referat

2. ГЕНОМИ

2.1. Хромозоми

2.1.1. Прокариотни и еукариотни хромозоми

Всички живи клетъчни форми имат структури, които носят гените, кодирани от ДНК, наречени хромозоми. Въпреки общия термин, съществуват значителни различия между прокариотните хромозоми и дори тези на най-простите еукариоти. При прокари-отите хромозомите се състоят от една двойноверижна ДНК, която е обикновено пръс-теновидна и има сравнително малко белтъци, свързани с нея. Репликацията на тази ве-рига става от едно начало на репликация (origin), както бе описано по-рано (вж. раздел 1.9). В повечето случаи еукариотните организми имат множество хромозоми, които са линейни и са локализирани в мембранния органел – ядрото. В тези хромозоми молеку-лата ДНК е тясно асоциирана с голямо количество специфични белтъци, които могат да имат структурна или функционална роля. Количеството на ДНК в еукариотните хромо-зоми е многократно по-голямо от това в прокариотните. По-тази причина репликацията в тях започва в множество начални места.

2.1.2. Морфология на хромозомите

Еукариотните хромозоми са обикновено видими само в определени периоди на делене на клетката (вж. раздели 2.2 и 3.3), след като хромозомите са се реплицирали в специални двойни структури, наречени хроматиди (дъщерни хромозоми). Хромозомите се класифицират на базата на тяхната морфология, а тя се определя от мястото на цен-тромера (първичното прещъпване). На Фиг. 2.1 са показани няколко типични структу-

ри на хромозоми. При метацентричните (медиоцентрични) хромозоми центромерът е близо до средата на хромозомата. Това разде-ля хромозомата на две сравнително равни части – рамене. Когато центромерът е на зна-чително по-голямо разстояние от средата, при което се формират две рамена – дълго (q-рамо) и късо (p-рамо), хромозомите се озна-чават като субметацентрични. При другите два класа центромерът е много близо до еди-ния край на хромозомата. При телоцентрич-ните хромозоми центромерът е в единия край на хромозомата, при което се наблюдава само едно рамо. Ако центромерът е толкова близо до края, че рамената са едва забележими, хромозомите се наричат акроцентрични. Двата последни типа могат лесно да се обър-

кат. Разликата между тях се забелязва лесно върху човешките хромозоми (Фиг. 2.2).

Фиг. 2.1. Морфология на хромозомата според положението на центромера

Пълният диплоиден набор хромозоми при всеки вид се нарича кариотип. Хромо-зомите се подреждат по намаляваща големина и се разделят на полови хромозоми (X и Y) и аутозоми (всички останали; вж. раздел 3.8). Хромозомите могат да се фотографи-рат и хомоложните хромозоми да се подредят по двойки и по ред. Това се означава като идеограма и е обикновеният начин за показване на кариотипа.

41

Чрез подреждането на хромозомите по големина и морфология е възможно да се идентифицира всяка индивидуална хромозома в кариотипа. Този процес е направен значително по-лесен с прилагане на специални процеси на третиране преди багрене. Това дава поредица тъмни и светли зони, уникални за всяка хромозома. Този начин на изследване се нарича бендинг (banding, от band – ивица, зона). Макар, че съществуват множество способи, най-широко използвани са т. нар G-бендинг и С- бендинг.

Фиг. 2.2. Човешки кариотип. Показан е по един член на всяка двойка хомоложни хромозоми на базата на G-бендинг. Хромозомите са подредени по дължина. Х-хромозомата е разполо-жена според дължината си, а Y-хромозомата е накрая.

G-бендинг може да се постигне с множество третирания, но най-широко се из-ползва предварително третиране на препаратите с хромозоми с протеолитични ензими, като например трипсин. Така обработените препарати се багрят по Giemsa (оттам про-излиза и името G-бендинг). Това третиране дава тъмни ивици и по-светли интервали. Наборът светли и тъмни зони е уникален за всяка хомоложна хромозомна двойка и по-мага изключително много за идентифициране на хромозомите. Тези набори са използ-вани за съставяне на цитологични карти на всяка хромозома при много видове, при ко-ето могат точно да се дефинират и субхромозомни области. Това е особено важно за картиране на гените и в медицинската генетика (Глава 13).

42

На фиг. 2.2 може да се види диаграма на G-бендинг зоните на всяка човешка хро-мозома. Този набор позволява всяка отделна хромозома да се раздели на области и по-добласти. Ако се използва хромозома 1 като пример, първото делене се прави между двете рамена (q и р). По-нататък се вижда, че q-рамото се дели на области 1, 2, 3 и 4. Има още две допълнителни нива на разделяне, така че една специфична област може да се дефинира с означението 1.q.42.1. Трябва да се отбележи, че не всички хромозоми и дори хромозомни области са разделени еднакво. Тези области са субективни и са дефи-нирани със специални конвенции на цитогенетиците. Като се има предвид, че подобни багрения могат да се прилагат и на по-дълги и на по-малко кондензирани хромозоми, броят на суб-регионите може да се увеличи значително. G-бендингът не само дава удо-бен начин за идентифициране на хромозомите, но и говори за общата организацията на ДНК и гените в еукариотните хромозоми. Като цяло тъмните зони са по-богати на ба-зите аденин и тимин, а по-светлите на гуанин и цитозин. Повечето гени са локализира-ни по-скоро в интервалите, отколкото в G-зоните.

С-бендингът също дава информация за организацията на хромозомите. Той дава определен брой тъмни зони, които са обикновено около центромерите. Те показват об-ластите на конститутивния хетерохроматин, които ще бъдат разгледани подробно по-късно.

2.1.3. Специализирана организация на хромозомите

Всички еукариотни хромозоми имат две специфични области с особено структур-но значение. Това са центромерите и теломерите. В допълнение някои хромозоми имат област на ядърцевия организатор (nucleolar organizer region - NOR). Центроме-рите са местата, където делителното вретено е свързано с хромозомите по време на де-лене на клетката и функционалните центромери са важни за този процес. Всеки хромо-зомен фрагмент, който загуби връзката си към центромера няма да се сегрегира в дъ-щерните клетки в края на клетъчното делене. Най-добре са проучени центромерите при дрождените хромозоми, някои от които са доста къси (до 200 нд), но повечето центро-мери са доста по-дълги. Обикновено центромерите се състоят от често повтарящи се фрагменти от сателитна ДНК (вж. раздел 2.4). При хората различните хромозоми могат да се отдиференцират по наличието на специална алфовидна сателитна ДНК в центро-мерите. Връзката между хромозомата и микротръбиците на делителното вретено се осъществява чрез специални белтъци, които са свързани с центромера и образуват мно-гослойна структура, наречена кинетохор.

Теломерите не са просто краищата на хромозомите и ДНК молекулите, а са спе-циализирани структури. Те съдържат множествени повторения на секвенции като TTAGGG. Няма обаче голяма специфика в различните организми – подобни секвенции са открити и в растения и в първаци. Към теломерните области се свързват специфични белтъци и се предполага, че получените нуклеопротеидни структури предотвратяват рекомбинацията между краищата на различните хромозоми. Броят на повторенията в теломерите е висок в младите делящи се клетки и постепенно намалява с възрастта на соматичните тъкани, поради което може да се счита, че това е молекулен маркер на процеса стареене. Дължината на теломерите се регулира от ензима теломераза, който съдържа фрагменти РНК, комплементарни на повторенията от ДНК, а те играят роля на матрици за удължаване на теломерите. Теломеразата липсва в соматичните клетки, но се появява отново в туморните клетки, където дължината на теломерите се стабилизи-ра.

NOR се откриват обикновено в т. нар. вторични прещъпвания. Те се състоят от тандемно повторени гени за рибозомните гени за 5,8S, 18S и 28S (вж. 1.6). В повечето организми гените за 5S рРНК са локализирани на други места в генома. В човешкия ге-

43

ном NOR са локализирани на късите рамена на всички алоцентрични хромозоми, с изк-лючение на Y хромозомата. Всеки NOR се състои от около 80-100 повторения. По вре-ме на интерфазата NOR се декондензира и около него отново се организира ядърце, при което NOR от различните хромозоми се обединяват в едно ядърце. Когато клетката навлезе в метафазата на митотичното делене, хромозомите могат да се окажат все още свързани с късите си рамена, което е известно като сателитна асоциация.

Вторичното прещъпване може да е толкова силно изразено, че една малка дистал-на част от хромозомата изглежда почти отделена от нея и се нарича хромозомен сате-лит. При човека те могат да се видят на хромозоми 13, 14, 15 и 21 (Фиг. 2.2). Хромо-зомният сателит не бива да се бърка със сателитната ДНК (вж. 2.4).

2.1.4. Молекулярна структура на хромозомите

Хромозомите са съставени от ДНК и белтък. Може да има и малко количество РНК, която обаче няма функционална роля в тях. Сместа от ДНК и белтък се нарича хроматин. Белтъците се делят на два класа – хистонови и нехистонови или кисели белтъци, като и двата типа играят важна роля в структурата и функцията на хромозоми-те. Хистоните са група малки белтъци с молекулна маса под 23 kD. Като съотношение

те са равни на количеството на ДНК в хромозомите. При физиоло-гично pH те има положителен за-ряд, който се дължи на големия процент базови аминокиселини ка-то аргинин и лизин. Този заряд по-мага за стабилната връзка с полиа-ниона ДНК. Установени са пет различни хистона Н1, Н2а, Н2b, H3 и Н4. Това се отнася до всички ор-ганизми и тъкани, с малки изклю-чения по отношение на Н1. Ами-нокиселинната секвенция на всеки хистон е високо-консервативна от еволюционна гледна точка, което показва, че тези молекули имат го-лямо значение, критично за прежи-вяването на еукариотите. Този факт е обяснен с откриване на нуклеозомите – основната градив-на единица на хроматина.

Нуклеозомите се състоят от ядро, изградено от хистони, около

което се увива веригата на ДНК. Ядрото се състои от два успоредни диска, образувани от по четири хистона - Н2а, Н2b, H3 и Н4. ДНК е разположена по ръбовете на цилиндъ-ра, образуван от дисковете. Хистонът Н1 се намира отвън на цилиндъра и фиксира на-вивките на ДНК. В нуклеозомата участва ДНК с дължина 146 нд. Участъкът от свърз-ващата ДНК между две нуклезоми се нарича линкер и варира в различните видове, но при човека е около 60 нд, което дава обща дължина на ДНК в една нуклеозома около 200 нд. Това е основното ниво на пакетиране на ДНК в хроматина. По-нататъшното па-кетиране в голяма степен зависи от хистона H1. Молекулите Н1 могат да си взаимо-действат и да организират нуклеозомите в спирална структура (solenoid) с диаметър 30 nm. Това е диаметърът на нишката, която най-често се вижда на електронните микрог-

Фиг. 2.3. Нуклеозоми. (а) диаграма на серия от нуклео-зоми; (b) нуклеозоми, свързани заедно, за да образувт со-леноид; (с) основна структура на нуклозомата с хисто-новите белтъци

44

рафии на хроматина, но са открити и някои по-плътно опаковани структури. Една прос-та структура на соленоид е представена на фиг. 2.3. В ядрото се наблюдават и структу-ри с по-висока степен на кондензация. Най-висока плътност се наблюдава в хромозо-мите по време на метафазата на клетъчното делене. Организирането на тези структури представлява свързване на хроматиновите нишки към скелета на хромозомата. Основна роля в това играе киселият ядрен белтък, топоизомераза II. Има специфични области на ДНК с дължина неколкостотин нуклеотидни двойки, богати на базите аденин и ти-мин, които са известни като области за свързване със скелета (scaffold attachment regions, SARs), и които свързват нишките ДНК със скелета. Веригите ДНК между тях са организирани като бримки с различна дължина. ДНК от тези област може да се види ако се премахнат хистоните в препарати от метафазни хромозоми. Тогава електронните снимки показват бримките, излизащи от скелета на хромозомите. Нехистоновите ядре-ни белтъци участват по различен начин във функционирането на хроматина като нап-ример регулация на генната експресия, където транскрипционните фактори играят съ-ществена роля. По-подробно тези процеси са разгледани в раздел 2.11.

2.1.4. Функционален и нефункционален хроматин

Не всички области на хроматина участват еднакво в транскрипцията на гените. Известна част от хроматина е функционално неактивна. Тази част е известна като хете-рохроматин, за разлика от функционално-активната му част – еухроматин. Както се вижда от електронно-микроскопските снимки хетерохроматинът има по-плътно опако-вана структура на хроматиновите нишки. Той може също така да се отдиференцира и с багрене на светлинна микроскопия. Част от хроматина е хетерохроматин във всички тъкани и всички етапи на развитие на клетката, нарича се конститутивен хроматин и може да се открие чрез С-бендинг. Както беше споменато по-горе със С-бендинг се от-криват центромерите. В тези области има здраво свързване на ДНК и белтък, което на-малява загубата на ДНК при обработката за С-бендинг, поради което тези области се багрят по-интензивно. Други области с конститутивен хроматин има в дългото рамо на човешката Y-хромозома и в области на половите хромозоми на някои животни. Подоб-ни С-зони се срещат по-често при растенията, където те се използват за идентифицира-не на хромозомите, тъй като при растителните хромозоми не се наблюдава G-бендинг.

