-
Uniwersytet Warszawski
Wydzia Biologii
Izabela Chojnicka
Nr albumu 217280
Cytotoksyczne i proapoptotyczne dziaanie kwasu oleanolowego
oraz jego pochodnych wyizolowanych z buraka wikowego
na komrki nowotworowe jelita grubego linii DeTa
Praca magisterska na kierunku Biologia
w zakresie Biologia Komrki i Organizmu
Praca wykonana pod kierunkiem
Prof. dr hab. Wirginii Janiszowskiej
Wydzia Biologii Uniwersytetu Warszawskiego
Warszawa, czerwiec 2008
-
Owiadczenie kierujcego prac
Owiadczam, e niniejsza praca zostaa przygotowana pod moim
kierunkiem i stwier-
dzam, e spenia ona warunki do przedstawienia jej w postpowaniu o
nadanie tytuu
zawodowego.
Data Podpis kierujcego prac
Owiadczenie autora pracy
wiadom odpowiedzialnoci prawnej owiadczam, e niniejsza praca
dyplomowa zo-
staa napisana przez mnie samodzielnie i nie zawiera treci
uzyskanych w sposb niezgodny
z obowizujcymi przepisami.
Owiadczam rwnie, e przedstawiona praca nie bya wczeniej
przedmiotem procedur
zwizanych z uzyskaniem tytuu zawodowego w wyszej uczelni.
Owiadczam ponadto, e niniejsza wersja pracy jest identyczna z
zaczon wersj
elektroniczn.
Data Podpis autora pracy
-
Streszczenie
Z korzeni buraka wikowego Beta vulgaris var. esculenta, stosujc
rne warunki eks-
trakcji i chromatografii (TLC, CC), wyizolowano mieszanin
saponin triterpenowych oraz
wyodrbniono pojedynczy zwizek, ktry zidentyfikowano jako
triglikozyd kwasu oleano-
lowego przy uyciu spektrometrii mas. Nastpnie zbadano ich
dziaanie cytotoksyczne
i proapoptotyczne (cytometria przepywowa), a take monoglukozydu
kwasu oleanolo-
wego, wolnego kwasu oleanolowego i wolnego kwasu ursolowego oraz
mieszaniny tych
ostatnich na ludzkie komrki raka jelita grubego linii DeTa.
Najsilniej dziaay w kolejno-
ci: monoglukozyd kwasu oleanolowego, triglikozyd kwasu
oleanolowego i kwas ursolowy,
co wskazuje na zaleno badanych waciwoci od struktury zwizku.
Sowa kluczowe
Kwas oleanolowy, kwas ursolowy, saponiny, linia komrkowa DeTa,
apoptoza, cytotok-
syczno
Dziedzina pracy (kody wg programu Socrates-Erasmus)
13.1. Biologia
Tytu pracy w jzyku angielskim
Cytotoxic and apoptogenic effect of oleanolic acid and its
derivatives from beet root on
human colorectal adenocarcinoma cell line DeTa
-
Pani prof. dr hab. Wirginii Janiszowskiej za powicony czas,
merytoryczn pomoc w
trakcie pisania pracy, a take za moliwo szczerej rozmowy,
otrzymania rady
i wsparcia.
Pani mgr Agnieszce Mroczek za wykonanie analizy MS, jak rwnie za
wszechstronn
pomoc i tworzenie niepowtarzalnej, koleeskiej atmosfery w czasie
pracy.
-
Prac dedykuj mojej Mamie
-
Spis treci
Spis treci 1
1 Wstp 3
1.1 Rak jelita grubego . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . 3
1.2 Chemoprewencja . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . 4
1.3 Saponiny triterpenowe . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . 6
1.3.1 Budowa i waciwoci chemiczne . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . 6
1.3.2 Wystpowanie saponin oraz wolnego kwasu oleanolowego i
kwasu
ursolowego w podkrlestwie rolin . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . 7
1.3.3 Aktywno przeciwnowotworowa saponin triterpenowych . . . .
. . . 8
2 Zaoenia i cel pracy 12
3 Materiay i metody 13
3.1 Materia badawczy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . 13
3.2 Odczynniki chemiczne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . 14
3.3 Ekstrakcja . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . 15
3.3.1 Przygotowanie materiau . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . 15
3.3.2 Ekstrakcja eterem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . 15
3.3.3 Ekstrakcja metanolem . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . 15
3.3.4 Ekstrakcja butanolem . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . 15
3.3.5 Ekstrakcja do fazy staej SPE . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . 15
3.4 Synteza monoglukozydu kwasu oleanolowego . . . . . . . . . .
. . . . . . . 16
1
-
SPIS TRECI 2
3.5 Metody chromatograficzne . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . 17
3.5.1 Chromatografia cienkowarstwowa TLC . . . . . . . . . . . .
. . . . . 17
3.5.2 Ukady chromatograficzne . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . 17
3.5.3 Chromatografia kolumnowa CC . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . 17
3.6 Spektrometria mas MS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . 18
3.7 Metody hodowli komrek . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . 18
3.7.1 Pasa do butelek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . 18
3.7.2 Pasa na szalki . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . 18
3.8 Badanie ywotnoci komrek . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . 19
3.9 Badanie apoptozy metod cytometrii przepywowej . . . . . . .
. . . . . . . 19
4 Wyniki 20
4.1 Analiza ekstraktw eterowych i butanolowych . . . . . . . . .
. . . . . . . . 20
4.2 Analiza MS mieszaniny saponin . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . 22
4.3 Pomiar ywotnoci komrek . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . 23
4.4 Analiza cytometryczna . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . 26
5 Dyskusja 40
Bibliografia 47
Spis symboli i skrtw 55
Spis rysunkw 57
Spis tabel 59
-
Rozdzia 1
Wstp
1.1 Rak jelita grubego
W krajach rozwinitych, wraz ze wzrostem dugoci ycia obywateli,
zwiksza si zapa-
dalno na schorzenia, a najbardziej powszechne pord nich s
choroby nowotworowe (ok.
77% przypadkw po 55 roku ycia), charakteryzujce si
niekontrolowanym namnaaniem
komrek, niezalenym od mechanizmw regulujcych podzia. W 2007 roku
American
Cancer Society zanotowao ok. 1,5 mln nowych przypadkw zachorowa
i ponad 0,5 mln
zgonw, czyli ponad 1500 osb kadego dnia [61].
Nowotwory dzielimy na agodne i zoliwe, z czego te ostatnie maj
zdolno do meta-
stazy, czyli rozprzestrzeniania si po organizmie i kolonizowania
tkanek. Do nowotworw
zoliwych nale: nowotwr anaplastyczny (typ nowotworu cakowicie
niezrnicowa-
nego), misak (nowotwor zoliwy pochodzenia nienabonkowego),
potworniak (nowotwr
wywodzcy si totipotencjalnych komrek zarodkowych) oraz rak
(nowotwr zoliwy wy-
wodzcy si z tkanki nabonkowej).
Rak jelita grubego, obejmujcy zmiany nowotworowe w obrbie
okrnicy, odbytnicy
oraz wyrostka robaczkowego, znajduje si na trzecim miejscu, po
raku prostaty, puc
i oskrzeli, na licie nowotworw, na ktre zapada ludno krajw
rozwinitych i na drugim
pod wzgldem miertelnoci wrd pacjentw, rwnie w Polsce. Kadego
roku rak jelita
grubego jest przyczyn zgonu 655 000 ludzi na wiecie. Najwysza
zapadalno wystpujeTylko na terenie USA
3
-
ROZDZIA 1. WSTP 4
w Europie Zachodniej, Stanach Zjednoczonych i Kanadzie,
natomiast najnisza w krajach
Afryki i Azji [40].
Przyczyny zachorowa obejmuj zarwno czynniki genetyczne jak i
rodowiskowe.
Wrd schorze dziedzicznych, zwizanych z rakiem jelita grubego, do
najpowszechniej-
szych naley rodzinna polipowato gruczolakowata (FAP) czy zesp
Lyncha (HNPCC),
t.j. dziedziczny rak jelita grubego niezwizany z polipowatoci.
Zdecydowanie najwicej
zachorowa (65%85%) to tzw. sporadyczny rak jelita grubego, gdzie
wystpuj naka-
dajce si mutacje genw supresorowych, kodujcych biaka takie jak
APC, DCC czy
p53, ktrych powstanie moe by zwizane z diet ubog w warzywa i
owoce, z przewag
misa czerwonego, paleniem papierosw, naduywaniem alkoholu czy
brakiem wysiku
fizycznego. Nowotwr jelita moe si rwnie rozwin w wyniku wczeniej
przebytych
chorb, takich jak wrzodziejce zapalenie jelita grubego czy
pojedyncze polipy wystpu-
jce w jego obrbie.
1.2 Chemoprewencja
Leczenie raka jelita grubego obejmuje zabiegi chirurgiczne, a
take radio- i chemiote-
rapi, ktre poza wysokim ryzykiem zgonu pacjenta, obciaj go
dokuczliwymi i czsto
upoledzajcymi samodzielne funkcjonowanie skutkami ubocznymi.
Dlatego niezwykle
wane jest zapobieganie powstawaniu choroby, a w przypadku jej
wystpienia, wczesne
wykrycie i zahamowanie na pocztkowym etapie rozwoju, czyli tzw.
prewencja [1, 15].
Chemoprewencja to stosowanie farmakologicznych lub naturalnych
substancji w celu
zapobiegania, zahamowania lub odwrcenia procesu kancerogenezy
[6]. Dotychczas opi-
sano wiele zwizkw wykazujcych zdolno zatrzymywania wczesnych
etapw powstawa-
nia i rozwoju nowotworu, wrd ktrych wystpuj zarwno leki jak i
zwizki pochodzenia
naturalnego. Do farmaceutykw obniajcych zapadalno i umieralno na
raka jelita
grubego nale celeksyb, rofekoksyb czy niesteroidowe leki
przeciwzapalne (np. sulindak).
