La regolazione dell’espressione genica Quali sono i meccanismi che determinano l’accensione o lo spegnimento dell’espressione di un gene?
La regolazione dell’espressione genica
Quali sono i meccanismi che determinano l’accensione o lo spegnimento dell’espressione
di un gene?
La regolazione dell’espressione genica
• Nei procarioti: – un’espressione genica selettiva permette alle
cellule di risparmiare energia– La regolazione avviene prevalentemente a
livello trascrizionale
• Negli eucarioti: – l’espressione genica selettiva permette alle
cellule di svolgere ruoli specializzati– La regolazione avviene a vari livelli
Regolazione genica nei procarioti
• Geni costitutivi: sono costantemente attivi (es. geni che codificano per gli enzimi della glicolisi)
• Geni regolati: la loro espressione è regolata in modo tale che che la quantità del corrispondente prodotto (proteina o RNA) è controllata in relazione al fabbisogno cellulare (es. sintesi adattativa di enzimi)
NON TUTTI I GENI VENGONO UTILIZZATI NELLO STESSO MOMENTO E NON TUTTI CON LA STESSA “INTENSITÀ”
Regolazione genica = la modalità con cui viene REGOLATA la tipologia e la quantità dei prodotti genici
Prodotto genico = RNA e/o proteina (in ultima analisi)
Regolazione Genica nei Procarioti
Finalità:Rispondere rapidamente ai cambiamenti ambientali
Logica:Risparmiare energia; niente mRNA o proteine che non
servano subito
Base fisiologica:la maggior parte dei geni è espressa costitutivamentepochi geni sono regolati, ognuno con il suo meccanismo
individuale, di induzione o di repressione
I geni strutturali dei batteri sono organizzati in“cluster” : gruppi di geni codificanti per proteinecon funzioni correlate, (es. enzimi di una stessavia metabolica, proteine deputate al trasportointracellulare ecc), che si trovano sotto il dominiodi un unico promotore.
OPERONE
• Geni strutturali: codificano per le proteine di interesse
• Operatore: Sito sul DNA riconosciuto dalla proteina repressore
• Promotore: Sito sul DNA cui si lega l’RNA polimerasi per iniziare la trascrizione dei geni situati a valle
Unità di trascrizione descritta nel 1961 da François Jacob e Jacques Monod, che per questo furono insigniti del premio Nobel.
L’unità completa include:
Promotore Gene 1 Gene 2 Gene 3Operatore
Sono sequenze di DNA
RepressoreRNA
polimerasi
Sono proteine
La capacità dell’RNA polimerasi di iniziare la trascrizione dipende dall’assenza di impedimenti a livello del promotore; possono essere presenti dei repressori che impediscono l’inizio della trascrizione.
Si parla di regolazione negativa
Promotore Gene 1 Gene 2 Gene 3Operatore
Repressore
Il repressore inattivo non si lega all’operatore. La RNA polimerasi può eseguire la trascrizione.
Proteina 3Proteina 2
Proteina 1
N.B.: il sito operatore non viene trascritto e non codifica per nessuna proteina
Promotore Gene 1 Gene 2 Gene 3Operatore
Il repressore attivo si lega all’operatore. La RNA polimerasi NON può eseguire la trascrizione.
Da dove viene il repressore ?
• La trascrizione dei geni strutturali è spesso controllata dall’attività di un altro gene, detto REGOLATORE
• Il gene regolatore codifica per la proteina repressore, che si lega in maniera specifica all’operatore di un operone
• Il gene regolatore può trovarsi in qualsiasi punto del DNA batterico, non necessariamente adiacente all’operone
Facciamo un esempio: Escherichia Coli
Per trasformare l’ALLOLATTOSIO in glucosio da utilizzare come fonte di energia sono necessari tre enzimi, codificati da tre geni appartenenti allo stesso operone (lac)
Per sintetizzare il TRIPTOFANO servono cinque enzimi, codificati da cinque geni appartenenti allo stesso operone (trp)
I batteri utilizzano strategie diverse per regolare la sintesi degli enzimi
• Vie catabolichee induzione da substrato
• Vie anabolichee repressione da prodotto finale
Gli enzimi che catalizzano queste vie sono spesso regolati in modo coordinato: la sintesi di tutti gli enzimi coinvolti in una particolare via viene attivata o repressa simultaneamente
Operone lac:
Si tratta di una VIA CATABOLICA, normalmente inattiva (non espressa), che viene attivata (INDOTTA) dalla presenza della molecola da degradare (il lattosio)Induttore
Repressore inattivo
OPERONE TRP:
Si tratta di una VIA ANABOLICA, normalmente attiva (espressa), che viene inattivata o REPRESSA dalla presenza della molecola (il triptofano) che si forma per effetto delle attività enzimatiche.
