Microbiologia1. Mtodos baseados na contagem do nmero de
clulasCada clula comporta-se como uma partcula slida,
individualizada ou em grupo, suspensa no seu meio de cultura pelo
que se deve falar em suspenso de clulas e nunca em soluo de clulas.
Clula vivel: clula com capacidade para se reproduzir. Clula no
vivel: clula que perdeu a potencialidade de se reproduzir.Ex:
Biocatalisador.O conjunto de mtodos a que se pode recorrer para
quantificar uma populao microbiana no : Universal; Estritamente
rigoroso.No entanto, todos eles so mtodos aproximados. Estes mtodos
fornecem uma ordem de grandeza do nmero de clulas por unidade de
volume de cultura.O conjunto dos mtodos de avaliao mais
frequentemente utilizados baseia-se na quantificao do nmero de
clulas. Destes, a contagem dos microorganismos pode ser: Direta
contagem de clulas totais fornecem uma resposta imediata: Cmaras de
contagem; Mtodo de Breed; Contador de Coulter. Indireta clulas
viveies. fornecem uma resposta desactualizada j que se refere ao
incio do perodo de incubao que estes mtodos obrigatoriamente
incluem: Mtodo das placas; Mtodo das diluies sucessivas.
1.1. Cmaras de contagem
A sua contagem direta feita com o auxlio do microscpio. A
utilizao das cmaras de contagem fundamenta-se no preenchimento de
um espao de capacidade conhecida, com um lquido em que se encontram
suspensas as partculas a contar. Derivam dos hemocitmetros,
inicialmente conhecidos para contagem de clulas do sangue.
Desvantagens: Utilizao deste mtodo para bactrias (devido ao seu
pequeno tamanho); Estreita profundidade de campo do microscpio
quando usado com ampliaes elevadas (1000x); No uma tcnica adequada
para quantificar microorganismos que no sejam constitudos por
clulas discretas, tal como fungos filamentosos; Dvidas na contagem,
no que se refere a aglomerados de clulas, a clulas em planos de
focagem diferentes, a artefactos visuais ou impurezas que, por
engano, sejam tomados como clulas e a clulas gemuladas. Apesar
desta tcnica ser normalmente usada para avaliao de clulas totais,
ela pode tambm servir para distinguir entre clulas vivas e clulas
mortas, sendo para tal necessrio usar certos corantes, como o azul
de metileno, que apenas cora as clulas mortas, j que as clulas
viveis o degradam na sua cadeia metablica.
1.2. Mtodo de Breed
usado em rotina nas indstrias de lacticnios para fazer a anlise
bacteriolgica de leites crus, isto , leites que vm directamente da
vacaria sem qualquer tratamento trmico. Consiste numa contagem
total feita num esfregao de rea e volume conhecidos, depois de
convenientemente corado. A fixao e a colorao de clulas to pequenas
como as das bactrias facilitam muito a sua contagem, quando
comparado com o mtodo da cmara de contagem. Adopta-se o critrio de
contar como uma s clula cada cadeia ou aglomerado de organismos
clump counting
1.3. Coulter Counter
um aparelho que no s conta clulas como tambm determina o seu
tamanho, resultando a anlise numa distribuio de tamanhos celulares.
Devido ao entupimento do tubo, por exemplo no caso de aglomerados
de clulas, e ao erro devido ao rudo de fundo, no caso de
microorganismos muito pequenos, os tubos com uma abertura d s devem
ser usados para medirem clulas entre 0,02d e 0,50d (no mximo).
1.4. Mtodo das Placas
No mtodo de contagem em placas plating out , um volume conhecido
de uma dada diluio da suspenso inicial de clulas inoculado
assepticamente num meio de cultura slido, adequado ao microrganismo
em causa, em placa de Petri. Cada clula vivel vai dar origem a uma
colnia, macroscopicamente visvel a olho nu, e contanto o nmero de
colnias na placa fica a saber-se o nmero de clulas viveis naquele
volume de suspenso diluda inoculado. O nmero mximo de colnias que
podem aparecer na placa de Petri est compreendido entre 30 e 300.
Este ensaio geralmente feito em triplicado para depois se obter um
valor mdio para o nmero de colnias. Para aumentar a segurana da
anlise, de modo a evitar a necessidade de repetir ensaios, faz-se
no s a inoculao da diluio que se previu ser a adequada, mas tambm a
inoculao da diluio imediatamente anterior quela, naturalmente uma
em cada triplicao. Desvantagens: Desfasamento no tempo com que se
obtm a informao e com o facto de o nmero dessas clulas ser sempre
maior do que o nmero de colnias contadas nas placas devido
sobreposio e aos aglomerados de clulas que do origem a uma nica
colnia. Assim, o erro desta determinao ser sempre um erro por
defeito, isto , a fraco de clulas viveis calculada ser um minorante
da fraco real. Esta tcnica muito mais til para bactrias e leveduras
do que para bolores.
