REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA LA UNIVERSIDAD DEL ZULIA DIVISIÓN DE ESTUDIOS PARA GRADUADOS FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS MAESTRÍA EN MICROBIOLOGÍA DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR DE PACIENTES CON SOSPECHA CLÍNICA DE BORRELIOSIS DE LYME Trabajo presentado para optar al grado de Magister Scientiarum en Microbiología Autor: Fabiola M. Espinoza L. Tutor: Dr. Francisco Arocha Cotutor: Dr. Manzur Hassanhi MARACAIBO, Junio 2006
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REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA LA UNIVERSIDAD DEL ZULIA
DIVISIÓN DE ESTUDIOS PARA GRADUADOS FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS
MAESTRÍA EN MICROBIOLOGÍA
DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y MOLECULAR DE PACIENTES CON SOSPECHA CLÍNICA DE BORRELIOSIS DE LYME
Trabajo presentado para optar al grado de Magister Scientiarum en Microbiología
Autor: Fabiola M. Espinoza L.
Tutor: Dr. Francisco Arocha
Cotutor: Dr. Manzur Hassanhi
MARACAIBO, Junio 2006
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“Diagnóstico serológico y molecular de pacientes con sospecha clínica de Borreliosis de Lyme”
________________________ MC. Fabiola M. Espinoza L. C.I. 12.591.464 Dirección: Av. 4A c/c 65. Residencias Jackie. Apart. 6B. Teléfonos: 0261-7929652; 0414-6142916 Correo electrónico: [email protected] Autor _____________________ Dr. Francisco J. Arocha S. C.I. 7.709.263 Tutor ____________________ Dr. Manzur Hassanhi C.I. 7.610.407 Co-tutor
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VEREDICTO
Este jurado aprueba el trabajo de grado titulado “Diagnóstico serológico y molecular de pacientes con sospecha clínica de Borreliosis de Lyme”, presentado por la Médica Cirujana Fabiola Espinoza, C.I. 12.591.464, ante la División de Estudios para Graduados de la Facultad Experimental de Ciencias para optar al grado de Magíster Scientiarum en Microbiología Maracaibo, 29 de Junio de 2006 _____________________ Dr. Francisco J. Arocha S. C.I. 7.709.263 Tutor ___________________ Dr. Manzur Hassanhi C.I. 7.610.407 Co-tutor El Jurado ________________ _______________ Prof.: Prof.: C.I. C.I.: Miembro del Jurado Miembro del Jurado ________________
Prof.: C.I. Miembro del Jurado
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AGRADECIMIENTO
A los doctores Manzur Hassanhi, Francisco Arocha y Maricela Urbina por sus valiosos
aportes en el desarrollo de esta investigación.
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ÍNDICE DE CONTENIDO
Resumen
Abstract
Introducción 9
Objetivos 16
Objetivo General 16
Objetivos Específicos 16
Sistema de hipótesis y variables 17
Materiales y métodos 19
Tipo de investigación 19
Población de estudio y muestras 19
Técnicas y procedimientos 20
Entrevista personal 20
Obtención de las muestras 20
Pruebas diagnósticas 21
ELISA 21
Western Blot 23
Reacción en Cadena de la Polimerasa 26
Método de análisis estadístico 29
Resultados 30
Discusión 33
Conclusiones 38
Recomendaciones 39
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Lista de Tablas 40
Lista de Figuras 41
Índice de Referencias 42
Anexo 1
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Espinoza-León, Fabiola: “Diagnóstico serológico y molecular de pacientes con sospecha clínica de Borreliosis de Lyme”. Trabajo de grado presentado ante la División de Estudios para Graduados de la Facultad Experimental de Ciencias para optar al grado de Magíster Scientiarum en Microbiología. La Universidad del Zulia. Maracaibo-Venezuela. 2006. 46 p.
