  a  une  diminution  significative  du  complexe  à  H6  après  stimulation  par  du  fMLP.  Selon  l’agoniste,  on  retrouve  donc  des  cinétiques  différentes  :  Le   LPS   entraîne   une   augmentation   significative   du   complexe   à   H1,   ainsi   qu’une  augmentation  de   la  protéine  S100A8  à  H1  et  H6.Il  n’y  a  pas  de  variation  significative  de   la  protéine  S100A9.  La   stimulation   par   le   fMLP   entraîne   une   diminution   significative   du   complexe   à   H6.   Les  monomères  ne  connaissent  pas  de  variation.  Le   GMCSF   entraîne   une   augmentation   du   complexe   à   H3   et   H6,   sans   variation   des  monomères.  Avec  l’IFNγ,   il  n’y  a  pas  de  mouvement  intracellulaire  des  monomères  ni  de  l’hétérodimère  au  cours  du  temps.       b.   Variation   intracellulaire   des   protéines   S100A8,   S100A9   et   du   complexe  S100A8/S100A9  après  stimulation  par  du  LPS,  du  fMLP,  du  GM-­‐CSF  et    de  l’IFNγ  dans  le  PMN  (Figure  6)  On  note  une  diminution  significative  spontanée  du  complexe  dans  le  cytosol  du  PMN    à  H1,  H3   et  H6   en   situation   contrôle,   par   rapport   au   taux   de   base.   Il   n’y   a   pas   de   variation   des  monomères  au  cours  du  temps  en  situation  contrôle.    La  protéine  S100A8  augmente  dans  le  PMN  après  stimulation  par  le  LPS  de  façon  précoce  et  durable   (de   H1   à   H6).   Après   stimulation   par   le   fMLP,   S100A8   voit   son   taux   intracellulaire  s’accroître   à   H1   et   H6.   Elle   est   augmentée   tardivement   à   H6   après   stimulation   par   du  GMCSF.  Il  n’y  a  pas  de  variation  notable  de  la  protéine  S100A8  après  traitement  par  l'IFNγ.  

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Pour  la  protéine  S100A9,  on  note  une  augmentation  précoce  et  constante,  de  H1  à  H6  après  une   stimulation   par   du   LPS.   Le  monomère   augmente   significativement     à   H1   et   H3   après  stimulation  par  du  fMLP.  Le  GMCSF  et  l’IFNγ  n’entraînent  pas  de  mouvements  de  S100A9.  La   stimulation   des   PMNs   par   le   LPS,   le   fMLP   et   le   GMCSF     entraîne   une   augmentation  significative  du  complexe  à  H1,  également  présente  à  H6  avec   le  GMCSF.  L’IFNγ  n’a  pas  de  conséquence   sur   la   quantité   intracellulaire   de   S100A8/S100A9     dans   le   PMN   au   cours   de  cette  cinétique.    On  note  donc  des  cinétiques  de  variation  de  ces  protéines  différentes  selon  l’agoniste  choisi:      Une   stimulation   par   le   LPS   entraîne   une   augmentation   du   complexe   à   H1,     et   des  monomères  à  H1,  H3  et  H6.    Après  incubation  avec  du  fMLP,  on  note  une  augmentation  du  complexe  à  H1,  de  la  protéine  S100A8  à  H1  et  H6  et  de  S100A9  à  H1  et  H3.  Une  stimulation  par  le  GMCSF  entraîne  une  augmentation  du  complexe  à  H1  et  H6.  S100A8  augmente  seulement  à  H6,  et  il  n’y  a  pas  d’augmentation  de  S100A9.  L’IFNγ  n’entraîne  pas  de  mouvements  des  monomères  ni  du  complexe.         c.   Variation   intracellulaire   des   protéines   S100A8,   S100A9   et   du   complexe  S100A8/S100A9  après  stimulation  par  de  la  CHX  dans  le  PMN  et  le  monocyte  (Figure  7)  Après  stimulation  par  de   la  CHX,  on  note  une  cinétique  de  variation  des  monomères  et  du  complexe  intracellulaire  qui  est  identique  dans  le  monocyte  et  le  PMN.  En  effet  on  retrouve  une  tendance  vers  la  diminution  des  monomères  intracellulaires  dans  les  2    types  cellulaires.  Cette  diminution  est   significative  à  H1  pour  S100A8  et  S100A9  dans   le  PMN,  et  à  H6  pour  S100A9   dans   le   monocyte.   On   retrouve   par   contre   une   tendance   à   l’augmentation   du  complexe  dans  les  2  cellules,  significative  à  H1  dans  le  monocyte.                                                