1.5. Mtodo das diluies sucessivas diluio extino
mais correntemente referido como determinao do Nmero Mais
Provvel (NMP) de clulas viveis. possvel tratar estatisticamente os
resultados e para tal podem ser usadas tabelas como as de McCrady.
Este mtodo frequentemente utilizado na anlise bacteriolgica das
guas para a determinao de bactrias coliformes, que constituem o
indicador mais seguro de poluio fecal e que incluem todos os
bastonetes gram negativos aerbios e facultativos anaerbios que no
formam esporos e fermentam lactose com produo de cido e gs. Esta
ltima caracterstica dos coliformes permite detetar visualmente e
depois da incubao, em pequenos tubos invertidos no meio de cultura,
se o ensaio positivo (presena de gs naqueles tubos) ou negativo
(ausncia de gs).
2. Mtodos baseados na medio da massa celular
Um outro conjunto de mtodos de avaliao quantitativa de populaes
microbianas baseia-se no clculo do nmero de organismos presentes
pela medida da sua massa celular, uma vez fixadas as condies de
observao e conhecida a funo (curva de calibrao) que relaciona essas
duas variveis (nmero e massa celular).A avaliao da biomassa
microbiana pode ser feita: Diretamente: Peso seco celular, com base
na gravimetria; Densidade tica, com base na turbidimetria. Estimada
por via indirecta: Reduo de indicadores de oxidao-reduo; Consumo de
nutrientes ou formao de produtos; Quantificao de componentes
celulares; Medio do ATP.
2.1. Peso seco celular
As amostras, de volume conhecido, do caldo de cultura so
recolhidas, centrifugadas, lavadas com tampo ou com gua e depois
secas a 80C durante 24 horas ou a 110C durante 8 horas. Se
estiverem presentes slidos no celulares como carbonato de clcio,
melaos, celulose, corn steep liquor ou soy bean meal, eles no so
removidos na lavagem e, como consequncia, contribuem para o peso
seco final. Quando o carbonato de clcio o nico material insolvel,
possvel usar uma lavagem cida para dissolver o sal e remov-lo das
clulas antes da secagem. Quando o meio de cultura contm alguns
slidos no celulares, desde que a massa das clulas seja muito maior
do que a passa das impurezas, o mtodo do peso seco celular ainda
til, embora no seja preciso. difcil fazer pesagens com preciso
inferior a 1mg.
2.2. Turbidimetria
Quando um feixe de luz atravessa uma matria no homognea, como
uma suspenso de partculas significativamente maiores do que as
molculas do meio em que se encontram, sofre uma alterao, mais ou
menos intensa, dependente da concentrao, do tamanho e da forma das
partculas, da opacidade, cor e ndice de refrao relativo das
partculas e do meio e ainda do comprimento de onda da luz
incidente. Se for I0 e I, respectivamente, as intensidades da luz
incidente e da atenuada pela passagem atravs da suspenso, poder-se-
escrever:Densidade tica/ Absorvncia
log10 (I0 / I) = kCConcentrao das partculas em
suspenso.Constante de proporcionalidade que resulta da espessura do
meio atravessado pela luz e de uma constante turbidimdrica.
Em alternativa frequentemente utilizada a varivel transmitncia
(T) relacionada com absorvncia (A) por:
A = - log10 (T(%) / 100)
A sensibilidade e preciso dos mtodos turbidimtricos variam
largamente com os tipos de aparelho e as condies de operao. A
turbidez de uma suspenso de clulas normalmente medida cm luz de
comprimento de onda entre os 600 e 700 nm quando se usa um
espectrofotmetro ou com luz atravs de um filtro vermelho quando se
usa um calormetro. Quando se usa a turbidimetria como medida da
massa celular, importante estar certo que os produtos da fermentao
ou os componentes do meio no absorvem luz no comprimento de onda
usado. Esta tcnica no adequada se existirem no meio de cultura
quantidades substanciais de slidos no celulares. Quando usada para
estimar a biomassa de organismos micelares, por vezes necessrio
homogeneizar previamente a amostra num misturador.