RESUMEN
La Borreliosis de Lyme es una enfermedad infecciosa causada por Borrelia burgdorferi y transmitida al humano por la picadura de garrapatas del género Ixodes. En 1994 se realizó en el Estado Zulia un estudio que detectó anticuerpos contra dicha bacteria en 29,7% de los pacientes analizados. Sin embargo, no hubo confirmación de los casos positivos mediante técnicas que proporcionan evidencia definitiva de la infección. El objetivo de esta investigación fue estudiar la presencia de infección por B. burgdorferi en suero de 30 sujetos con clínica sugestiva de la patología y 30 controles sanos, mediante las técnicas ELISA y Western Blot y en biopsias de piel de pacientes con morfea mediante el ensayo nested PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) usando primers específicos para el gen de la flagelina. Se encontraron cuatro muestras positivas (7%) de las 60 estudiadas; de éstas, tres (5%) correspondieron a pacientes sintomáticos y una (2%) a un sujeto sano. Todas las muestras ELISA positivas fueron negativas en la prueba IgG Western Blot. El ensayo nested PCR de las biopsias de piel no mostró amplificación de las secuencias seleccionadas del gen de la flagelina. Los datos obtenidos no soportan la evidencia de infección por B. burgdorferi en los pacientes estudiados, pero tampoco excluyen la posibilidad de la existencia de una genoespecie distinta de B. burgdorferi sensu stricto, de una especie de borrelia diferente del complejo B. burgdorferi sensu lato o de otro organismo espiroquetal, como el agente causal de Borreliosis de Lyme en la región. Palabras Clave: Borreliosis de Lyme, Borrelia burgdorferi, ELISA, Western Blot, PCR. Correo electrónico: [email protected]
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Espinoza-León, Fabiola: “Serological and molecular diagnosis of patients with clinical manifestations associated with Lyme disease”. Trabajo de grado presentado ante la División de Estudios para Graduados de la Facultad Experimental de Ciencias para optar al grado de Magíster Scientiarum en Microbiología. La Universidad del Zulia. Maracaibo-Venezuela. 2006. 46 p.
ABSTRACT
Lyme disease is an infectious disease caused by the tick-borne spirochete Borrelia burgdorferi. In 1994 it was conducted a research in Zulia State that detected antibacterial antibodies in 29.7% of the studied population. However, none of the positive results were confirmed by other techniques. The aim of this research was to study Borrelia burgdorferi infection in sera of 30 patients with clinical manifestations associated with the disease and 30 healthy controls, using ELISA and Western Blot and in skin biopsies of morphea patients using nested PCR (Polymerase Chain Reaction), with a primer set specific for the bacterial flagellin gene. Four serum samples (7%) were ELISA positive: three (5%) from symptomatic patients and one (2%) from a healthy control. All ELISA positive samples were negative by IgG Western Blot. Nested PCR did not show amplification of bacterial DNA in the skin samples. Our data do not support evidence of infection by B. burgdorferi in the studied patients, but do not rule out the possibility of the existence of an unknown geno-specie of B. burgdorferi sensu lato complex, a different Borrelia specie or a different spirochetal organism, as the etiological agents of Lyme Borreliosis in the area. Key words: Lyme Borreliosis, Borrelia burgdorferi, ELISA, Western Blot, PCR. e-mail: [email protected]
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INTRODUCCIÓN
La Borreliosis de Lyme es una enfermedad infecciosa multisistémica causada por
la bacteria Borrelia burgdorferi y transmitida al humano por la picadura de garrapatas
del género Ixodes. Los primeros reportes de la enfermedad fueron publicados en
Europa, a finales del siglo XIX, pero no es hasta 1975 cuando todas estas tempranas
descripciones cobran importancia, a partir de la epidemia de artritis ocurrida en Lyme,
Connecticut, USA, de donde toma el nombre de enfermedad de Lyme, el cual es luego
cambiado por Borreliosis de Lyme, a partir del aislamiento de la bacteria Borrelia
burgdorferi por William Burgdorfer, en 1982 (Nocton y Steere, 1995; Dickison y Battle,
2000).
A pesar de que ésta patología ocurre en todo el mundo, la incidencia real y la
distribución es todavía incierta, ya que la mayoría de los reportes provienen de países
desarrollados (Wang y col., 1999; Dickison y Battle, 2000). Sólo en ellos se ha aislado
el agente etiológico a partir de muestras humanas, de los reservorios y de las
garrapatas. En Estados Unidos y en Europa, representa la infección transmitida por la
picadura de artrópodos más frecuente. China, Japón, Australia, África y Sudamérica
también la reportan (Wang y col., 1999). La enfermedad es más frecuente en
poblaciones cercanas a áreas boscosas, en donde la transmisión a humanos sigue
un ciclo estacional que aumenta en primavera, verano e inicio de otoño (Nocton y
Steere, 1995).
