RESPON SEL LEYDIG DARI MENCIT NEONATAL TERHADAP … filerespon sel leydig dari mencit neonatal terhadap hcg selama kultur in vitro achmad syamroni fakultas kedokteran hewan institut

RESPON SEL LEYDIG DARI MENCIT NEONATAL

TERHADAP hCG SELAMA KULTUR IN VITRO

ACHMAD SYAMRONI

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2016

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN

SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul “Respon Sel Leydig dari

Mencit Neonatal terhadap hCG selama Kultur in Vitro” adalah benar karya saya

dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun

kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari

karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan

dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.

Bogor, Juni 2016

Achmad Syamroni

NIM B04120028

ABSTRAK

ACHMAD SYAMRONI. Respon Sel Leydig dari Mencit Neonatal terhadap hCG

selama Kultur in Vitro. Dibimbing oleh KUSDIANTORO MOHAMAD dan

WAHONO ESTHI PRASETYANINGTYAS.

Sel Leydig merupakan sel penghasil hormon testosteron pada hewan jantan.

Berdasarkan tingkat kematangan, populasinya terbagi menjadi sel Leydig fetal dan

sel Leydig dewasa. Hormon human chorionic gonadotropin (hCG) adalah salah

satu faktor yang memengaruhi proliferasi dan diferensiasi pada sel Leydig dewasa,

tetapi belum diketahui pengaruhnya pada sel Leydig fetal. Penelitian ini bertujuan

untuk menjajaki respon sel Leydig fetal terhadap penambahan hCG pada kultur in

vitro dengan menggunakan sel Leydig yang diisolasi dari mencit neonatal. Sel

Leydig diisolasi dari mencit neonatal umur tiga hari, dikultur in vitro selama enam

hari, dan diberi perlakuan dengan dan tanpa penambahan hCG. Data yang

dievaluasi berupa tingkat proliferasi (population doubling time, PDT) dan jumlah

sel yang mengekspresikan keberadaan enzim 3β-HSD. Hasil penelitian

menunjukkan bahwa penambahan hCG pada kultur in vitro sel Leydig dewasa

meningkatkan proliferasi sel, sebaliknya pada sel Leydig fetal menurunkan

proliferasi sel. Penambahan hCG tidak memengaruhi persentase jumlah sel Leydig

dari mencit neonatal yang mengekspresikan enzim 3β-HSD. Dapat disimpulkan

bahwa sel Leydig fetal dari mencit neonatal memiliki respon yang berbeda dengan

sel Leydig dewasa terhadap penambahan hCG secara in vitro.

Kata kunci: hCG, kultur in vitro, mencit neonatal, proliferasi, sel Leydig

ABSTRACT

ACHMAD SYAMRONI. Responsiveness of Neonate Mice Isolated Leydig Cells

to hCG during in Vitro Culture. Supervised by KUSDIANTORO MOHAMAD and

WAHONO ESTHI PRASETYANINGTYAS.

Leydig cells that producing testosterone in the male are divided into two

different mature populations, i.e. fetal Leydig cells and adult Leydig cells. Human

chorionic gonadotropin (hCG) is one of the factors that influence the proliferation

and differentiation of adult Leydig cells, but it is not known its effect on fetal Leydig

cells. This study aims to examine the responsiveness of the fetal Leydig cells that

isolated from neonate mice to hCG supplementation during in vitro culture. Leydig

cells were isolated from three days old mice, cultured for six days, and treated with

and without hCG supplementation. Data that analyzed were the proliferation rate

(population doubling time, PDT) and the number of cell that expressing the 3β-

HSD enzyme. The results of this study showed that the hCG supplementation

increased the proliferation rate of the adult Leydig cells. In contrast the hCG

supplementation decreased the proliferation rate of fetal Leydig cells from neonate

mice. The hCG supplementation did not affect the number of fetal Leydig cells that

expressing the 3β-HSD enzymes from neonate mice. It can be concluded that the

fetal Leydig cells from neonate mice responsed differently to hCG supplementation

in vitro compared to the adult Leydig cells.

Keywords: hCG, in vitro culture, Leydig cell, neonatal mice, proliferation

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Kedokteran Hewan

pada

Fakultas Kedokteran Hewan

RESPON SEL LEYDIG DARI MENCIT NEONATAL

TERHADAP hCG SELAMA KULTUR IN VITRO

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2016

ACHMAD SYAMRONI

PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta‘ala atas segala

nikmat yang dilimpahkan sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang

berjudul “Respon Sel Leydig dari Mencit Neonatal terhadap hCG selama Kultur in

Vitro”.