Някои области на хроматина могат да съществуват или в хетерохроматиново или в еухроматиново състояние. Такива области се наричат факултативен хетерохрома-тин. Женските бозайници имат две Х-хромозоми, като едната е неактивна по отноше-ние на транскрипцията. Тя се превръща в хетерохроматин и се наблюдава като малка плътна точка в интерфазното ядро, известна като телце на Бар или Х-хроматин. По този начин се осъществява компенсация в броя на експресираните гени с мъжките ин-дивиди, които имат само една Х-хромозома и една Y-хромозома, която също се състои основно от хетерохроматин. Коя от двете Х-хромозоми ще се инактивира е случаен процес. При около половината от женските екземпляри се инактивира Х-хромозомата с произход от мъжкия родител, а при другата половина – от женския. Инактивираната Х-хромозома се реактивира по време на гаметогенезата.

2.1.5. Аберации в броя на хромозомите

Промяна в броя на хромозомите може да се получи при грешки по време на мейо-зата, процес, свързан с гаметогенезата (3.3). В резултат на това се получават гамети със загуба или излишък на генетичен материал. Ако гаметите са жизнени те ще дадат по-томство със същата абнормална конфигурация на хромозомите. Грешки, които стават по време на митозата (вж. раздел 2.2) дават поколение с повече от един кариотип. Та-кива индивиди се наричат мозаечни, тъй като хромозомни аберации има само в опре-

45

делени участъци, които са изградени от поколенията на клетката, в която е станала абе-рацията.

Полиплоидия се получава тогава, когато броят на хромозомите се увеличава или намалява с число, кратно на хаплоидния набор. Еуплоидните серии показват различни плоидни нива. Един пример за човешкия геном е даден в Табл. 2.1. Триплоидите и тет-раплоидите представляват около 10% от спонтанните аборти и никога не се наблюдават при живи деца. Полиплоидията е рядка в животинското царство, но се среща често при растенията, при които е важна за еволюцията. Много от важните културни растения са полиплоиди. Обикновено при тези растенията се наблюдава по-голяма продуктивност, на базата на многото копия гени.

Таблица 2.1. Човешки еуплоидни серии

Брой хромозоми Плоидност Нормално се открива в 23 46 69 96

Хаплоид Диплоид Триплоид Тетраплоид

Гамети Соматични клетки

Анеуплоидията се отнася до случаи, при които се наблюдават малки отклонения в хромозомните от еуплоидния набор. Нулизомията е липса на едно копие от опреде-лена хромозома. Като дизомия се означава наличие на две копия на хромозомата, а при тризомията има три копия. Монозомията е нормална при гаметите, дизомията е харак-терна при соматичните, диплоидни клетки. На табл. 2.2 са представени случаи на ане-уплоидия при човешкия хромозомен набор.

Таблица 2.2. Анеуплоидии в човешките популации

Състояние Участващи хромозоми Приблизителна честота Допълнителна аутозомна хромозома

Синдром на Едуард Синдром на Пато Сндром на Даун

Анеуплоидия на полова хромозома Синдром на Търнър Синдром на Килфелтер Синдром на тройна Х хромозома

18 13 21 ХО ХХY XXX

1 на 5 000 1 на 5 000 1 на 750 1 на 10 000 1 на 2 000 1 на 2 000

Установена е анеуплоидия и за някои други гени, освен посочените, но само в за-родиши от спонтанен аборт. Като цяло се счита, че около 4% от човешките аборти са резултат на тризомия. При зародиши, които при този дефект оживяват, се предполага сравнително кратко време на живот. Индивиди, при които има тризомия само по част от хромозомата проявяват отрицателните признаци значително по-слабо. Тук трябва да се отбележи, че в този смисъл аутозомните тризомии, отбелязани по-горе, се отнасят до малките хромозоми. Присъствието на допълнително копие от една голяма хромозома вероятно ще доведе до експресия на прекалено много гени, за да се развие зародиш.

Анеуплоидия на полови хромозоми е сравнително често явление, въпреки, че Х-хромозомата спада към големите хромозоми, носещи много гени. Как може да се обяс-ни това? Както беше отбелязано по-рано, само едната Х-хромозома е активна по отно-шение на транскрипцията, така че присъствието на още една хромозома има по-малък ефект, отколкото бихме могли да предположим. Синдромът на Търнър (ХО) е по-рядък от другите полови анеуплоидии и често се среща като мозайка, където е смесен с (ХХ) клетки и това може да улесни преживяването.

46

Анеуплоидни гамети се получават от грешки при първото или второто делене на мейозата чрез един процес, при който се нарушава разделянето (nondisjunction). Това може да стане например когато две хомоложни хромозоми при мейоза 1 или центроме-рът не успее да се раздели при метафазата на мейоза 2. (вж. раздел 3.3). Подобен процес при центромера може да се получи и при митозата. Счита се, че неразделянето възник-ва като спонтанен процес, подобен на мутациите в секвенцията на ДНК, но все пак се влияе от някои външни фактори. Това се вижда ясно при тризомията на хромозома 21, където случаите се увеличават с възрастта на майката. В някои случаи има семейна предразположеност към тризомия 21, поради наличието на носители в семейството, ко-ито имат нормален фенотип, но имат транслокация на хромозома 21. Те могат да пре-дадат на поколението си или нормалното копие на хромозома 21 или транслокация, ко-ято също съдържа хромозома 21. Засегнатото дете унаследява и нормално копие на хромозома 21 от другия родител и така ще има три копия от хромозомата. Това е опи-сано на Фиг. 2.4.

Носител Нормален Резултат 21, 14 21, 14 Жизнен, нормален 21/14 21, 14 Жизнен, носител 21, 21/14 21, 14 Тризомия 21 14 21, 14 Летален нулизомик 14, 21/14 21, 14 Не жизнен 21 21, 14 Летален нулизомик

Фиг. 2.4. Унаследяване на тризомия 21 (Синдром на Даун). Ако индивидът е носител на три-зомия 21, поради наличие на транслокация между хромозома 21 и хромозома 14, ще се получат ге-нетично различни гамети в резултат на неравномерната сегрегация на транслокацията при мейо-зата. Тези гамети ще се оплодят от нормални гамети, монозомни за хромозоми 21 и 14. Двете гру-пи гамети и резултатът на тяхното сливане са показани по-горе. Транслокацията е означена като 21/14. Трябва да се отбележи, че честотата на получаване на различни гамети не еднаква.

Всички описани синдроми, с изключение на синдромът на Търнър (ХО), показват наличие на една допълнителна хромозома. Индивиди със загуба на една хромозома, или монозомици, са много редки и имат много кратък живот. При човека нулизомиците ни-кога не са жизнеспособни. При растенията нещата са много различни. Там има много мутанти-нулизомици, които са жизнени и освен това се използват при контролни кръс-тоски с цел характеризиране на генома.

2.2. Делене на клетките

2.2.1. Еукариотен клетъчен цикъл

Преминаването от едно клетъчно делене към следващото може да се разглежда като цикличен процес или клетъчен цикъл. През това време клетката трябва да удвои съдържанието си и след това да организира разпределението на компонентите по равно между двете дъщерни клетки. С изключение на образуването на гамети (раздел 3.3) ядрото на клетката се дели чрез митоза и заедно с цитоплазмата делението се означава като цитокинеза. Тези процеси лесно могат да се наблюдават при фиксирани или при живи клетки. Периодът между две последователни деления се нарича клетъчен цикъл. Репликацията на ДНК се извършва в етап от клетъчния цикъл, който се нарича синте-тична или S-фаза. Периодът, който предшества S-фазата се означава като G1 (Gap 1), а периодът между S-фазата и деленето е известен като G2 (Gap 2).

47

Клетки в различни фази на делене могат да бъдат идентифицирани лесно в случа-ите, когато могат да се отглеждат суспензионни клетъчни култури. В този случай се из-ползва флуоресцентно активирано разделяне на клетките, което може да раздели клетки в G1, S и G2 фазите на клетъчния цикъл. С изключение на този подход фазите G1, и G2 се отдиференцират доста трудно. Клетките в S-фаза се характеризират лесно с използ-ване на белязани предшественици за синтез на ДНК, като например тимидин-3Н, който е специфичен белег за ДНК, тъй като този нуклеотид липсва в РНК. Процентът беляза-ни клетки след кратка експозиция на белязания предшественик е пропорционален на частта, която S-фазата заема от целия клетъчен цикъл.

2.2.2. Митоза и цитокинеза

Митозата има много сходства с мейозата, (с изключение на процесите на редук-ционно делене). Основните етапи на митозата са показани на фиг. 2.5. Трите етапа G1, S и G2 се означават общо като интерфаза. След G2 клетката навлиза в етапа профаза. Отделните хромозоми постепенно стават видими и тяхната хроматинова структура за-почва да се кондензира. В този етап те са двойни структури, наречени хроматиди, тъй като ДНК се е реплицирала в S-фазата. Към края на профазата ядрената мембрана за-почва да се разрушава. Освободените ядрени белтъци започват да се свързват към по-върхността на кондензиращите се хромозоми. След това клетката преминава към ме-тафаза. През тази фаза ядрената мембрана и ядърцето липсват и хромозомите са под-редени по екватора на клетката. Това се постига с действието на тубулиновите нишки на делителното вретено, които започват от двата полюса на клетката и се свързват с центромерите на хромозомите (вж. раздел 2.1). Следващият етап, анафазата, започва

веднага след разделяне-то на центромерите, кое-то позволява на хромо-зомите да се разделят. Отделните хроматиди, които е по-добре да се означават като дъщерни хромозоми, се придърп-ват към полюсите на клетката от нишките на делителното вретено. Когато двата комплекта хромозоми са добре от-делени и са около полю-сите, започва процес на декондензация и около декондензиращия се хроматин започва да се формира ядрена мемб-рана, като временно клетката е с две ядра.

Фазата се нарича телофаза. В същото време при животинските клетки започва да се формира съкратителен пръстен по екватора на клетката. Тази структура се състои от миозин-съдържащи микрофиламенти и постепенно се свива, и в края на краищата раз-деля клетката на две дъщерни клетки, процес известен като цитокинеза. При растения-та цитокинезата се осъществява чрез образуване на нова клетъчна стена (фрагмопласт) по екватора на клетката.

Фиг. 2.5. Схема на митозата в животинска клетка

48

2.2.3. Регулация на клетъчния цикъл

Регулацията се отнася до скоростта, с която клетките преминават през клетъчния цикъл. Основното нещо, което трябва да се подчертае е, че в многоклетъчните организ-ми повечето клетки не се делят постоянно. Тези неактивни клетки трябва да бъдат ак-тивирани, за да се разделят и се счита, че те са във фаза G0. Само някои специфични тъ-кани, като костният мозък при животните и нарастващата меристема на кореновите връхчета при растенията притежават по-голямо количество непрекъснато делящи се клетки. За да напуснат фазата G0, клетките се задействат от специални растежни факто-ри. След това те преминават към фаза G1. Това може да отнеме определено време за преминаване от клетка в клетка, но веднъж клетките пресекли една определена точка, наречена R или рестрикционна точка, те задължително ще преминат етапите на деле-нето и отново ще стигнат до фаза G1. Следващите фази S и G2 имат сравнително фикси-рана продължителност. Преминаването през отделните етапи на клетъчния цикъл като ефект на растежните хормони се осъществява чрез механизъм, наречен сигнална тран-сдукция. Това включва серия от ефекторни молекули, които прехвърлят и усилват сиг-налите от растежните хормони, като в края на краищата предизвикват транскрипция на гените, участващи в клетъчния растеж и деленето. В същото време преминаването през клетъчния цикъл се регулира негативно от серия контролни точки, които клетката не може да премине, без да са изпълнени определени критерии. Така растежът и деленето на клетките остават високо-регулирани процеси, които са необходими за развитие на многоклетъчните организми. Ключовите играчи в процесите на делене са групи от ки-назни ензими, които добавят фосфатни групи към техните субстрати. За да продължава клетъчния цикъл, е необходимо да се фосфорилират специални таргетни белтъци на различни нива на цикъла. Киназите се свързват с друга група белтъци, наречени цикли-ни, които регулират тяхната активност. При липса на циклини фосфокиназите са неак-тивни, поради което те се наричат циклин-зависими кинази. В различните етапи на клетъчния цикъл се използват различни циклини.

Установени са и някои контролни точки на границата между фазите S и G1, меж-ду фазите G2 и митозата, както и в самата митоза. Те осигуряват правилното подрежда-не и координирано протичане на отделните фази. Така например клетки с необратими повреди на ДНК (вж. раздел 2.6) не могат да навлязат във S-фазата, където реплицира-нето на ДНК може да доведе до получаване на мутации. Клетки с незавършена репли-кация не могат да навлязат в митозата. Митозата не завършва, докато не се формира делителното вретено и хромозомите не се свържат с тях.

Мутации на гените, свързани с пътищата на сигналната трансдукция, могат да са ракообразуващи. Тези гени са известни като онкогени. Други гени, участващи в раз-личните контролни точки могат да са мутантни в различни тумори. Те са известни като туморни супресорни гени.