Wszystkie one posiadaj wspln cech s inhibitorami cyklooksygenazy
2 (COX-2) .
Jednak pomimo korzystnego wpywu rofekoksybu na jelito jego
przyjmowanie wizao
si z wystpieniem chorb ukadu krenia, gwnie zatorw i atakw serca.
W efekcieNiesteroidowe leki zapalne hamuj obie izoformy enzymu COX:
COX-1 i COX-2
-
ROZDZIA 1. WSTP 5
w 2004 roku lek wycofano z rynku, a w 2007r. firma Merck musiaa
wypaci odszko-
dowanie w wysokoci 4,85 miliardw dolarw na terenie Stanw
Zjednoczonych Ameryki
Pnocnej.
Zatem leczenie oparte na stosowaniu syntetycznych farmaceutykw
moe wiza si
z wystpieniem wielu powika i skutkw ubocznych. Dlatego wielu
badaczy skupio si
na poszukiwaniu naturalnych substancji, ktre mogyby by stosowane
zarwno w chemo-
prewencji jak i wczesnej terapii nowotworowej [45]. Wykazano
niewtpliwy wpyw diety
na raka jelita grubego w wielu badaniach in vivo zarwno na
ludziach jak i zwierztach
laboratoryjnych [8, 22, 32, 36, 42, 48, 49, 54, 56].
Stwierdzono, e jadospis powinien za-
wiera produkty bogate w bonnik, takie jak warzywa, zboa i owoce.
Ostatnio testuje
si wpyw ekstraktw z wielu rolin na komrki nowotworowe jelita
grubego in vitro i in
vivo. Jednak nadal niewiele wiadomo, jaki jest dokadny skad
podawanych ekstraktw,
ani nie znany jest mechanizm dziaania zawartych w nich
substancji.
Jedn z wielu jarzyn powszechnie spoywanych nie tylko w kulturze
sowiaskiej,
ale na wszystkich kontynentach, jest burak zwyczajny Beta
vulgaris, rolina dwuletnia
z rodziny komosowatych Chenopodiaceae. Najpopularniejsze odmiany
hodowlane to tzw.
bowina, czyli burak liciowy (Beta vulgaris ssp. vulgaris convar.
vulgaris var. cicla)
i burak korzeniowy (Beta vulgaris ssp. vulgaris convar. crassa),
w przypadku ktrego
wyrniamy buraka wikowego (Beta vulgaris ssp. vulgaris convar.
crassa var. esculenta),
cukrowego (Beta vulgaris ssp. vulgaris convar. crassa var.
altissima) oraz pastewnego
(Beta vulgaris ssp. vulgaris convar. crassa var. rapacea)
[64].
Burak wikowy to bogate rdo witamin (A, C, E, witaminy z grupy B
tiamina, ry-
boflawina, niacyna, pirydoksyna i kwas foliowy), mineraw i
pierwiastkw ladowych. Za
fioletowo-czerwon barw odpowiedzialne s betaniny, uywane w
przemyle spoywczym
jako barwnik E162. Do tej pory ukazaa si jedna praca,
dokumentujca wystpowa-
nie saponin triterpenowych w buraku wikowym [12], rolinnych
metabolitw wtrnych,
budzcych obecnie due zainteresowanie ze wzgldu na wykazywany
przez nie szereg ak-
tywnoci farmakologicznych. Brakuje jednak informacji na temat
ich skadu jakociowego
i wykazywanego dziaania.
-
ROZDZIA 1. WSTP 6
Rysunek 1: Burak wikowy [58]
1.3 Saponiny triterpenowe
1.3.1 Budowa i waciwoci chemiczne
Saponiny s to glikozydy wystpujce u wielu gatunkw rolin i kilku
organizmw mor-
skich [51]. Nazwa pochodzi od charakterystycznej zdolnoci tych
zwizkw doobniania
napicia powierzchniowego roztworw wodnych z wytworzeniem piany
[34], std roliny
bogate w saponiny uywane byy dawniej jako substytut myda, jak na
przykad mydlnica
lekarska Saponaria officinalis czy mydlany korze Chlorogalum
pomeridianum [25].
Saponiny s zbudowane z aglikonu zwanego te sapogenin poczonej
wizaniem
O-glikozydowym lub estrowo-glikozydowym z czci cukrow, czyli
glikonem. Ze wzgldu
na budow wyrniamy aglikony sterydowe i aglikony triterpenowe.
Sapogeniny sterydowe
wystpuj najczciej w formie furostanolowej albo spirostanolowej,
natomiast triterpe-
nowe w formie oleananu, ursanu albo lupanu.
Sapogeniny triterpenowe to trzydziestowglowe triterpenoidy
pentacykliczne, posiada-
jce w swojej czsteczce pi piercieni skondensowanych, przy czym
cztery piercienie s
-
ROZDZIA 1. WSTP 7
szecioczonowe, a ostatni szecio- lub picioczonowy. Ich
prekursorem jest skwalen zbu-
dowany z szeciu jednostek izoprenoidowych [34]. Z pord
triterpenoidw pentacyklicz-
nych najliczniej u rolin wystpuj kwas oleanolowy (kwas
3-hydroksy-olea-12-en-28-owy)
i kwas ursolowy (kwas 3-hydroksy-urs-12-en-28-owy), rnice si
pooeniem grup me-
tylowych przy wglach C-19 i C-20 (Rys. 2). Oba posiadaj grup
hydroksylow przy
wglu w pozycji 3 i grup karboksylow przy wglu w pozycji 17.
Cz cukrowa zbudowana jest z pojedynczej czsteczki cukru bd
liniowego lub roz-
gazionego acucha cukrowego, w ktrego skad mog wchodzi zarwno
heksozy jak
i pentozy, gwnie: D-glukoza, D-galaktoza, D-ksyloza,
L-arabinoza, L-fukoza, D-chinowoza,
kwas D-glukuronowy czy kwas D-galaktouronowy [34, 51]. W
zalenoci od liczby do -
czonych reszt cukrowych mamy mono-, di- i tridesmozydy [34, 71].
Obecno cukru
w czsteczce zwiksza polarno zwizku, a wic jego rozpuszczalno w
wodzie i alkoholu.
(a) Kwas oleanolowy (OA)
(b) Kwas ursolowy (UA)
Rysunek 2: Kwas oleanolowy i kwas ursolowy
1.3.2 Wystpowanie saponin oraz wolnego kwasu oleanolowego i
kwasu ursolowego
w podkrlestwie rolin
Kwas oleanolowy wyizolowano po raz pierwszy w roku 1931 z lici
oliwki europejskiej
Olea eurepaea [52]. Zarwno wolny kwas jak i jego glikozydowe
pochodne znajduj
si we wszystkich czciach rolin, to jest w korzeniach, odydze,
liciach, kwiatach,
owocach i nasionach, jednak ich zawarto i proporcje w rnych
organach rni si
-
ROZDZIA 1. WSTP 8
u rnych gatunkw [7, 29, 30, 31, 55, 68]. Zwizki te wystpuj
powszechnie w klasie
dwuliciennych Magnoliopsida, z czego w dwch spord omiu podklas,
w podklasach
Ranunculidae i Asteridae we wszystkich nadrzdach. Nie wystpuj
natomiast wrd
przedstawicieli podklas Magnoliidae i Hamamelididae. Z kolei
kwas ursolowy wyizolowano
po raz pierwszy w roku 1923 z lici mcznicy lekarskiej
Arctostaphylos uva-ursi [52].
On i jego pochodne rwnie wystpuj powszechnie w klasie
Magnoliopsida, gwnie
w podklasach: Hamamelididae, Asteridae, Lamiidae, Rosidae,
Dilleniidae. Kwas ursolowy,
w przeciwiestwie do kwasu oleanolowego, wystpuje u rolin
najczciej w postaci wolnej.
1.3.3 Aktywno przeciwnowotworowa saponin triterpenowych
Proces powstania i rozwoju nowotworu, czyli kancerogeneza
obejmuje trzy etapy
faz inicjacji, promocji oraz progresji. W fazie inicjacji zdrowa
komrka w wyniku mutacji
staje si komrk rakow, dzielc si niezalenie od mechanizmw
regulujcych podzia.
Dochodzi do hiperplazji, czyli rozrostu tkanki, bd dysplazji,
czyli nieprawidowoci
w jej strukturze. W fazie promocji namnaajce si komrki
charakteryzuje zwikszona
ruchliwo, utrata penionej funkcji i cznoci z ssiednimi komrkami.
W ostatniej
fazie progresji nastpuje proces angiogenezy, a zmienione komrki
wydzielaj autokrynne
czynniki wzrostowe. Dochodzi do licznych aberracji DNA. Komrki
przenikaj do naczy
krwiononych i limfatycznych, kolonizuj nowe tkanki, tworzc
przerzuty [2, 28, 70].
Terapia moe obejmowa oddziaywanie na kadym z tych etapw.
Dziaanie przeciwoksydacyjne i przeciwmutagenne
Z procesem powstawania nowotworu wie si generowanie wolnych
rodnikw, ktre
wywouj nieodwracalne zmiany w komrkach ogranizmu poprzez
peroksydacj lipidw
i destrukcj biaek, co moe zapocztkowa proces kancerogenezy.
Znane s m.in. dwie
grupy enzymw zwizane z ich genereowaniem w organizmie:
cyklooksygenazy (COX)
i lipooksygenazy (LOX). Uczestnicz one w przemianach
dwudziestowglowych, wielo-
nienasyconych kwasw tuszczowych (gwnie kwasu arachidonowego) do
eikozanoidw,
fizjologicznie i farmakologicznie czynnych zwizkw, do ktrych
nale prostaglandyny,
tromboksany, leukotrieny i lipoksyny [46]. Niektre z nich to
hormony parakrynne, mo-
-
ROZDZIA 1. WSTP 9
gce hamowa reakcje odpornociowe organizmu, aktywowa namnaanie
komrek oraz
indukowa angiogenez, jak to ma miejsce w przypadku raka jelita
grubego [35].