Ungkapan terima kasih penulis sampaikan kepada orang tua, adik, dan

seluruh keluarga atas dukungan dan kasih sayang yang selalu dilimpahkan kepada

penulis. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Drh Kusdiantoro Mohamad,

MSi, PAVet dan Drh Wahono Esthi Prasetyaningtyas, MSi, PAVet selaku

pembimbing yang senantiasa memberikan motivasi dan masukan selama penelitian

dan penulisan skripsi. Terima kasih kepada Prof Drh Arief Boediono, PhD, PAVet

(K) atas saran dan pengetahuan yang diberikan selama penelitian. Terima kasih

kepada Wahyudin, AMd dan teman sepenelitian “Embrio penuh warna” (Senna,

Herman, Yusa, Riki, Alisa, Septi, Kak Reza, kakak-kakak pascasarjana) atas

bantuan dan kerja sama selama penelitian. Terima kasih kepada Erfan dan Bhetari,

keluarga HKRB 49, teman-teman Astrocyte (FKH 49), dan teman-teman Cahsper

yang selalu mendengarkan keluh kesah penulis selama penelitian.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Juni 2016

Achmad Syamroni

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL vi

DAFTAR GAMBAR vi

PENDAHULUAN 1

Latar Belakang 1

Tujuan Penelitian 1

Manfaat Penelitian 1

TINJAUAN PUSTAKA 2

Anatomi dan Histologi Testis 2

Perkembangan Sel Leydig 2

Peran hCG dalam Perkembangan Sel Leydig 3

Sintesis Testosteron pada Sel Leydig 3

METODE 4

Tempat dan Waktu 4

Bahan 4

Alat 4

Tahapan Prosedur Kerja 5

Persiapan Cawan Petri 5

Isolasi dan Kultur Sel Leydig 5

Perlakuan Kultur Sel Leydig 5

Evaluasi Hasil Kultur 5

Prosedur Analisis Data 7

HASIL DAN PEMBAHASAN 7

Proliferasi Sel Leydig in Vitro 7

Identifikasi Sel Leydig 9

SIMPULAN DAN SARAN 10

Simpulan 10

Saran 10

DAFTAR PUSTAKA 10

RIWAYAT HIDUP 12

DAFTAR TABEL

1 Kosentrasi, population doubling time (PDT) dan viabilitas sel Leydig dari

mencit neonatal dan dewasa setelah kultur in vitro selama enam hari 7

2 Persentase sel Leydig dari mencit neonatal berdasarkan keberadaan enzim

3β-HSD setelah kultur in vitro selama enam hari 9

DAFTAR GAMBAR

1 Gambar 1 Mekanisme sintesis testosteron pada sel Leydig 4

2 Gambar 2 Sel Leydig dari mencit neonatal setelah pewarnaan vital dan

3β-HSD 6

3 Gambar 3 Kultur in vitro sel Leydig dari mencit neonatal 8

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Sel Leydig merupakan sel penghasil hormon testosteron yang fungsinya

dibantu oleh enzim steroidogenik dan induksi berbagai faktor pertumbuhan yang

lain. Sel Leydig dibagi menjadi dua jenis populasi berdasarkan tingkat kematangan,

yaitu sel Leydig fetal dan sel Leydig dewasa. Sel Leydig fetal dapat ditemukan

selama masa fetal sampai beberapa hari pascalahir, sedangkan sel Leydig dewasa

terdapat pada hewan dewasa, telah terdiferensiasi, dan bersifat fungsional sebagai

penghasil hormon testosteron (Ariyaratne et al. 2000).

Penelitian mengenai proses perkembangan sel Leydig fetal mengarah kepada

tiga pendapat utama, yaitu 1) sel Leydig fetal mengalami degenerasi atau mati,

kemudian digantikan oleh Leydig dewasa, 2) sel Leydig fetal mengalami regresi

membentuk sel pseudo-fibroblas, atau 3) sel Leydig fetal berkembang dan

berdiferensiasi menjadi sel Leydig dewasa. Hal yang menjadi kesamaan dalam

ketiga asumsi tersebut adalah sel Leydig fetal hanya bertahan beberapa hari

pascalahir (Wen et al. 2011).

Human chorionic gonadotropin (hCG) merupakan hormon yang analog

dengan LH karena sebagian besar komponen dalam hCG merupakan hormon

luteotropik. Hormon LH/hCG pada hewan jantan diketahui memiliki peran penting

dalam menginduksi produksi testosteron dan memicu perkembangan sel Leydig,

baik secara in vivo maupun in vitro (Cole et al. 1991).

Sel Leydig fetal pada saat neonatal dan sel Leydig dewasa diduga akan

menunjukkan perbedaan respon pada saat dipaparkan dengan hCG. Akan tetapi

belum banyak dilaporkan pengaruh hCG terhadap perkembangan sel Leydig fetal

secara in vivo maupun in vitro. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan

informasi tentang pengaruh hCG terhadap perkembangan sel Leydig fetal dan

dewasa secara in vitro, sebagai gambaran umum kondisi in vivo.

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk menjajaki perbedaan sifat kultur sel Leydig

fetal dan dewasa terhadap penambahan hCG, ditinjau dari proliferasi dan

diferensiasi sel secara in vitro.

Manfaat Penelitian

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan gambaran umum tentang respon

sel Leydig yang diisolasi dari mencit neonatal terhadap hCG dan strategi dasar

untuk perbanyakan sel tersebut pada kultur in vitro.

2

TINJAUAN PUSTAKA

Anatomi dan Histologi Testis

Testis disusun atas dua komponen utama, yaitu tubulus seminiferus dan

jaringan interstisial. Tubulus seminiferus terdiri dari sel-sel spermatogenik, sel

Sertoli, sel myoid dan jaringan ikat yang berfungsi untuk mempertahankan bentuk

organ. Jaringan interstisial disusun atas sel-sel Leydig sebagai sel utama disamping

pembuluh darah, jaringan ikat, sistem limfatik, makrofag, dan sel-sel fibroblas

(Fawcett et al. 1970).