2.3. Reduo de indicadores de oxidao-reduo
Usado correntemente em provas colorimtricas de qualificao dos
leites. Parte-se da hiptese de que todas as clulas viveis presentes
reduzem igualmente os corantes e tm o mesmo tempo de duplicao. A
quantificao pode ser feita em funo do grau de reduo do corante em
determinado tempo, como acontece na prova de resauzurina, ou pelo
tempo necessrio reduo, como na prova do azul de metileno (azul na
forma oxidada e incolor na forma reduzida).
2.4. Consumo de nutrientes ou formao de produtos
A interpretao de mtodos indirectos para a medio da massa celular
facilitada tendo em conta a estequiometria global do crescimento e
da formao de produtos metablicos, que pode ser escrita de uma forma
geral por: Fonte de C + Fonte de N + Fosfato + O2 Massa celular +
CO2 + H2O + Produto + Calor
2.5. Quantificao de componentes celulares
Quantificao de um componente celular macromolecular como
protena, RNA ou DNA. Desvantagens: A proporo destes materiais na
clula no constante no tempo, variando com a fase de crescimento,
pelo que, no mnimo, preciso cuidado na interpretao dos resultados.
Na verdade, s durante a fase exponencial de crescimento que a
composio se mantm constante. Outro inconveniente em usar mtodos de
doseamento de protena (como o mtodo de Folin ou o da reaco birueto)
para acompanhar o crescimento celular, est no facto de os meios de
cultura serem muitas vezes ricos em protenas e seus hidrolisados, o
que atenua a variao relativa de protena derivada do crescimento,
tornando difcil a sua deteco por aqueles mtodos.
2.6. Medio do ATP
A adenosina trifosfato (ATP) um intermedirio comum de energia
qumica usado para crescimento e biossntese nos organismos vivos. A
anlise do ATP pode ser para qualitativamente detetar clulas vivas e
quantitativamente medir a quantidade de massa celular presente.~ O
mtodo detetado para detetar ATP baseado na reaco catalisada pela
luciferase, na qual a luciferina oxidada custa do oxignio e do ATP,
estando envolvido um foto de luz. A luciferase uma enzima que se
extrai do pirilampo e das bactrias fosforescentes junto s plpebras
dos peixes de profundidade. Neste caso a intensidade do brilho
proporcional quantidade de ATP e de microrganismos. Os mtodos de
deteco de luz, como por exemplo os fotmetros ou contadores de
cintilaes, so muito sensveis e podem detetar abaixo de 10-12g de
ATP por litro.
3. Crescimento microbiano
Crescimento: multiplicao do nmero de indivduos.A velocidade com
que os microorganismos se multiplicam (reproduzem) depende de:
Fatores intrnsecos ao prprio organismo, que tem a ver com a
complexidade destes variando numa relao inversa; Fatores externos
ao organismo, como a composio do meio de cultura, ou as condies
ambientais em que o organismo incubado. Por esta razo no tem
significado dizer que a taxa de crescimento de um dado organismo
tem um determinado valor, a no ser que sejam devidamente
explicitadas todas as caractersticas relevantes do meio de cultura,
assim como os parmetros ambientais em que a cultura
realizada.Quando se fala em taxa de crescimento, refere-se,
normalmente, cultura em meio lquido pois a a velocidade de
transporte de nutrientes e de oxignio em direco s paredes celulares
muito maior do que em meio slido. A velocidade de crescimento neste
meio de cultura significativamente superior que ocorre em meio
slido.Incubao: perodo de crescimento celular que comea com a
inoculao do meio de cultura e que termina quando a velocidade de
crescimento se aproxima de zero. Isto acontece quer por: Exausto
dos nutrientes devido ao aumento da densidade populacional (em
culturas descontnuas); Alteraes ambientais induzidas por
metabolitos sintetizados pelos prprios microrganismos e que sejam
inibidores do seu prprio crescimento (produtos txicos, antibiticos,
variaes de pH, etc).O crescimento microbiano um processo dinmico,
cuja velocidade global um balano entre nascimento e morte de clulas