2.3. Прокариотни гени

2.3.1. Организация на прокариотните гени

Живите организми най-общо се разделят на примитивни, прокатриоти, към кои-то основно се отнасят бактериите, и еукариоти – тук са многоклетъчните организми. Структурата и организацията на клетките на прокариотните и еукариотните е различна. Еукариотните клетки имат сложна вътрешна структура с мембранни органели и отди-ференцирано ядро. Прокариотните клетки нямат сложна организация и отделен ядрен компартмент. Те се делят на две групи – еубактерии или същински бактерии, към кои-то спада и E. coli, и на една особена група, наречена архибактерии. Повечето от извес-тната информация за прокариотите всъщност засяга основно E. coli и еубактериите.

49

Прокариотите имат една двойноверижна, пръстеновидна ДНК, наречена бактериална хромозома, която съдържа почти всички гени. Веригата ДНК е изключително дълга в сравнение с размерите на клетката. За да се събере в бактерията тя е подложена копм-пактизиране, известно като суперспирализация. Това се осъществява от ензими топо-изомерази, които дават допълнително спирализиране на ДНК, предизвикващо усукване на веригата около себе си, за да получи по-компактна форма (Фиг. 2.6). Един от меха-низмите на действие на топоизомеразите е разкъсване на пръстена и въртене на двата края в противоположни посоки. След това ензимът отново свързва двата края и верига-та се усуква както беше споменато. Този процес се нарича позитивна суперс-пирализация. Топоизомеразите могат да премахнат допълнителното усукване с нега-

тивна суперспирализация чрез завъртане на краищата в об-ратна посока. Суперспирали-зацията се получава и в еука-риотните организми и улесня-ва пакетирането на ДНК в хромозомите.

Макар, че бактериите нямат диференцирано ядро, електронно-микроскопските

снимки показват наличие на по-тъмна централна област, наречена нуклеоид и по-светла околна зона – цитоплазма. Точната структура на нуклеоида не е известна, но се счита, че има централно белтъчно ядро, от което радиално излизат суперспирални бримки (Фиг. 2.7). Някои от белтъците, изолирани от нуклеоида напомнят хистоновите белтъци в еукариотния хроматин и се счита, че те помагат за по-компактната структура на ДНК в бактериите. Дължината на прокари-отната хромозома, сравнена с раз-мерите на клетката показват, че репликацията на ДНК и разделянето на молекулите няма да лесно. Това може да стане като молекулата ДНК се залови за определена част на бак-териалната мембрана (мезозома), от която точка се разделят с деленето на клетката.

Фиг. 2.6. Суперспирализиране на молекула ДНК

Фиг. 2.7. Структура на нуклеоида на E. coli 2.3.2. Прокариотни гени

Почти всички гени, присъстващи в бактерията са върху бактериалната хромозома. Малък брой гени съществуват в малки, пръстеновидни ДНК структури, наречени плазмиди, които присъстват в бактерията заедно с бактериалната ДНК. Организацията на гените по бактериалната хромозома е най-добре установена в Е. coli, където има около 4300 гена, носени от бактериална ДНК с дължина 4,6 милиона нуклеотидни двойки (нд). Днес е известна цялата секвенция на този геном и разположението на всички гени. Някои гени са организирани на групи, наречени оперони, кодиращи син-тезата на белтъци със свързана функция и регулирани координирано. Други гени са разположени по хромозомата без някаква очевидна организация. Повечето от гените присъстват в единични копия. Основното изключение тук са гените за рибозомните РНК, които се намират на групи от по седем копия. Подобна организация се наблюдава

50

и при други еубактерии. Генетичните карти на сродни бактерии са много сходни. Око-ло 90% от цялата ДНК в бактериите е заета от гените. Останалите 10% се нарича ин-тергенна ДНК, която разделя отделните гени. Някои части на тази ДНК играят важна роля, като например локализация на началото на репликация на бактериалната хромо-зома (origin).

Други междугенни области може би се използват за контакт между ДНК и паке-тиращите белтъци. Големината на бактериалните геноми е различна при различните видове бактерии. Вариацията в големината на генома отразява разликите в броя на ге-ните и може би в големината на междугенните участъци.

2.3.3. Плазмиди

Тези пръстеновидни молекули ДНК присъстват като допълнение на бактериална-та хромозома в почти всички бактерии. Плазмидите носят гени, които липсват на бак-териалната хромозома и често кодират полезни за бактерията признаци като резистент-ност към бактериални антибиотици. Те носят собствено начало на репликация и могат да се реплицират независимо от хромозомната ДНК. Някои малки плазмиди използват клетъчните ензими за репликация. По-големите плазмиди носят гени, които кодират синтезата на собствени репликативни ензими. Някои плазмиди се интегрират с генома на бактерията и се реплицират едновременно с него. Такива интегриран форми се нари-чат епизоми и могат да минат множество клетъчни деления, преди да се обособят като отделни плазмиди.

В бактериите са установени множество различни плазмиди и отделните видове могат да съдържат няколко типа. Те могат да се класифицират по гените, които носят и белезите, които бактериите дължат на техния геном. В този аспект са установени пет различни типа плазмиди:

Резистентни (R) плазмиди. Те носят гени, които правят бактерията резистентна към антибиотици като ампицилин и хлорамфеникол. Начините, по които се осъществя-ва резистентността са различни. Подобен пример е плазмидът RP4, който се открива в Pseudomonas и в други бактерии. R-плазмидите имат голямо значение при лекуване на бактериалните болести с антибиотици, защото те са един начин, по който антибиотич-ната резистентност може да се предава между различните видове бактерии.

Фертилни (F) плазмиди. Тези плазмиди позволяват гените да бъдат прехвърляни между бактерии в един процес, известен като конюгация. Те съдържат гени, които на-сочват трансфера на F-плазмиди от една бактерия в друга чрез една тръбовидна струк-тура, наречена полова нишка или пила (sex pilus). F-плазмидът може да съдържа и други гени, получени от хромозомата, които след това да прехвърля в реципиентни бактерии по време на конюгацията.

Col-плазмиди. Те носят гени, кодиращи синтезата на белтъци, наречени колици-ни, които могат да убиват други бактерии. Пример за това е ColE1 на E. coli.

Деградивни плазмиди. Съдържат гени, които кодират белтъци, позволяващи на бактерията да разгражда необичайни субстрати като толуен или салицилова киселина.

Вирулентни плазмиди. Придават на бактерията свойството да предизвиква забо-лявания. Пример за това е Ti-плазмида, който се съдържа в Agrobacterium tumefaciens, който предизвиква образуването на коронни гали (тумори) при растенията.

Плазмидите варират значително по големина, като най-малките са около 1 кб, а най-големите – около 250 кб. Едни и същи плазмиди могат да варират в зависимост от бактерията, в която се намират. Някои могат да се срещат в много видове бактерии, а някои – само в няколко вида. Броят на плазмидните копия в една клетка също варира. Когато плазмидите в клетката са само няколко, те се означават като плазмиди с нисък брой копия и се наричат ограничени (stringent) плазмиди. Тези, които присъстват в

51

повече от 10 копия се означават като релаксирани (relaxed) плазмиди. Има също така и ограничение на различните видове плазмиди, които могат да съществуват заедно в една клетка. Това явление се нарича плазмидна несъвместимост. Най-често тази не-съвместимост се осъществява чрез конкурентни механизми на потискане на процеса репликация. Плазмидите, които се срещат в един и същи вид трябва да принадлежат на различни групи на несъвместимост.

2.3.4. Бактериални транспозони

Съществуват елементи от ДНК секвенцията, които имат способността да се придвижват по генома. Има ги в еукариотните и в прокариот-ните организми, като в пос-ледните могат да се намират както по хромозомата, така и в плазмидната ДНК. Придвижва-нето им се нарича транспозиция и зависи от рекомбинацията на секвенции ДНК. Транспозони-те са автономни елементи и имат ген, кодиращ синтезата на ензим, наречен транспозаза, катализиращ прехвърлянето на транспозона. Известни са много различни транспозони. Първи са установени т. нар. инсерци-онни секвенции (Insertion Se-quences, IS) в E. coli (Фиг. 2.8). Открити са няколко типа IS, присъстващи с около 10 копия в бактериалния геном. Транспо-зицията е сравнително рядък процес и възниква едва на все-ки 103 – 104 клетъчни деления. IS могат да се прехвърлят и между бактериите по време на конюгацията и могат да се прехвърлят между сродни ви-

дове бактерии. Характерна особеност на IS е, че те съдържат къси, обърнати повторе-ния (short inverted repeats) на всеки край. Това са повторени секвенции, които са ори-ентирани в противоположни посоки. Това означава, че в двата края на IS има секвен-ции, които се четат еднакво при движение от края към вмъкната секвенция. В допълне-ние, когато IS се пренася, реципиентната ДНК в мястото на инсерцията се дуплицира така, че инсерционната секвенция е винаги фланкирана от къси дупликации от таргет-ната секвенция, известни като директни повторения (тук директни означава, че пов-торенията са в еднаква ориентация). Способността на транспозоните да се движат по генома означава, че те могат да мутират даден ген, когато се пренесат в него. Когато те се придвижат към друг сайт, в гена остава късо повторение на оригиналната таргетна секвенция, което означава, че гена остава мутирал, дори след като транспозона го е на-пуснал (Фиг. 2.8). Повече данни за тези елементи има в глава 8.

Фиг. 2.8. Инсерционни секвенции. (а) Структура на инсер-ционната секвенция (IS), показваща възможните повто-рени секвенции. (b)Генни мутации чрез транспозиция ма ISD

52

2.3.5. Архибактерии

Тези организми са ясно отличаващи се от еубактериите. Днес е установено, че те са толкова различни от еубактериите, колкото и от еукариотите. Те са представени от три сравнително сходни групи – метаногени, екстремни термофили и екстремни ха-лофили. Много от архибактериите живеят в екстремни условия, което ги прави трудни за култивиране и изучаване. Биохимично те се различават от еубактериите по структура и състав на клетъчната им стена. Генетично има няколко основни различия, отнасящи се до рибозомните РНК, включително и наличие на интрони, както и различна структу-ра и организация на гените.

2.4. Човешки геном

2.4.1. Човешки геном – обща характеристика

Този термин се използва, за да означат различните типове секвенции, които като цяло образуват ДНК на човешката клетка. ДНК в човешкия геном е около 3 милиарда нуклеотидни двойки и се предполага, че съдържа около 30 000 гена. ДНК е организира-на в набор от 23 хромозоми, всяка от които е единична, двойноверижна молекула ДНК с дължина от 55 до 250 милиона нд. Гените и секвенциите, свързани с гените представ-ляват около 25% от цялата ДНК (Фиг. 2.9). Останалата част се нарича екстрагенна ДНК и функцията и е почти неизвестна.

2.4.2. Гени

Кодиращата информация в гените е съсредоточена в серия секвенции ДНК, нари-чани екзони, разделени един от друг с други междинни, некодиращи секвенции – инт-рони. Гените варират много както по размери, както и по отношение на броя и големи-ната на интроните. Някои гени, като например гена за хистоновия белтък Н4, са дълги само няколкостотин нуклеотида. Други, като гена за фактор VIII, са дълги няколкосто-тин килобази (кб) и съдържат голям процент интрони, като дължината на кодиращите секвенции е не повече от няколко процента от общата дължина на гените. Съществуват и допълнителни секвенции, асоциирани с гените, като лидерни и трейлърни секвен-ции, които се намират съответно на 5’ и на 3’-краищата им. Те се транскрибират, но не се транслират в белтък. Други некодиращи секвенции са например промоторните сек-венции, които се намират надясно от стартовата точка, от която започва транскрипция-та. Те регулират синтезата на РНК от съответния ген. Промоторни секвенции могат да се открият до около 1 000 нуклеотида надясно от стартовата точка (upstream), но има други регулаторни секвенции, като например енхансерите, които могат да се намират на значително по-големи разстояния.

53

Фиг. 2.9. Секвенции в човешкия геном

54

2.4.3. Генни семейства

Съществуват определен брой гени с идентична или сходна секвенция, които могат да се групират като генни семейства Те могат да се групират по различни начини:

а) всички гени от семейството се намират на един и същ хромозомен локус – при-мер за това е семейството на растежните хормони, чиито пет члена са групирани на хромозома 17;

б) гените, принадлежащи на семейството могат да се намират на различни локуси – например петте гена от алдолазното семейство са на различни хромозоми;

в) гените от семейството могат да съществуват като поредица от групи, всяка от които е локализирана в различен локус – пример са хомеобоксните гени, които същес-твуват като четири групи на различни хромозоми, а във всяка група се съдържат около 10 отделни гена.

В някои мултигенни семейства всички гени са идентични и кодират синтеза на белтък, който е необходим в големи количества в клетката, както е случая с хистоните. В други групи гените не са идентични, а показват определена дивергенция в секвенция-та си. В някои случаи дивергенцията е толкова голяма, че гените кодират сродни бел-тъци, които обаче имат съвсем специфични функции. Пример за това е семейството на α и β-глобиновите гени, които се експресират в различни етапи на ембрионалното раз-витие и във възрастния организъм.