Sel-sel Leydig berfungsi sebagai sel penghasil hormon testosteron. Hormon

testosteron pada hewan jantan berperan dalam perkembangan karakteristik kelamin

sekunder, peningkatan massa otot dan tulang, status reproduksi serta pertumbuhan

hewan (Campbell et al. 2010).

Sebagian besar mamalia memiliki testis di luar tubuh yang dibungkus oleh

skrotum, suatu lipatan dinding tubuh untuk mempertahankan suhu testis sekitar 2 oC di bawah suhu tubuh. Testis berkembang di dalam rongga abdominal selama

masa fetal, kemudian turun ke kantung skrotum seiring dengan perkembangannya

(Campbell et al. 2010).

Perkembangan Sel Leydig

Perkembangan sel Leydig berlangsung bersamaan dengan proses

organogenesis testis. Sel Leydig merupakan sel somatis yang berasal dari jaringan

mesoderm paraksial, yang kemudian selama masa fetal bermigrasi menuju korda

testikular dan kemudian mengisi jaringan interstisial testis (Huhtaniemi dan

Pelliniemi 1992).

Perkembangan sel Leydig melalui beberapa tahapan, yaitu sel prekursor

(Leydig fetal), sel progenitor, sel leydig dewasa awal, dan sel Leydig dewasa

matang (Mendis-Handagama dan Ariyaratne 2001). Masing-masing tahapan

perkembangannya dipengaruhi oleh sistem endokrin dan faktor induksi yang lain.

Sel Leydig fetal merupakan sel mesenkim yang menjadi prekursor untuk sel

Leydig dewasa (Mendis-Handagama dan Ariyaratne 2001). Sel Leydig fetal

muncul sejak terbentuknya rigi genital sampai beberapa hari pascalahir. Sel Leydig

fetal memiliki bentuk menyerupai fibroblas dengan ciri-ciri mempunyai banyak

retikulum endoplasma halus, lipid droplet dan glikogen sitoplasma, serta memiliki

mitokondria dengan bentuk yang tidak seragam, berlamela dan berbetuk tubular

(Kerr dan Knell 1998).

Jumlah sel Leydig fetal mencapai puncak pada hari ke-17 sampai ke-22

kebuntingan, kemudian mengalami penurunan pada hari ke-3 pascalahir, dan

mencapai jumlah terendah pada hari ke-14 pascalahir (Kerr dan Knell 1998).

Menurut Teerds et al. (1989) setelah itu sel Leydig fetal akan digantikan oleh sel

Leydig dewasa selama hidup hewan.

Unsur yang berperan dalam menstimulasi proliferasi dan diferensiasi sel

Leydig fetal antara lain transforming growth factor alpha (TGFα), platelet

derivated growth factor subunit A (PDGF-A), dan hormon tiroid. Faktor yang

3

menghambat perkembangan sel Leydig fetal menjadi sel Leydig dewasa adalah

hormon androgen, estrogen, dan hormon anti-Mulerian yang dihasikan oleh sel

Sertoli (Mendis-Handagama dan Ariyaratne 2001).

Sel Leydig fetal akan berdiferensiasi menjadi sel progenitor yang

merupakan peralihan dari fase fetal ke fase dewasa (Mendis-Handagama dan

Ariyaratne 2001). Morfologi sel progenitor serupa dengan sel Leydig fetal, tetapi

pada sel progenitor telah terbentuk reseptor enzim 3β-HSD dan hormon LH

meskipun belum fungsional. Sel progenitor pada mencit muncul pada hari ke-10

pascalahir (Hardy et al. 1989). Setelah itu, sel progenitor akan berkembang menjadi

fase dewasa pada hari ke-14 pascalahir, yaitu sel Leydig dewasa tahap awal

kemudian sel Leydig dewasa matang.

Fase dewasa sel Leydig memiliki bentuk yang berbeda dengan fase fetal,

yaitu bentuk lebih bulat, ukuran sel yang lebih besar, sitoplasma dipenuhi

mitokondria dan retikulum endoplasma halus, dan jarang ditemukan lipid droplet

(Kerr dan Knell 1998). Sel Leydig dewasa memiliki organel dan reseptor yang lebih

lengkap daripada sel Leydig fetal, sehingga mampu berfungsi optimal dalam

memproduksi hormon testosteron.

Peran hCG dalam Perkembangan Sel Leydig

Human chorionic gonadotropin (hCG) merupakan hormon glikoprotein

yang diproduksi oleh plasenta pada wanita hamil. Komposisi hCG sebagian besar

adalah LH sehingga hCG merupakan hormon analog untuk LH (Cole et al. 1991).

Luteinizing hormone (LH) menjadi faktor utama dalam diferensiasi dan

produksi hormon testosteron pada sel Leydig dewasa. Munurut Mendis-

Handagama dan Ariyaratne (2001), LH tidak memengaruhi diferensiasi dan

proliferasi sel Leydig fetal, akan tetapi sangat berpengaruh pada sel Leydig dewasa.

Adanya reseptor LH dan hormon testosteron memungkinkan sel Leydig dewasa

responsif terhadap LH, dan meningkatkan tingkat proliferasi dan diferensiasi sel

Leydig dewasa pada kultur in vitro.