e, quando essa velocidade se aproxima de zero, isso significa que a
taxa de morte tende para a taxa de reproduo.A incubao em meio slido
realizada numa estufa, designada por incubadora.A incubao em meio
lquido pode ser feita simplesmente num balo de Erlenmeyer com rolha
de algodo, colocado numa incubadora orbital com controlo de
temperatura, ou, mas sofisticadamente, num fermentador, que para
alm do controlo da temperatura, permite tambm controlar o pH (com
adio de cido ou base), controlar as espumas (com a adio de um
anti-espumas qumico, por exemplo, silicone) e permite ainda uma
agitao mecnica (mais eficiente do que a agitao orbital) e um
arejamento por borbulhamento (tambm mais eficiente do que a simples
difuso do ar atravs da rolha de algodo).O crescimento microbiano
pode tambm ser definido como o aumento ordenado e proporcional de
todos os componentes qumicos e celulares. Este ocorre depois da
cultura estar completamente adaptada a um meio que lhe adequado e
antes de sofrer fenmenos de exausto dos nutrientes ou alteraes
desfavorveis das condies ambientais. Durante esse perodo, a
duplicao de biomassa acompanhada pela duplicao de todas as outras
propriedades mensurveis da populao (por exemplo: protenas RNA, DNA
e gua intracelular), o que significa que a composio qumica da
cultura permanece constante. Uma cultura nesta fase de crescimento
cineticamente anloga a uma reaco qumica auto-cataltica de primeira
ordem, isto , a velocidade de multiplicao das clulas num dado
instante de tempo proporcional ao nmero ou massa das clulas
presentes nesse instante. , taxa especfica de crescimento ou ou
Quantidade de qualquer componente celular/mLMassa de clulas/mLN de
clulas/mL
Integrando qualquer uma testas equaes, temos:ln X ln X0 = (t t0)
ln (X / X0) = (t t0) X / X0 = exp [ (t t0) X = X0 exp [ (t
t0)]Quando a densidade populacional X duplicar (isto , X = 2X0), o
tempo de cultura correspondente (t t0 = tD) designa-se por tempo de
duplicao e vem dado por:ln 2 = tD tD = ln 2 / O perodo do
crescimento celular, traduzido pelas equaes anteriores que prevem
uma relao exponencial entre a concentrao de biomassa (ou
equivalente) e o tempo, designa-se por fase exponencial do
crescimento. Fase de adaptao: ser curta se o inculo estiver em
crescimento exponencial e se no houver choques trmicos. Fase
exponencial: altura em que o crescimento efectivo parou. A fase
exponencial nunca longa e a transio entre a fase exponencial e a
fase estacionria envolve um perodo de crescimento celular no
equilibrado ( varia desde um valor mximo na fase exponencial at
zero). Fase estacionria: as clulas na fase estacionria tm uma
composio qumica diferente da das clulas na fase exponencial. H
mesmo alguns metabolitos, designados por secundrios que s so
sintetizados na proximidade e durante a fase estacionria (por
exemplo, antibiticos, alcalides, hormonas), em posio aos
metabolitos primrios que so produzidos durante a fase de
crescimento exponencial. Fase de morte: o nmero de clulas viveis
diminui, tambm exponencialmente, no tempo.
Curva de crescimento de uma cultura microbiana
O mtodo a que mais vulgarmente se recorre para acompanhar o
crescimento de microrganismos unicelulares o mtodo ptico, baseado
na determinao da quantidade de luz dispersa por uma suspenso de
clulas. Os aparelhos normalmente utilizados so o: Espectrofotmetro:
mede a intensidade da luz que atravessa a amostra segundo a direco
da radiao incidente; Nefelmetro: mede a luz dispersa segundo um
ngulo de 90 relativamente direco da luz incidente (e em relao
intensidade desta radiao que feita a comparao em ambos os
casos).
4. Catlise enzimtica na ausncia e na presena de inibidoresAs
enzimas so biomolculas que em termos: Estruturais: pertencem ao
grupo das protenas; Funcionais: constituem catalisadores das reaces
biolgicas. Estes biocatalisadores aumentam a velocidade das reaces
bioqumicas devido ao abaixamento da energia de activao, de tal modo
que a variao da energia livre padro da reaco respeitado.