2.4.4. Псевдогени

Има дивергирали членове на генните фамилии, натрупали мутации, които ги пра-вят неактивни и неспособни да кодират синтезата на функционално активни белтъци. Псевдогенът е всъщност мутирала версия на родителския ген. Често срещани мутации в такива псевдогени са безсмислените (nonsense) мутации, което има за резултат преж-девременно спиране или терминация на белтъчната синтеза. Близки до псевдогените са процесираните гени, които са ДНК копие на иРНК. Тези гени нямат интрон и понеже нямат и промотор, те не се транскрибират и по този начин не кодират белтъци. Не е яс-но как са се получили тези гени в човешкия геном, но една от възможностите е това да е станало като обратната транскрипция на иРНК до двойноверижна ДНК, която след това е инсертирана в генома. Друга група неактивни гени са т. нар. генни фрагменти, на които липсва или 5’ или 3’-края на родителския ген. Счита се, че те са възникнали чрез процес на делеция или чрез рекомбинация, която разцепва родителския ген.

2.4.5. Екстрагенна ДНК

Тази ДНК съществува като секвенции, които са допълнение към секвенциите свързани с гените, които бяха описани по-горе (Фиг. 2.9). Екстрагенната ДНК е изгра-дена от секвенции, които не са част от гените (екзони или интрони), не са свързани с гените (лидерни и трейлърни секвенции, промотори или далечни регулиращи секвен-ции) и не са псевдогени или генни фрагменти. Макар че в човешкия геном това е по-голямата част от ДНК (70-80%) и досега не е ясно каква е функцията им. Повечето от секвенциите екстрагенна ДНК (70-80%) са къси и се повтарят с малък брой копия. Ос-таналата част (20-30%) са умерено или високоповтарящи се секвенции, които могат да бъдат пръснати по целия геном или да са подредени един след друг в дълги тандем-ни редици.

2.4.6. Разпръснати повтарящи се секвенции

Съществуват два типа такива секвенции, известни като къси и дълги разпръснати ядрени елементи (short/long interspersed nuclear elements), чиито абревиатури са SINEs и LINEs. Един пример за SINEs в човешкия геном са т. нар. Alu-елементи. Тези сек-

55

венции не са еднакви, но са достатъчно близки, за да могат да се класифицират като едно семейство. Те имат средна дължина от около 250 нд и от тях съществуват около 1 милион копия, много широко разпръснати из целия геном, появяващи се на много мес-та, включително и в итроните. Произхода на Alu-елементите е неясен, но се счита, че те са възникнали като един или няколко процесирани псевдогена. Предполага се, че тога-

ва те са имали транспозонна активност, която им е позво-лила да се реплицират и да се придвижват по целия геном.

LINEs са сходни със SINEs, но имат по-голяма дължина Добре известен при-мер е L1 LINE, който е дълъг 6500 нд и е представен в 60 000 копия. LINEs са един тип ретроелементи. Това са сек-венции, които са способни да се движат по генома чрез процес, известен като транс-позиция, който им позволява да се копират чрез обратна транскрипция и да инсертират свои копия на доста големи разстояния в генома (Фиг. 2.10). Повечето L1 елементи

са скъсени, но пълната им дължина има всички компоненти, необходими за траспози-ция, включително и гени за обратна транскриптаза.

Фиг. 2.10. Транспозиция на ретроелементи

2.4.7. Групирани повтарящи се секвенции

Човешкият геном съдържа множество области, в които са подредени една след друга повторени секвенции в дълги тандемни групи. Те се означават като сателитна ДНК (Фиг. 2.9) и се появяват в различни форми, всяка с различна повтаряща се едини-ца. Макар, че известна част от сателитната ДНК е разпръсната по целия геном, повече-то е локализирана в областта около центромерите, където вероятно играе структурна роля. Има три класа сателитна ДНК, различаващи се по големината на клъстера и дъл-жината на повтарящата се единица.

• Първият установен в човешкия геном клас се нарича сателитна ДНК и представлява повтарящи се единици с дължина около 200 нд, организирани в клъстери с обща дължина между 100 и 5000 кб.

• Минисателитната ДНК представлява по-малки клъстери от около 25 кб, съставени от повтарящи се елементи с дължина до 25 нд.

• Микросателитната ДНК се среща в малки клъстери, обикновено по-малки от 150 нд, а повтарящите се елементи, които са обикновено дълги 4 нд или дори по-малко.

Особено характерна е микросателитната ДНК. Такава една, която има повтаряща се СА секвенция обхваща около 0,5% от ДНК в генома. Мононуклеотидните повторе-ния, които представляват повторение на един нуклеотид заемат още 0,3% от геномната ДНК.

56

2.4.8. Променлив брой тандемни повторения

Дължината на микросателитните секвенции, съставени от повторения, подобни на СА варират при различните хора. Във всяко определено място на генома, броят на пов-торенията, присъстващи в микросателитната ДНК може да се различава 10 пъти и по-вече. Затова тези секвенции са известни като променлив брой тандемни повторения (variable number of tandem repeats, VNTRs). Те могат да бъдат анализирани с полимераз-ната верижна реакция (PCR), както е показано на фиг. 2.11. Като се използват прайме-ри, които са специфични за уникалните секвенции от двата края на повторената сек-венция, с PCR се намножават молекули ДНК, чиято дължина е различна и зависи от броя на повторените елементи. С изследването на няколко VNTRs е възможно да се

направи генетичен про-фил, който е уникален за тествания индивид.

VNTRs имат ня-колко много полезни приложения, базиращи се върху установяване на индивидуалността на тестваната личност. Те могат да бъдат да бъдат използвани в криминал-ната практика за устано-вяване на личността на заподозрени в престъп-ления, като се използват малки количества био-логичен материал, съб-ран от местопрестъпле-нието. Те могат да бъдат използвани и в медици-ната, като например сравняване на пациенти, на които предстои тран-сплантация на органи, за

идентифициране на носители на генетични заболявания и установяване на бащинство. VNTRs освен това са широко използвани и за целите на генетичното картиране на чо-вешкия геном като генетични маркери, характеризиращи локализацията и реда на хро-мозомите в генома (вж. глава 7).

Фиг. 2.11. VNTRs. СА е повторена 4-16 пъти. PCR, използваща праймери, специфични за фланкиращите уникални секвенции дават амплифицицирана ДНК с различни дължини.

2.5. Мутации на ДНК

2.5.1. Мутации – обща характеристика

Секвенцията на ДНК в гена определя секвенцията на аминокиселините в белтъка, който се кодира от този ген. Много е важно секвенцията на ДНК да се запазва непро-менена, тъй като промените в секвенцията на белтъка могат да повлияят на способност-та му да изпълнява своята функция, което от своя страна да има вреден или дори лета-лен ефект за организма. Всъщност обаче такива промени в секвенцията на ДНК стават непрекъснато под въздействие на множество химични и физични фактори и по-рядко в процеса на репликация на ДНК. Тези промени са известни като мутации. Веднъж въз-

57

никнали, те остават постоянно в генома благодарение на репликацията и се пренасят от една клетка в друга при делене.

В организмите, които носят мутации има две важни характеристики – генотип и фенотип. Генотипът се използва за описание на гена и на мутациите, които възникват в него. Фенотипът описва промените, които възникват в организма, в който стават мута-циите. Организъм, който показва нормалния генотип за дадения вид се означава като див тип. Организъм, чийто нормален фенотип е променен в резултат на мутацията се нарича мутант. Мутациите възникват в две форми – точкови мутации, които включ-ват промени само на една база на което и да е място в генома, и масивни мутации (gross), които представляват промяна на по-големи секвенции ДНК. Важна е и локали-зацията на мутациите в генома. Само тези, които са локализирани в кодиращите сек-венции могат да засегнат белтъка. Обикновено мутациите в некодиращите области или в междугенните участъци нямат ефект.

2.5.2. Точкови мутации

Точковите мутации се разделят на няколко категории, всяка от които засяга коди-рания от гена белтък по различен начин.

2.5.2.1. Мисенс-мутации Тези точкови мутации включват промени само на един нуклеотид, което променя

кодона и така се променя кодираната аминокиселина (Фиг. 2.12а). Такива мутации въз-никват обикновено в първите две бази на кодона. Изродеността на кода е причината мутациите в третата база много рядко да предизвикат замяна на аминокиселина. Ефек-тът на мисенс-мутациите върху организма е различен. Някои белтъци понасят малки промени в секвенцията си. Въпреки това промените и на една АК в белтъци, които иг-раят важна структурна и функционална роля, обикновено се отразява на организма и дава мутантен фенотип. В зависимост от промяната на нуклеотидите, тези мутации се разделят на транзиции (замяна на пурин с пиримидин и обратно) и трансверсии (за-мяна на един пурин с друг).

2.5.2.2. Нонсенс-мутации Това са мутации, които променят кодона за дадена АК в терминиращ кодон (Фиг.

2.12б). Тези мутации предизвикват преждевременно спиране на транслацията на дадена информационна РНК, при което се получава незавършен, по-къс белтък, на който липс-ва карбоксилния край. Нонсенс-мутациите обикновено имат сериозен ефект върху ак-тивността на белтъка и предизвикват мутантен фенотип. Такива мутации в бактериите се означават като полярни, тъй като те засягат и дисталните участъци в генома (тези, намиращи след мутацията) и предизвикват липса и на други белтъци, освен този, коди-ран от засегнатия ген.

2.5.2.3. Фреймшифт-мутации Тези мутации са резултат от инсерция (вмъкване) на една допълнителна база или

делецията (откъсване) на вече съществуваща база от секвенцията на гена. Ако броят на променените бази не е кратен на три, рибозомата чете от друга рамка на четене (измес-тване на рамката, frame shift) и се синтезират белтъци с напълно променена секвенция (Фиг. 2.12в). Фреймшифт мутациите имат сериозен ефект на кодираните белтъци и ви-наги са свързани с мутантен фенотип.

2.5.2.4. Тихи мутации Мутациите могат да възникват в третата база на кодона и поради изродеността на

кода те не предизвикват промяна на секвенцията на белтъка (Фиг. 2.12г). Тихите мута-ции не предизвикват промяна на кодирания белтък и нямат влияние върху фенотипа. Те

58

имат тенденцията да се натрупват в ДНК на организмите, което е известно като поли-морфизъм. Те допринасят за вариабилността на ДНК и индивидуалността на видовете.

a) Phe Asp Glu Pro Leo Cys Thr 5’ – TTC GAT GAG CCC TTG TGC ACG - 3’ Mутация G → A Phe Asp Lys Pro Leo Cys Thr 5’ – TTC GAT AAG CCC TTG TGC ACG - 3’ б) Phe Asp Glu Pro Leo Cys Thr Arg Gly Pro 5’ – TTC GAT GAG CCC TTG TGC ACG CGC GGT CCG - 3’ Mутация C → A Phe Asp Glu Pro Leo Stop 5’ – TTC GAT GAG CCC TTG TGA ACG CGC GGT CCG - 3’ в) Phe Asp Glu Pro Leo Cys Thr Arg Gly Pro 5’ – TTC GAT GAG CCC TTG TGC ACG CGC GGT CCG - 3’ Инсерция на А Phe Asp Glu Thr Leo Val His Ala Arg Ser 5’ – TTC GAT GAG АCC CTT GTG CAC GCG CGG TCC G - 3’ г) Phe Asp Glu Pro Leo Cys Thr 5’ – TTC GAT GAG CCC TTG TGC ACG - 3’ Мутация C → T Phe Asp Glu Pro Leo Cys Thr 5’ – TTC GAT GAG CCT TTG TGC ACG - 3’

Фиг. 2.12. а) Мисенс точкова мутация; б) Нонсенс точкова мутация; в) Фреймшифт точ-кова мутация г) тиха точкова мутация

2.5.3. Масивни мутации

Тези мутации предизвикват съществени промени на ДНК, често засягащи големи фрагменти от генома.

2.5.3.1. Делеции Тук се включват загуба на цели части от секвенцията на ДНК (Фиг. 2.13а). Коли-

чеството на загубите варира значително. Делециите могат да варират от загуба на само една база, до значителни секвенции; в някои случаи на цели гени.

2.5.3.2. Инсерции В този случай мутациите възникват в резултата на инсерции на допълнителни ба-

зи, обикновено от друга част на хромозомата (Фиг. 2.13б). Както и при делециите, ин-серциите могат да варират значително по големина на инсертирания фрагмент.

2.5.3.3. Ре-аранжировки Тези мутации включват промяна на позицията на фрагменти ДНК, както в гена,

така и между гени (Фиг. 2.13в). Един прост пример са инверсните мутации, при които една секвенция се делетира и след това отново се инсертира на същото място, но в обърната ориентация.

Масовите мутации предизвикват големи промени в секвенцията на ДНК и винаги имат сериозни въздействия върху кодирания белтък и много често са свързани с мутан-тен фенотип.

59

2.5.4. Мутации и болести

При човека и други висши организми мутациите играят значима роля в развитие-то на някои болести. Така например мутациите са безспорната причина за заболявания като хемофилия и цистозна фиброза (CS), а освен това допринасят и за развитие на рак.