Repressore inattivo
Corepressore + repressore
Effettore
E’ una molecola che si lega in maniera specifica al repressore.
Questo legame può rendere attivoo inattivoil repressore.
In base all’effetto che il complesso EFFETTORE-REPRESSORE produce
sulla trascrizione si possono distinguere:
• geni inducibili
• geni reprimibili
Caratteristiche comuni ai due processi
1. Il controllo è effettuato a livello genomico
2. Il controllo viene indotto da piccole molecole (effettori) che modificano la conformazione di molecole che controllano l’espressione genicaPer le vie cataboliche i substrati (lattosio)
Per le vie anaboliche i prodotti finali (triptofano)
I geni coinvolti nel catabolismo del lattosio sono organizzati in un operone inducibile
La delezione del gene lac I origina cellule che producono sempre le tre proteine indipendentemente dalla presenza dell’induttore
Lac I codifica per un repressore
Gli operoni lac e trp spiegano il controllo negativo della trascrizione
• Per le vie cataboliche la forma attiva del repressore (che si lega al DNA) è rappresentata dalla proteina repressore libera dall’effettore
• Per le vie anaboliche la forma attiva è quella della proteina repressore legata all’effettore che in questo caso può definirsi corepressore
In entrambi i casi il risultato è lo stesso: il repressore attivo previene la trascrizione dell’operone bloccando il legame della RNA polimerasi al DNA
Il repressore lac si lega ai due operatori come tetramero
• L’ansa si forma tra le repressore legato all'operatore principale e quello a monte, ausiliario a 90 bp . Un'ansa del tutto simile si può formare in alternativa con un operatore a valle, a 400 bp
Operone del triptofano
• l'operone triptofano di E.colicodifica per il leader e per geni strutturali che codificano gli enzimi trp
La attenuazione• Anche con basso Trp molti tradotti terminano
prematuramente, prima del gene trpE. Solo la sequenza leader viene tradotta. Essa è seguita da un terminatore
• Ci sono 4 sequenze complementari nel mRNA 1, 2, 3 e 4. Esse si possono appaiare diversamente
• L’RNA ha una ORF di 14 amino acidi, con una forte RBS e che codifica per 2 trp.
In condizioni di elevata concentrazione di triptofano la sequenza 3 si appaia con la sequenza 4 costituendo la hairpin di terminazione della traduzione .
In condizioni di bassa concentrazione di triptofano il ribosoma si blocca sugli adiacenti codoni per il triptofano permettendo alla sequenza 2 di appaiarsi con la 3 e quindi impedendo la formazione della forcine di terminazione 3 e 4. Quindi la traduzione può continuare
In assenza di sintesi proteica poiché il ribosoma non inizia la traduzione della AUG del peptide leader si forma una forcina appaiando le sequenze 1 e 2 e quindi non si forma quella data dalle sequenze 2 e 3 ne consegue che si forma una forcina con le sequenza 3 4 e gli enzimi per trp non sono espressi
Differenze della regolazione genica fra procarioti ed eucarioti
• Dimensione e complessità del genoma
• Compartimentazione del genoma
• Organizzazione strutturale del genoma
• Stabilità dell’mRNA
• Modificazione post-traduzionale delle proteine
• Turnover delle proteine
• Le cellule eucariotiche sono prive di operoni!
•Regolazione trascrizionale
•Regolazione post-trascrizionale
•Meccanismi epigenetici e controllo dell’espressione genica a lunga distanza
I meccanismi di controllo usati per regolarel’espressione dei geni umani devono esseremolto più complessi da quelli utilizzati daglialtri organismi.