Sintesis Testosteron pada Sel Leydig

Kolesterol merupakan bahan baku dalam sintesis testosteron. Kolesterol

dari luar dimobilisasi ke dalam sel kemudian diubah menjadi testosteron oleh

enzim-enzim steroidogenik. Proses tersebut diawali dengan pembentukan ikatan

antara reseptor LH dengan cyclic adenosine monophosphate cAMP atau LH yang

akan mengubah C27-kolesterol menjadi C21-steroid (pregnenolon) dengan bantuan

enzim sitokrom P450scc di mitokondria (Gambar 1). Proses selanjutnya yaitu

perombakan pregnenolon menjadi progesteron oleh enzim 3β-HSD. Progesteron

selanjutnya diubah menjadi C17-hidroksilasi progesteron dan androstenedion oleh

enzim sitokrom P45017α. Gugus 17-keton pada androstenidion selanjutnya

dihilangkan oleh enzim 17-ketosteroid reduktase agar menjadi testosteron.

Serangkaian proses ini terjadi di retikulum endoplasma halus sel (Payne dan

Youngblood 1995).

4

Gambar 1 Mekanisme sintesis testosteron pada sel Leydig. 17KSR: 17-ketosteroid

reduktase, SER: retikulum endoplasma halus (Payne dan Youngblood

1995).

METODE

Tempat dan Waktu

Penelitian ini dilaksanakan pada Februari 2016 sampai dengan Juni 2016 di

Laboratorium Embriologi, Bagian Anatomi Histologi dan Embriologi, Departemen

Anatomi Fisiologi dan Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut

Pertanian Bogor.

Bahan

Bahan-bahan yang digunakan antara lain mencit (Mus musculus) jantan umur

3 hari (neonatal) dan 28 hari (dewasa), xylazine (Sigma, USA), ketamine (Sigma,

USA), enzim kolagenase (Sigma, USA), tripsin (Sigma, USA), HAM’s F12

(Biowest, France), Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, Gibco, USA),

New Born Calf Serum (NBCS, Sigma, USA), gentamisin (Sigma, USA), gelatin

(Sigma, USA), Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline (DPBS, Gibco, USA), hormon

human chorionic gonadotropin (hCG, Chorulon, Intervet, EU), insulin transferrin

selenium (ITS), nitrotetrazolium blue chloride (Sigma, USA), etiocholanα-01-17-

one (Sigma, USA), dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma, USA), serta β-nicotinamide

adenine dinucleotide (β-NAD, Sigma, USA).

Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah peralatan bedah, botol Scott

(Pyrex) 50 mL dan 100 mL, gelas baker 150 mL, gelas penutup, tabung sentrifugasi,

spuit 5 mL, mikrofilter 0.75 µm, penangas air, mikropipet 100 µL dan 1000 µL,

cawan petri kultur berdiameter 35 mm (Corning, USA), improved haemositometer

Neubaeur, centrifuge swinged-rotor, inkubator dan laminar flow.

5

Tahapan dan Prosedur Kerja

Persiapan Cawan Petri

Sebelum kultur, cawan petri kultur berdiameter 35 mm dilapisi gelatin dengan

cara menambahkan larutan gelatin 0.1% (b/v) sebanyak 1 mL selama 1 jam. Setelah

perendaman, larutan gelatin dibuang dan cawan petri dicuci menggunakan DPBS

dan didiamkan ± 5 menit hingga kering.

Isolasi dan Kultur Sel Leydig

Sel Leydig diisolasi dan dikultur berdasarkan metode yang dilakukan oleh

Chemes et al. (1992) yang telah dimodifikasi. Mencit (Mus musculus) jantan

neonatal diinduksi secara hipotermia menggunakan balok es hingga mencit tidak

bergerak, setelah itu dilakukan dislokasi servikal. Mencit jantan dewasa berumur

28 hari dibius dengan xilazine-ketamin sampai terbius sempurna, kemudian

dilakukan dislokasi servikal. Testis diisolasi dari rongga abdomen dan ditempatkan

pada cawan petri berisi DPBS.

Testis dicuci menggunakan DPBS sebanyak 2 kali dan dilakukan dekapsulasi.

Setelah itu, testis dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi 15 mL yang berisi 2 mL

DPBS dan 200 µL enzim kolagenase 1 mg/mL. Suspensi diinkubasi di dalam

penangas air bersuhu 37 oC selama 20 menit. Setelah itu, sebanyak 3 mL

DPBS+serum (10% NBCS) ditambahkan ke dalam suspensi untuk menghentikan

reaksi enzimatis.

Supernatan hasil pencacahan enzimatis kemudian didiamkan selama 3 menit

untuk mengendapkan jaringan tubulus seminiferus dan supernatan yang

mengandung sel-sel interstisial diambil dengan spoit 5 mL. Supernatan kemudian

disaring menggunakan mikrofilter 0.75 µm, selanjutnya disentrifugasi dengan

kecepatan 2000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang dan pelet dibilas kembali

dengan 2 mL DPBS+serum. Setelah itu sel dicuci sebanyak 3 kali menggunakan

media kultur DMEM:HAM’s F12 dengan perbandingan 1:1 dan disuplemetasi

dengan insulin transferrin selenium (ITS), gentamisin, dan serum (DMEM+F12).