Desde su aislamiento inicial en 1982, se han identificado cientos de cepas de
Borrelia burgdorferi. Los análisis moleculares de dichas cepas indican la existencia de
diferencias genéticas y fenotípicas entre las mismas. Por esta razón se definió un grupo
o complejo que comprende las distintas especies o grupos genómicos de Borrelia
asociados con la Borreliosis de Lyme, el cual ha sido denominado complejo Borrelia
burgdorferi sensu lato. Dentro de ese complejo existen 10 especies, de las cuales hasta
la fecha, solo tres se consideran patógenas para los humanos: B. burgdorferi sensu
stricto, B. garinii, B. afzelii (Wang y col., 1999).
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Borrelia burgdorferi sensu lato, pertenece a la familia Spirochaetaceae, género
Borrelia. Es una bacteria gram negativa, microaerofílica, móvil, en forma de espiral, con
7 a 11 flagelos periplásmicos y un tamaño de 10 a 30 μm de longitud y 0.2 a 0.5 μm de
ancho. La cepa B. burgdorferi senso stricto B31, una de las más estudiadas, tiene un
cromosoma lineal de 910.725 pb y 21 plásmidos (nueve circulares superenrollados y 12
lineales). Uno de los plásmidos lineales, de 49 Kb, codifica dos de las principales
proteínas de superficie de la espiroqueta, Osp A y Osp B (Nocton y Steere, 1995; Wang
y col., 1999).
Las distintas especies de Borrelia están distribuidas en diferentes áreas
geográficas; B. sensu stricto se distribuye en Norteamérica y Europa Occidental,
B. afzelii se encuentra en Europa Occidental y Central y en Rusia y B. garinii se localiza
en Europa, Rusia y Norte de Asia (Reed, 2002).
Diversos estudios demuestran que las manifestaciones clínicas de la enfermedad
pueden variar de acuerdo a la genoespecie infectante de B. burgdorferi sensu lato: en
pacientes con artritis, las cepas más comúnmente aisladas pertenecen a B. burgdorferi
sensu stricto; mientras que B. garinii está más involucrada en casos donde predominan
las manifestaciones neurológicas y las cepas de B. afzelii son más prevalentes en las
formas cutáneas de la enfermedad, como son el eritema migrans (EM) y la
acrodermatitis crónica atrófica (ACA) (Balmetti y Pifferetti, 1995).
Por otra parte, las manifestaciones clínicas varían entre los pacientes de
Norteamérica y los de Europa y Asia. Por ejemplo, la encefalomielitis severa y la ACA
son más comunes en Europa, en contraste con la artritis que es más frecuente en
Norteamérica. Este hecho es explicado, en parte, por las diferentes genoespecies de
Borrelia responsables de la enfermedad en las distintas regiones geográficas que
pueden tener distintos tropismos tisulares y posiblemente por diferencias genéticas
entre las poblaciones afectadas (Wang y col., 1999; Reed, 2002).
11
Las garrapatas del género Ixodes son los vectores o transmisores de la
enfermedad; se han descrito diferentes especies transmisoras: Ixodes ricinus en
Europa; Ixodes persulcatus en Asia y en el este de Europa; Ixodes pacificus e Ixodes
scapularis (antes llamado Ixodes dammini) en Norteamérica (Nocton y Steere, 1995).
Los vectores no son estrictamente especie-específicos. I. ricinus es vector de B.
burgdorferi sensu stricto, B. afzelli y B. garinii, mientras que I. scapularis e I. pacificus
son vectores de B. burgdorferi sensu stricto en Norteamérica (Wang y col., 1999). En
Venezuela se han encontrado garrapatas del género Ixodes: Ixodes iatrellei, Ixodes
ioricatus e Ixodes venezuelensis, que pudieran representar vectores potenciales de la
enfermedad (Arocha y col., 1994).