As enzimas possuem caractersticas prprias: Tm uma elevada
especificidade relativamente aos reagentes que transformam,
designados agora substratos. Sofrem saturao com o(s) substrato(s),
quando a concentrao deste(s) elevada; Necessitam, em geral, da
presena de co-factores (substncias de natureza no proteica), de tal
modo que o conjunto do co-factor com o apoenzima (parte proteica do
catalisador) que constitui a haloenzima ou enzima biologicamente
activo. Os co-factores dividem-se em dois grupos principais: Ies
metlicos; Co-enzimas: molculas orgnicas que constituem substratos
particulares, em geral transportadores de determinados radicais, e
que so caracterizveis por se encontrarem transformados aps a aco
sobre elas exercidas por uma enzima. So exemplos de co-enzimas: NAD
(NADH quando reduzido); NADP (NADPH quando reduzido); FAD; CoA
(co-enzima A). Sofrem desactivao mais facilmente que os
catalisadores qumicos, quer por simples armazenamento, quer devido
s condies operatrias. A actividade cataltica das enzimas est
dependente das foras intramoleculares que so fracas e facilmente
anulveis, ocorrendo ento a desnaturao da protena que pode resultar
da ao de diversos agentes como por exemplo: Calor; cidos; lcalis;
Solues salinas concentradas; Solventes orgnicos; Detergentes;
Radiaes.A velocidade enzimtica a actividade cataltica de uma enzima
por unidade de tempo, ou seja, a quantidade (concentrao) de produto
formado na unidade de tempo.A actividade cintica global das enzimas
est relacionada linearmente com a concentrao de enzima [E] e
hiperbolicamente com a concentrao de substrato [S]. Verifica-se
ainda o seguinte: A velocidade de reaco enzimtica diminui no tempo,
devido ao facto dos produtos da reaco inibirem a enzima devido lei
de aco das massas, ou ao facto de a enzima sofrer um processo de
inactivao como consequncia das condies operatrias (temperatura,
ph). Se a concentrao de substrato elevada, a velocidade da reaco
independente dela e a reaco de ordem zero. Se a concentrao de
substrato baixa, a velocidade da reaco proporcional a essa
concentrao e a reaco de primeira ordem. Qualquer que seja a
concentrao de substrato, a velocidade da reaco proporcional
concentrao inicial de enzima [E0].
Michaelis e Menten propuseram um modelo para a cintica de uma
reaco enzimtica com um substrato, um produto e um complexo
intermedirio (ou complexo de transio):K+1K+2
E +S ES E + PK+2
Neste modelo a enzima (E) liga-se ao substrato (S) para formar
um complexo enzima-substrato (ES). Este pode separar-se novamente
en enzima e substrato livre ou transformar o substrato em produto
(P). O primeiro passo uma reaco reversvel que leva formao muito
rpida do composto intermedirio (ES), e o segundo passo uma reaco
reversvel que leva formao muito rpida do composto intermedirio, e o
segundo passo uma reaco essencialmente irreversvel e que limitante
para a velocidade global da reaco.A decomposio do complexo ES em P
e E nem sempre to simples e directa, envolvendo, por vezes,
mltiplos passos em srie cujas constantes so geralmente condensadas
num nico parmetro kcatque, na situao mais simples, justamente a
constante k2, (oturnover number nmero de molculas de substrato que
por unidade de tempo so convertidas em produto no stio activo
quando o enzima est completamente saturado de substrato)Este modelo
tem inmeras aplicaes prticas, como: Descrever a catlise enzimtica
de isomerases; Biotransformaes importaes importantes na indstria de
esterides (ou na indstria farmacutica em geral); Quando o segundo
substrato est em excesso relativamente ao primeiro.
precisamente no instante inicial da reaco que as condies
experimentais so conhecidas com exactido (sem terem ainda sofrido
alteraes), sendo perfeitamente admissvel tomar a concentrao do(s)
produto(s) aproximadamente nula.
As duas hipteses restritivas apresentadas a seguir podem ser
usadas em alternativa. Uma delas considera que o primeiro passo da
reaco traduzida pelo modelo de Michaelis-Menten um qumico, sendo a
constante de equilbrio (Keq) definida por:Keq = Sendo Ks a
constante de dissociao do complexo intermedirio ES e designada por
constante de substrato. Na verdade, a concentrao do composto
intermedirio ES pequena mas no desprezvel.A estratgia global para
obter a expresso da velocidade de uma reaco enzimtica : Estabelecer
o modelo da reaco enzimtica; no caso em estudo seja o modelo de
Michaelis Menten. Exprimir a velocidade da reaco em termos do passo
limitante; neste caso v = k+2 [ES]. Escrever o balano referente
conservao da enzima total, independentemente da forma em que ele
esteja (livre ou ligada); neste caso fica [E0] = [E] + [ES].