Sebanyak 1 x 105 sel hasil isolasi dimasukkan ke dalam cawan petri berisi 2 mL

medium kultur DMEM+F12, kemudian diinkubasi dalam inkubator CO2 5%

dengan suhu 37 oC.

Perlakuan Kultur Sel Leydig

Kultur sel Leydig fetal dan dewasa masing-masing dikelompokkan menjadi

dua kelompok yaitu kelompok kultur tanpa dan dengan penambahan hCG (3 IU/mL

media) yang dilakukan pada hari ke-2 dan ke-4, penambahan hCG dilakukan

bersamaan dengan penggantian media kultur. Kultur diinkubasi di dalam inkubator

CO2 5% dengan suhu 37 oC. Media kultur diganti setiap dua hari sekali, dan hasil

kultur dikoleksi pada hari ke-6.

Evaluasi Hasil Kultur

Evaluasi dilakukan setelah sel hasil kultur dikoleksi dengan tripsin 1 mg/mL

(0.1%, b/v). Parameter yang diukur adalah population doubling time (PDT),

viabilitas sel, dan kemurnian sel Leydig pada setiap perlakuan kultur. Konsentrasi

6

dihitung menggunakan improved haemasitometer Neubaeur dengan rumus: (total

sel pada 5 kotak besar/5) x 104 x faktor pengenceran. Nilai PDT dihitung dengan

rumus menurut Davis (2011):

PDT (hari) =1

(log 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑠𝑒𝑙 𝑎𝑘ℎ𝑖𝑟 − 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑠𝑒𝑙 𝑎𝑤𝑎𝑙)𝑥3.32𝑥1

𝑤𝑎𝑘𝑡𝑢 (ℎ𝑎𝑟𝑖)

Evaluasi viabilitas dilakukan dengan pewarnaan trypan blue pada saat

penghitungan sel hasil kultur. Sel yang mati akan menyerap warna biru dari trypan

blue karena perubahan permeabilitas membran, sebaliknya sel hidup akan tetap

bening atau tidak terwarnai (Gambar 2A).

Gambar 2 Sel Leydig dari mencit neonatal setelah pewarnaan vital dan 3β-HSD.

A. Trypan blue, sel yang hidup ( ) dan yang mati ( ), B. 3β-HSD,

pewarnaan positif di inti ( ), sitoplasma dan inti ( ) dan negatif ( ).

Garis skala = 50 µm.

Kemurnian kultur sel Leydig dievaluasi dengan pewarnaan enzim 3β-HSD

berdasarkan metode yang dilakukan oleh Chemes et al. (1992) yang dimodifikasi.

Pewarnaan enzim 3β-HSD dilakukan dengan dua macam larutan, yaitu larutan A

dan larutan B. Larutan A dibuat dengan melarutkan 1 mg nitrotetrazolium blue

chloride (Sigma, USA) ke dalam 0.6 mL larutan 1 mg/mL etiocholanα-01-17-one

(Sigma, USA) dalam dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma, USA). Larutan B dibuat

dengan mencampurkan 10 mg β-nicotinamide adenine dinucleotide (β-NAD,

Sigma, USA) ke dalam DPBS hangat.

Sel terlebih dahulu difiksasi menggunakan paraformaldehid 4% selama 2

jam pada suhu ruang, kemudian larutan fiksasi dibuang dan dibilas dengan DPBS

sebanyak dua kali. Setelah itu, larutan A dan B ditambahkan kemudian didiamkan

selama 4-5 jam pada suhu 37 oC. Pewarna kemudian dibuang, dan sisa pewarna

dibilas menggunakan DPBS sebanyak tiga kali. Setelah itu hasil pewarnaan diamati

dengan mikroskop cahaya pada perbesaran 10 x 20. Sel berwarna biru keunguan

menunjukkan bahwa sel tersebut adalah sel Leydig karena mengekspresikan enzim

3β-HSD (Gambar 2B).

7

Prosedur Analisis Data

Parameter yang diamati adalah konsentrasi sel, viabilitas, PDT dan

kemurnian kultur sel Leydig. Data yang didapat kemudian dianalisis dengan sidik

ragam ANOVA dengan tingkat kepercayaan 95% dan dilanjutkan dengan uji Tukey.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Proliferasi Sel Leydig in Vitro

Menurut Davis (2011) population doubling time (PDT) adalah waktu yang

dibutuhkan oleh populasi sel untuk mencapai jumlah dua kali lipat dari jumlah

semula. Semakin kecil nilai PDT, dapat diartikan bahwa proliferasi sel tersebut

semakin cepat. Hasil kultur in vitro sel Leydig fetal dari testis mencit neonatal dan

sel Leydig dewasa dengan dan tanpa hCG tersaji pada Tabel 1 dengan gambaran

kepadatan sel sebelum dan setelah kultur dapat diamati pada Gambar 3.