Генетичните болести се предизвикват от мутации, ко-ито се унаследяват и предават от родителите на поколение-то. Мутациите могат да въз-никват случайно във всяка клетка, но обикновено такива мутации нямат ефект на орга-низма, тъй като отделните клетки непрекъснато се заме-нят. Затова пък мутации в по-ловите клетки (сперматозои-ди и яйцеклетки) могат да бъ-дат пренесени при опложда-нето и след това да присъст-ват във всяка клетка на ново-формирания организъм, кой-то след това става носители на мутациите и на свой ред могат да ги предават на следващото поколение. Гене-тичните болести най-често засягат един отделен ген. Му-тиралите гени варират широ-ко, което е причина и за ши-рокия спектър на генетичните болести.

Мутациите, свързани с развитие на ра стават в обик-новените, соматични клетки на тялото. Рак често се разви-ва във връзка с мутации на гени, участващи в регулация на клетъчния цикъл и делене-то на клетките. Такива мута-ции често предизвикват нова способност на клетките да се делят неконтролирано, което води до развитие на тумор.

к

Фиг. 2.13 (а) Делеционни мутанти (b) Инсерционни мутанти;(с) реаранжировки

60

2.5.5. Мутации на организмово ниво

В допълнение на дефиницията за мутациите като промени в секвенцията на ДНК, подобна дефиниция би могла да се използва и за характеризиране на мутантния фено-тип на мутантният организъм. Този подход може да се приложи както за еукариотните, така и за прокариотните организми, но най-често се свързва с прокариотните клетки. Известни са няколко мутантни фенотипа.

2.5.5.1. Ауксотрофни мутанти

На тези мутанти им липсва генен продукт, участващ в продуцирането на важни метаболити, като например аминокиселини. Те могат да се изолират на среди, в които има добавка на важния метаболит. Така например триптофановите ауксотрофи на E. coli не могат да синтезират триптофан и трябва да го получат от хранителната среда. Противоположност на ауксотрофите са прототрофите, които нямат специални храни-телни изисквания.

2.5.5.2. Температурно-чуствителни мутации Тези мутации са ограничени от условията, при които растат клетките, които могат

да оживеят само се култивират при определена температура. Ако се повиши темпера-турата клетките не могат да растат и загиват. Мутациите, които се проявяват като тем-пературно-чувствителни обикновено засягат някоя аминокиселина, критична за запаз-ване структурата на белтъка. Когато се повиши температурата, нестабилният белтък се денатурира и губи активността си, което има за резултат мутантен фенотип.

2.5.5.3. Антибиотично-резистентни мутанти Антибиотиците убиват бактериите от дивия тип и нямат ефект върху резистент-

ните бактерии. Антибиотична резистентност може да възникне по няколко начина, но най-често засяга бактериалния белтък, който се атакува от антибиотика.

2.5.5.4. Регулаторни мутанти В този случай мутантите губят способността да регулират експресията на белтъци

от гена или оперона. Например има регулаторни мутанти на E. coli, които експресират белтъци за разграждане на лактоза, дори когато в клетката липсва този субстрат. Те се наричат конститутивни мутанти и най-често възникват като мутации в lac-репресорния белтък.

2.6. Мутагенеза и репарация на ДНК

2.6.1. Мутагенеза

Мутациите могат да възникват и от грешки, които стават при репликация на ДНК. Те по правило са много редки и при бактериите възникват веднъж на 1010 бази, а при висшите организми вероятно честотата е по-голяма. Това се означава като честота на спонтанните мутации. Нивото на мутациите нараства когато клетките са изложени на въздействие на химични и физични агенти, известни като мутагени, които пряко про-менят структурата на отделните нуклеотиди. Това може да доведе до промяна или дори до липса на комплементарно свързване на базите, когато това се наложи при реплика-ция, като например присъединяване на грешен нуклеотида срещу модифицираната ба-за, което променя секвенцията на новосинтезираната ДНК. Следващата репликация прави тази промяна постоянна, при което ДНК секвенцията мутира (Фиг. 2.14). Някои мутагени действат по друг механизъм и предизвикват сериозни физически промени на ДНК, които могат да блокират репликацията и транскрипцията.

61

Фиг. 2.14. Механизми на мутациите (а) Мутации от грешки в репликацията; (b) Мутации от структурни промени на нуклеотидите , водещи до променена комплемента-ция

62

Съществуват цяла поредица природни и синтетични, органични и неорганични вещества, които взаимодействат с ДНК и могат да променят нейната структура и да предизвикват мутации. Повечето химични мутагени са канцерогенни и предизвикват рак. В допълнение има и физични въздействия, които предизвикват мутации. Това са йонизиращи излъчвания под формата на рентгенови лъчи, γ-излъчвания и нейонизира-ща радиация като ултравиолетова светлина или дори топлина.

2.6.2. Химични мутагени

Съществуват широк спек-тър химични съединения, които предизвикват мутации в ДНК. Някои химични мутагени са ба-зови аналози. Те са структур-но-подобни на нормалните ба-зи, които се намират в ДНК и могат по същия начин да се включват във веригата по време на репликация. Те предизвикват мутация с алтернативното ком-плементиране. Например 5-бромурацила (5BU) е базов аналог, който се получава от тимин. 5BU нормално компле-ментира с аденина, но освен то-ва може да претърпи и малка промяна, наречена тавтомерно изместване, след която може да се свързва и с гуанина. След

репликацията оригиналната двойка АТ се замества с двойката GC, при което на едната дъщерна верига се получава мутация (Фиг. 2.15).

Фиг. 2.15. (а) 5-бромурацил (b) мутации от 5-бромурацил

Други химични мутагени са известни като интеркалиращи агенти. Това са плоски молекули, които нарушават репликацията на ДНК чрез вмъкване между съ-седните базовите двойки на двойната спирала. Пример за това е етидиевият бромид, една моле-кула, която съдържа четири пръс-тена с относителна големина, сходна с двойката пурин-пиримидин. Предполага се, че етидиевият бромид интеркалира в двойната верига, предизвиквайки леко изместване на съседните бази (Фиг. 2.16). Не е ясно как това променя репликацията на ДНК, но цялостния ефект е инсерция на единичен нуклеотид в интеркали-

Фиг.2.16. (а) Етидиев бромид (ЕБ); (b) мутации от ЕБ

63

раща позиция, предизвикващи фреймшифт мутация в гена. Много мутагени

действат чрез химична модификация на базите. Някои предизвикват вмък-ване на алкилова или ари-лова група. Пример за то-ва са метилметан сулфо-на и етилнитрозокарба-мид, които добавят мети-лова група към базите в няколко позиции (Фиг. 2.17). Други химични мо-дификации включват деа-миниране. Например азо-тистата киселина деами-нира окислително цитози-на, при което се получава

урацил (Фиг. 2.18), който образува комплементарна двойка с аденина. След репликаци-ята това има за резултат получаване на две алтернативни базови двойки – GC и AT. Деаминирането на аденина до един гуанинов аналог, наречен хипоксантин предизвиква замяната на АТ двойката с GC.

Фиг. 2.17.Примери за (а) алкилиращи агенти (b) алкилиращи бази

Фиг. 2.18. Депуринизация на цитозина до урацил

Мутациите могат да възникват и спонтанно поради естествената реактив-ност на ДНК с някои други естествени вещества в клетката. Така например цито-зинът претърпява спонтанно деаминиране

до урацил. Освен това цитозинът, който често присъства като 5-метилцитозин може да бъде спонтанно деаминиран до тимин. Много типична модификация, която възниква

спонтанно е депуринация, което става с разрушаване на връзката между де-зоксирибозата и нейния пурин (Фиг. 2.19). Повреда на базите може да въз-никне и в присъствие на активни кис-лородни форми (reactive oxygen species, ROS). Такива могат да са су-пероксиди, водороден пероксид и во-дородни радикали.

Фиг. 2.19. Депуринизиране на ДНК

2.6.3. Физични мутагени

Високата енергия на йонизиращата радиация, каквито са рентгеновите лъчи или γ-лъчите предизвикват повреда в ДНК молекулите, предизвиквайки прекъсвания на вери-гата и повреди в пентозите и захарите. Нейонизиращите лъчения, каквито са UV-лъчите се поглъщат от базите и предизвикват структурни промени в тях. В частност UV лъчите могат да предизвикат формиране на структури, наречени циклобутилови димери между съседни пиримидини и по-специално – тимини (Фиг. 2.20). Димеризацията предизвиква по-голямо сближаване на базите и делеционни мутации по време на репликацията. Топлината е също значителен мутаген от околната страна. Ефектът на топлината е да

64

образува апуринови сайтове в полинуклеотидната верига на ДНК, което може да предиз-вика точкови или делеционни мутации когато ДНК се реп-лицира.

2.6.4. Репарация на ДНК

Изискването секвенцията на ДНК да се запазва при всички случаи, независимо от въздействията на околната среда, които могат да предизвикат мутации, кара организ-мите да развиват механизми, които предпазват ДНК от повреди в резултат на мутации, чрез репариране на получените повреди. Репаративните механизми са сложни, но най-често възникват три от тях.

Фиг.2.20. Формиране на тиминови димери от UV радиация

2.6.4.1. Ексцизионни репарации Това е комплексна система, която вероятно е най-широко използвана за репарация

на ДНК. Така се репарират множество типове повреди, включително и пиримидинови димери. Първоначално един ензим сканира нуклеотидите, които са повредени и ги мар-

кира за репарацията. Маркирането може да е под формата на еднове-рижно прекъсване (nick), в съседство с повредата, или повредената база може да бъде премахната, което ос-тавя празно място. В следващата фа-за нуклеазен ензим премахва марки-рания нуклеотид, както и няколко нуклеотида наоколо. След това ДНК полимераза (ДНК полимераза I в E. coli) синтезира нова верига ДНК в замяна на липсващите бази, а лигазен ензим свързва старата и ново синте-зираната верига, при което се възста-новява оригиналната структура на ДНК (Фиг. 2.21).

2.6.4.2. Пряка репарация Това е много по-малко използ-

ван механизъм и представлява възс-тановяване на структурни промени, възникващи в нуклеотидите. Важен пример за пряка репарация е фоторе-активацията, която репарира пири-мидиновите димери, получени при UV-лъчението Една група ензими, наречени фотолиази се активира от видимата светлина и репарира тими-

новите димери чрез прекъсване на връзките, формирани при димеризацията. ДНК фо-толиази има при бактерии, едноклетъчни еукариоти и растения.

Фиг. 2.21. Ексцизионна репарация на ДНК

2.6.4.3. Репарация на грешни нуклеотиди (mismatch repair) Тази система поправя грешки, възникнали по време на репликацията чрез иден-

тифициране на грешно комплементираните (mismatch) нуклеотиди. Няколко ензима

65

разпознават тези нуклеотиди и ги маркират или могат да ги отделят. В този процес е важно да се различават грешните бази и ензимът върши това чрез сравнение с матрич-ната верига. При E. coli матричната верига се различава лесно, защото е маркирана чрез метилиране на адeниновите бази.

2.4.5. Генотоксикология

Това е наскоро развит клон от токсикологията, който идентифицира мутагените в околната среда. Много агенти, които предизвикват рак, карциногените, са също мута-гени. Идентифицирането на мутагените е важно за редица области, като например фар-мацевтика, хранителна индустрия, селско стопанство, анализ на замърсяване в индуст-риалните процеси. По тази причина е необходимо да се развият тестове за идентифици-ране на опасни съединения. Ранните тестове са провеждани на дребни животни като мишки и плъхове, но те са сложни, продължителни, скъпи и търпят съществена критика в етично отношение. Затова са развити множество in vitro тестове, които използват бак-терии или животински клетъчни култури, растящи на хранителни среди. В някои стра-ни има официални изисквания за тестване на всички нови химикали, преди одобряване-то им за използване

Най-добре известен е т. нар. Амес тест (Ames Test), който е особено бърз тест за мутагени. Той използва бактерии от вида Salmonella typhimurium, които имат мутация в хистидиновия оперон (Вж. 1.10), поради което не могат да синтезират хистидин. Такива мутанти се наричат хистидинови ауксортофи (his-). Веществата се тестват за способ-ността им да ревертират тази мутация. Тестът може да се извърши много лесно, като бактериите his- се посяват върху агарова хранителна среда, която съдържа само следи от хистидин. Изследваното вещество или хартиен диск, напоен с разтвор от него се поставят върху повърхността на агара. Бактериите растат съвсем кратко, докато има хистидин. Бактериите, които след това могат да продължат да растат са само тези, кои-то са претърпели реверсия на мутацията и могат да синтезират собствен хистидин, т. е. те са вече хистидинови прототрофи (his+). Ако веществото не е мутаген, тогава ще се наблюдават случайно разпределени редки ревертирали колонии. Ако то има мутагенна природа, тогава ще има повече колонии, които освен това ще са струпани около трети-раните места. Разбира се тестът може да се конструира и на количествена основа, за да се определи дозовата концентрация на веществото.