W organizmie czowieka wystpuj dwie izoformy enzymu COX,
posiadajce odmienne
funkcje biologiczne. Stale syntetyzowane biako COX-1 bierze
udzia w utrzymywaniu
homeostazy. Z kolei enzym COX-2, ktrego ekspresja wystpuje w
komrkach transfor-
mowanych nowotworowo, w wielu postaciach raka i w procesach
zapalnych, pobudza
migracj komrek rdbonka, angiogenez a take zapobiega apoptozie
[35]. Poniewa
regulacja ekspresji cox-2 oraz hamowanie aktywnoci COX-2 jest
obiecujcym krokiem
w zapobieganiu i leczeniu nowotworw, to chemoprewencyjne
Syntetyczne zwizki, b-
dce skutecznymi inhibitorami cyklooksygenazy 2, w praktyce jako
leki wywoyway liczne
skutki uboczne [15]. Dlatego wydaje si, e naturalne zwizki
hamujce aktywno COX-2
mog by potencjalnymi rodkami chemoprewencyjnymi w terapii
przeciwnowotworowej.
Kwas ursolowy, kwas oleanolowy oraz jego glikozydowe pochodne
wykazuj zdolno
do hamowania tranksrypcji genu cox-2 i aktywnoci enzymu COX-2
[63, 65], a take
enzymu lipoksygenazy [47, 59, 60] oraz wzrostu wytwarzania
peroksydazy glutationowej
(GPx) i dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) [62], to jest enzymw
rozkadajcych reak-
tywne formy tlenu [46].
Ponadto kwas oleanolowy poprzez hamowanie kinazy biakowej C
(PKC), wpywa
na obnienie trankskrypcji protoonkogenw, midzy innymi c-fos,
c-myc i c-jun, jak
rwnie aktywnoci enzymw takich jak metalotioneina i
dekarboksylaza ornitynowa,
ktre s charakterystyczne dla pocztkowych etapw rozwoju nowotworu
[50, 65].
Dziaanie cytotoksyczne
Jeli chemoprewencyjne strategie zawiodz, naley zatrzyma
transformacj nowotwo-
row tkanki poprzez zahamowanie proliferacji, bd zaindukowanie
apoptozy w zmie-
nionych komrkach. Wiele bada wskazuje na cytotoksyczne waciwoci
kwasu ole-
anolowego i ursolowego, jednak mechanizm ich dziaania nie jest
dokadnie poznany
[9, 11, 13, 18, 26, 33]. Z drugiej strony brakuje prac
opisujcych dziaanie pojedynczych
saponin ze wzgldu na trudn procedur oczyszczenia i rodzielania
zwizkw triterpeno-Wykazano, e nadekspresja COX-2 zwizana jest z
procesem nowotworzenia w obrbie bony luzowej jelita
grubego [69].
-
ROZDZIA 1. WSTP 10
wych. Na og komrkom podawane s ekstrakty, bdce mieszanin bardzo
wielu rnych,
czsto niezidentyfikowanych substancji, przez co trudno
stwierdzi, ktra z nich ma wpyw
na wywoany efekt.
Apoptoza, czyli programowana mier komrkowa, to zachodzcy w
zdrowych tkan-
kach proces zapobiegajcy nadmiernemu rozrostowi tkanki,
eliminujcy nadliczbowe bd
uszkodzone komrki, hamujcy nieprawidow proliferacj oraz bdcy
narzdziem walki
komrek ukadu immunologicznego z patogenami. Moe by zaindukowany
poprzez dwie
oddzielne cieki sygnaowe, zewntrz- i wewntrzkomrkow.
cieka wewntrzkomrkowa, wywoywana poprzez sygnay uszkodzenia DNA
lub
aktywowane onkogeny, generuje wzrost przepuszczalnoci bon
mitochondrialnych i ak-
tywacj kaskady kaspaz. Natomiast cieka zewntrzkomrkowa
inicjowana jest przez
receptory mierci na powierzchni plazmalemmy. Receptory te s
aktywowane przez li-
gandy cytokin i biaka powierzchniowe komrek NK oraz
cytotoksycznych limfocytw T.
Znajdujce si po cytozolowej stronie bony domeny aktywowanych
receptorw mierci
poczone s z biakami adaptorowymi FADD w kompleksie zwanym DISC,
ktry akty-
wuje kaskad kaspaz samodzielnie lub z wspudziaem cieki
wewntrzkomrkowej.
Do najwaniejszych regulatorw apoptozy nale inhibitory apoptozy
IAP, inaktywu-
jce kaspazy oraz biaka z rodziny BCL2, w ktrej znanych jest ok.
20 biaek znajdujcych
si w bonie mitochondrialnej, z ktrych niektre s induktorami
apoptozy (gwne biaka
BAX i BAK), a inne maj dziaanie antyapoptotyczne. Biaka BAX i
BAK poredni-
cz w indukowaniu zmian w strukturze i funkcji mitochondriw.
Nastpuje translokacja
ADP + Pi i ATP w wewntrznej bonie mitochondrialnej, a czsteczki
razem z jo-
nami Ca 2+ uwalniane s do cytoplazmy przez powstae w zewntrznej
bonie pory, co
prowadzi do zaniku potencjau bonowego. Nastpuje uwolnienie m.in.
cytochromu c,
biaka SMAC/Diablo oraz indukujcej apoptoz flawoproteiny AIF.
Osiem czsteczek
cytochromu c asocjuje z t sam liczb czsteczek biaka APAF-1,
formujc struktur o
ksztacie koa, zwan apoptosomem lub koem mierci. Apoptosom
aktywuje kaspaz 9,
ktra aktywuje kolejne kaspazy, m.in. egzekutorow kaspaz 3,
inicjujc zalen od ATP,
autokatalityczn proteoliz [2, 14, 39, 57].
Liczne prace omawiaj dziaanie cytotoksyczne i indukowanie
apoptozy w komrkach
-
ROZDZIA 1. WSTP 11
wielu linii nowotworowych przez wolny kwas oleanolowy [3, 4, 27]
i ursolowy [5, 10, 15, 37],
a take ich glikozydowe pochodne, takie jak -D-glukozyd OA i
metylglukuronozyd OA
z Viguiera decurrens [41] czy kwas
3-[(-L-arabinopiranozylo)-oksy]-23-hydroksyolean
-12-en-28-owy z Sanguisorba officinalis L. [43]. Kwas oleanolowy
i kwas 2-hydroksy-oleanolowy
oraz kwas ursolowy i kwas 2-hydroksy-ursolowy hamoway aktywno
polimeraz DNA
i oraz topoizomerazy II [44]. Ponadto OA i UA indukoway apoptoz
poprzez za-
trzymnie komrek w fazie G0/G1 [16, 17, 65], uruchomienie kaskady
kaspaz i zaburzenie
metabolizmu mitrochondrialnego [5, 10, 23, 27, 37], jednak
dokadny mechanizm dziaania
tych zwizkw nie jest poznany.
Zbadane zostay rwnie wyizolowane z Silene fortunei saponiny
triterpenowe, ktre
nie wykazuj waciwoci cytotoksycznych, lecz wpywaj na zwikszenie
akumulacji
w organizmie cis-platyny, leku stosowanego w terapii raka
okrnicy, potgujc jego
dziaanie [63].
-
Rozdzia 2
Zaoenia i cel pracy
Rak jelita grubego jest trzecim co do czstoci wystpowania i
drugim pod wzgldem
miertelnoci typem nowotworu w krajach rozwinitych, a rozwj
choroby jest niezwykle
uciliwy i nieprzyjemny dla pacjenta. Dlatego te cigle poszukuje
si naturalnie wy-
stpujcych w rolinach substancji, ktre mogyby by zastosowane w
prewencji choroby,
gdy wpyw diety na rozwj raka jelita grubego zosta szeroko
udokumentowany.
Wydaje si, e takimi zwizkami mogyby by saponiny treiterpenowe,
wykazujce
liczne waciwoci farmakologiczne, takie jak dziaanie
przeciwbakteryjne, przeciwwiru-
sowe oraz przeciwgrzybicze, pierwotniakobjcze, przeciwzapalne,
przeciwnowotworowe jak
rwnie oddziaywanie na ukad i mmunologiczny i krwionony [11, 13,
20, 38].
Ostatnio wykazano, e w korzeniu buraka wikowego wystpuj ladowe
iloci wolnego
kwasu oleanolowego oraz jego glikozydowych pochodnych, przy czym
stosunek zawartoci
aglikonu do jego formy zwizanej wynosi jak 1:600 [12].
Celem niniejszej pracy byo:
1. Wyizolowanie mieszaniny saponin triterpenowych z korzenia
buraka wikowego Beta
vulgaris var. esculenta.
2. Zbadanie dziaania cytotoksycznego i proapoptotycznego
wyizolowanych saponin oraz
wolnego kwasu oleanolowego i jego izomeru kwasu ursolowego na
komrki nowotwo-
rowe jelita grubego linii DeTa.
12
-
Rozdzia 3
Materiay i metody
3.1 Materia badawczy
Materia badawczy stanowiy:
1. Korzenie buraka wikowego Beta vulgaris var. esculenta (Rys.
3), zebrane z pola
na terenie powiatu ochowskiego w wojewdztwie mazowieckim w
padzierniku 2006
roku.
2. Ludzkie komrki nowotworowe jelita grubego linii DeTa,
otrzymane z warszawskiego
Centrum Onkologii Instytutu im. Marii Skodowskiej-Curie, a
oryginalnie pochodzce
z wiedeskiego The Cancer Research Institute [53].