Tabel 1 Kosentrasi, population doubling time (PDT) dan viabilitas sel Leydig dari

mencit neonatal dan dewasa setelah kultur in vitro selama 6 hari

Perlakuan Konsentrasi awal

(105 sel/mL)

Kosentrasi akhir

(105 sel/mL) PDT (hari) Viabilitas (%)

Neonatal -hCG 1 13.16 ± 3.90a 1.65 ± 0.18c 81.36 ± 4.60a

+hCG 1 6.36 ± 1.30b 2.30 ± 0.28b 85.79 ± 10.80a

Dewasa -hCG 1 3.20 ± 0.20c 3.59 ± 0.19a 73.83 ± 7.42a

+hCG 1 6.44 ± 0.40b 2.24 ± 0.08b 71.00 ± 6.90a Huruf superskrip yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang

sangat nyata (p<0.01).

Kultur sel Leydig fetal dari mencit neonatal yang tidak diberi perlakuan hCG

mengalami peningkatan konsentrasi yang lebih tinggi secara nyata (p<0.01)

dibandingkan dengan yang diberi perlakuan hCG (Tabel 1, Gambar 3A-B). Hasil

ini berimplikasi pada nilai PDT yang lebih kecil secara nyata (p<0.01). Nilai PDT

yang kecil pada kultur tanpa perlakuan hCG menunjukkan tingkat proliferasi yang

lebih cepat dibadingkan dengan sel yang diberi hCG.

Hasil menunjukkan bahwa hCG menghambat proliferasi sel Leydig fetal

pada kultur in vitro. Respon sel Leydig fetal terhadap hCG berupa peningkatan

produksi cAMP dan hormon testosteron (Warren et al.1984). Menurut Mendis-

Handagama dan Ariyaratne (2001) testosteron merupakan salah satu penghambat

proliferasi sel Leydig fetal. Teori ini didukung oleh Gaytan et al. (1994) dan Teerds

et al. (1999) yang menyatakan bahwa pemberian LH atau hCG dapat menghambat

proses proliferasi sel Leydig fetal atau sel prekursor.

Kelompok kultur sel Leydig dewasa dengan penambahan hCG memiliki

proliferasi yang lebih cepat secara nyata (p<0.01) dibandingkan dengan kelompok

8

kultur sel Leydig dewasa tanpa penambahan hCG (Tabel 1). Hal ini ditunjukkan

dengan nilai PDT yang lebih kecil dibandingkan dengan kelompok yang tanpa

ditambahkan hCG (Tabel 1). Menurut Saez (1994), LH/hCG merupakan faktor

penting dalam proliferasi dan diferensiasi sel Leydig dewasa. Mendis-Handagama

dan Ariyaratne (2001) juga menyatakan bahwa sel Leydig dewasa memerlukan LH,

androgen, insulin-like growth factor-1 (IGF-1), transforming growth factor alpha

(TGFα), transforming growth factor beta (TGFβ) dan estrogen untuk proses

proliferasi dan diferensiasi. Pendapat ini sejalan dengan hasil kultur sel Leydig

dewasa, yang menunjukkan bahwa kelompok kultur dengan penambahan hCG

berproliferasi lebih cepat dibanding kelompok yang tanpa penambahan hCG.

Gambar 3 Kultur in vitro sel Leydig dari mencit neonatal. A. Kultur hari kedua

tanpa hCG; B. Kultur hari keenam tanpa hCG; C. Kultur hari kedua

dengan hCG; D. Kultur hari keenam dengan hCG. Garis skala = 50 µm.

Apabila dibandingkan antara kultur sel Leydig fetal tanpa penambahan hCG

(1.65 ± 0.18 hari) dengan kultur sel Leydig dewasa yang sama-sama tanpa

penambahan hCG (3.59 ± 0.19 hari), kultur sel Leydig fetal memiliki nilai PDT

yang lebih kecil dibanding kultur sel Leydig dewasa (Tabel 1). Hasil ini

menunjukkan bahwa pada kondisi tanpa penambahan hCG, tingkat proliferasi sel

Leydig fetal lebih tinggi dibandingkan dengan sel Leydig dewasa. Hipotesis ini

dikuatkan dengan ulasan oleh Moore et al. (1992) yang menyatakan bahwa sel

Leydig fetal memiliki kecepatan mitosis relatif lebih tinggi dibanding sel Leydig

dewasa. Selain itu, Mendis-Handagama et al. (1998) juga menyatakan bahwa tidak

adanya aktivitas diferensiasi pada sel Leydig fetal mengakibatkan tingkat

proliferasi menjadi meningkat.

Penambahan hCG pada media kultur sel Leydig fetal dan dewasa

menunjukkan respon yang berbeda (Tabel 1). Pada kultur sel Leydig fetal,

penambahan hCG menurunkan tingkat proliferasi sel kultur (nilai PDT kelompok

9

kultur tanpa penambahan hCG adalah 1.65 ± 0.18 hari; nilai PDT kelompok kultur

dengan penambahan hCG adalah 2.30 ± 0.28 hari), sebaliknya pada kultur sel

Leydig dewasa penambahan hCG meningkatkan tingkat proliferasinya (nilai PDT

kelompok kultur tanpa penambahan hCG adalah 3.59 ± 0.19 hari; nilai PDT

kelompok kultur dengan penambahan hCG adalah 2.24 ± 0.08 hari). Perbedaan

respon ini disebabkan karena sel Leydig dewasa sudah memiliki reseptor LH/hCG,

sebaliknya pada sel Leydig fetal belum terbentuk, sehingga sel Leydig fetal menjadi

kurang responsif dibanding sel Leydig dewasa (O’Shaughnessy et al. 1998).