La Borreliosis de Lyme es una enfermedad infecciosa compleja, que
ataca piel, articulaciones, corazón y sistema nervioso. Las manifestaciones clínicas son
variadas y solapadas, debido a la múltiple afectación de órganos en las diferentes
etapas, simulando enfermedades infecciosas y no infecciosas (Dickison y Battle, 2000).
Siguiendo a la picadura de la garrapata y a un período de incubación de cinco a seis
días, se reconocen tres etapas clínicas: temprana localizada, temprana diseminada y
tardía. La etapa temprana localizada se extiende desde la picadura del vector hasta las
tres o cuatro semanas. En el 60 a 80% de los pacientes aparece la lesión cutánea
inicial denominada EM, en el sitio de la picadura. Comienza como una mácula o pápula
eritematosa que se expande gradualmente para formar una extensa lesión anular, con
un tamaño promedio de 5 cm, con el borde rojo brillante y el centro claro, y se
acompaña de síntomas parecidos a los de un síndrome viral autolimitado, como son
fiebre, malestar general, fatiga, cefalea y linfadenopatías (Nocton y Steere, 1995; CDC,
1997).
La segunda etapa, temprana diseminada, ocurre uno a tres meses después de la
picadura. En ella ocurre diseminación hematógena de las espiroquetas y se caracteriza
por: manifestaciones musculoesqueléticas en 50% de los pacientes (artralgias
migratorias recurrentes, mialgias, dolores óseos); manifestaciones neurológicas en
15 a 20% de los casos (meningitis linfocítica, neuritis craneal, particularmente parálisis
facial, que puede ser bilateral y radiculoneuropatías motoras, sensitivas o mixtas),
12
manifestaciones cutáneas en la mitad de los pacientes (lesiones anulares
secundarias, urticaria, eritema difuso); manifestaciones cardíacas en 4 a 8 % de los
casos (bloqueos A-V de II o III grado que se resuelven en días o semanas y suelen ir
acompañados de miocarditis) y manifestaciones oculares (iritis, vasculitis retinal,
oclusión de las arterias de la retina, neuritis óptica) (Nocton y Steere, 1995; CDC, 1997).
La etapa tardía o crónica, aparece un año después de la picadura. Ocurren
enfermedades autoinmunes (lupus eritematoso sistémico) y enfermedades virales (virus
Epstein-Barr) (Blaauw y col., 1999; Brown y col., 1999). En este sentido Rose y col.
estudiaron pacientes con resultados discordantes en las pruebas ELISA y Western Blot,
encontrando que el 91% de los individuos que presentaban ELISA positivo y Western
blot negativo tenían otra patología de tipo reumática o inflamatoria, diferente de
Borreliosis de Lyme.
La posibilidad antes mencionada fue descartada en esta investigación, puesto
que ninguno de los sujetos positivos presentó manifestaciones clínicas o hallazgos de
laboratorio sugerentes de cualquiera de las patologías ya nombradas y de otras que
frecuentemente necesitan ser diferenciadas de Borreliosis de Lyme, como esclerosis
múltiple y el síndrome de Guillain-Barré. Además, el inmunoensayo enzimático usado
en este estudio, elaborado con el péptido sintético C6, derivado de una región
inmunodominante conservada de la proteína bacteriana VlsE, se considera altamente
específico. Es capaz de discriminar entre Borreliosis de Lyme e infecciones por otras
espiroquetas (T. pallidum) u otras borrelias (B. hermsii, B. recurrentis), así como
enfermedades autoinmunes, infecciones por micobacterias, esclerosis múltiple y el
síndrome de Guillain-Barré (Ting y col., 1999).
A pesar de que según las recomendaciones del CDC/ASTPHLD, la obtención de
un resultado negativo en la prueba confirmatoria indica que no hay evidencia serológica
de infección por B. burgdorferi por el momento (CDC, 1995), existen estudios como el
realizado por Dattwyler y col., que demuestran la presencia de una respuesta
proliferativa vigorosa de células T frente a la bacteria en pacientes sin niveles
diagnósticos de anticuerpos en las pruebas ELISA, IFA o Western blot. Por esta razón
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concluyen que no se puede descartar la Borreliosis de Lyme crónica por la sola
ausencia de anticuerpos contra la espiroqueta.