Estabelecer as hipteses restritivas; para alm do uso de velocidades
iniciais pode usar-se a hiptese de equilbrio ou a hiptese de estado
estacionrio. Escrever a equao para a velocidade mxima da reaco;
neste caso seria quando a enzima interveniente na reaco estivesse
sob a forma de complexo de transio, isto , vmx = k+2 [E0].A deduo
da equao da velocidade para o modelo de Michaelis-Menten de acordo
com: A hiptese de equilbrio :
Em que :
OndeKs igual ao inverso da constante de equilbrio para o
primeiro passo da reaco; Ks = k-1/k+1 = 1/Keq. Os dois parmetros
cinticos para descrever uma reaco traduzida por aquele modelo, de
acordo com a hiptese de equilbrio, so pois Vmax e Ks. A hiptese de
estado estacionrio :
Esta hiptese foi feita por Briggs e Haldane; no entanto, a
constante KM = (k-1 + k+2)/k+1 conhecida por constante de
Michaelis-Menten. Km e Vmax so agora os parmetros cinticos que
descrevem o mesmo modelo mas de acordo com a hiptese de estado
estacionrio para o complexo intermedirio.A hiptese de equilbrio
(devido a Michaelis e Menten) mais restritiva do que a hiptese de
estado estacionrio (devida a Briggs e Haldane). A hiptese de estado
estacionrio implica que k-1 + k+2 >> k+1, para que a
concentrao do complexo intermedirio ES seja pequena; a hiptese de
equilbrio para alm de k-1 + k+2 >> k+1, tambm k-1 >>
k+2. Quando [S] = Km, quer dizer que metade da enzimaest no estado
livre e outra metade est na forma combinada. Logo v = Vmax. Quando
[S] > Km a maior parte da enzima est na forma combinada com o
substrato. Quando [S] < Km a maior parte da enzima est na forma
livre.Km representa o inverso da afinidade da enzima para com o
substrato, indicando a eficincia com que a enzima converte o
substrato: Valor pequeno de Km significa que, para igual concentrao
do substrato, a enzima catalisa a transformao do substrato a uma
maior velocidade do que quando o valor de Km elevado.
Quando no modelo apresentado, k-1 >> k+2, isto , quando
vlida a hiptese de equilbrio, ento Km coincide com Ks.Km no um
valor constante para uma dada enzima, sendo independente da
concentrao inicial de enzima [E0], varia no entanto com a estrutura
do substrato, com o pH e com a temperatura. Assim, se uma enzima
tiver vrios substratos, a cada um deles corresponde um valor de
Km.O valor de Vmax (Vmax = k+2 [E0]) para uma dada enzima depende
da concentrao inicial deste, para de depender tambm da estrutura do
substrato, do pH e da temperatura.A equao de cintica do modelo de
Michaelis-Menten, que traduz a variao da velocidade de reaco
enzimtica com a concentrao do substrato, representada graficamente
por uma hiprbole que tende assimptoticamente para as retas V = Vmax
e [S] = - Km.A equao de Michaelis-menten pode ser transformada de
modo a convert-la numa equao linear. A linearizao mais comum a
devida a Lineweaver e Burk:
Nesta representao, os pontos correspondentes a elevados valores
de [S] podem vir influenciados pela inibio do substrato, e os
pontos correspondentes a baixos valores de [S] vm com certeza
afectados de maiores erros relativos na determinao das respectivas
velocidades. Por estas razes, o clculo dos parmetros cinticos por
regresso linear no necessariamente mais rigoroso do que a sua
determinao a partir da melhor recta traada mo.A velocidade das
reaces enzimticas muitas vezes afetada pela presena de agentes
qumicos que: Activam (activadores) a actividade enzimtica: Inibem
(inibidores) a actividade enzimtica: so compostos que se combinam
com as enzimas e que bloqueiam de um modo reversvel ou irreversvel
a sua actividade cataltica. Podem ser: Produtos da reaco;
Substratos; Outros compostos: drogas, antibiticos, venenos, etc.A
inibio irreversvel ocorre quando certos compostos se ligam
covalentemente ao stio activo da enzima, bloqueando um aminocido
responsvel pela catlise. Assim, na presena destes inibidores a
velocidade da reaco tende rapidamente para zero.E + S ES E + P + I
EIMais importante, do ponto de vista cintico, do que a inibio total
a inibio parcial, que acontece quando o inibidor e liga
reversivelmente enzima:E + I EIOnde KI a constante de dissociao do
complexo enzima-inibidor. Neste caso, a velocidade da reaco
enzimtica reduzida, mas no anulada, mesmo para concentraes elevadas
de inibidor.Inibies na ausncia de substncias estranhas reaco podem
ocorrer com o substrato ou com o produto da prpria reaco bioqumica:
Inibio por substrato acontece quando, para elevadas concentraes do
substrato, este atua como inibidor, fazendo associar uma segunda
molcula de substrato ao complexo intermedirio ES, provocando a
formao de uma espcie de (ESS) cataliticamente inactiva, isto , que
no da origem ao produto da reaco Inibio por produto fcil de
compreender porque sendo este o substrato da reaco inversa, a sua
presena diminui a velocidade da reaco direta. Para evitar este tipo
de inibio, os estudos cinticos devem ser feitos com velocidades
iniciais.Existem vrios tipos de inibio: Competitiva: quando o
inibidor uma substncia estranha reaco bioqumica, pode acontecer que
ele se ligue ao mesmo stio activo da enzima a que se liga o
substrato, competindo directamente com este para ocupar o mesmo
centro cataltico na protena enzimtica. No-competitiva: quando o
inibidor se liga a um stio activo diferente do stio activo a que se
liga o substrato, mas que por impedimentos estreos seja dificultado
o acesso do substrato ao seu prprio stio activo na molcula da
enzima, ou seja, o substrato e inibidor no competem entre si pelo
mesmo stio activo na enzima. Incompetitiva: quando o inibidor se
liga apenas ao complexo intermedirio, dando origem a um composto
que no se converte em produto.