Hasil pewarnaan trypan blue menunjukkan viabilitas sel Leydig pada

kelompok kultur yang diberi dan tanpa diberi penambahan hCG tidak berbeda nyata

(p>0.05) pada semua kelompok perlakuan (Tabel 1). Hasil ini berarti penambahan

hCG tidak berpengaruh terhadap daya hidup sel Leydig fetal setelah kultur in vitro.

Identifikasi Sel Leydig

Pewarnaan spesifik 3β-HSD mendeteksi enzim 3β-HSD yang ada di

retikulum endoplasma halus sel Leydig. Enzim 3β-HSD berperan dalam proses

pembentukan testosteron (Payne dan Youngblood 1995). Sel yang bereaksi positif

dengan pewarnaan 3β-HSD menunjukkan bahwa sel tersebut adalah sel Leydig.

Pewarnaan 3β-HSD pada kultur sel Leydig menunjukkan bahwa tingkat kemurnian

kultur sel Leydig dari mencit neonatal berkisar 90%, tidak berbeda nyata (p>0.05)

baik pada perlakuan dengan dan tanpa penambahan hCG. Hasil pewarnaan 3β-HSD

pada kultur sel Leydig dari mencit neonatal disajikan pada Tabel 2.

Tabel 2 Persentase sel Leydig dari mencit neonatal berdasarkan keberadaan enzim

3β-HSD setelah kultur in vitro selama 6 hari

Perlakuan Pewarnaan 3β-HSD (%)

Positif (sel Leydig) Negatif (sel non Leydig)

-hCG 93.00 ± 5.57a 7.00 ± 5.57a

+hCG 90.33 ± 5.51a 9.67 ± 5.51a

Huruf superskrip yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata (p>0.05).

Hasil evaluasi menunjukkan bahwa kemurnian kultur sel Leydig dari mencit

neonatal cukup tinggi. Kemurnian hasil isolasi sel Leydig yang tinggi membuktikan

bahwa kontaminasi sel spermatogenik pada testis mencit neonatal sangat kecil.

Perkembangan jaringan tubulus seminiferus pada mencit neonatal masih berbentuk

korda testikular dengan kandungan utama berupa sel prasertoli dan sel

praspermatogonia (Kossack et al. 2009), sehingga potensi kontaminasi saat isolasi

sel Leydig dari testis neonatal oleh sel-sel spermatogenik menjadi semakin kecil

jika dibandingkan dari testis dewasa. Hal ini didukung oleh Gassei et al. (2006)

yang menyatakan bahwa testis tikus prapubertal disusun oleh sel interstisial (sel

Leydig), sel Sertoli dan sedikit sel spermatogenik di membran basal tubulus

seminiferus.

10

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Sel Leydig dari mencit neonatal memiliki respon yang berbeda dengan yang

dewasa terhadap penambahan hCG secara in vitro. Penambahan hCG pada kultur

sel Leydig dewasa meningkatkan tingkat proliferasi, sebaliknya pada sel Leydig

dari mencit neonatal menurunkan tingkat proliferasi. Penambahan hCG tidak

memengaruhi persentase jumlah sel Leydig dari mencit neonatal yang bereaksi

positif terhadap enzim 3β-HSD.

Saran

Kultur in vitro sel Leydig fetal dengan tujuan meningkatkan jumlah sel atau

proliferasi sebaiknya dilakukan tanpa penambahan hCG.

DAFTAR PUSTAKA

Ariyaratne HBS, Mendis-Handagama SMLC, Hales DB, Mason JI. 2000. Studies

on the onset of Leydig precursor cells differentiation in the prepubertal rat testis.

Biology of Reproduction. 63:165-171.

Campbell NA, Reece JB, Urry LA, Cain ML, Wasserman SA, Minorsky PV,

Jackson RB. 2010. Biologi jilid 3. Ed ke-8. Wulandari DT, penerjemah; Hardani

W, Adhika P, editor. Jakarta (ID): Penerbit Erlangga. Terjemahan dari: Biology.

Ed ke-8.

Chemes H, Cigorraga S, Bergada C, Schteingart H, Rey R, Pellizzar E. 1992.

Isolation of Human Leydig Cell Mesenchymal Precursors from Patients with the

Androgen Insensitivity Syndrome: Testosterone Production and Response to

Human Chorionic Gonadotropin Stimulation in Culture. Biology of

Reproduction. 46:793-801.

Cole LA, Kardana A, Andrade-Gordon P, Gawinowicz M, Morris JC, Bergert ER,

O’Connor J, Birken S. 1991. The heterogeneity of human chorionic

gonadotropin (hCG). III. The Occurrence and Biological and Immunological

Activities of Nicked hCG. Endocrinology. 129(3):1559-1567.

Davis JM. 2011. Basic Techniques and Media, The Maintenance of Cell Lines and

Safety. Di dalam: John MD, editor. Animal Cell Culture Essential Methods.

England (GB): John Wiley and Sons Ltd.

Fawcett DW, Leak LC, Heidger PM. 1970. Electron microscopic observations on

the ultrastructural components of the blood testis barrier. Reproduction and

Fertility Supplement. 10:105-122.