За идентифициране на максимален брой мутагени се използват два типа his- му-танти, като единият от тях е единична базова субституция, а другият е фреймшифт му-тант (Вж. 2.5). Това позволява да се установят мутагени с различно въздействие върху ДНК. Възможно е генетично да се модифицира пропускливостта на бактерията за мута-гена, както и да се намали възможността за репарация на повредите. И двата подхода повишават шанса да се установи мутагенната активност.

Някои съединения, които са известни като причиняващи рак стават такива, след като бъдат променени в мутагени от ензимите в организма. Те са известни като про-карциногени. Действието на ензимите ги променя до крайни канцерогени. Ако про-карциногените се тестват с Амес-теста, ще се получи отрицателен резултат, макар че тестът може да се модифицира, за да открива и такива вещества. Така черният дроб е богат на активиращи ензими, затова ако към тестовата суспензия се добави екстракт от черен дроб, съдържащ тези ензими, тестът ще може да се използва и в този случай. Ак-тивирането на прокарциногените ще се прояви с нараснало количество ревертирали му-танти. Амес теста е бърз – той може да се извърши за 48 часа и освен това може да дава и количествени резултати. По този начин са идентифицирани множество мутагени, та-кива като бои за коса, хранителни багрила и др.

66

Веществата, които повреждат хромозомите се наричат кластогени (clastogens). Те също са определени чрез тест-системи. Тези тестове могат да се правят на клетъчни ли-нии, лабораторни животни или дори на растения. Тестът се състои в определяне на хромозомните аберации като разкъсвания, обмени, пръстеновидни хромозоми, дицент-рици и транслокации. Честотата на аберациите е често ниска. Един алтернативен начин за характеризиране на масовите хромозомни аберации е преброяването на обмените на сестринските хромозоми. Това е явление, при което се обменя материал между двете хроматиди на една и съща хромозома и е процес, който се наблюдава с ниска честота във всички клетъчни типове. Той може да възникне както при мейозата, така и при ми-тозата. Ползата от този подход е, че честотата на тези обмени при третиране с класто-гени нараства много по-бързо, отколкото масовите хромозомни аберации. Обмяната може да се проследи с няколко различни процедури, базиращи се на полуконсерватив-ния механизъм на репликация на ДНК (вж. раздел 1.9). В основата на техниките е раз-личното багрене на двете хроматиди, така че обмените да са видими. Това се постига със сложен метод на багрене, след двукратно инкубиране на клетките в присъствие на тиминовия аналог бромдезоксиурацил (BrdU). При репликацията той замества тимина в новосинтезираната хроматида, което променя начина, по който тя се багри, при което едната се багри по-тъмно, а другата – по-светло.

2.7. Рекомбинация

Рекомбинацията означава създаване на нови комбинации на генетичната инфор-мация на ДНК молекулата (хромозомата). При това явление не става дума за размесе-ното разпределение на целите хромозомите, които са отделни молекули ДНК, в гамети-те и зиготите. Механизмите на рекомбинация включват взаимодействие между две двойноверижни молекули ДНК (dsДНК), при което двете вериги се разкъсват и след това се свързват различни краища, а процесът е по-близък до сплайсинга. Процесът се нарича още кросинговър и се вижда като наличие на хиазми (прещъпвания) по време на мейозата. Мейотичния кросинговър (вж. раздели 2.3 и 2.4) засяга една dsДНК - хро-матида от всяка от двете хомоложни хромозоми.

2.7.1. Генерална рекомбинация

Това е тип рекомбинация, чийто механизъм еукариотите използват за рекомбини-ране хроматидите по време на мейоза. Бактериите също го използват за да включват хомоложни области от чужда ДНК в техните хромозоми, след като ДНК навлезе в клетката по време на конюгацията (полов процес при бактериите), при трансдукция (чрез бактериофаги) или чрез трансформация (ДНК просто се приема от клетката от околната среда). Това е реципрочен процес на обмяна между две хромозоми и при еу-кариотите е полуконсервативен процес (нищо не се губи и нищо не се печели с изклю-чение на конверсията; виж по-долу). Ефектът е, че двете хомоложни двойноверижни ДНК молекули се доближават, разкъсват се на едно и също място и всеки откъснат край се свързва отново със съответния му край на другата молекула, за да се обмени (реком-бинира) целия край на dsДНК. Молекулният механизъм прилича повече на сплайсинг, отколкото на отрязване на тъп край и свързване на тъпи краища, и генетичната инфор-мация се запазва. В бактериите ДНК, която не образува стабилна пръстеновидна струк-тура ще бъде загубена от клетката. Генералната рекомбинация изисква наличие на го-ляма област на хомология между две dsДНК (почти идентични секвенции), обикновено с дължина около стотина нуклеотида. Вероятно минималната дължина на хомология за рекомбинация варира при различните видове.

67

2.7.2. Структури на Холидей

Най-важната междинна структура при рекомбинацията е образуване на структура на Холидей (наречена така по името на Robin Holliday), наричана още свръзка на Хо-лидей или полукръстосване Теоретично това може да стане чрез едноверижни пре-късвания на две вериги с еднаква организация, като всяка се намира на отделна двойна верига ДНК, последвано от кръстосано обменяне на прекъснатите краища, така че едната прекъсната верига се прехвърля на противоположната двойна спирала и обрат-но. Прехвърлените вериги образуват комплементарна двойноверижна структура с ин-тактната комплементарната верига на противоположната двойна спирала (Фиг. 2.22). От двата освободени края при прекъсването се прехвърлят 3’-краищата, защото те мо-гат да служат за субстрат на ДНК полимеразата и да бъдат удължавани. Причината е че ензимът работи само в посока 5’-3’, т.е. нови нуклеотиди могат да се добавят само към свободен 3’-край. Няма доказателство коя верига започва първа прехвърлянето. Това

прехвърляне на веригите е на прак-тика размяна на партньорните вериги в ДНК. В оригиналният модел на Холидей се предполага, че двете прекъсвания възникват на едно и също място в двете двойни вериги (хроматиди), както е показано на фиг. 2.22, но има генетични доказа-телства, че такива прекъсвания могат да стават и асиметрично.

За да вземе предвид тази аси-метрия моделът е ревизиран и е на-речен модел Авимор (Aviemore) по мястото на симпозиума, на който е дискутиран или модел на Мезелсон-Радинг (Messelson-Radding), по име-то на авторите на публикацията. Ос-новната разлика с горния модел е, че първоначално се прекъсва само едната верига на едната двойна спи-рала и тя се прехвърля върху друга-

та. Изместената при това верига частично се разгражда и след това се прехвърля върху оригиналната донорна верига (в която започва едноверижното прекъсване) и там фор-мира структурата на Холидей (Фиг. 2.23а). Едноверижното празно място, което се фор-мира в донорната верига се запълва от синтезата на ДНК от ДНК полимеразата (пока-зано е с пунктир на Фиг. 2.23а). По този начин прехвърлянето е асиметрично спрямо началното прекъсване. Този модел е много удачен, тъй като всеки свободен край може да се разгради от ендонуклеаза, всеки недостигащ край може да се синтезира от ДНК полимераза, и всеки два свободни края биха могли да се свържат от ДНК лигаза.

Фиг. 2.22. Формиране на структура на Холидей чрез прекъсване на единичните вериги и размяна на краи-щата с еднаква полярност; (b, c) мигриране на кръс-тосването чрез ротационна дифузия

Структурата на Холидей има интересни особености. Ако двете двойни вериги се въртят в една и съща посока (ротационна дифузия), тогава двете обменени единични вериги ще се развиват от едната верига и ще се увиват около другата. Мястото на тях-ното прекръстосване (branch point) се движи по хроматидите и се нарича мигриране на кръстосването (branch migration) (Фиг. 2.22с). Друга особеност е, че и четирите двойноверижни ДНК, излизащи радиално от мястото на обмяна на едноверижните ДНК (ssDNA) са структурно идентични (Фиг. 2.23). Тази организация може да претърпи

68

изомеризация на веригите (strand isomerization), така че се обменят или двете 3’-5’ ве-риги, или двете 5’-3’ вериги (тези, с антипаралелен ход). Описаните механизми са пока-зани подробно на Фиг. 2.23. В началото (Фиг. 2.23а) става прехвърляне на единичните вериги. Това се вижда по-добре ако веригите се нарисуват с прави линии (Фиг. 2.23b). В оригиналните вериги краищата А и В са на едната хроматида, а C и D – на другата. Структурата може да се отвори (Фиг. 2.23d), след това да се завърти за да обърне краи-щата C и D, при което се премахва кръстосването на разрязаните краища А и В (Фиг. 2.23е). Сега структурата е отворена с четири еквивалентни края. Размяната на краищата В и C причинява кръстосването на интактните (неотрязани) краища (А-В и D-C) (Фиг. 2.23f). Разкъсването и лигирането на тези краища предизвиква рекомбинация (кросин-говър) (Фиг 2.23g и h). Сега краищата А и D са едната хроматида, а С и В – на другата.

Фиг. 2.23. Формиране (a, b); изомеризиране на веригите (d, e, f) и алтернативно разре-шаване (b, c и g, h) на структурата на Холидей.

Като цяло структурата може да бъде завършена чрез разкъсване на веригите с еднаква полярност и свързването им по различен начин, така че да могат да се разделят двете двойноверижни ДНК. Ако двете единични вериги, които първоначално са разме-нени се разрежат и краищата им се разменят и след това се свържат (лигират), тогава ще се възстановят оригиналните dsДНК вериги без всякаква рекомбинация (Фиг. 2.23с).

69

Ако другите две вериги се отрежат и обме-нят, тогава и двете единични вериги в двете спирали на ДНК ще бъдат разрязани и об-менени. Именно това е последователното разкъсване и свързване, което причинява рекомбинация на гените, тъй като краищата на веригите ДНК са били обменени. Имен-но това е и процесът рекомбинация – ре-комбинация. Това може добре да се види на схемите на Фиг. 2.23. В процеса на реком-бинация вземат участие белтъци, които за-въртат мястото на кръстосване, предизвик-ват въртене чрез развиване на противопо-ложните спирали, както и извършват рязане и лигиране на кръстосаните единични вери-ги.

2.7.3. Модел с разкъсване на двете вериги

Този модел е направен, за да обясни механизмът на кросинговър, който се наб-людава при S. сerevisiae (дрожди). Много е възможно този механизъм да функционира при всички еукариоти, а моделът от Авимор въобще да не става в природата. Всъщност има много малко данни за това как се из-вършва кросинговъра при еукариотите с по-големи геноми. Много учени смятат, че по-голямата сложност и големина на еукариот-ните геноми изисква по-прецизни механиз-ми от двойното прекъсване на веригите. Инициацията на рекомбинацията на S. cerevisiae започва с двойноверижно прекъс-ване на едната от двете вериги на ДНК. Белтъкът, който върши това – SPO11, е сро-ден с топоизомеразите от клас II и формира

ковалентни ДНК-белтък връзки през прекъсването. 5’-краищата се разгражда в обратна посока, за да останат 3’-краища с дължина около 500 bp, които могат да бъдат доказани биохимически. Моделът предполага, че тези 3’-краища атакуват интактната хомоложна двойна спирала на ДНК (Фиг. 2.24b) и могат да инициират удължаване на тези краища през прекъсването с ДНК полимераза, използвайки комплементарната верига на интак-тната dsДНК като матрица (Фиг. 2.24с). Когато се пресече прекъсването, следва обмяна на веригите, което образува структура на Холидей – по една на всяка страна на ориги-налното прекъсване (Фиг. 2.24d). Ако и двете се завършват по същият начин (същите вериги се разкъсват/съединяват във всяка), тогава няма да има рекомбинация (Фиг. 2.24е), но секвенцията в прекъснатото място в съответната прекъсната хроматида ще бъде конвертирана до същата секвенция, както другата хромозома. Ако двете структури на Холидей се завършат по друг начин, ще има обмяна (кросинговър), която може да бъде от двете страни на прекъсването и краищата на двете двойни вериги ще бъдат ре-комбинирани (Фиг. 2.24f).

Фиг. 2.24. Модел за рекомбинация с разкъс-ване на двете вериги. (а) получава се двойно-верижно прекъсван, след което (b) сво-бодните краища се прехвърлят към интак-тния хомолог. Те се удължават през прекъс-ването(с, празни стрелки) и се формира по една структура на Холидей от всяка страна (d). Това може да завърши или с конверсия (е) или с рекомбинация (f).

70

Конверсия

Конверсията е феномен, който има за резултат не-Менделови съотношения в че-тирите хаплоидни клетки, получени при мейотичното делене на една клетка. Ако цяла-та генетична информация е консервативна, то две от четирите хаплоидни клетки ще унаследят копие от един алел, а другите две – копия на другия алел, в съответствие със законите на Мендел. Понякога това правило се нарушава и възниква съотношение 3:1. В някои гъби има второ митотично делене, което удвоява хаплоидните продукти на ме-йозата, формирайки осем хаплоидни спори, променяйки съотношението от 3:1 до 6:2. Това може да даде съотношение 5:3, аномално съотношение 4:4 или по-рядко – 7:1. В този случай сестринските клетки от едно поколение са различни, явление, което е из-вестно като следмейотично разпределение (post meiotic segregation, PMS). Двойнове-

рижната ДНК, формирана в резултат на рязания и свързвания при рекомбинацията ве-роятно има неправилно комплементирани нуклеотиди (Фиг. 2.25). Тук трябва да се от-бележи, че при асиметричното свързване на хроматидите ще има неправилно свързан и бази).