4.1. Inibio competitivaO inibidor provoca um consumo adicional
de enzima, deslocando o equilbrio da reaco enzimtica para a
esquerda e aumentando a constante de dissociao do complexo
intermedirio ES.
No estado quasi-estacionrio pode deduzir-se que a velocidade da
reaco dada por:
Onde:
Linearizando a equao, obtm-se:
Km inclui dois parmetros: Km, j obtido na ausncia de inibidor, e
KI que a constante de dissociao do complexo enzima-inibidor.A aco
dos inibidores competitivos eliminada para concentraes elevadas no
substrato, no afectando o valor de Vmax. No entanto, a afinidade da
enzima para com o substrato reduzida (Km > Km).Na representao de
Lineweaver-Burk, ao aumentar a concentrao do inibidor competitivo
aumenta o declive mas a ordenada na origem permanece
inalterada.4.2. Inibio no competitivaOs inibidores no-competitivos
ligam-se enzima num local diferente do stio activo a que se liga o
substrato. Assim, a afinidade da enzima para com o substrato no
alterada mas o valor de Vmax vai ser reduzido, seja por modificao
da configurao cataltica da enzima, seja por impedimentos da
configurao cataltica da enzima, seja por impedimentos estreos que
dificultam o acesso do substrato ao centro cataltico da enzima, O
certo que o cimplexo EIS estril, isto , no d origem a qualquer
produto. Assim, a ligao do substrato enzima faz-se de um modo
equivalente quer este esteja na forma livre ou ligado j ao
inibidor. Isto significa que as constante de dissociao dos
complexos ES e EIS (EIS EI + S) so idnticas,
Supondo que I tem idntica afinidade para E e para ES (mas podem
essas afinidades ser diferentes):
Onde:
Linearizando a equao, obtm-se:
A constante de Michaelis-Menten (Km) permanece inalterada mas a
velocidade mxima (Vmax), dita agora aparente, reduzida.Na
representao de Lineweaver-Burk, ao aumentar a concentrao do
inibidor no-competitivo, aumenta quer o declive quer a ordenada na
origem.4.3. Inibio incompetitivaNeste tipo de inibio o inibidor no
se liga com a enzima livre mas apenas com o complexo intermedirio
ES. Ambas as constantes cinticas, Km e Vmax, so neste caso
afectadas.
A expresso para a velocidade com a aproximao do estado
quasi-estacionrio :
Isto :Linearizando a equao, obtm-se:
Na representao de Lineweaver-Burk, ao aumemtar a concentrao do
inibidor competitivo, aumenta a ordenada na origem mas o declive
permanece constante, originando rectas paralelas para diferentes
concentraes.
4.4. Inibio pelo substrato
ES +S ESSPode deduzir-se que a velocidade da reaco dada por:V =
k+2 [ES][E0] = [E] + [ES] + [ESS]Km = Kss = Kss = [ESS] = Vmax =
k+2 [E0]Substituindo [E] e [ESS] na equao do balano enzima,
obtm-se:[E0] = [ES] Daqui tira-se [ES] que se substitui na equao da
velocidade:V = com Kss = Km + /KSS > KmPara baixas concentraes
de substrato o termo [S]/(KssVmax) desprezvel, o mesmo acontecendo
com o termo Km/(Vmax[S]) para concentraes elevadas de
substrato.
Esquema global de WebbK+2Ks
E ES E + P2KIKI
EI EIS E + P +I1 Ks k+2
Em que Ks, KI, 1Ks e 2KI so as seguintes constantes de
dissociao: Ks = [E][S] / [ES] KI = [E][I] / [EI] 1Ks = [EI][S] /
[EIS] 2KI = [ES][I] / [EIS]
Em geral, 1 = 2 = e quando: = 1 e = 0: inibio no competitiva
pura = 1 e 0 < < 1: inibio no-competitiva parcial = 1: no h
qualquer inibioSe 1 ocorre uma inibio no-competitiva mais geral (ou
mais complexa) ou, eventualmente, uma inibio mista.