11

Gassei K, Schlatt S, Ehmcke J. 2006. De novo morphogenesis of seminiferous

tubules from dissociated immature rat testicular cells in xenografts. Andrology.

27(4):611-618.

Gaytan F, Pinilla L, Romero JL, Aguilar E. 1994. Differential effects of the

administration of human chorionic gonadotropin to post-natal rats.

Endocrinology. 142:527–534.

Hardy MP, Zirkin BR, Ewing LL. 1989. Kinetic studies on the development of the

adult population of Leydig cells in testes of prepubertal rat. Endocrinology.

124:762–770.

Huhtaniemi I, Pelliniemi LJ. 1992. Fetal Leydig Cells: Cellular Origin, Morphology,

Life Span, and Special Functional Features. Society for Experimental Biology

and Medicine 201(2):125-140.

Kerr JB, Knell CM. 1998. The fate of fetal Leydig cells during the development of

the fetal and postnatal rat testis. Development. 103(3):535-44.

Kossack N, Meneses J, Shefi S, Nguyen HN, Chavez S, Nicholas C, Gromoll J,

Turek PJ, Reijo-Pera RA. 2009. Isolation and characterization of pluripotent

human spermatogonial stem cell-derived cells. Stem Cells. 27(1):138-49.

Mendis-Handagama SMLC, Ariyaratne HBS, Teunissen van Manen KR, Haupt RL.

1998. Differentiation of adult Leydig cells in the neonatal rat testis is arrested by

hypothyroidism. Biology of Reproduction. 59:351–357.

Mendis-Handagama SMLC, Ariyaratne HBS. 2001. Differentiation of adult Leydig

Cell Population in the postnatal testis. Biology of Reproduction Review. 65:660-

671.

Moore A, Findlay K, Morris ID. 1992. In vitro DNA synthesis in Leydig and other

interstitial cells of the rat testis. Endocrinology. 134:247–256.

O’Shaughnessy PJ, Baker P, Sohnius U, Haavisto AM, Charlton HM, Huhtaniemi

I. 1998. Fetal development of Leydig cell activity in the mouse is independent

of pituitary gonadotroph function. Endocrinology. 139:1141–1146.

Payne AH, Youngblood GL. 1995. Regulation of Expression of Steroidogenic

Enzymes in Leydig Cells. Biology of Reproduction. 52:217-225.

Saez JM. 1994. Leydig Cells: Endocrine, paracrine and autocrine regulation.

Endocrinology Review. 15(5):574-626.

Teerds KJ, de Rooij DG, Rommorts FFG, van den Hurk R, Wensing CJG. 1989.

Proliferation and differentiation of possible Leydig cell precursors after

destruction of existing Leydig cell with ethane dimethane sulphonate: The role

of LH/human chorionic gonadotropin. Endocrinology. 122:689–696.

Teerds KJ, de Boer-Brouwer M, Dorrington JH, Balvers M, Ivell R. 1999.

Identification of markers for precursor and Leydig cell differentiation in the adult

rat testis following ethane dimethyl sulphonate administration. Biology of

Reproduction. 60:1437–1445.

Warren DW, Huhtaniemi IT, Tapanainen J, Dufau ML, Catt KJ. 1984. Ontogeny of

gonadotropin receptors in the fetal and neonatal rat testis. Endocrinology.

114:470-476.

Wen Q, Liu Y, Gao F. 2011. Fate determination of fetal Leydig cells. Frontiers in

Biology. 6(1):12-18.

12

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Rembang, Jawa Tengah pada tanggal 13 Maret 1994.

Penulis merupakan anak pertama dari dua bersaudara. Penulis memulai pendidikan

di SD Negeri Sendangcoyo 1 pada tahun 2000 dan lulus pada tahun 2006.

Kemudian penulis melanjutkan pendidikan ke SMPN 1 Lasem dan lulus pada tahun

2009. Pada tahun yang sama penulis melanjutkan pendidikan ke SMAN 1 Lasem

dan lulus pada tahun 2012. Pada tahun 2012, penulis melanjutkan pendidikan ke

perguruan tinggi Institut Pertanian Bogor melalui jalur SNMPTN undangan dan

diterima di Fakultas Kedokteran Hewan.

Selama menempuh pendidikan S1 di Fakultas Kedokteran Hewan penulis

mengikuti kegiatan kemahasiswaan seperti Himpro Hewan Kesayangan Satwa

Akuatik (HKSA), Organisasi Mahasiswa Daerah Himpunan Keluarga Rembang di

Bogor (HKRB) dan kegiatan non kampus di Lembaga Bimbingan Belajar Privat

Al-Fattah (Bimbel AF). Penulis aktif di Divisi Kuda Himpro HKSA pada masa

bakti 2013/2014 dan 2014/2015. Penulis membantu dan menyelenggarakan

program-program tahunan Divisi Kuda HKSA. Penulis aktif mengikuti kegiatan

organisasi mahasiswa daerah HKRB sebagai ketua panitia untuk sosialisasi IPB di

Rembang tahun 2013 dan mengadakan canvassing sebagai anggota formatur acara.

Penulis aktif sebagai pengajar di Bimbel AF tahun 2012 sampai sekarang dan

sebagai Tim Menejemen Bimbel periode 2014/2015.