Фиг. 2.25. Конверсия на гена чрез корекция в хетеродуплексната ДНК

Да предположим, че едната от родителските хромозоми в двойката има АТ базова двойка, докато другата (нейният хомолог) има CG. Ако в тази област се обменят еди-нични вериги, тогава хетеродуплексът ще има (съставен от по една ssДНК верига от двете хромозоми) ще има АG и СТ базови дойки. Ако тези грешки се разпознаят от ре-парационните ензими, те могат да бъдат променени на АТ или GC базови двойки и вся-ка друга грешка на другите вериги може да бъде поправена по двата начина (или изоб-що да не бъде репарирана). Тогава три от четирите хроматиди могат да съдържат съща-та секвенция. Ако грешките не се репарират преди следващата синтеза на ДНК, тогава двете вериги ще се използват като матрици за синтеза на нови дуплекси. Те ще се раз-делят в последващата митоза, давайки дъщерни клетки с различни секвенции – едната АТ, а другата CG. Тъй като това става при митозата, след мейозата, процесът се нарича следмейотично разпределение. За всяка хроматида има три възможности, двете насо-чени към репарация или липса на репарация, така че има девет възможни комбинации, една от които възстановява родителското подреждане. Хетеродуплекс, който може да съдържа грешно комплементирани бази е показан още на Фиг. 2.23 и на Фиг. 2.24. Си-метрична размяна без репарация дава съотношение 4:4 след PMS.

Конверсията, и по-конкретно съотношение 3:1 след мейозата се обяснява лесно с модела на двойноверижното прекъсване тъй като секвенцията на базите в прекъсната хроматида винаги се замества като информация за секвенцията се взема от другата хо-моложна хромозома.

71

2.7.4. Ензими на рекомбинацията

Рекомбинацията включва много белтъци. Няколко от тях са сходни с белтъка RecA от E. coli, който се свързва с едноверижната ДНК (ssДНК) и я инсертира в хомо-ложната двойноверижна ДНК (dsДНК). Тези белтъци при бактериите, дрождите и чове-ка са много сходни. Много от ензимите, които участват в репарацията също се наблю-дават и при мейотичната рекомбинация. Репарацията на двойноверижни прекъсвания в резултат на йонизиращи лъчения е много активна в дрожди и включва серия рекомби-нации, подобно на модела, който описва разкъсванията и свързванията на веригите ДНК. Ензимите, които извършват репарация чрез изрязване на нуклеотиди и замяната им с други (excision repair) също се използват широко в мейотичната рекомбинация. Ензимни системи, които разпознават грешно комплементирани нуклеотиди (mismatch), като например тези, които репарират тиминовите димери след ултравиолетово облъч-ване, също изглежда функционират в мейозата. Някои белтъци, които репарират не-комплементарни нуклеотиди се откриват на етапа на свързването и синапса на целите хомоложни хромозоми и могат да помагат в ограничаване на рекомбинацията в хомо-ложната ДНК. Отхвърлянето на некомплементарните двойки може да предотврати ре-комбинацията между хромозомите на хибриди от близки видове, като по този начин се осъществява след-размножителна изолация на тези видове. Други репарационни белтъ-ци се локализират на местата на рекомбинация. Гените, необходими за рекомбинацията са обикновено основни за нормалната репарация на повредите. Когато те не функцио-нират, повредите в ДНК предизвикват мутации, които предизвикват рак. Нормалния продукт на човешкия ген за рак на гърдата Brca1 е част от синаптичния комплекс, кой-то играе роля в свързването на две вериги и за рекомбинацията на хромозомите при ме-йозата (Вж. 3.3). Гените, които са дефектни при заболяването атаксия, също играят важна роля при мейотичната рекомбинация.

2.7.4. Сайт-специфична рекомбинация

Бактериофагът ламбда (λ) може да интегрира своята ДНК в хромозомата на гос-топриемника си E. Col., Тя остава неактивна и се реплицира заедно с бактериалната хромозома. Явлението е известно като лизогения. Това става чрез рекомбинация меж-

ду секвенция от 15 нуклеотида в бактериалната хромозома (нарича-на att от свързване – attachment) и идентична секвенция в пръстено-видната хромозома на бактериофа-га. Тази реакция изисква интегри-ращ ензим (наричан Int), кодиран от бактериофагната ДНК. Изрязва-нето става също чрез рекомбина-ция, която се катализира в този случай от изрязващ ензим ексци-зионаза (excisionase), кодирана от гена xis в бактериофага.

Фиг. 2.26. Структура на бактериофага (а) икосаедрална (b филаментозна или спирална;(с) глава и опашка

2.8. Бактериофаги

Бактериофагите (фаги) са ви-руси, които инфектират бактерии-те. Съществуват много различни типове бактериофаги, които имат

72

тенденция да са специфични за гостоприемника, инфектирайки точно опредена бакте-рия. Както и при другите вируси, структурата им се състои от вътрешен ДНК геном, за-обиколен от външна защитна обвивка. Има три типа вируси, показани на Фиг. 2.26: а) икосадрални, при които отделните белтъчни молекули образуват геометрична струк-тура, която затваря генома. Пример за това е фага MS2, който инфектира E. coli; b) фи-ламентозни или спирални, при които полипептидните единици са организирани като спирала и образуват пръчковидни структури; c) структура глава и опашка, която е най-сложна и с състои от икосаедрална глава и филаментозна опашка, която позволява на фаговата ДНК да преминава в бактерията. Пример за това са фагите на E. coli Т2 и λ. Нуклеиновата киселина на фагите може да е ДНК или РНК, които могат да са еднове-рижни и двойноверижни. Най-често всички гени са разположени на една единствена верига ДНК, като по-рядко и двете вериги могат да са кодиращи. Понякога в бактерио-фага има няколко отделни вериги и такива фаги се означават като сегментирани. Фа-говите геноми варират силно по големина от само няколко килобази (kbp), до около 150 kbp. Броят на гените е обикновено пропорционален на големината на генома. Геномът на фага М13 е около 6 kbp и има само 10 гена. По-големите фаги и по-специално тези с по-сложна структура (глава и опашка) обикновено имат много повече. Например Т4 при 166 kbp има 150 гена. Гените на фагите кодират белтъци за образуване на капсида и ензими, участващи в репликация на вирусната ДНК. Всички фаги изискват поне някол-ко белтъка и РНК от гостоприемника. Характеристиката на някои фаги (като например на φХ174), срещащи се и в някои еукариотни вируси е, че те имат т. нар. се припокри-ващи се гени, транслирани в различни рамки на четене.

2.8.1. Жизнен цикъл на бактериофагите

Явленията, които следват след инфекцията варират, но като цяло има два основни на-чина за развитие на бактерио-фагите – литична и лизогенна инфекция. При литичният път фагите предизвикват лизис на клетките на гостоприемника скоро след инфекцията. При лизогенният път фагите пре-дизвикват лизис едва след про-дължителен период от време, през което те остават неактив-ни. Различните фаги могат да преминават и двата пътя на развитие. Фагите, които пре-дизвикват литична инфекция се наричат вирулентни. Тези, ко-ито преминават през литична инфекция се означават като умерени. Фиг. 2.27. Литична инфекция на E. coli от фага Т4

2.8.2. Литичен път на Т4

Фагът Т4 причинява литична инфекция в E. coli (Фиг. 2.27). Фаговите частици се закрепват за рецепторни белтъци на повърхността на E. coli, наречени ОmpC (продукти на гена ompC) и фаговата ДНК се инжектира в бактерията чрез опашната структура на

73

Т4. Вътре в клетката започва транскрипция на фаговата ДНК, а синтезата на клетъчните ДНК, РНК и белтъци се потиска. ДНК на бактериалната клетка се деполимеризира, а нуклеотидите се използват за репликация на фаговата ДНК. Синтезират се белтъци на фаговия капсид и се сглобяват нови фагови частици. Най-накрая клетката се лизира и от нея излиза 200-300 нови фаги.

Лизогенен цикъл на ламбда-фага

Умерените фаги, към които спада и ламбда-фага могат да причинят литична ин-фекция на E. coli, но по-често поемат алтернативния път на лизогенията (Фиг. 2.28).

След като фагът инжек-тира своята ДНК в клет-ката, тя се циклизира и след това се интегрира в бактериалната хромозо-ма. Интеграцията става чрез рекомбинация и включва секвенция от 15 bp от фаговата секвен-ция, хомоложна на сек-венция в ДНК на E. coli. Интеграцията става ви-наги на едно и също място, а интегрираната форма се нарича про-фаг. Той остава необез-покояван много поколе-ния и се реплицира за-едно с бактериалната хромозома. В края на краищата след множест-во клетъчни деления, става превключване на механизма на лизогения, към цикъл на лизис. То-

ва се индуцира от множество физични и химични стимули, като всички са свързани с повреди на ДНК и водят евентуално до крайната смърт на клетката. В отговор на тези сигнали фаговата ДНК се изрязва от бактериалния геном чрез обратна рекомбинация. Синтезират се фагови капсидни белтъци, фаговата ДНК се реплицира и се пакетира в капсида. В края клетката се лизира и от нея излизат нови фагови частици.

Фиг. 2.28. Лизогенна инфекция на E. coli от фага λ

2.8.3. Фагът M13

Някои фагови цикли показват вариране в на литичния и лизогенния път. Пример за това е фагът М13, който инфектира E. coli. Неговият геном е едноверижна, пръсте-новидна ДНК молекула. При инфекцията от ензимите на гостоприемника се формира двойноверижна репликативна форма (RF). Синтезират се множество RF, които служат като матрици за синтеза на едноверижни форми, които се пакетират в капсиди и изли-зат от клетката, без да я лизират. Фагите се разпространяват чрез деленето и инфекти-раните с М13 клетки продължават да растат и да дават дъщерни клетки, заразени с фа-га. Някои особености на М13 ги правят особено удобни да се използват като удобни клониращи вектори за молекулярната биология. Двойноверижните RF могат лесно да

74

се пречистват както плазмидите, а едноверижната ДНК е идеална матрица за секвени-ране на ДНК.

2.8.4. Експресия на гените при литичната инфекция

Фагите показват различни степени на регулация на генната експресия. Обикнове-но геномната репликация предшества синтезата на капсидни белтъци, а лизозима, ен-зим който предизвиква лизис на бактерията, се формират накрая на клетъчния цикъл. За простите фаги като φХ174 регулацията е минимална. Всичките 11 гена се транскриби-рат от клетъчната РНК полимераза веднага след инфекцията. Въпреки това синтезата на лизозима, който е нужен последен се забавя, чрез забавяне на транслацията му в срав-нение с другите продукти. При повечето други фаги има две фази на генна експресия, известни като ранни и късни. Ранната експресия на гените е обикновено свързана с репликация на фаговия геном, а късната генна експресия – с продуцирането на струк-турни белтъци. Ранните гени се експресират първи и са отговорни за активиране на ек-спресията на късните гени. При Т4 най-ранните гени се транскрибират от бактериална-та РНК полимераза, като се използва секвенцията на фаговия промотор, която е много сходна с бактериалните промотори на E. coli. Някои от транскрибираните гени кодират синтезата на белтъчни продукти, които така модифицират бактериалната РНК полиме-раза, че тя спира да различава бактериалните промотори. Това предизвиква изключване на генната експресия на гостоприемника, но едновременно с това води до експресия на втора група фагови гени (Вж. 1.10). Някои от тях кодират белтъци, които по-нататък модифицират спецификата на полимеразата, така че тя транскрибира трета група гени. По този начин експресията на фаговите гени е организирана на фази, като продуктите на ранните гени включват по-късните.

2.8.5. Генна експресия при лизогенна инфекция

Бактериофагът λ е изследван подробно като модел за фаговата генна експресия. При инфекция на E. col,i фагът може да премине или в литичен или в лизогенен цикъл. Генната експресия на λ-фага има три фази – бърза ранна, забавена ранна и късна. Експресията на ран-ните гени се регулира от два про-мотора – PL и PR, намиращи се от двете страни на регулаторния ген, наречен cI, който кодира един реп-ресорен белтък (Фиг. 2.29). По време на лизогенията транскрип-цията от PL и PR е блокирана от белтъка на cI, който освен това стимулира собствената си експре-сия, когато е свързан с PR, който се застъпва с промотора на cI. Докато присъства репресорният белтък, експресията на ранните и по-късните гени е блокирана и така се поддържа лизогенията. Изборът между литичния и лизогенен път

Фиг. 2.29. Контрол на експресията на λ фага, (а) cl реп-ресорът блокира транскрипцията на ранните гени и стимулира транскрипцията на cl. (b) cro репресорът блокира транскрипцията на cl гена, позволявайки експ-ресия на ранните гени

75

включва използването на един белтък, наречен Сro, който играе ролята на репресор на транскрипцията на cI. След инфекцията, бактериалната РНК полимераза започва транс-крипция на λ-гените от няколко λ-промотора. Тогава се експресира и cI, който предотв-ратява транскрипцията на ранните гени, като по този начин блокира литичния цикъл. Генът сro също се транскрибира и ако се натрупа достатъчно количество Cro белтък, cI се репресира и така се премахва блокирането на литичния път. Конкуренцията между cI и cro и изборът между лизогения и лизис изглежда е случаен и зависи от това колко бързо се натрупва даден белтък. Докато има достатъчно количество cI се поддържа ли-зогенията. Ако нивото му намалее, спонтанно ще се индуцира лизис. Индукцията на лизиса, който следва след лизогенията може да се включи от агенти като йонизираща радиация, която активира общата защитна система на E. coli, наречена SOS отговор. Това включва гена recA, който инактивира репресора cI, като го разгражда. Когато cI е активиран, се активират ранните гени, лизогенията свършва и се индуцира литичният път.