Rysunek 3: Korzenie buraka wikowego
13
-
ROZDZIA 3. MATERIAY I METODY 14
3.2 Odczynniki chemiczne
Skadniki medium, w ktrym hodowano komrki:
kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowy HEPES (firmy
GIBCO) penicylina (firmy SigmaAldrich) podowa surowica cielca FCS
(firmy GIBCO) RPMI (firmy SigmaAldrich) streptomycyna (firmy
SigmaAldrich)
Inne odczynniki:
acetylobromoglukoza (firmy Fluka Chemie GmbH) alkohol butylowy
(firmy Chempur, Piekary lskie) alkohol etylowy (firmy Chempur,
Piekary lskie) alkohol metylowy (firmy Chempur, Piekary lskie) bkit
trypanu (firmy Sigma Aldrich) chloroform (firmy Chempur, Piekary
lskie) eter dietylowy (firmy Chempur, Piekary lskie) kwas siarkowy
(firmy POCh, Warszawa) toluen (firmy Chempur, Piekary lskie)
trypsyna (firmy Sigma Aldrich) wglan kadmu (firmy POCh, Warszawa)
zestaw Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I, zawierajcy aneksyn
sprzonz fluorescein, jodek propidyny i bufor do aneksyny (firmy BD
Biosciences, NJ USA)
Wzorce:
kwas oleanolowy (otrzymany w Zakadzie Biochemii Rolin)
3-O-monoglukozyd kwasu oleanolowego (otrzymany w Zakadzie Biochemii
Rolin) kwas ursolowy (otrzymany w Zakadzie Biochemii Rolin)
-
ROZDZIA 3. MATERIAY I METODY 15
3.3 Ekstrakcja
3.3.1 Przygotowanie materiau
Pokrojone korzenie suszono w temperaturze 50oC, a nastpnie
mielono w mynku do
kawy (firmy Moulinex, typ A505).
3.3.2 Ekstrakcja eterem
Rozdrobniony materia (pkt 3.1) umieszczono w gilzie i
ekstrahowano eterem etylowym
w aparacie Soxhleta w cigu szesnastu godzin. Otrzymane ekstrakty
zatano do sucha.
3.3.3 Ekstrakcja metanolem
Pozostay materia po ekstrakcji eterowej (pkt 3.3.2) zalewano w
zlewce metanolem
i umieszczano w ultrasonifikatorze (firmy POLSONIC, typ Sonic 2,
moc 250W) w tem-
peraturze 30oC na 20 minut. Powstay osad odsczano na lejku
Buchnera i ekstrahowano
w tych samych warunkach szeciokrotnie. Do ekstraktu metanolowego
dodawano rwn
objeto wody, a nastepnie oddestylowano metanol na wyparce
obrotowej (firmy Heidel),
pozostawiajc frakcj wodn.
3.3.4 Ekstrakcja butanolem
Frakcj wodn (pkt 3.3.3) ekstrahowano szeciokrotnie n-butanolem.
Poczone eks-
trakty odparowywano do sucha pod zmniejszonym cinieniem na
wyparce obrotowej.
3.3.5 Ekstrakcja do fazy staej SPE
25 g elu krzemionkowego RP-18 (LiChroprep RP-18, o wielkoci
ziaren 40-60 m,
firmy Merck) zawieszano w metanolu i wlewano do lejka Schotta o
rednicy 6 cm i wy-
sokoci 10 cm. Lejek by umieszczony w kolbie ssawkowej poczonej z
pompk (Rys. 4),
wytwarzajc podcinienie. Zoe kondycjonowano, przepuszczajc przez
nie nastpujce
roztwory metanolu w wodzie w objtoci 300 ml:
75% metanolu 50% metanolu
-
ROZDZIA 3. MATERIAY I METODY 16
20% metanolu 10% metanolu woda
Rysunek 4: Schemat aparatury uytej do SPE
Ekstrakt butanolowy (800 mg) (pkt 3.3.4) rozpuszczono w
najmniejszej objtoci wody,
naniesiono na zoe i przemywano kolejnymi roztworami (300 ml)
metanolu w wodzie:
I 100% H2O
II 10% metanolu
III 40a% metanolu
IV 40b% metanolu
V 60% metanolu
VI 80% metanolu
VII 100% metanol
Zebrane frakcje zatano do sucha na wyparce obrotowej.
3.4 Synteza monoglukozydu kwasu oleanolowego
W kolbie trjszyjnej z wkraplaczem, termometrem oraz chodnic
Lebiega umiesz-
czono bezwodny toluen (24 ml) z rozpuszczonym kwasem oleanolowym
(60 mg) i katali-
zatorem wglanem kadmu (120 mg) i ogrzewano do wrzenia. W czasie
oddestylowywania
-
ROZDZIA 3. MATERIAY I METODY 17
toluenu wkraplano powoli najpierw roztwr rozpuszczonej w 36 ml
toluenu acetylobro-
moglukozy (240 mg), a nastpnie toluen, w celu utrzymania staej
objtoci mieszaniny.
Syntez prowadzono przez 4 godziny. Nastpnie na sczku karbowanym
odsczano kata-
lizator, a przescz zatano do sucha na wyparce obrotowej.
3.5 Metody chromatograficzne
3.5.1 Chromatografia cienkowarstwowa TLC
Do analitycznej chromatografii cienkowarstwowej stosowano pytki
Kieselgel firmy
Merck o gruboci warstwy elu 0,2 mm i wymiarach 20 x 20 cm.
Do preparatywnej chromatografii cienkowarstwowej stosowano pytki
Kieselgel 60 F254
firmy Merck o gruboci warstwy elu 2 mm i wymiarach 10 x 20
cm.
3.5.2 Ukady chromatograficzne
Pytki TLC rozwijano w szczelnych, wysyconych parami
rozpuszczalnikw kamerach
szklanych w ukadach rozpuszczalnikw:
I chloroform : metanol (98 : 2, v/v)
II chloroform : metanol (85 : 15, v/v)
III chloroform : metanol (60 : 40, v/v)
IV chloroform : metanol : woda (60 : 40 : 10, v/v)
V chloroform : metanol : woda (50 : 50 : 10, v/v)
Do wywoywania pytek stosowano:
A) 50% kwas siarkowy i ogrzewano w temperaturze 120oC
(chromatografia analityczna).
B) wod (chromatografia preparatywna).
3.5.3 Chromatografia kolumnowa CC
15 g elu krzemionkowego zawieszano w ukadzie IV (pkt 3.5.2) i
wlewano do szklanej
kolumny o rednicy 1,5 cm i wysokoci 21 cm. Po ustabilizowaniu si
zoa pozostawiano
-
ROZDZIA 3. MATERIAY I METODY 18
0,3 cm mieszaniny rozpuszczalnikw nad jego powierzchni. Frakcj
rozpuszczano w nie-
wielkiej objtoci stosowanego ukadu i nanoszono na kolumn. Kolumn
rozwijano t
sam mieszanin rozpuszczalnikw w przepywie 2,5 ml/ min zbierajc
ok. 10 ml frakcje.
3.6 Spektrometria mas MS
Spektroskopia mas zostaa przeprowadzona w Zakadzie Biochemii
Instytutu Uprawy,
Nawoenia i Gleboznawstwa w Puawach na spektrometrze masowym
Thermo Finnigan
LCQ Adventage Max.
3.7 Metody hodowli komrek
Komrki hodowano w sterylnych butelkach zamykanych korkiem z
filtrem na podou
RPMI (pkt 3.2) z dodatkiem 5% FCS, 1% Hepes oraz antybiotykami
penicylin i strep-
tomycyn z zawartoci CO2 5%, w temperaturze 37oC. Co trzeci dzie
zbierano zuyte
medium znad hodowli i uzupeniano butelki wieym medium (15
ml).
3.7.1 Pasa do butelek
Raz w tygodniu przeprowadzano pasa komrek. Zlewano medium,
dodawano 1 ml
trypsyny, po czym trypsyn zbierano razem z resztkami medium.
Pozostae w butelce
komrki inkubowano z 3 ml trypsyny w cigu 5-10 min, po czym
dodawano 12 ml medium.
Pobierano 3 ml otrzymanej zawiesiny komrek, przenoszono do
nowej, sterylnej butelki
i dopeniano 12 ml medium.
3.7.2 Pasa na szalki
Otrzyman zawiesin komrek (pkt 3.7.1) rozlewano na szeciodokowe
szalki. W ka-
dym doku umieszczano 0,5 ml zawiesiny i dopeniano 4,5 ml medium.
Po trzech dniach
hodowli do dokw dodawano jeden z badanych zwizkw (Tab. 1) w
odpowiednim st-
eniu albo 100M etanolu (kontrola z etanolem) albo niczego nie
dodawano (kontrola).
Dowiadczenie wykonano w dwch powtrzeniach. Komrki inkubowano
24h.
-
ROZDZIA 3. MATERIAY I METODY 19
Tabela 1: Zwizki podawane komrkom
Zwizek lub mieszanina zwizkw Stenie ( M)rozpuszczonych w
etanolu
OA 25, 50, 100, 150UA 10, 50, 100
UA + OA UA10 + OA10UA10 + OA25UA10 + OA50
monoglukozyd OA 10, 25, 50, 100, 150, 200triglikozyd OA 50, 100,
150mieszanina saponin 29, 57, 86, 143, 200
3.8 Badanie ywotnoci komrek
Po inkubacji ze zwizkami (pkt 3.7.2) do zawiesiny komrek (30 l)
dodawano bkit
trypanu (30 l) i umieszczano kilka kropel w komorze Burkera
przykrytej szkiekiem
nakrywkowym. Pod mikroskopem wietlnym liczono ywe i martwe
komrki, a nastpnie
wyliczano procent ywych komrek w preparacie.