Cellula umana contiene circa 30000 geni
RNA genes
Geni per proteine
Ogni cellula in un determinato momento esprime solo una piccola partedi questo potenziale (˜ 5000 geni)
Geni housekeeping Geni tessuto - specificimetabolismobiosintesimembranaistoniribosomali DIFFERENZIAMENTO
CELLULARE
A QUESTA ESPRESSIONE SELETTIVA NON CORRISPONDE (IN GENERE)UNA VARIAZIONE DEL CONTENUTO DI DNA
NUCLEO
controllo trascrizionale: legame di fattori trascrizionali tessuto specifici, legame diretto di ormoni, fattori di crescita o elementi intermedi a elementi risponsivi di geni inducibili
controllo post-trascrizionale: splicing alternativo, polyA alternativo, RNA editing tessuto-specifico
controllo del trasporto
mRNA
controllo della stabilità
degradazionetraduzione
PROTEINA
controllo post-traduzionale
PROTEINA attiva o inattiva
DNA Meccanismi epigenetici: controllo a lungo raggio mediante rimodellamento della struttura della cromatina
Trascritto primario(precursore)
mRNA
controllo traduzionale
CITOPLASMA
Esistono molteplici livelli di regolazione dell’espressione genica negli eucarioti
•EUCROMATINA -> TRASCRIZIONE POTENZIALE
a) geni housekeeping
b) geni tessuto-specifici
•ETEROCROMATINA FACOLTATIVA -> inattiva quando condensata.
Fornisce un meccanismo di compensazione:
rapporto geni autosomici/geni X-linked
maschi = 2/1 donne = 1/1
•ETEROCROMATINA COSTITUTIVA ->
sempre inattiva; Localizzata nelle regioni
peri - e centromeriche
CROMATINA
Meccanismi epigenetici
Fattori che vengono trasmessi alla progenie, ma che nonsono direttamente attribuibili alla sequenza del DNA.
•Metilazione del DNA;
Nelle cellule eucariotiche la metilazione è a carico della C.Solo il 3% delle C sono metilate ed in genere è bersagliodella metilazione la C della doppietta CpG.
•Modificazioni degli istoni;
Acetilazioni, fosforilazioni e metilazioni, responsabili dicambiamenti conformazionali della cromatina.
Modificazioni epigenetiche:
• Modificazioni ereditabili che non alterano la sequenza nucleotidica dei geni ma ne alterano l’attivita’:
– Acetilazione degli istoni della cromatina
– Metilazione del DNA
Meccanismi epigenetici: Metilazione del DNA
La metilazione del DNA è un processo post-replicativo. L’estensione delle modificazioniriguardanti la metilazione del DNA è fondamentalmente decisa durante lo sviluppo. Lametilazione del DNA è quindi uno dei meccanismi correlati con il differenziamento cellulare,tramite l’inibizione dell’espressione genica a livello trascrizionale.
Le principali funzioni della metilazione sono collegate alla repressione della trascrizione:
• Difesa contro i trasposoni: la metilazione e’ fondamentale per mantenere silenti i genomi dei trasposoni e dei retrotrasposoni
• Regolazione genica:la metilazione contribuisce a stabilire e mantenere uno stato trascrizionalmente inattivo (eterocromatina)
Metilazione e regolazione genica:• Dnmt metilano il DNA• Il DNA metilato è legato da proteine che legano il
metile(MeCP2, MBD1-4)
• Queste a loro volta sono in grado di reclutare diversi HDAC -> repressione della trascrizione
Modificazioni degli istoni H3 e H4
La lisina 9 di H3 può essere sia acetilata che metilata. L’acetilazione è associata alla cromatina trascrizionalmente attiva, ma se la regione cromatinica viene metilata a livello del DNA (CpG), le proteine che si legano al DNA metilato richiamano le deacetilasi istoniche, che rimuovono i gruppi acetile e le metil transferasi istoniche, legate alle CpG binding protein, metilano gli istoni. Il risultato è la condensazione della cromatina.
Caratteristica Cromatina
attiva
Cromatina
inattiva
Conformazione
della cromatina
Estesa, aperta Condensata
Metilazione del
DNA
Poco metilata
specialmente
nelle regioni
del promotore
Metilata
Acetilazione
degli istoni
Istoni acetilati Istoni non
acetilati
CARATTERISTICHE DELLA CROMATINA
Repressori e attivatori possono dirigere la deacetilazione/acetilazione degli istoni a
livello di specifici geni
Importanza della struttura modularee delle interazioni proteina-proteina
Elementi distali Elementi prossimali
Promotore basale
• Una serie di fattori trascrizionali deve legarsi al promotore prima che possa farlo la RNA polimerasi. Quindi se la RNA polimerasi potràiniziare la trascrizione dipenderà anche dal legamedi proteine regolatorie, attivatori e repressori.