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fMLP   GMCSF  

Contrôle   LPS  

S100A8,  S100A9,  S100A8/S100A9  dans  le  monocyte  

Figure  5  :  cinétique    intracellulaire  de  S100A8,  S100A9  et  S100A8/S100A9  à  H0,  H1,  H3  et  H6  en  situation  contrôle  et  après  stimulation  par  du  LPS,  du  fMLP,  du  GMCSF  et  de  l’IFNγ    dans  le  monocyte.    Valeurs  exprimées  en  nombre  de  sites  par  cellules  (ordonnées)  en  fonction  du  temps  (abscisse).  Contrôle  (n=  13)  /  LPS  (100ng/ml)  n=  8  /    fMLP  (10-­‐8  M),  n=8  /  GMCSF  (100UI/µl)  n=5  /  IFNγ    (50UI/ml  )  n=  5  CHX  (100µg/ml  n=3  *  :  p<  0,005  (valeurs  comparées  aux  valeurs  contrôles  des  temps  correspondants)  

S100A8/S100A9

S100A8

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H0 H1 H3 H6

Contrôle   LPS  

fMLP   GMCSF  

IFNγ  

S100A8,  S100A9,  S100A8/S100A9  dans  le  PMN  

Figure  6  :  cinétique    intracellulaire  de  S100A8,  S100A9  et  S100A8/S100A9  à  H0,  H1,  H3  et  H6  en  situation  contrôle  et  après  stimulation  par  du  LPS,  du  fMLP,  du  GMCSF  et  de  l’IFNγ  dans  le  PMN.    Valeurs  exprimées  en  nombre  de  sites  par  cellules  (ordonnées)  en  fonction  du  temps  (abscisse).  Contrôle  (n=  13)  /  LPS  (100ng/ml)  n=  8  /    fMLP  (10-­‐8M),  n=8  /  GMCSF  (100UI/µl)  n=5  /IFNγ  (50UI/ml)  n=  5  *  :  p<  0,05  (valeurs  comparées  aux  valeurs  contrôles  des  temps  correspondants)  

S100A8/S100A9

S100A8

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H1 H3 H60

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H1 H3 H6

PMN   Monocyte  

S100A8  

S100A9  

S100A8/S100A9

Figure   7  :   cinétique   intracellulaire   de   S100A8,   S100A9   et   S100A8/S100A9,   après  stimulation  par  de  la  CHX  (100µg/ml)  dans  le  PMN  et  le  monocyte  à  H0,  H1,  H3  et  H6.  Valeurs  exprimées  en  nombre  de  sites  par  cellules  (ordonnées)  en  fonction  du  temps  (abscisse).  n=  3.  *  :  p<  0,05  (valeurs  comparées  aux  valeurs  contrôles  des  temps  correspondants)  

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4.  Relation  entre  l’expression  intracellulaire  de  calgranulines  et  le  niveau  de  protéine  extracellulaire       a.  Variation  de    la  protéine  S100A8  dans  le  surnageant  de  sang  total  stimulé  par  du  LPS  et  du  fMLP    (figure  8):  Après  stimulation  par  du  LPS,  on  note  une  augmentation  significative  et  croissante  dans  le  temps  des  concentrations  de  S100A8  extracellulaire  à  H1,  H3  et  H6  par  rapport  aux  valeurs  des  temps  contrôles  correspondants.  Une  stimulation  par   le   fMLP    entraîne  également  une  augmentation  des   taux  de  S100A8  à  H1,   H3   et   à   H6   dans   le   surnageant   par   rapport   aux   valeurs   des   temps   contrôles  correspondants.   Cette   augmentation   est   stable   dans   le   temps,   contrairement   à   une  stimulation  par  du  LPS.  Par   ailleurs,   les   taux   de   S100A8   dans   le   surnageant   après   une   stimulation   par   le   LPS   sont  significativement  plus  augmentées  qu’après  une  stimulation  par  le  fMLP.                        

        b.  Variation  de  la  protéine  S100A8  dans  le  surnageant  de  sang  total  stimulé  par  un  agoniste  apoptotique  et  après  nécrose  cellulaire.  

Ces  résultats  sont  en  cours.  

0

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H0 H1 H3 H6

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H0 H1 H3 H6

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H0 H1 H3 H6

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H1 H3 H6H0

° °

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H1 H3 H6H0

° °

LPS  

Contrôle,  LPS,  fMLP  

fMLP  

Figure  8  :  cinétique  H0,  H1,  H3,  H6  de  S100A8  extracellulaire  (dosage  ELISA),  en  situation  contrôle  et  après  stimulation  par  du  LPS  (100ng/ml)  et  du  fMLP    (10-­‐8M).    Valeurs  exprimées  en  pg/ml.  (ordonnées)  en  fonction  du  temps  (abscisse).n=9  *:p<  0,005  (données  comparées  aux  valeurs  contrôles  des  temps  correspondants)  °  :  p<  0,005  (données  après  stimulation  LPS  comparées  aux  données  après  stimulation  par  fMLP  des  temps  correspondants)  