Una investigación similar conducida por Buechner y col., para estudiar la
respuesta linfoproliferativa frente a B. burgdorferi en pacientes con manifestaciones
cutáneas de la enfermedad, mostró una respuesta linfoproliferativa elevada en 45
pacientes con morfea, 32 de los cuales no tenían anticuerpos detectables mediante IFA,
por lo que concluyen que el ensayo de proliferación de linfocitos tiene valor diagnóstico
en pacientes con una fuerte sospecha clínica de Borreliosis de Lyme, pero sin niveles
diagnósticos de anticuerpos antibacterianos.
Wang y Hilton en un intento por explicar la razón de la seronegatividad en
individuos con sospecha de la enfermedad, investigaron las diferencias entre los alelos
HLA (antígenos leucocitarios humanos) de clase II en pacientes seropositivos y
seronegativos para Borreliosis de Lyme, encontrando que HLA-DR7 estaba asociado a
la producción de anticuerpos contra la espiroqueta y presente en sujetos seropositivos,
mientras que HLA-DR1, presente en sujetos seronegativos, no se asociaba a la
producción de anticuerpos antibacterianos. Ellos concluyen que la presencia o ausencia
de anticuerpos frente a B. burgdorferi pueden estar asociada a tipos específicos de
antígenos HLA de clase II. Sería interesante realizar un estudio similar en los pacientes
seronegativos de la localidad que tienen manifestaciones asociadas a la enfermedad.
Otros estudios que intentan explicar la razón de la seronegatividad en individuos
con clínica de Borreliosis de Lyme, señalan que puede ser debida al secuestro de los
anticuerpos en complejos inmunes con los antígenos que inicialmente desencadenaron
su producción. La disociación de estos complejos libera principalmente anticuerpos
reactivos para el antígeno 41 kD y en ocasiones para un antígeno aproximado al 30 Kd
(Schutzer y col., 1990; Brunner, 2001)
Según un estudio llevado a cabo por Tugwell y col., antes de realizar pruebas de
detección de anticuerpos contra B. burgdorferi se debe valorar la probabilidad pretest
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para la enfermedad. Si los síntomas y signos no son específicos de la patología y se
procede de un área de baja endemicidad, la probabilidad pretest es baja (<0.20). En
este caso, las pruebas serológicas arrojarán más resultados falsos positivos, que
verdaderos positivos (Tugwell y col., 1997; American Collegue of Physicians, 1997).
Hasta tanto no se lleven a cabo estudios de seroprevalencia en la región, con una
población representativa, no es posible considerar el planteamiento anterior.
Por otro lado, algunos autores expresan que en ausencia de síntomas y signos
clínicos típicos, las pruebas de detección de anticuerpos para B. burgdorferi tienen un
valor limitado (Blaauw y col., 1999). En los pacientes con clínica fuertemente sugestiva
de la enfermedad (EM, ACA, artritis crónica) es más probable que la serología sea
positiva, en particular si están en la etapa tardía, como los incluidos en este estudio. Por
el contrario en aquellos con manifestaciones que no están claramente asociadas a la
infección, la interpretación de los resultados debe ser cautelosa (Brown y col., 1999).
Este es el caso de la asociación entre morfea y Borreliosis de Lyme, la cual permanece
sin aclarar.
Desde que la relación entre B. burgdorferi y morfea fue sugerida por primera vez
en 1985 por Aberer y col., muchas investigaciones han sido conducidas para establecer
una posible asociación entre ambas patologías. Algunos estudios, la mayoría europeos,
usando diferentes técnicas como inmunohistoquímica (Aberer y Stanek, 1987), cultivo
(Aberer y col., 1987; Weber y col., 1988; Breier y col., 1999), serología (Aberer y col.,
1987; Aberer y col., 1991; Nakashima y col, 1999; Wojas-Pelc y col., 2002) y reacción
en cadena de la polimerasa (Schempp y col., 1993; Ozkan y col., 2000) han
demostrado dicha asociación. Por el contrario, los estudios realizados en Norteamérica
han fallado en ese propósito (Dillon y col., 1995; De Vito y col., 1996; Fujiwara y col.,
1997).