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Micro RNA (miRNA)
• Piccole molecole di RNA (20-22 nt)
• Prodotte da precursori di 90-100 nt trascritti autonomamente (anche policistronici) o maturati da introni
• Si legano a mRNA che hanno sequenze complementari
• Presenti in tutti gli eucarioti
miRNA
• miRNA lin4 e let7 sono stati scoperti inizialmente nei nematodi
• sono conservati dai vermi fino all’uomo
• la loro funzione è il controllo della TRADUZIONE di specifici mRNA
• funzionano come MODULATORI
Biogenesi dei microRNA
I microRNA sono
molecole, dalla
lunghezza di 21-25
nucleotidi, che regolano
l’espressione dei geni a
livello post-
trascrizionale
Funzione dei miRNA
• Controllo della proliferazione cellulare
• Controllo della apoptosi
• Differenziamento ematopoietico
• Controllo dello sviluppo in piante ed animali
• Controllo della identità cellulare delle cellule staminali
Meccanismi del funzionamento di miRNA in piante
• MicroRNA portano al taglio e degradazione di mRNA
• La gran parte dei bersagli dei miRNAnelle piante codifica per proteine regolatrici suggerendo che i miRNAhanno una funzione gerarchicamente molto elevata
• miRNA coinvolti nello sviluppo e nell’identità delle cellule staminali
Mantenimento dell’identità cellulare (es. pluripotenza) �L’identità cellulare viene mantenuta silenziando mRNAs che non appartengono allo specifico repertorio della cellula
Network di miRNA che controllano specifici pathway (miR-21 regola miRNA che controllano apoptosi: disregolazione di miR-21� cancro. miRNA che controllano la via di segnale dell’insulina, diverse tipologie cellulari hanno maggiore o minore necessità di glucosio quindi il funzionamento di questo network di miRNA è regolato a seconda della tipologia cellulare)
FUNZIONI FISIOLOGICHE DEI miRNA
Tumori: pattern specifico di espressione dei miRNA che permettono didiscriminare i diversi tipi di cancro e di identificare il tessuto di originedelle metastasi
miRNA e cancro
miRNA e cancro
miRNA oncogeni: miRNA overespressi nei tumori (es. miR-155 èupregolato in tumori maligni del sistema ematopoietico, della mammella,del polmone e del pancreas, miR-380-5p reprime p53 nelneuroblastoma, antagonizzandolo con un oligonucleotide antagonistamigliora la prognosi) � blocco dei miRNA con oligonucleotidi antisenso
miRNA oncosoppressori: miRNA ridotti o mancanti nei tumori. La lorooverespressione limita la proliferazione o induce apoptosi (es. miR-15a-16-1, downregolato in cellule B di pazienti con leucemia linfociticacronica, adenomi della prostata e dell’ipofisi) � miRNA mimics ovettori virali
Strategie per terapie anti-cancro basate su miRNA:
1. Bloccare miRNA oncogeni usando oligonucleotidi antisenso
2. Costrutti Locked nucleic acid (LNA)
3. miRNA sponges
4. miR-mask
5. Small molecule inhibitors
6. Ripristinare l’espressione di miRNA oncosoppressori
7. Riprogrammare le cellule cancerogene
Benefits of the LNA technologySome of the benefits of using LNA include:Ideal for the detection of short RNA and DNA targetsIncreases the thermal stability of duplexesCapable of single nucleotide discriminationResistant to exo- and endonucleases resulting in high stability in vivo and in vitro applicationsIncreased target specificityFacilitates Tm normalizationStrand invasion properties enables detection of “hard to access” samplesCompatible with standard enzymatic processes
FUNZIONI DELL'RNA NELLA CELLULA MODERNA
→ → → → traduzione rRNA, mRNA, tRNA
→ → → → maturazione rRNA snoRNA,
→ → → → splicing snRNA, introni gruppi I e II
→ → → → maturazione tRNA RNasi P
→ → → → sintesi DNA primers, telomerasi
→ → → → traslocaz. proteine srpRNA
RNA Interference: il processo attraverso il quale un RNA a doppio filamento interferisce con l’espressione genica:sia inducendo la degradazione di RNA complementare che bloccandone la traduzione
http://www.nature.com/focus/rnai/animations/index.html
Silenziamento Post-trascrizionale (1990)Jorgensen 1990:
Introduzione di transgeni responsabili della pigmentazione della petunia per ottenere petunie più scure
�pigmentazione ridotta del 40% nelle petunie transgeniche
�ridotta espressione sia del gene endogeno che del transgene (cosoppressione)
A variegated petunia. Upon injection of the gene responsible for purple colouring in petunias, the flowers became variegated or white rather than deeper purple as was expected.