LPS

fMLP

contrôle

LPS

fMLP

LPS

fMLP

contrôle

LPS

fMLP

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 DISCUSSION  

   Le   choc   septique   reste   de   nos   jours   la   principale   cause   de  mortalité   dans   les   services   de  réanimation  [1].  Très  récemment,  les  protéines  S100A8,  S100A9  et  leur  complexe,  pourtant  connus   de   longue   date,   ont   émergé   comme   pouvant   jouer   un   rôle   majeur   dans   la  physiopathologie  de  cette  maladie.  Ces  protéines,  augmentées  dans  le  plasma  des  patients  en   choc   septique   qui   vont   mourir   [3]   ont   été   décrites   comme   spécifiques   du   système  immunitaire   inné   et   dotées   de   fonctions   pro-­‐inflammatoires,   notamment   lorsqu’elles   sont  libérées  dans  le  compartiment  extracellulaire.  Nous   avons   donc   choisi   de   les   étudier   dans   les   cellules   immunitaires   sanguines,   PMNs,  monocytes   et   lymphocytes   dans   un   modèle   in   vitro   se   rapprochant     d’une   agression  septique.  La  cytométrie  en  flux,  qui  permet  de  caractériser  les  différents  types  cellulaires  en    évitant  une  stimulation  secondaire  aux  méthodes  de  séparation,  nous  a  permis  de  travailler  en  sang  total.  Nous  avons  ainsi  pu  maintenir  le  plus  longtemps  possible  une  interaction  entre  les   différents   éléments   sanguins   après   stimulation,   et   réduire   au  minimum  une   activation  arctéfactée  par  la  préparation  cellulaire.  Grâce   aux   marqueurs   d’activation   membranaires   choisis,   nous   avons   d’abord   pu   vérifier  l’induction  de   l’activation  des  monocytes  et  des  PMNs  après   incubation  avec   les  différents  agonistes   choisis.   Ainsi,   dans   nos   conditions   expérimentales,   nous   retrouvons   une  augmentation  significative  de  l’expression  membranaire  du  HLA-­‐DR  monocytaire  par  rapport  aux   valeurs   contrôles   après   traitement   par   du   LPS,   du  GMCSF   et   de   l’IFNγ.   Nous   pouvons  noter  que  la  stimulation  par  du  fMLP  n’entraîne  pas  de  variation  de  son  expression  sur  cette  cinétique.  Pourtant,  la  littérature  rapporte  une  activation  monocytaire  après  stimulation  par  le   fMLP,  avec  augmentation  du  burst  oxydatif  et  de   l’expression  de  CD11b     [25].   Il   se  peut  que   la   cinétique   utilisée   soit   trop   rapide,   les   doses   insuffisantes   ou   que   l’activation  monocytaire  par  ce  peptide  ne  passe  pas  par  une  augmentation  de  l’  HLA-­‐DR,  comme  cela  a  été  décrit  après  activation  monocytaire    par  le  PFA-­‐4.[26]    Concernant   le   PMN,   il   y   a   une   activation  précoce   et   durable   avec   exposition  de  CD11b  et  CD18  à   la   surface   cellulaire  dès  H1  et   ce,   jusqu’à  H6  avec   le   LPS,   le  GMCSF  et   le   fMLP.   La  stimulation  par  l’IFNγ  est  moins  intense  et  plus  tardive.    Ces  résultats  nous  permettent  donc  de  vérifier  l’activation  des  cellules  myélo-­‐monocytaires  avec  les  agonistes  choisis,  selon  la  cinétique  choisie  et  dans  les  conditions  d’étude  choisies.    Une  fois  notre  modèle  validé,  nous  avons  pu  vérifier  que  les    2  protéines  et   leur  complexe  étaient  bien  présents  à  la  fois  dans  le  monocyte  et  le  PMN,  mais  absents  des  lymphocytes.  Ceci  est  conforme  aux  données  de   la   littérature  sur   le  sujet   [9].  Nous  avons  également  pu  montrer,  et  ce,  pour  la  première  fois  à  notre  connaissance  que  la  répartition  des  protéines  S100A8,  S100A9  et  de  leur  complexe  était  différente  selon  le  type  cellulaire.  En  effet,  dans  le  PMN,  la  quantité  de  S100A9  intracellulaire  est  supérieure  à  celle  du  complexe,  alors  que  le  complexe   est   plus   abondant   que   la   protéine   S100  A9   dans   le  monocyte.   Cette   répartition  spécifique  du  type  cellulaire  est  maintenue  après  l’activation  cellulaire.  Outre  le  fait  que  cela  semble   présager   d’une   régulation   différente   selon   le   type   cellulaire,   et   pour   un   type  cellulaire  selon  la  protéine,  conférant  à  chacune  de  ces  protéines  un  rôle  propre,    cela  nous  permet   de   conclure   à   une   certaine   spécificité   de   l’anticorps   marquant   le   complexe,   utile  pour   l’interprétation   des   résultats.   Pour   valider   la   spécificité   de   l’anticorps   marquant   le  