2.9. Еукариотни вируси

2.9.1. Вируси – обща характеристика

Вирусите са субмикроскопични инфекциозни агенти, съставени от геном от нук-леинова киселина, обвит в белтъчна обвивка. Те са паразитни и се репродуцират чрез инфектиране на клетката и използване на нейната способност да реплицира ДНК и да синтезира белтък. Трудно е да бъдат дефинирани като живи организми, защото не мо-гат да съществуват независимо. Много вируси са патогени и предизвикват разрушаване на клетката-гостоприемник, което води до заболявания при човека и другите организ-ми. Освен еукариотните организми, прокариоти като бактериите също могат са бъдат инфектирани от вируси, наречени бактериофаги (вж. раздел 2.8).

2.9.2. Вирусни геноми

Има много различни типове вируси, които инфектират еукариотните клетки. Те се различават по отношение на нуклеиновата киселина на техния геном, която може да бъде едноверижна или двойно верижна ДНК или РНК. Нуклеиновата киселина може да бъде също линейна или пръстеновидна. В някои случаи вирусният геном е единична молекула от нуклеинова киселина, но в други вирусните гени съществуват върху пове-че от една молекула и тези геноми се означават като сегментирани. Едноверижните геноми се реплицират чрез двойноверижни междинни форми и могат да имат позити-вен или негативен смисъл. Тези форми касаят секвенцията на генома и иРНК, транск-рибиран от него. Ако геномът е с позитивен смисъл, секвенцията му ще бъде същата, както на транскрибираните от него иРНК. Обратно – негативните геноми имат секвен-ция, която е комплементарна на иРНК. В някои случаи геномът можа да кодира и пози-тивна, и негативна иРНК. Много вирусни частици нямат пълен или функционален ге-ном и за това могат да се реплицират само ако са подпомогнати от ко-инфекция на клетката с вирус от див тип, който може да се реплицира и който се означава като хел-перен вирус (helper virus) или от процес, известен като комплементация, при който става ко-инфекция с дефектен вирус, но с друга мутация.

2.9.3. Структура на вирусите

Вирусният геном е затворен в защитна белтъчна обвивка, известна като капсид, която е изградена от отделни вирусно кодирани белтъци. Комбинацията от генома и капсида се нарича нуклеокапсид. Съществуват две основни форми на вирусите (Фиг. 2.30): а) икосаедрални – при тях отделните полипептидни молекули образуват геомет-

76

рична структура, която обгражда нуклеиновата киселина; б) филаментозни или спирал-ни – в този случай полипептидите са организирани като спирала, за да формират пръч-ковидна структура, заобикаляща нуклеиновата киселина. При много вируси капсидът е заобиколен с липидна обвивка, получена от мембраната на клетката гостоприемник, ко-гато вирусът излиза от нея. В мембраната могат да се инсертират вирусно-кодирани

гликопротеини и белтъци от клет-ката. Вирусните гликопротеини участват в инфекцията чрез взаи-модействие с рецепторни белтъци на повърхността на клетката. Има и матриксни белтъци, които осъщес-твяват взаимодействие между нук-леокапсида и липидната обвивка. Матриксните и капсидните белтъ-ци имат също и други функции, свързани с вирусната репликация и транскрипция на вирусните гени. Структурните белтъци на вируса са често антигенни и представляват интерес за създаване на ваксини.

2.9.4. Стратегии на репликация

Вирусите се копират като из-ползват способността на клетката

да реплицира ДНК и синтезира белтъци. Стратегиите на вирусите за репликация на ви-русния геном и транскрипция на вирусните гени варират много. Всички вируси зависят от клетката за транслацията и в различна степен за транскрипцията и репликацията. ДНК вирусите са по-зависими от клетъчните ензими, отколкото РНК вирусите и малки-те ДНК вируси са по-зависими, отколкото големите ДНК вируси. РНК вирусите изиск-ват РНК зависима РНК полимераза за репликация на геномите си, която липсва в клетката на гостоприемника и трябва да бъде кодирана от вируса. Други РНК вируси, наречени ретровируси, се реплицират чрез междинна двойно верижна ДНК форма. Тя се получава от вирусната РНК чрез уникален вирусно кодиран ензим, наречен обратна транскриптаза, която копира ДНК върху РНК матрица.

Фиг. 2.30. Структура на еукариотните вируси. (а) Ико-саедрална; (b) нишковидна или пръстеновидна (с) мемб-

Възприемчивостта на клетката към вирусната инфекция се определя от нейната способност да поддържа вирусната репликация, както и наличието на вирусно специ-фични рецептори на повърхността на клетката. Клетки, които са способни да поддър-жат репликацията се наричат пермисивни.

Не винаги следствието на вирусната инфекция е заболяване. Първичната функция на вируса е да реплицира себе си, което може да има за резултат повреждане на клетка-та. Ако са повредени достатъчен брой клетки, това може да причини заболяване. Капа-цитетът на вируса да причинява заболяване са нарича вирулентност и може да не бъде от полза за вируса, тъй като може да намали капацитета за неговата репликация.

2.9.5. ДНК вируси

Геномът на ДНК вирусите варира значително по големина от 5 kbp до 279 kbp. ДНК може да бъде едноверижна или двойноверижна, както и линейна или пръстено-видна. Почти всички ДНК вируси се реплицират в ядрото и използват клетъчната ма-шина за репликация на генома и експресия на вирусните гени. Големите ДНК вируси кодират до 200 гена и имат сложен жизнен цикъл, който координирана генната експре-сия и геномна репликация. Пример за големи ДНК вируси са херпес вирусите, които

77

инфектират поредица от гръбначни, включително и човека. Те предизвикват заболява-ния като варицела, херпес зостер, възпаление на лимфните жлези. Херпес симплекс ви-рус 1 е добре проучен херпес вирус, който предизвиква херпес на устните. Той има ге-ном от 150 kbp двойноверижна ДНК, която съдържа около 70 гена, разположени и по двете вериги на ДНК, а някои от тях се припокриват. Транскрипцията и репликацията на вирусния геном са строго регулирани. Вирусните гени се групират в три групи, на-речени незабавни, ранни (α), ранни (β) и късни (γ), които се експресират в определена последователност, следваща инфекцията на клетката гостоприемник. Експресията е също координирана с репликацията на вирусния геном.

ДНК вирусите с малки геноми съдържат по-малко гени и са по-зависими от клет-ката за репликацията и генната експресия. Примери за това са полиомния вирус и маймунския вирус SV40, които са изследвани много интензивно, поради това, че при-чиняват тумори. И двата принадлежат към семейството на паповавирусите. SV40 има малък геном от 5 kbp, който съдържа 5 гена. Гените са разположени върху малкия ге-ном и на двете вериги на ДНК и имат припокриващи се секвенции. Вирусните белтъци се образуват чрез комбинация oт използването на припокриващи се рамки на четене и алтернативен сплайсинг. Гените се експресират на две фази след инфекцията, известни

като ранни и късни. Ранните гени дават белтъци, които активират транскрипцията, които се наричат голям Т антиген и малък Т анти-ген. Те стимулират както вирусна-та, така и вирусната транскрипция и репликация, и са отговорни за туморообразуващите свойства на вируса.

Фиг. 2.31. Жизнен цикъл на ретровирусите

2.9.6. РНК вируси

Геномите на РНК вирусите могат да са едноверижни или двойно верижни. Ако са еднове-рижни, геномите могат да са пози-тивни или негативни. В някои слу-чаи геномът кодира и РНК от двата типа. Транскрипцията на вирусни-те гени от РНК генома изисква ен-зим, наречен РНК зависима РНК полимераза, която липсва в клетка-та, но се кодира от вирусен ген, на-речен pol. Тъй като РНК вирусите не изискват клетъчна полимераза, не е задължително транскрипцията и репликацията да стават в ядрото, както е при ДНК вирусите. По тази причина много РНК вируси се реп-лицират в цитоплазмата. За разлика от клетъчните полимерази, РНК зависимата РНК полимераза не е способна на корекции и реплицира своята матрица с доста по-високо

78

ниво на грешки. Нивото на мутации е една база от 103 – 104 за репликационен цикъл, което е доста по-високо, отколкото нивото за ДНК вирусите – една база 108 – 1011. Следствието от по-високото ниво на мутации за РНК вирусите е, че те са способни да еволюират бързо и много бързо могат да развият промени в антигенността или виру-лентността, което им позволява да се адаптират към промените на околната среда и опитите на клетъчната имунна система да ги елиминира.

Някои РНК вируси мутират толкова бързо, че съществуват като популации от ге-номни секвенции, които се реплицират чрез комплементация и са известни като квази-видове (мними видове). Много от мутациите, които възникват в РНК вирусите са фа-тални за вирусната репликация. Това поставя горна граница на големината на големи-ната на генома от около 104 нуклеотида, която е равна на големината, която средно предизвиква една мутация на генома.

2.9.7. Ретровируси

Това е важна група РНК вируси с едноверижен, позитивен РНК геном. В групата се включват човешкия имунодефицитен вирус (HIV), който причинява синдромът на придобитата имунна недостатъчност, СПИН (AIDS). Ретровирусите съдържат по две копия от генома си във всяка вирусна частица. При инфекцията на клетката в нея влиза ssРНК, която се трансформира в копие dsДНК от ензима обратна транскриптаза (reverse transcriptase), която след това се интегрира в клетъчния геном от един вирусен ензим интеграза. Интегрираната форма е известна като провирус и той играе ролята на матрица за репликация на вирусния геном и за експресия на вирусните гени (Фиг. 2.31). Геномите на ретровирусите имат структурно сходство и известна хомология с едни геномни елементи в човешкия геном, известни като ретротранспозони. Ретрови-русите имат различна сложност, като някои са много прости. Те се различават от рет-ротранспозоните само по наличието на ген env, който кодира синтеза на гликопротеи-ните на обвивката, необходими за инфекциозността на вирусите. Други, като HIV, имат по-големи геноми с по-сложен жизнен цикъл, кодират белтъци, които са активни на различни етапи на репликационния цикъл и участват в регулацията на вирусните и кле-тъчни функции.

За някои ретровируси е известно, че причиняват рак при животни и много по-рядко при човека. Тези ретровируси са известни като онкогенни и често носят гени, наречени онкогени. Тези гени са първоначално взети от човешкия геном чрез реком-бинация с вирусния геном. Онкогените кодират белтъци, които участват в регулацията на клетъчния растеж и имат противоположни клетъчни гени, наречени прото-онкогени. Експресията на онкогените по време на вирусната инфекция причинява не-контролирано клетъчно делене, водещо до образуването на тумори.

Всички геноми на рет-ровирусите имат една и съ-ща базова структура (Фиг. 2.32). По голямата част от геномите са заети от три ге-на, наречени gag, pol и env. Gag кодира синтезата на капсидните белтъци, pol – на ензимите, необходими за клетъчната репликация (об-

ратната транскриптаза, РНК-аза Н, протеаза и интеграза), а env кодира белтъците за ви-русната липидна обвивка. От двете страни на генома се намират две повторени секвен-ции, наречени LTRs (long terminal repeats), които участват във вирусната репликация,

Фиг. 2.31. Ретровирусни геноми

79

интеграция и експресия на гените. Транскрипцията на вирусните гени от интегрирания провирус зависи от клетъчната РНК полимераза II, която се свързва към една секвенция в края на 5’-LTR. Получената иРНК се транслира в т. нар. полипротеини, които след това се разрязват протеолитично и дават отделните вирусни белтъци. Някои вируси, ка-то HIV, образуват различни иРНК чрез диференциален сплайсинг. Обратната транск-риптаза на някои ретровируси има много висока степен на грешки при репликацията. Това означава, че много от получените геномни копия не могат да се реплицират. Това се преодолява чрез комплементиране между двете геномни копия, които присъстват във всяка вирусна частица и могат също могат да рекомбинират помежду си по време на обратната транскрипция. Тези характеристики, заедно с високата скрост на репро-дукция (109-1010 нови вирусни частици на ден) позволяват на HIV-1 да се адаптира към нови среди, като например при селекционния натиск от антибиотици и третиране с ле-карства.

Освен този кратък преглед на устройството и функцията на вирусите, повече ин-формация за РНК и ДНК вирусите има в глави 5 и 6.

80