3.9 Badanie apoptozy metod cytometrii przepywowej
Po zebraniu medium znad hodowli (pkt 3.7.2), dodawano trypsyn
(100 l) i usuwano
resztki medium. Nastpnie ponownie dodawano trypsyn (500 l) i
inkubowano komrki
5-10 min. Gdy komrki odkleiy si od dna szalki, dodawano medium
(2,5 ml), wirowano
zawiesin (1200 rpm, 8 min., 20oC) i zlewano supernatant. Komrki
zawieszano w buforze
do aneksyny, tak by otrzyma stenie ok. 10 mln komrek/1 ml
(komrki liczono w ko-
morze Burkera). Nastpnie 100 l zawiesiny komrek umieszczano w
probwce, dodawano
jodek propidyny (10 l) oraz aneksyn (5 l). Komrki inkubowano w
ciemnoci w cigu
15 min i przeprowadzano pomiar w cytometrze przepywowym
(FACSCalibur firmy BD
Biosciences, NJ USA) maksymalnie w przecigu 60 min od zakoczenia
inkubacji komrek
z jodkiem propidyny i aneksyn.
-
Rozdzia 4
Wyniki
4.1 Analiza ekstraktw eterowych i butanolowych
Z wysuszonych korzeni uzyskano ekstrakt eterowy (pkt 3.3.2) i
butanolowy (pkt 3.3.4)
wedug schematu przedstawionego na rysunku 5. ! "#$%&'()*)'
+, ! -./ 0 / 00 / 000 / 01 / 1 / 10 / 10022222234567 89 : ;
%TLCRysunek 5: Schemat izolowania saponin triterpenowych z korzenia
buraka wikowego
20
-
ROZDZIA 4. WYNIKI 21
Frakcja eterowa zawieraa wolny kwas oleanolowy, natomiast
frakcja butanolowa jego
glikozydowe pochodne.
Wstpn analiz ekstraktu butanolowego przeprowadzono technik
chromatografii
TLC (pkt 3.5.1) w ukadzie III wobec wzorca 3-O-monoglukozydu
kwasu oleanolowego.
Wykazaa ona obecno zwizkw mogcych by glikozydowymi lub
glikozydoestrowymi
pochodnymi kwasw triterpenowych lub steroli, widocznych na pytce
po wywoaniu (pkt
3.5.2) w postaci pasm o charakterystycznym, fioletowo-rowym
zabarwieniu.
Ekstrakty butanolowe poddano ekstrakcji SPE (pkt 3.3.5).
Otrzymane frakcje poddano
wstpnej analizie TLC (pkt 3.5.1) w ukadzie IV wobec wzorca
3-O-monoglkozydu OA.
Uzyskany chromatogram przedstawiono na rysunku 6, gdzie pasma o
zabarwieniu fioleto-
wym, fioletowo-rowym i fioletowo-niebieskim zostay
zaklasyfikowane jako potencjalne
saponiny. Frakcja nr III, frakcje nr IV + V oraz VI + VII (pkt
3.3.5) zostay poddane
w celu oczyszczenia chromatografii kolumnowej (pkt 3.5.3), a
nastpnie chromatografii
cienkowarstwowej (pkt 3.5.1).
Rysunek 6: Wstpna analiza TLC frakcji po ekstrakcji SPE
W wyniku chromatofrafii kolumnowej dla prby nr III zebrano 27
frakcji, dla prb
nr IV + V 36 frakcji oraz dla prb nr VI + VII 30 frakcji.
Wszystkie frakcje otrzymane
-
ROZDZIA 4. WYNIKI 22
w wyniku chromatografii kolumnowej wstpnie analizowano technik
TLC w ukadzie
IV. Frakcje zawierajce saponiny, oczyszczano nastpnie technik
TLC w ukadzie V.
Zeskrobane do szklanych kolumienek pasma elu z saponinami
eluowano dziesiciokrotn
objtoci metanolu, po czym powtrnie wykonywano chromatografi TLC
w ukadzie IV.
Ca procedur powtrzono, uzyskujc z frakcji nr III pojedynczy
zwizek, widoczny na
rysunku 6 jako najniej umiejscowione pasmo w prbie a po
ekstrakcji 40% metanolem.
Oczyszczone saponiny pochodzce z frakcji nr IV + V oraz VI +
VII, poczono.
4.2 Analiza MS mieszaniny saponin
W celu zidentyfikowania zwizkw wystpujcych w oczyszczonej
mieszaninie saponin
poddano je analizie metod spektrometrii masowej (pkt 3.6). W
wyniku bezporedniego
nastrzyku mieszaniny saponin usyskano widmo MS szeregu jonw
molekularnych o masach
molowych od 763 do 1117 gmol(Rys. 7).
Rysunek 7: Widmo MS mieszaniny saponin
W oczyszczonym esktrakcie z B. vulgaris var. esculenta
stwierdzono obecno dzie-
wiciu rnych saponin w siedmiu spord nich aglikon stanowi kwas
oleanolowy, a
w dwch hydroksy-oleanolowy. Natomiast nie stwierdzono obecnoci
glikozydw kwasu
ursolowego. Czci cukrowe wyizolowanych saponin zawieraj od dwch
do czterech reszt
-
ROZDZIA 4. WYNIKI 23
Rysunek 8: Widmo MS oczyszczonego triglikozydu kwasu
oleanolowego
cukrowych, wrd ktrych wystpuj pentozy, heksozy oraz kwas
glukuronowy w rnej
liczbie i kombinacjach.
Przeprowadzono fragmentacj do minujcego ilociowo w mieszaninie
jonu o masie
955,5 gmol(Rys. 8). Analiza wykazaa, e zwizek ten jest
triglikozydem kwasu oleanolowego
(Rys. 8) zawierajcym dwie heksozy i kwas glukuronowy.
4.3 Pomiar ywotnoci komrek
W celu zbadania waciwoci cytotoksycznych zwizkw triterpenowych,
to jest kwasu
oleanolowego, 3-O-monoglukozydu OA oraz triglikozydu OA,
podawano je osobno do ho-
dowli komrek nowotworowych linii DeTa. Po 24-godzinnej inkubacji
dodawano bkit
trypanu (pkt 3.8), ktry wnika do martwych komrek, barwic je na
fioletowo-niebieski
kolor. Obliczono procent ywych komrek (Tab. 2, 3, 4).
Wpyw kwas oleanolowego
Wyniki badania ywotnoci komrek DeTa hodowanych w obecnoci kwasu
oleanolo-
wego w rnych steniach przedstawiono w tabeli 2 i na rysunku
9.
-
ROZDZIA 4. WYNIKI 24
Tabela 2: Zawarto procentowa ywych komrek hodowanych z kwasem
oleanolowym
Kontrola EtOH100 M
OA25M
OA50M
OA100M
OA150M
95% 94% 92% 96% 89% 87%
Nie zaobserwowano wpywu etanolu na ywotno komrek, ani znaczcych
rnic
ywotnoci w prbach z kwasem oleanolowym o wzrastajcym steniu.
Przy najwyszych
steniach 100 i 150 M liczba martwych komrek jest wiksza zaledwie
o ok. 5% w
porwnaniu do pozostaych prb.
Rysunek 9: Zawarto procentowa ywych komrek hodowanych z kwasem
oleanolowym
K kontrola, EtOH etanol 100 M
Wpyw 3-O-monoglukozydu kwasu oleanolowego
Wyniki badania ywotnoci komrek DeTa hodowanych w obecnoci
3-O-monoglukozydu
kwasu oleanolowego w rnych steniach przedstawiono w tabeli 3 i
na rysunku 10.
3-O-monoglukozyd OA hamuje ywotno komrek o 60-80%, jednak nie ma
liniowej
zalenoci liczby martwych komrek od podanego stenia
monoglukozydu. Najwicej
martwych komrek wystpio przy steniu 100 i 200 M, najmniej przy
steeniu 150
M.
-
ROZDZIA 4. WYNIKI 25
Tabela 3: Zawarto procentowa ywych komrek hodowanych z
3-O-monoglukozydem kwasuoleanolowego
Kontrola EtOH 100M
Mono 50M
Mono 100M
Mono 150M
Mono 200M
95% 0,02 94% 0,06 25% 0,01 17% 0,06 38% 0,06 18% 0,01
Rysunek 10: Zawarto procentowa ywych komrek hodowanych z
3-O-monoglukozydem kwasuoleanolowego
Wpyw triglikozydu kwasu oleanolowego
Wyniki badania ywotnoci komrek DeTa hodowanych w obecnoci
triglikozydu
kwasu oleanolowego w rnych steniach przedstawiono w tabeli 4 i
na rysnunku 11.
Tabela 4: Zawarto procentowa ywych komrek hodowanych z
triglikozydem kwasu oleanolo-wego
Kontrola EtOH 100 M Tri 50 M Tri 100 M Tri 150 M99% 0,03 91%
0,04 79% 0,02 69% 0,03 77% 0,01
Liczba martwych komrek jest wiksza o ok. 10-20% w przypadku prb
z triglikozydem
OA ni w kontroli i kontroli z etanolem. Nie obserwuje si jednak
liniowej zalenoci
liczby martwych komrek od stenia triglikozydu, poniewa najwicej
martwych komrek
wystpio przy steniu 100 M, natomiast przy steniu 50 i 150 M
uzyskane wyniki
s praktycznie identyczne.
-
ROZDZIA 4. WYNIKI 26
Rysunek 11: Zawarto procentowa ywych komrek hodowanych z
triglikozydem kwasu oleano-lowego
4.4 Analiza cytometryczna
Metoda badania ywotnoci komrek z zastosowaniem bkitu trypanu, w
ktrej
komrki s liczone pod mikroskopem wietlnym przez czowieka, jest
metod niedokadn.
Dlatego postanowiono zastosowa bardziej precyzyjn cytometri
przepywow, w ktrej
jednorazowej analizie zostao poddanych trzydzieci tysicy komrek.
Co wicej, analiza
cytometryczna pozwala rozrni komrki martwe na komrki
apoptotyczne i na komrki
nekrotyczne.