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complexe   nous   avons   également   pu   vérifier   que   la   quantité   de   S100A8/S100A9   retrouvée  dans   le  cytoplasme  des  PMNs  et    des  monocytes  n’était   jamais   la  somme  des  quantités  de  monomères.    Concernant   les   modifications   de   l’expression   des   calgranulines   après   activation   cellulaire,  notre  travail  nous  permet  de  montrer  qu’il  y  a  une    régulation  différente  des  mouvements  intracellulaires  des  2  protéines  et  du  complexe  en  fonction  du  type  cellulaire  et  de  l’agoniste  utilisé.  En  effet,  outre   le   fait  que   les    PMNs  paraissent  dans   l’ensemble  plus   réactifs,  nous  pouvons  noter  d’autres  divergences  intéressantes.  D’une  part,  quelque  soit  l’agoniste  utilisé,  il  n’y  a  pas  de  mouvement  de  la  protéine  S100A9  dans  le  monocyte,  contrairement  au  PMN,  pour   lequel   cette  protéine  est  augmentée  après  une  stimulation  par   le   LPS  et   le   fMLP.  De  même   pour   la   protéine   S100A8  :   seulement   augmentée   après   une   stimulation   par   le   LPS  dans  le  monocyte,  mais  élevée  dans  le  PMN  après  une  stimulation  par  le  LPS,  le  fMLP  et  le  GMCSF.   Les   variations   intracellulaires   du   complexe   suivent   à   peu   prêt   la  même   cinétique  pour  le  PMN  et  le  monocyte,  sauf  après  stimulation  par  le  fMLP  qui  entraîne  une  diminution  du  complexe  dans  le  monocyte  à  H6.    Nous   pouvons   également   remarquer   des   cinétiques   différentes   selon   l’agoniste   utilisé.  L’augmentation   est   généralement   plus   précoce,   plus   rapide   et   plus   intense   avec   le   LPS,  activateur   d’une   voie   de   signalisation   majeure   dans   les   phénomènes   immuno-­‐inflammatoires   observés   au   cours   du   choc   septique,   celle   médiée   par   l’activation   du    récepteur  Toll-­‐4  et  aboutissant  à   l’activation  du   facteur  de   transcription  nucléaire  NFκB.   Il  est  également   intéressant  de  noter  qu’après  une  stimulation  par   l’IFNγ,  cytokine    ayant  un  rôle   dans   la   modulation   des   réactions   immunitaires,   notamment   en   favorisant   la  coopération   cellulaire   via   une   stimulation   de   la   présentation   antigénique   et   pouvant   être  utilisée   en   thérapeutique   pour   améliorer   l’immunoparalysie   septique   [19]   il   n’y   a     aucune  modification  de  l’expression  intracellulaire  des  calgranulines,  quelques  soit  le  type  cellulaire.    Pour  tenter  d’expliquer  l’augmentation  intracellulaire  des  protéines,  les  temps  d’incubation  étant   trop   courts   pour   objectiver   une   synthèse   de   novo,   plusieurs   hypothèses   sont  envisageables.   Il   se   peut   qu’il   y   ait   une   mobilisation   à   partir   de   stocks   ou   organelles  intracellulaires.   Pourtant,   les   données   actuelles   de   la   littérature   sur   ce   sujet   sont  contradictoires.  Ainsi,  il  n’y  aurait  pas  d’organelle  intracellulaire  stockant  ces  protéines  dans  le  monocyte  [27].  Pour  le  PMN  certains  auteurs  retrouvent  des  calgranulines  dans  certaines  granules    [28],  d’autre  non  [27].  De  même,  une  mobilisation  à  partir  du  cytosquelette  serait  également  possible,  rendant  alors  les  protéines  accessibles  aux  anticorps  utilisés  dans  notre  travail   et   donc   détectables.   Pourtant,   les   données   de   la   littérature   rapportent   plutôt   une  mobilisation  des  protéines  et  du  complexe  vers  le  cytosquelette  et  la  membrane  au  décours  des   processus   d’activation   cellulaire.   Dans   nos   conditions   expérimentales,   et   après  stimulation  par  du   LPS,   il   n’a  pas  été   retrouvé  de   complexe,  ni  de  monomère  à   la   surface  membranaire   (données   non   montrées).   L’augmentation   du   complexe   pourrait   également  être   secondaire   à   une   dimérisation   à   partir   des  monomères   suite   à   l’activation   cellulaire.  Cependant,   dans   aucune   de   nos   expériences   nous   ne   retrouvons   de   diminution   des  monomères.   Une   étude   en   microscopie   confocale   permettrait   sûrement   de   mieux  comprendre  les  mouvements  intracellulaires  de  ces  protéines  après  stimulation.  Enfin,   il  se  pourrait   que   ces   protéines   soit   stockées   sous   forme   d’ARN   messager   (ARNm)   et   que  l’activation  cellulaire  entraîne  sa  traduction  en  protéines.  Cette  hypothèse  serait  en  accord  avec  le  fait  que  Rammes  retrouve  dans  son  étude  de  1997  une  diminution  de  l’ARNm  de  la  