1993: Viene identificato il primo miRNA nel C. elegans
1998: Fire e Mello descrivono la presenza di RNA interference nel C. elegans
1999: il silenziamento genico nelle piante è accompagnato dall’accumulo di piccoli frammenti di RNA (20-25 Nt) complementari al gene silenziato. dsRNAs vengono ridotti a piccoli frammenti di 21-23 Nt
2001: Tuschl et al. dimostrano nella Drosophila che una piccola sequenza di RNA può interferire in modo specifico con la trascrizione
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006
"for their discovery of RNA interference - gene silencing by double-stranded RNA"
Andrew Z. Fire Craig C. MelloStanford University University
of Massachusetts b. 1959 b. 1960
Small RNAs
miRNA siRNA
Prodotti in modo endogeno
Funzione: regolazione dell’espressione genica
sopprimendo la traduzione o la trascrizione di geni target
Exo-siRNA:Introdotti in modo esogeno (virus a dsRNA,
transposoni, transgeni)
Endo-siRNA: derivati da loci genomici endogeni
Funzione principale: rispondere alle minacce esterne sopprimendo la
trascrizione genica dell’”invasore”
Interferenza basata su RNA (RNA interference)
Attori:
Micro RNA (miRNA) precursori a forcina
Small interfering RNA (Si) (2 nt 3’ protrundenti)
Ribonucleasi DICER
RISC (RNA driven interference silencing complex) che comprende: Argonaute, la proteina che srotola il doppio filamento e la ribonucleasi che taglia la sequenza senso a 10-11 nt dal terminale 5’.
Il complesso RISC attivato riconosce sequenze complementari di RNA, le lega e degrada: questo puo’ avvenire diverse volte in quanto l’RNA antisenso, protetto dal complesso proteico è stabile e in cellule che si dividono lentamente puo’ agire per 3-7 giorni.
siRNA sinteticoa doppio filamento
shRNA plasmidico
RNA lungo a doppio filamento
miRNA endogeno
20-25 NT
funzionemiRNA
Formazione del complesso RISC (RNA induced silencing complex)
Complesso RISC attivato
Blocco traduzione
funzionesiRNA
Formazione doppia elica con RNA complementare e attacco di endonucleasi
Amplificazione RNA-dip RNA polimerasi
si RNA – caratteristiche
RNA a doppia elica di 21-23 ntPresenza di terminale 3’ più lungo di 2ntPresenza di gruppi OH in 3’Presenza 5’ fosfatoAlta stabilità nella porzione 5’ senso(ricco in GC)Bassa stabilità nella porzione 5’ antisenso(ricco UA)Bassa stabilità nella zona centrale dove deve avvenire l’attacco della endonucleasi2’ desossitimidina per proteggere siRNA da attività esonucleasiche
Non deve essere complementare a zone intronicheComplementare a una porzione di RNA a non più di 75 basi da codone di inizio trad.
In rosso: siRNA marcatoIn blu: nucleiIn verde la proteina GAPDH
CELLULE HeLa
si RNA non specifico si RNA contro GAPDH
Trattamento: 48h
siRNA come agenti terapeutici
LA SOMMINISTRAZIONE
1. Applicazione topica: instillazione di gocce, aerosol, iniezione intratumorale
2. Somministrazione sistemica: a. iv (molecole di circa 5nm riescono a passare le
membrane, fino a 200 nm passano solo capillari fenestrati : uso di nanocarrier)
b. RNA di sintesi modificati per migliorarne la farmacocinetica
c. Utilizzo di vettori virali e non per esprimere l’RNAdella cellula bersaglio
siRNA come agenti terapeutici
LA SOMMINISTRAZIONE
Modificazione delle molecole di siRNA per una distribuzione più efficiente
modificazioni per evitare le difeseimmunitarie (modificazione con 2’-o-metile nel filamento antisenso)
Metodi di somministrazione:
FISICI
Iniezione idrodinamica: efficace in epatociti ma invasiva
Elettroporazione: campo elettrico che facilita la transfezione di acidi nucleici, utilizzata in vivo nel muscolo, retina, giunture artritiche e tumori
DI CONIUGAZIONE
Potenziali effetti collaterali della terapia con siRNA:
1. Attivazione del sistema immunitario
2. Effetti off-target
3. Saturazione di vie di silenziamento endogene (miRNA)
Similarità e differenze con oligonucleotidi antisenso
Similarità: - lunghezza- metodologia di delivery comune- induzione di silenziamento genico a livello
post-trascrizionale- digestione di RNAm bersaglio da parte di
endonucleasi- possibilità di stabilizzazione con basi
modificate- similarità nella biodistribuzione
Differenze: - doppio filamento verso singolo filamento- maggiore stabilità della molecola naturale- maggiore efficacia in cellule in coltura- meccanismo di azione mediato da RISC