Jest to moliwe dziki wykorzystaniu faktu, e we wczesnym stadium
apoptozy na-
stpuje przeniesienie umiejscowionej w bonie fosfatydyloseryny ze
strony cytozolowej
na zewntrz komrki. Do fosfatydyloseryny docza si sprzona z
fluorescein aneksyna.
Do prb dodaje si rwnie barwicy DNA jodek propidyny, ktry wnika
przez
polunion bon martwych komrek. Rwnoczesne podanie jodku propidyny
i anek-
syny pozwala na rozrnienie zdrowych komrek, komrek nekrotycznych
oraz wczesno i
pno-apoptotycznych, co przedstawiono schematycznie na rysunku
12).
W lewym dolnym kwadracie lokuj si zdrowe komrki, do ktrych nie
wnika jodek
propidyny ani nie przycza si aneksyna. W lewym grnym kwadracie
znajduj si ab-
-
ROZDZIA 4. WYNIKI 27
Rysunek 12: Schemat analizy cytometrycznej
sorbujce jodek propidyny komrki nekrotyczne, ktre posiadaj
fosfatydyloseryn po
cytozolowej stronie bony, w zwizku z czym nie wi aneksyny. Prawy
dolny kwadrat
zawiera komrki znajdujce si we wczesnej apoptozie wice aneksyn,
ktrych plazma-
lemma jest szczelna i nie przepuszcza do wntrza jodku. W prawym
grnym kwadracie
znajduj si komrki z rozszczelnion bon w rodkowym i pnym stadium
apoptozy,
ktre wi aneksyn i absorbuj jodek propidyny.
Wpyw kwasu oleanolowego
Wyniki analizy cytometrycznej komrek DeTa hodowanych w obecnoci
kwasu ole-
anolowego w rnych steniach zestawiono w tabeli 5.
Tabela 5: Analiza cytometryczna komrek hodowanych z kwasem
oleanolowym
kontrola EtOH 100 M OA 25M
OA 50M
OA100M
OA 150 M
ywe 90,35% 0,68 87,00% 3,44 88,20% 90,00% 86,89% 79,90%
1,03nekroza 2,34% 0,16 3,55% 0,24 3,42% 1,53% 3,30% 5,50%
3,41apoptoza 7,32% 0,5 9,46% 3,2 8,37% 8,48% 9,81% 14,61% 4,44
Najwysz warto procentow komrek ywych (Rys. 13) obserwowano w
kontroli
(90,35%) oraz w hodowli z kwasem oleanolowym w steniu 50 M
(90%), Nastnie liczba
-
ROZDZIA 4. WYNIKI 28
Rysunek 13: Analiza cytometryczna komrek hodowanych z kwasem
oleanolowym
Rysunek 14: Zawarto procentowa komrek apoptotycznych i
nekrotycznych po analizie cyto-metrycznej hodowanych z kwasem
oleanolowym
ywych komrek stopniowo malaa przy wzrastajcych steniach, osigajc
79,9% pzy
steniu 150 M.
Niejednoznaczne s wyniki dla nekrozy (Rys. 14). Najwicej komrek
nekrotycznych
zaobserwowano w prbie z OA 150 M (5,5%) (bardzo wysoka warto
odchylenia standar-
-
ROZDZIA 4. WYNIKI 29
dowego), a najmniej w prbie OA 50 M (1,53%). Ponadto liczba
komrek nekrotycznych
nie rosa wraz z steniem podanego kwasu warto dla stenia 25 M
kwasu oleano-
lowego bya zbliona do wartoci dla stenia 100 M i kontroli z
etanolem i wysza ni
dla stenia 50 M. Przy wzrocie stenia od 50 M do 100 M ronie
liczba martwych
komrek, najwysza dla stenia 150 M.
Liczba komrek apoptotycznych (Rys. 14) w obecnoci kwasu
oleanolowego w steniu
25 M i 50 M jest praktycznie identyczna, natomiast ronie przy
wyszych steniach
OA, osigajc najwysz warto przy steniu 150 M (14,61%). Najmniej
komrek
apoptotycznych znajduje si w prbie kontrolnej (7,63%). Wystpiy
rnice w przypadku
kontroli i kontroli z etanolem 100 M warto dla prby z etanolem
(9,46%) jest zbliona
do prby z OA 100 M (9,81%) i wysza ni dla prb z 25 i 50 M.
Nie zaobserwowano znaczcego wpywu etanolu na liczb komrek ywych
i komrek
martwych ani na proporcje midzy komrkami nekrotycznymi i
apoptotycznymi.
Wpyw kwasu ursolowego
Wyniki analizy cytometrycznej dla komrek DETA hodowanych w
obecnoci kwasu
ursolowego w rnych steniach zestawiono w tabeli 6.
Tabela 6: Analiza cytometryczna komrek hodowanych z kwasem
ursolowym
kontrola EtOH100 M
UA 10 M UA 50 M UA 100 M
ywe 90,76% 0,86 89,62% 0,95 86,42% 1,57 66,11% 2,4 60,72%
18,72nekroza 1,85% 0,66 1,29% 0,32 1,31% 0,23 7,43% 0,82 16,66%
20,35apoptoza 7,40% 0,2 9,05% 1,2 12,28% 1,33 26,46% 3,22 22,63%
1,63
-
ROZDZIA 4. WYNIKI 30
Rysunek 15: Analiza cytometryczna komrek hodowanych z kwasem
ursolowym
! " # " " # Rysunek 16: Zawarto procentowa komrek apoptotycznych
i nekrotycznych po analizie cyto-metrycznej hodowanych z kwasem
uroslowym
-
ROZDZIA 4. WYNIKI 31
Najwysz warto procentow komrek ywych obserwowano w obu prbach
kon-
trolnych (kontrola 90,76%, kontrola z etanolem 100 M 89,62%),
tym samym etanol
nie wywiera wpywu cytotoksycznego na komrki. Najnisz warto
procentow ko-
mrek ywych zaobserwowano w hodowli komrek z najwyszym steniem UA
100 M
(60,72%), co stanowi znaczc rnic 30% (Rys. 15) w porwnaniu z
kontrol. Ponadto
liczba ywych komrek maleje wraz ze wzrostem stenia UA od 10 do
100 M.
Liczba komrek nekrotycznych (Rys. 16) podobna i nie
przekraczajca 2% dla kontroli,
kontroli z etanolem i UA 10 M, znaczco wzrastaa przy wyszym
steniu kwasu
ursolowego (7,43%, UA 50 M). Ze wzgldu na bardzo wysokie
odchylenie standardowe
dla prby z UA 100 M wynik nie jest analizowany.
W przypadku kwasu ursolowego liczba komrek apoptotycznych (Rys.
16) bya zna-
czco wysza ni komrek nekrotycznych i komrek kontrolnych i rosa
wraz ze wzrostem
stenia UA, osigajc najwysz warto (26,46%) przy steniu 50 M.
Wpyw mieszaniny kwas ursolowego i kwasu oleanolowego
Wyniki analizy cytometrycznej dla komrek DeTa hodowanych w
obecnoci miesza-
niny kwasu ursolowego i oleanolowego w rnych steniach zestawiono
w tabeli 7. Dla
porwnania w tabeli umieszczono rwnie wyniki otrzymane dla komrek
hodowanych z
wolnym kwasem ursolowym w steniu 10 M oraz z kwasem oleanolowym
w steniu 25
i 50 M.
Tabela 7: Analiza cytometryczna komrek hodowanych z kwasem
ursolowym i oleanolowym
Kontrola EtOH100M
UA10MOA10M
UA10MOA25M
UA10MOA50M
UA10M
OA25M
OA50M
ywe 92,96%1,29
92,17%0,94
94,08%0,91
92,82%0,5
93,73%1,23
86,42%1,57
88,20% 90,00%
nekroza 3,59%0,4
2,77%0,48
3,03%0,46
5,03%0,99
2,84%0,03
1,29%0,23
3,42% 1,53%
apoptoza 3,47%0,88
5,07%0,47
2,89%0,59
2,15%1,51
3,43%1,27
12,28%1,33
8,37% 8,48%
-
ROZDZIA 4. WYNIKI 32
Rysunek 17: Analiza cytometryczna komrek hodowanych z kwasem
ursolowym i oleanolowym
! " ! ! "
Rysunek 18: Zawarto procentowa komrek apoptotycznych i
nekrotycznych po analizie cyto-metrycznej hodowanych z kwasem
uroslowym i oleanolowym
Liczba ywych komrek (Rys. 17) jest taka sama w poszczeglnych
prbach (ok.
9294%). Najwicej komrek ywych wystpuje w prbie z UA 10 M + OA 10
M
(94,08%), najmniej w kontroli z etanolem 100 M (92,17%).
Rwnie liczba komrek apoptotycznych i nekrotycznych (Rys. 18)
utrzymuje si
-
ROZDZIA 4. WYNIKI 33
na podobnie niskim poziomie we wszystkich prbach. Nie
zaobserwowano te zalenoci
midzy liczb komrek martwych a wzrastajcym steniem kwasu
oleanolowego w mie-
szaninie.
Apoptoza w adnym ze stosowanych ste zwizkw nie jest wiksza ni w
kontroli,
najwysz warto osigajc w kontroli z etanolem 100 M (5,07%), a
najnisz dla
mieszaniny UA 10 M + OA 25 M (2,15%). Z kolei w tej prbie
nekroza osigna
warto najwysz (5,03%), za najnisz w prbie z etanolem
(2,77%).
Porwnujc wyniki otrzymane dla komrek DeTa hodowanych z mieszanin
kwasu
oleanolowego i ursolowego z wynikami otrzymanymi dla hodowli z
pojedynczymi kwasami,
nie zaobserwowano istotnych rnic w liczbie komrek ywych i komrek
nekrotycznych.
Jedynie liczba komrek apoptotycznych jest wysza o ok. 10% dla
prby z UA 10 M i o
ok. 5% dla OA 25 M i 50 M od prby z mieszanin obu kwasw.