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protéine   S100A8  après   stimulation  par   du   LPS   [12].   Il   n’y   a   pas  de  données   concernant   le  PMN.  L’étude  de   l’expression  des  calgranulines   intracellulaires  au  cours  de   la  cinétique  apoptose  nous   montre   des   mouvements   protéiques   originaux   puisque   l’on   retrouve   une   variation  d’expression   semblable   dans   les   2   types   cellulaires.   En   effet,   on   observe   d’une   part   une  tendance  à   la  baisse  des  monomères  qui  n’avait   jamais  été  observée  après  stimulation  par  les  autres  agonistes,  d’autre  part  une  tendance  à   l’augmentation  du  complexe  au  cours  du  temps.   Ces   mouvements   protéiques   pourraient   être   dus   à   une   hétérodimérisation   des  monomères.   De   nouveau,   une   étude   en   microscopie   confocale   permettrait     de   mieux  comprendre  les  variations  observées.    Nous  avons  enfin  voulu  nous   intéresser  à   la   relation  entre   l’expression   intracellulaire  et   le  niveau  d’expression  des  protéines  extracellulaires.  En  extracellulaire,   les  concentrations  de  base  de   la  protéine  S100A8  mesurées  sur  du  sang  total  de  patients  sains  ne  sont  pas  détectables  avec  les  méthodes  utilisées.  Pour   expliquer   la   présence   de   la   protéine   S100A8   à   des   concentrations   élevées   dans   le  plasma  de  patients  en  choc  septique  nous  avons  supposé  qu’une  sécrétion  par   les  cellules  myélo-­‐monocytaires   sanguines  activées  était  possible.  Ces  protéines,  décrites   comme  pro-­‐inflammatoires  et  très  spécifiques  des  PMNs  et  des  monocytes  représentent  en  effet  prêt  de  40%  des  protéines  cytosoliques  du  PMN,  et  1%  de  celles  du  monocyte.  Dans  nos  conditions  expérimentales  nous  retrouvons  bien  une  augmentation  significative  de  cette  protéine  dans  le  surnageant  après  activation  des  monocytes  et  des  PMNs  par   les  agonistes  choisis.  Cette  augmentation   est   plus   importante   après   incubation   avec   du   LPS   que   du   fMLP,   et   va   en  croissant   avec   le   LPS.   Pourtant     les   quantités   retrouvées   restent   inférieures   à   celles  mesurées  par  Payen  [3]  au  cours  du  choc  septique  .  Dans  notre  travail,  un  taux  maximal  de  1,2  pg/ml  de  S100A8  dans  le  surnageant  est  mesuré  à  H6  après  une  stimulation  par  du  LPS  alors  que  Payen  retrouve  dans  le  plasma  de  patients  en  choc  septique  des  valeurs  de  S100A8  de   l’ordre   de  10   à   20   µg/ml,   les   mêmes   méthodes   de   dosage   ayant   été   utilisées   [3].   De  même,  de  nombreux   travaux   s’intéressant   aux   calgranulines  dans   les  états   inflammatoires  chroniques,   mais   mesurant   cette   fois   la   concentration   du   complexe   et   non   de   S100A8  circulante,   retrouvent  des  valeurs   inférieures  à  1mg/ml  chez   le   sujet   sain,  et  pouvant  aller  jusqu’à  une  vingtaine  de  mg/ml  en  cas  de  pathologie  inflammatoire  [29].  Enfin,    notons  que  les   concentrations   retrouvées   dans   notre   travail   ne   sont   pas   secondaires   à   une   nécrose  cellulaire,   la   viabilité   cellulaire   ayant   été   contrôlée   sur   lame   à   chaque   temps   et   avec   les  divers  agonistes.    Nous  ne  pouvons  pas  exclure  que   la   cinétique  utilisée  dans  notre  modèle   soit   trop  courte  pour   permettre   d’atteindre   les   concentrations   de   S100A8   mesurées   in   vivo.   Cela   semble  pourtant  peu  probable  puisque  les  différences  observées  sont  très  importantes.  On  pourrait  également  envisager  la  possibilité  d’une  synthèse  de  novo  de  ces  protéines,  couplées  à  une  sécrétion,   non   objectivable   dans   notre   modèle   du   fait   d’une   cinétique   trop   courte.   Mais  certains   auteurs   rapportent   au   contraire   une   diminution   de   l’ARNm   avec   l’activation  cellulaire   [12].  Une  étude  de   l’expression  des  gênes  des   calgranulines  après  activation  des  cellules  immunitaires  apporterait  probablement  un  éclaircissement  sur  la  question.  L’augmentation  plasmatique  pourrait  également  faire  suite  à  une  mort  cellulaire  (apoptose  ou  nécrose  des   cellules   immunitaires)   comme   le   rapportent   certains  auteurs[14].  D’autant  que  le  choc  septique  est  associé  à  une  surmortalité  cellulaire,  aboutissant  à  un  relargage  de  toutes   les   protéines   intracellulaires.[30].  Notre   travail   ne   nous   permet   pas   d’écarter   cette  