5. Cintica enzimtica
Na indstria cervejeira usam-se leveduras do gnero Saccharomyces
para converter acares mais simples em etanol e dixido de carbono.
Esses acares so unidades de glucose e/ou maltose resultantes da
hidrlise do amido proveniente da cevada. Essa hidrlise catalisada
enzimaticamente por um conjunto de enzimas designados por
amilolticos e obtido durante a operao de maltagem.O amido um
polmero natural constitudo por dois componentes: a amilose, com uma
estrutura linear e a amilopectina, com uma estrutura ramificada.Os
principais amilolticos so: -milase: corta a cadeia polimrica ainda
em grandes seces designadas por dextrinas; -amilase: liberta duas
unidades de glucose, isto , o dissacardeo maltose;
amiloglucosidase: liberta unidades de glucose simples (um acar
redutor) e ainda uma enzima hidroltica desramificante que, como o
prprio nome nome indica, corta ligaes ramificadas.A enzima
amiloglucosidase , pois, uma das principais enzimas utilizadas
industrialmente na produo da glucose a partir do amido. tambm usado
para a produo de cerveja com um contedo reduzido de hidratos de
carbono. A enzima hidrolisa as ligaes -1,4 e tambm as ligaes -1,6
do aido, sendo a velocidade de hidrlise das ligaes -1,4 cerca de 15
a 30 vezes mais elevada do que as ligaes -1,6.Para uma actividade e
estabilidade ptimas durante longos tempos de reaco (40 a 100
horas), que so usados na indstria para a produo de xaropes de
glucose (em grandes tanques de sacarificao), o pH ptimo cerca de
4,5 e a temperatura ptima 60C.6. AminocidosAs protenas so
biomolculas polimricas constitudas por cadeias de diversos
aminocidos, ligados uns aos outros por meio de ligaes peptdicas,
estabelecidas entre o grupo carboxilo de um aminocido e o grupo
amina do aminocido seguinte,As protenas, consoante a funo que
desempenham, podem dividir-se em trs grupos principais, a saber:
Funo estrutural: existem nos msculos, na pele, nos ossos, nos rgos
internos, nas membranas celulares, e apresentam geralmente uma
estrutura fibrosa. Fisiologicamente activas: enzimas, hormonas e as
protenas do sangue e do plasma; estas ltimas transportam oxignio,
defendem o organismo contra infeces, participam na coagulao,
transportam e armazenam substncias nutritivas. Nutritivas.
As protenas dos serres vivos so constitudas essencialmente por
20 aminocidos diferentes, ditos fundamentais e determinados pelo
cdigo gentico.
De acordo com a estrutura do grupo R, podem dividir-se aqueles
20 aminocidos em 7 grupos, por facilidade de sistematizao: Grupo I:
Glicina: este o nico aminocido que no possui um carbono assimtrico,
como tal no forma dois enantimeros como os restantes aminocidos.
Alanina Valina (e) Leucina (e) Isoleucina (e): este aminocido
possui, para alm de um carbono assimtrico, um carbono tambm
assimtrico, dando origem a 4 enantimeros. Grupo II: Serina Treonina
(e): este aminocido tambm possui um carbono assimtrico, semelhana
da isoleucina. Grupo III: Cistena Metionina (e) Grupo IV: cido
asprtico Asparagina cido glutmico Glutamina Grupo V: Lisina (e)
Arginina (e) Histidina (e): este aminocido caracterizado pelo grupo
imidasol Grupo VI: Fenilalanina (e) Tirosina Triptofano (e): este
aminocido caracterizado pelo grupo indol. Grupo VII: Prolina:
possui um grupo amina secundrio.
Os aminicidos anotados com (e) designam-se essncias, querendo
com isto dizer que eles tm de estar presentes na alimentao dos
animais, por impossibilidade de estes os sintetizarem a partir de
outras substncias existentes nos alimentos.
7. Aldoses e Cetoses
Os monossacardeos so os hidratos de carbono mais simples e,
consoante possuem um grupo aldedo ou um grupo cetnico, assim se
designam por aldoses ou cetoses. Os monossacardeos mais abundantes
na Natureza so pentoses e hexoses, aldoses com, respectivamente,
cinco e seis tomos de carbono.