Wpyw 3-O-monoglukozydu kwasu oleanolowego
Wyniki analizy cytometrycznej dla komrek DeTa hodowanych w
obecnoci 3-O-monoglukozydu
kwasu oleanolowego w rnych steniach zestawiono w tabeli 8.
Tabela 8: Analiza cytometryczna komrek hodowanych z
monoglukozydem kwasu oleanolowego
kontrola EtOH100 M
Mono10 M
Mono25 M
Mono50 M
Mono100 M
Mono150 M
Mono200 M
ywe 90,35%0,68
87%3,44
93,65%0,15
91,28%0,18
15,04%4,35
2,70%0,12
6,78%0,53
6,57%0,23
nekroza 2,34%0,16
3,55%0,24
2,77%0,31
3,16%0,03
79,68%6,59
89,89%0,47
81,26%1,31
80,13%4,48
apoptoza 7,32%0,51
9,46%3,2
3,58%0,45
5,56%0,22
13,42%2,23
7,42%0,59
11,42%1,57
13,30%4,22
Podobnie wysokie wartoci liczby komrek ywych wystpuj w obu
kontrolach (87%
i 90%) i w obecnoci monoglukozydu OA przy steniach 10 M i 25 M
(Rys. 19).
Poczwszy od monoglukozydu OA w steniu 50 M liczba komrek ywych
gwatownie
maleje, osigajc najnisz warto dla stenia 100 M (2,7%). Dla obu
najwyszych
ste 150 i 200 M liczba komrek ywych jest podobna i wynosi ok.
6,5%.
Wraz ze spadkiem liczby komrek ywych wzrasta liczba komrek
martwych nie-
wielka liczba komrek nekrotycznych wystpuje w przypadku obu
kontroli i stenia 10
-
ROZDZIA 4. WYNIKI 34
Rysunek 19: Analiza cytometryczna komrek hodowanych z
monoglukozydem kwasu oleanolo-wego
M i 25 M monoglukozydu OA, nieprzekraczajc 3,55%. Liczba komrek
nekrotycznych
(Rys. 20) gwatownie wzrasta od stenia 50 M monoglukozydu i jest
najwysza dla
stenia 100 M (89,89%).
W przypadku komrek apoptotycznych wida, e ich liczba jest
zdecydowanie nisza
ni nekrotycznych (Rys. 20). Ponadto liczba komrek apoptotycznych
w kontrolach (r-
nica ok. 2%) i prbie z monoglukozydem w steniu 100 M jest wysza
ni dla ste
10, 25. Najwicej komrek apoptotycznych wystpuje w obecnoci
monoglukozydu OA
w steniu 50 M i 200 M (ok. 13 %). Od stenia 100 M do 200 M
liczba komrek
apoptotycznych wzrasta. W obu kontrolach i w prbach z
monoglukozydem w steniach
10 M i 25 M komrek apoptotycznych jest wicej ni nekrotycznych,
natomiast przy
wyszych steniach monoglukozydu OA odwrotnie.
Wpyw triglikozydu kwasu oleanolowego
Wyniki analizy cytometrycznej dla komrek DeTa hodowanych w
obecnoci trigliko-
zydu kwasu oleanolowego w rnych steniach zestawiono w tabeli
9.
Najwicej komrek ywych (Rys. 21) znajduje si w kontroli (89,07%)
i kontroli z
etanolem (79,52%). Natomiast we wszystkich prbach z
triglikozydem OA liczba ywych
-
ROZDZIA 4. WYNIKI 35
! " " Rysunek 20: Zawarto procentowa komrek apoptotycznych i
nekrotycznych po analizie cyto-metrycznej hodowanych z
monoglukozydem kwasu oleanolowego
Tabela 9: Analiza cytometryczna komrek hodowanych z
triglikozydem kwasu oleanolowego
kontrola EtOH 100 M Tri 50 M Tri 100 M Tri 150 Mywe 89,07% 2,04
79,52% 2,62 54,59% 3,68 52,46% 2,12 54,36% 1,7nekroza 5,08% 1,6
8,26% 1,42 30,18% 0,93 28,49% 0,3 31,86% 2,35apoptoza 5,85% 2,2
12,26% 4,04 15,24% 2,74 19,06% 1,82 13,79% 0,65
komrek jest podobna i wynosi rednio 54%.
-
ROZDZIA 4. WYNIKI 36
Rysunek 21: Analiza cytometryczna komrek hodowanych z
triglikozydem kwasu oleanolowego
Rysunek 22: Zawarto procentowa komrek apoptotycznych i
nekrotycznych po analizie cyto-metrycznej hodowanych z
triglikozydem kwasu oleanolowego
-
ROZDZIA 4. WYNIKI 37
Podobnie we wszystkich prbach z triglikozydem OA liczba komrek
nekrotycznych
wynosi ok. 30% (Rys. 22) bez wzgldu na stenie.
Najmniej komrek apoptotycznych znajduje si w kontroli (5,85%),
najwicej w prbie
z triglikozydem o steniu 100 M (Rys. 22). Liczba komrek
apoptotycznych wynosia
mniej wicej poow liczby komrek nekrotycznych we wszystkich
prbach z triglikozydem
kwasu oleanolowego.
Wpyw mieszaniny saponin
Wyniki analizy cytometrycznej dla komrek DeTa hodowanych w
obecnoci mieszaniny
saponin w rnych steniach zestawiono w tabeli 10.
Tabela 10: Analiza cytometryczna komrek hodowanych z mieszanin
saponin
kontrola EtOH100 M
Sapo 29M
Sapo 57M
Sapo 86M
Sapo143 M
Sapo200 M
ywe 92,96%1,29
92,17%0,95
91,64%0,2
92.30%1,46
93,43%0,35
92,46%0,88
91,86%0,71
nekroza 3,56%0,4
2,77%0,48
3,13%0,78
3,33%0,33
3,24%0,11
4,13%0,98
3,57%0,67
apoptoza 3,47%0,88
4,41%0,45
5,07%0,47
5,52%0,16
5,20%0,62
4,97%0,3
4,38%1,14
Nie obserwuje si znaczcych rnic midzy liczb ywych komrek przy
wzrastajcych
dawkach saponin (Rys. 23). Najnisze wartoci procentowe ywych
komrek wystpiy
w przypadku podania saponin w steniu 29 M (91,64%) i 200 M
(91,86%), a najwysze
(93,43%) przy steniu 86 M.
-
ROZDZIA 4. WYNIKI 38
!"#$"$$% &' '
Rysunek 23: Analiza cytometryczna komrek hodowanych z mieszanin
saponin
!" "
Rysunek 24: Zawarto procentowa komrek apoptotycznych i
nekrotycznych po analizie cyto-metrycznej hodowanych z mieszanin
saponin
-
ROZDZIA 4. WYNIKI 39
We wszystkich przypadkach zarwno nekroza jak i apoptoza (Rys.
24) utrzymuje si
na niskim poziomie, przy czym liczba komrek nekrotycznych we
wszystkich prbach
ma podobn warto ok. 3,5%, a komrek apoptotycznych nieco wysz w
przypadku
prb z saponinami (ok. 5%). Najnisza warto nekrozy wystpia u
komrek kontrolnych
z etanolem (2,77%), a najwysza u komrek z saponinami w steniu
143 M (4,13%).
Najmniej komrek apoptotycznych znajdowao si w kontroli (3,47%).
Natomiast
najwicej w przypadku saponin w steniach 29, 57, 86 M, z czego
najwiksz warto
osigno dla komrek ze steniem saponin 57 M (5,52%).
-
Rozdzia 5
Dyskusja
Badanie waciwoci cytotoksycznych i proapoptotycznych
Do medium, w ktrym hodowano komrki linii DeTa dodawano zwizki
wystpujce
w korzeniu B. vulgaris, czyli kwas oleanolowy, triglikozyd kwasu
oleanolowego oraz mie-
szanin pozostaych omiu saponin. W celu zbadania, jak zmiany
budowy czsteczki natu-
ralnych triterpenoidw wpywaj na ich waciwoci cytotoksyczne i
proapoptotyczne, po-
dawano rwnie zwizki, ktrych obecno w buraku wikowym nie zostaa
wykryta [12],
t.j. kwas ursolowy oraz jego mieszanin z kwasem oleanolowym, a
take syntetyzowany
3-O-monoglukozyd kwasu oleanolowego. Monoglukozyd kwasu
oleanolowego, zawierajcy
pojedyncz glukoz poczon wizaniem glikozydowym z grup
3-hydroksylow kwasu
oleanolowego, zosta wybrany jako zwizek poredni midzy wolnym
kwasem oleanolo-
wym a jego triglikozydow pochodn wyizolowan z korzenia B.
vulgaris. Z kolei kwas
ursolowy jest izomerem kwasu oleanolowego, rnicym si pooeniem
grup metylowych
przy wglach C-19 i C-20 i czsto wykazujcym silniejsze waciwoci
farmakologiczne.
Stenia podawanych zwizkw ustalono, analizujc przegld literatury.
Istniej donie-
sienia o oddziaywaniu kwasu ursolowego i niektrych saponin na
linie komrkowe ju przy
steniach rzdu kilku M [17, 47, 50, 66] lub kilkudziesiciu M [19,
72]. W przypadku
linii komrkowej HepG2, ludzkiego wtrobiaka zarodkowego, kwas
ursolowy obnia y-
wotno komrek przy steniu poniej 30 M, natomiast powyej tej
wartoci indukowa
apoptoz, wywoujc fragmentacj DNA, powstanie komrek
subdiploidalnych, uwolnie-
40
-
ROZDZIA 5. DYSKUSJA 41
nie cytochromu c oraz zalenej od niego kaspazy 3 [33].
Na tej podstawie ustalono rozpito ste dla kwasu oleanolowego od
25 do 150 M
i dla kwasu ursolowego od 10 do 100 M, dostosowujc do tych
wartoci ilo pozostaych
zwizkw.