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hypothèse.  Cependant,  des  dosages  de  la  protéine  S100A8  extracellulaire  après  nécrose  des  PMNs  et  des  monocytes  et  après   stimulation  par  un  agoniste  apoptotique,   selon   la  même  cinétique   sont   en   cours.   Il   serait   enfin   envisageable   que   d’autres   types   cellulaires   soient  impliqués  dans  l’augmentation  de  S100A8  plasmatique,  soit  suite  à  une  mort  cellulaire,  soit  suite   à   une   sécrétion.   Les  protéines   S100A8  et   S100A9  ont   été   jusqu’à  présent   identifiées  dans   des   populations   cellulaires   restreintes  :   PMNs   et   monocytes   majoritairement   [29].  Pourtant  des  publications   récentes  ont  mis  en  évidence   la  présence  de  ces  protéines  dans  d’autres  cellules  comme  les  cardiomyocytes  [16]  Il  serait  donc  très  intéressant  de  rechercher  d’autres  types  cellulaires  exprimant  ces  protéines,  notamment  les  cellules  endothéliales  qui  sont  également  des  cellules  clés  de  la  pathologie  septique.  La   stimulation   choisie   pourrait   également   être   trop   faible   par   rapport   à   l’orage   que  représente   le  choc  septique.  Un  autre  travail  utilisant  du  plasma  septique  comme  agoniste  serait   sûrement   intéressant   à   réaliser.   Enfin   les   méthodes   de   dosage   en   ELISA   utilisées  peuvent   ne   pas   être   adéquates,   bien   que   ce   soit   ces   mêmes   techniques   qui   aient   été    utilisées  dans  le  travail  de  Payen.  Le  parallèle    entre  les  mouvements  intracellulaires  et  extracellulaires  est  difficile  à  faire.  En  effet,   les   techniques  utilisées  pour   le  dosage  extracellulaire  ne  permettent  à  priori  que  de  doser  la  protéine  S100A8.  Nous  n’avons  aucune  donnée  concernant  la  protéine  S100A9  dans  le  surnageant,  de  même  pour  le  complexe.  De  plus  les  données  intra  et  extracellulaires  sont  exprimées  dans  des  unités  différentes  et  de  ce  fait,  non  comparables.      Les  principales  limites  de  notre  travail  résident  dans  le  modèle  utilisé.  Nous  avons  choisi  une  cinétique  rapide  puisque  les  concentrations  de  S100A8  sont  élevées  très  précocement  dans  le   choc   septique   [3],   conscients   que   cette   cinétique   est   trop   rapide   pour   objectiver   une  néosynthèse   et   peut-­‐être   pour   une   activation   cellulaire   optimale.   De   plus,   les   données  obtenues  après  une  stimulation  de  24h  montraient  une  mortalité  cellulaire  importante  dans  les   conditions   expérimentales   choisies   (données   non   montrées).   Cette   cinétique   nous   a  néanmoins   permis   d’observer   une   activation   cellulaire   ainsi   qu’une   variation   des  concentrations  de  calgranulines  intra  et  extra  cellulaires.  Nous  sommes  conscients  que  l’étude  sur  sang  de  volontaires  sains  après  stimulation  est  un  modèle     in   vitro   imparfait   de   choc   septique,   que   ce   soit   en   terme  de  quantité   et   de   type  cellulaire   (nombreuses   cellules   immatures   circulantes   dans   les   premiers   jours   du   choc  septique),  d’activité  métabolique,  et  d’interactions  cellulaires,  notamment  avec   les  cellules  endothéliales.  De  plus,   la  stimulation  des  cellules  myélo-­‐monocytaires  par  un  agoniste  seul  ne   reflète  que   très   imparfaitement   l’orage   inflammatoire  et  cytokinique  que   représente   le  choc   septique.   Ce   modèle   reste   toutefois   intéressant   puisqu’il   nous   permet   d’étudier   les  cellules  immunitaires  avant  et  après  activation  par  des  agonistes  présents  au  cours  du  choc  septique  et  n’activant  pas  les  mêmes  voies  de  signalisation.  Au   terme   de   ce   premier   travail,   et   comme   mentionné   ci-­‐dessus,   un   certains   nombre  d’études   complémentaires   apporteraient   des   précisions   très   utiles.   Ainsi,   une   étude   en  microscopie  confocale  permettrait  de  localiser  exactement  les  monomères  et  leur  complexe  en   intracellulaire   et   donc   de   mieux   comprendre   les   mouvements   observés   au   cours   de  l’activation   cellulaire.   Une   étude   de   l’expression   des   gênes   des   calgranulines   permettrait  également   de   mieux   expliquer   les   variations   intracellulaires   retrouvées.   De   plus,   pour  parfaire  notre  modèle,  une  stimulation  par  du  plasma  septique,  de  même  qu’une  étude  de  l’expression  des  calgranulines  par  les  cellules  septiques  serait  également  intéressante.  Enfin,  la   recherche   des   calgranulines   dans   d’autres   types   cellulaires,   notamment   les   cellules  