La asociación entre las diferentes manifestaciones clínicas de Borreliosis de
Lyme y las distintas genoespecies de B. burgdorferi puede parcialmente explicar estos
resultados controversiales. Balmetti y Pifferetti reportaron asociación entre síntomas
cutáneos (EM, ACA) y la genoespecie B. afzelii. Fujiwara y col., detectaron B. afzelii y
37
B. garinii (genoespecies Europeas), pero no B. burgdorferi sensu stricto, en biopsias de
pacientes de Alemania y Japón con morfea, usando reacción en cadena de la
polimerasa. Es importante señalar que la genoespecie predominante en Norteamérica,
B. burgdorferi sensu stricto, no ha sido relacionada hasta la fecha, con manifestaciones
cutáneas de la enfermedad (Schmidt, 1997).
En el estudio realizado previamente en la región por Arocha-Sandoval y col., el
54,5% de las muestras positivas mediante ELISA (elaborado con la cepa B31 de
B. burgdorferi), correspondió a individuos con morfea, mientras que en la presente
investigación, dos de las tres muestras ELISA positivas también correspondieron a
sujetos con morfea.
Los resultados negativos en el ensayo IgG WB de este estudio, la falta de
confirmación mediante inmunoblot de los resultados previamente detectados en el
Estado y la ausencia de amplificación del ADN bacteriano en las biopsias de piel de
pacientes con morfea, nos llevan a considerar la posibilidad de que los resultados
obtenidos por el grupo de Arocha-Sandoval sean falsos positivos, debidos a reactividad
cruzada.
Los datos obtenidos en este estudio no soportan la evidencia de infección por B.
burgdorferi en los pacientes estudiados, pero tampoco excluyen la posibilidad de la
existencia de una genoespecie distinta de B. burgdorferi sensu stricto, de una especie
de borrelia diferente del complejo B. burgdorferi sensu lato o de otro organismo
espiroquetal, como el agente causal de Borreliosis de Lyme en Sudamérica. Un estudio
realizado en Colombia reportó reactividad parcial en el suero de pacientes con sífilis y
escleroderma localizada, aportando evidencia de una posible asociación entre las
lesiones escleróticas y un organismo espiroquetal (Palacios y col., 2003).
También es importante señalar que la población de pacientes estudiada fue
pequeña, resultando pertinente llevar a cabo otro estudio con una mayor población,
para obtener conclusiones definitivas.
38
CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio no soportan la evidencia de infección
por B. burgdorferi en los pacientes estudiados, pero tampoco excluyen la posibilidad de
la existencia de una genoespecie distinta de B. burgdorferi sensu stricto, de una
especie de borrelia diferente del complejo B. burgdorferi sensu lato o de otro organismo
espiroquetal, como el agente causal de Borreliosis de Lyme en la localidad.
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RECOMENDACIONES
En vista de que los resultados obtenidos en la presente investigación no permiten
descartar definitivamente la presencia de la infección por B. burgdorferi, se recomienda
la realización de nuevos estudios dirigidos a la documentación de la infección en las
garrapatas consideradas vectores potenciales de la enfermedad en la región. Así
mismo, sería ideal llevar a cabo un estudio para intentar aislar la espiroqueta mediante
cultivo bacteriano de muestras humanas y si éste es positivo, realizar posteriormente la
extracción de un antígeno bacteriano que se utilizaría para la elaboración de un nuevo
ensayo ELISA. Finalmente se recomienda la realización de estudios para evaluar la
respuesta inmunitaria celular frente a la bacteria en pacientes con sospecha de la
enfermedad.
40
LISTA DE TABLAS
1 Relación entre la positividad de la prueba ELISA y las entidades clínicas sugestivas de Borreliosis de Lyme.
31
2 IgG Western Blot de las muestras estudiadas 32
41
42
LISTA DE FIGURAS
1 Secuencia del gen de la flagelina de la cepa B31 de B. burgdorferi.
27
2 Electroforesis en gel de agarosa de ADN de piel de pacientes con escleroderma localizada (morfea)
32
3 Electroforesis en gel de agarosa de ADN de piel de pacientes con escleroderma localizada (morfea)
32
43
ÍNDICE DE REFERENCIAS
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