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endothéliales   permettrait   peut-­‐être   d’expliquer   la   présence   de   ces   protéines   à   des  concentrations   si   élevées   dans   le   plasma   des   patients   en   choc   septique   qui   vont   mourir.  Rappelons  que  des  dosages  extracellulaires  de  S1008  au  cours  de  cinétiques  de  nécrose  et  d’apoptose  des  cellules  immunitaires  sont  en  cours.                                                      

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CONCLUSION      

Le   choc   septique   reste   une   des   principales   cause   de   mortalité     dans   les   services   de  réanimation,  mettant   en   jeu   des   interactions   complexes   entre   comorbidités   des   patients,  facteurs   génétiques,   désordres   inflammatoires,   délai   de   mise   en   route   du   traitement   et  stratégie  thérapeutique  utilisée.  De  nouveaux  paradigmes  ont  vu  le  jour  durant  les  dernières  décennies,  mettant  notamment  en  exergue  le  système  immunitaire   inné  et   le  relargage  de  «  Damage  Associated  Molecular  Patterns  »    ou  DAMPS  prolongeant   l’inflammation  après   la  résolution  du  sepsis.  Pourtant  ces  nouvelles  théories  n’ont  pas  encore  abouti  à  de  progrès  majeurs  en  terme  de  pronostic  et  de  traitement  du  choc  septique.  La  persistance  de  taux  de  mortalité  élevés  chez  les  patients  en  choc  septique  malgré  une  thérapeutique  standardisée  et   des   avancées   médicales   stimule   la   recherche   vers   2   axes  :   trouver   de   nouveaux  paradigmes   pour   expliquer   les   «  mécanismes  »   septiques,   parmi   lesquels   le   concept   de  DAMPS  a  ouvert  de  nouvelles  voies  pour  expliquer  l’inflammation,  et  découvrir  de  nouveaux  marqueurs   permettant   de   mieux   prédire   le   pronostic   des   patients.   La   découverte   des  DAMPS  comme  pouvant  être  de  potentiels  marqueurs  pronostics  pourraient  être  une  aide  précieuse   au   développement   de   nouvelles   thérapies.   Parmi   les   candidats   potentiels,   les  calgranulines  pourraient  être  ces  candidats  :  considérées  comme  des  DAMPS,  jouant  un  rôle  dans  la  signalisation  cellulaire,  et  présentes  à  des  taux  différents  selon  la  survie  ou  non  des  patients  en  choc  septique.  Comprendre  quel  est  leur  rôle  exact  dans  la  pathologie  septique,  et  quel  mécanisme  aboutit  à  leur  présence  à  des  concentrations  si  élevées  chez  les  patients  qui  vont  mourir  constitue  donc  un  défi.    Notre   travail   nous   a   permis   de   montrer   une   répartition   différente   de   ces   protéines   en  fonction  du  type  cellulaire.  Nous  avons  également  pu  constater  une  réponse  différente  en  terme   de   mouvements   intracellulaires   de   ces   protéines   en   fonction,   d’une   part   du   type  cellulaire   et   d’autre   part   des   voies   de   signalisations   activées.   Enfin,   notre   travail,   dans   les  limites  du  modèle  choisi,  ne  nous  permet  pas  d’attribuer  l’augmentation  de  S100A8  dans  le  plasma  des  patients  en  choc  septique  à  une  sécrétion  par  les  cellules  immunitaires  activées,  mais   des   dosages   de   cette   protéine   après   nécrose   ou   apoptose   des   cellules   immunitaires  sont  en  cours.  

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RESUME      Avec  une  mortalité  allant  de  40  à  70%,  le  choc  septique  reste  à  ce  jour  la  principale  cause  de  décès   dans   les   unités   de   réanimation,   et   donc   un   défi   permanent.   Récemment,   deux  protéines   S100A8,   S100A9   et   leur   complexe   S100A8/S100A9,   également   connues   sous   le  nom   de   calgranulines,   ont   émergé   comme   pouvant   jouer   un   rôle   crucial   dans   cette  pathologie  :   il   a   été   montré   que   ces   deux   protéines,   initialement   décrites   dans   les  pathologies  inflammatoires  chroniques  et  dont  l’expression  serait  restreinte  aux  cellules  du  système  immunitaire  inné  (PMNs  et  monocytes)  étaient  significativement  plus  élevées  dans  le   plasma     de   patients   en   choc   septique   qui   allaient   mourir.   Au   contraire   les   survivants  voyaient  leur  concentration  plasmatique  décroître.    Pour   tenter   de  mieux   comprendre   la   place   des   calgranulines   dans   le   choc   septique,   nous  avons   choisi   d’étudier   ces   protéines   dans   les   cellules   immunitaires,   cellules   dont   elles  semblent    spécifiques,  et  ce,  dans  un  modèle  in  vitro  se  rapprochant  de  l’agression  immuno-­‐inflammatoire   qu’est   le   choc   septique.   Nous   avons   ainsi   voulu   savoir   quelle   était   la  répartition  de  ces  protéines  dans   les   cellules   immunitaires,  quelles  étaient   leurs  variations  intracellulaires     selon   le   type   cellulaire   et   l’agoniste   utilisé   et   enfin   quelle   était   la   relation  entre  cette  expression  intracellulaire  et  le  niveau  d’expression  de  protéine  extracellulaire.    Nous  avons  ainsi  stimulé  in  vitro  pendant  1H,  3H  et  6H  du  sang  total  de  volontaires  sains  par  divers  agonistes  retrouvés  dans  l’orage  inflammatoire  du  choc  septique  (LPS,  fMLP,  GMCSF  et   IFNγ),   induit  une  mort  cellulaire,  soit  par  apoptose  grâce  à  un  agoniste  apoptotique  soit  par  nécrose.  Nous  avons  ensuite  analysé  les  mouvements  intracellulaires  des  2  monomères  et  du  complexe    par  cytométrie  de  flux,  et  les  concentrations  extracellulaires  de  la  protéine  S100A8  par  ELISA.    Nous  montrons  ainsi  que  la  répartition  intracellulaire  des  calgranulines  est  différente  selon  le  type  cellulaire  :  le  complexe  est  la  forme  majoritaire  dans  le  cytoplasme  du  monocyte,  la  protéine   S100A9   celle   du   cytoplasme   du   PMN.   Cette   répartition   reste   la   même   après  activation  cellulaire.  Nous  avons  pu  vérifier   l’absence  de  ces  protéines  dans   le   lymphocyte.  En   intracellulaire,   après   induction   d’une   activation   cellulaire,   nous   retrouvons   une  augmentation  du  complexe  et  des  monomères,  dans  le  monocyte  et  dans  le  PMN,  variable  selon  le  type  cellulaire  et  l’agoniste.  Ceci  semble  témoigner  d’une  régulation  différente  selon  la   protéine   et   le   type   cellulaire,   et   donc   de   fonctions   propres   à   chaque  monomère   et   au  complexe.   La   cinétique   choisie   dans   notre   modèle   étant   trop   rapide   pour   objectiver   une  synthèse  de  novo,   l’augmentation  retrouvée  pourrait  être   le   fait  d’une  mobilisation  de  ces  protéines   à   partir   d’organelles   intracellulaires.   En   extracellulaire,   nous   retrouvons   une  augmentation  de  la  protéine  S100A8  circulante  après  une  stimulation  par  du  fMLP  et  du  LPS,  mais  à  des  valeurs  nettement  moindres  que  celles  mesurées  dans  le  plasma  de  patients  en  choc  septique.  Dans  les  limites  de  notre  modèle,  l’activation  des  PMNs  et  des  monocytes  au  cours  du  choc  septique  ne  semble  donc  pas  pouvoir  expliquer  les  concentrations  retrouvées  chez   ces   patients.   Des   dosages   extracellulaires   sont   en   cours   pour   pouvoir   attribuer   cette  augmentation  à  une  mort  cellulaire  des  PMNs  et  des  monocytes  (nécrose  ou  apoptose).  Par  la   suite,   il   serait   très   intéressant   de   chercher   d’autres   types   cellulaires   exprimant   ces  protéines,   notamment   les   cellules   endothéliales,   autres   cellules   clés   de   la   pathologie  septique,  et  de  tester  si  elles  ont  éventuellement  un  part  dans  l’augmentation  plasmatique  des  calgranulines  au  cours  du  choc  septique.  

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