Inkubacj komrek ze zwizkami prowadzono 24 godziny, poniewa po
tym czasie skad
medium ulega zmianom, ktre mogyby mie wpyw na przeywalno
komrek.
W celu sprawdzenia, czy wyniki otrzymane dla wszystkich badanych
zwizkw s po-
rwnywalne, w tabelach 11, 12 i na rysunkach 25, 26 przedstawiono
rezultaty pomiarw
cytometrycznych dla wszystkich kontroli oraz kontroli z etanolem
w steniu 100 M.
Tabela 11: Porwnanie analiz cytometrycznych prb kontrolnych
OA UA UA+OA Mono Tri Sapo redniaywe 90,35%
0,6890,76%0,86
92,96%1,29
90,35%0,68
89,07%1,42
92,96%1,29
91,07
nekroza 2,34%0,16
1,85%0,66
3,59%0,40
2,34%0,16
5,08%1,34
3,59%0,40
3,13
apoptoza 7,32%0,51
7,40%0,21
3,47%0,88
7,32%0,51
5,85%1,30
3,47%0,88
5,80
Tabela 12: Porwnanie analiz cytometrycznych prb kontrolnych z
etanolem 100 M
OA UA UA+OA Mono Tri Sapo redniaywe 87,00%
3,4489,62%0,95
92,17%0,95
87,00%3,44
76,52%2,62
92,17%0,95
87,41
nekroza 3,55%0,24
1,29%0,32
2,77%0,48
3,55%0,24
8,26%1,42
2,77%0,48
3,70
apoptoza 9,46%3,20
9,05%1,20
5,0%0,47
9,46%3,20
12,23%4,04
4,41%0,45
8,28
Wyniki otrzymane dla kontroli s podobne, rnice wynosz
maksymalnie ok. 4%.
Wiksze rnice wystpiy w zestawieniu kontroli z etanolem
(7-15%).
Porwnanie rednich wartoci wszystkich kontroli i kontroli z
etanolem pokazuj nie-
wielkie rnice (ok. 3-4%) midzy wartociami procentowymi komrek
ywych i apopto-
tycznych oraz brak rnic dla komrek nekrotycznych.
Podsumowujc, niewielkie rnice midzy prbami kontrolnymi pozwalaj
porwny-
wa ze sob aktywnoci badanych zwizkw, co wicej obecno etanolu, w
ktrym byy
-
ROZDZIA 5. DYSKUSJA 42
!"!#$
"%%&"'()('(*+,-"%. )(%
Rysunek 25: Porwnanie analiz cytometrycznych prb kontrolnych
! "#$% & ' (
$))*$+,-,+,./01$)2 -,)
Rysunek 26: Porwnanie analiz cytometrycznych prb kontrolnych z
etanolem 100 M
rozpuszczone podawane triterpenoidy, praktycznie nie wpywaa na
przeywalno kom-
rek.
Aktywno cytotoksyczn mierzono dwiema metodami jedn z
zastosowaniem barw-
nika bkitu trypanu (pkt 3.8) i bardziej dokadn, rnicujc komrki
martwe na ne-
-
ROZDZIA 5. DYSKUSJA 43
krotyczne i apoptotyczne, metod cytometrii przepywowej (pkt
3.9). Otrzymane obiema
metodami wyniki dla hodowli z 3-O-monoglukozydem OA oraz
triglikozydem OA znacznie
rni si midzy sob.
Wyniki analizy cytometrycznej pokazuj radykaln aktywno
cytotoksyczn 3-O-mono-
glukozydu kwasu oleanolowego na komrki DeTa, ktry obnia liczb
ywych komrek
w prbie nawet o 97%. Z kolei przy zastosowaniu bkitu trypanu
stwierdzono obnienie
liczby ywych komrek o 83%. Poniewa cytometria przepywowa jest
metod znacznie
bardziej precyzyjn ni liczenie komrek pod mikroskopem wietlnym,
wyniki uzyskane
t metod s bardziej wiarygodne.
Analizujc proporcje komrek apoptotycznych i komrek nekrotycznych
okazao si,
e aktywuje on gwnie mier na drodze nekrozy, w mniejszym stopniu
indukujc pro-
gramowan mier komrkow. Aktywno proapoptotyczna wystpia na
podobnym
poziomie, jak w hodowli w obecnoci OA w steniu 150 M oraz UA w
steniu 10
M.
Wyniki uzyskane obiema metodami dla triglikozydu kwasu
oleanolowego rwnie r-
ni si midzy sob. W pomiarze z uyciem bkitu trypanu zaobserwowano
sabsz
aktywno cytotoksyczn (ok. 70-80% ywych komrek) ni w pomiarze
cytometrycznym
(ok. 54%). Wrd komrek martwych komrki nekrotyczne do
apoptotycznych wystpo-
way w stosunku 2:1. Stosujc obie metody, wykazano e dziaanie
cytotoksyczne trigli-
kozydu kwasu oleanolowego byo silniejsze ni wolnego kwasu
oleanolowego, ale sabsze
od 3-O-monoglukozydu OA. Interesujcym jest, e w pomiarze
cytometrycznym nie za-
obserwowano zmian aktywnoci triglikozydu w zalenoci od stenia.
Wydaje si wic,
e wynik uzyskany w metodzie z uyciem bkitu trypanu dla
triglikozydu OA o steniu
100 M, ktry odbiega od dwch pozostaych wynikw dla ste 50 M i 150
M, jest
najprawdopodobniej zwizany z niedoskonaoci zastosowanej
metody.
Kwas oleanolowy nie wykazywa znaczcego dziaania cytotoksycznego
bez wzgldu na
zastosowan metod. Rnice dotyczce liczby ywych komrek wyniosy
kilka procent.
Wraz ze wzrostem stenia tylko nieznacznie rosa liczba komrek
znajdujcych si
w apoptozie, dlatego mona powiedzie, e kwas oleanolowy w
podanych steniach
wykazywa jedynie bardzo sabe waciwoci proapoptotyczne na komrki
linii DeTa.
-
ROZDZIA 5. DYSKUSJA 44
Uzyskane wyniki wyranie wskazuj na zaleno dziaania
cytotoksycznego od struk-
tury triterpenoidu. Kwas oleanolowy z woln grup hydroksylow przy
wglu C-3 i woln
grup karboksylow przy wglu C-17 praktycznie nie wykazywa
badanych aktywnoci,
natomiast zablokowanie grupy hydroksylowej przez czsteczk
glukozy radykalnie zmie-
niao waciwoci zwizku. 3-O-monoglukozyd OA zabija niemal
wszystkie komrki w
prbie. Obecno dodatkowej heksozy oraz kwasu glukuronowego w
triglikozydzie OA
obniaa aktywno cytotoksyczn prawie o poow. Jednak nieznajc
dokadnej budowy
reszt cukrowych triglikozydu kwasu oleanolowego wyizolowanego z
B. vulgaris, ani miejsca
ich przyczenia do aglikonu, nie mona wykluczy, e to nie liczba
reszt cukrowych, a ich
rodzaj i miejsce wystpowania w czsteczce saponiny decyduj o
aktywnoci biologicz-
nej caego zwizku. Z drugiej strony mieszanina omiu saponin
triterpenowych z buraka
wikowego w podanych steniach nie wykazaa ani wybirczo waciwoci
proapopto-
tycznych ani waciwoci cytotoksycznych. W mieszaninie tej wystpuj
zarwno di-, tri-
jak i tetra-glikozydy kwasu oleanolowego (6 zwizkw) oraz kwasu
hydroksy-oleanolowego
(2 zwizki) o nieznanych proporcjach ilociowych. Jako e dominujcy
ilociowo wrd sa-
ponin triterpenowych wystpujcych w korzeniu buraka wikowego,
triglikozyd kwasu
oleanolowego wykazywa dziaanie cytotoksyczne, a mieszanina
pozostaych omiu zwiz-
kw nie wykazywaa tej aktywnoci, to wydaje si e zarwno liczba
reszt cukrowych, ich
rodzaj i miejsce przyczenia maj istotny wpyw na aktywno
biologiczn zwizku. Nie
mona wykluczy, i w tej mieszaninie wystpuj glikozydy o aktywnoci
cytotoksycznej,
ale by moe wystpuj one w bardzo maych ilociach i/lub znosz
wzajemnie swoje
dziaanie.
Podobnie Gurfinkel i Rao [21] stwierdzili brak waciwoci
cytotoksycznych saponin
triterpenowych wyizolowanych z soi na komrki nowotworowe jelita
grubego linii HT-29.
Nastpnie przeprowadzili fermentacj glikozydowych pochodnych
przez bakterie nalece
do mikroflory jelitowej, otrzymujc aktywne aglikony.
Zatem glikozydowe pochodne mog potencjalnie dziaa
przeciwnowotworowo in vivo,
nie wykazujc takiego dziaania in vitro, poniewa w wyniku
hydrolizy w organizmie
chorego mog dostarcza aktywnych, czy to aglikonw czy zwizkw z
mniejsz iloci
reszt cukrowych, np. monoglikozydw.
-
ROZDZIA 5. DYSKUSJA 45
W nienijszej pracy wykazano rwnie, i na waciwoci cytotoksyczne i
proapop-
totyczne triterpenoidw mia wpyw nie tylko doczony do aglikonu
cukier, ale take
zmiana pooenia jednej grupy metylowej w piercieniu E. Ot kwas
ursolowy, w przeci-
wiestwie do kwasu oleanolowego, obnia liczb ywych komrek linii
DeTa o ok.24-30%,
przy czym wicej byo komrek apoptotycznych ni komrek
nekrotycznych, co wskazuje
na waciwoci proapoptotyczne kwasu ursolowego.
Wyniki dziaania cytotoksycznego i proapoptotycznego kwasu
oleanolowego oraz
kwasu ursolowego na komrki linii DeTa odbiegaj od danych
literaturowych dotyczcych
innych linii komrek nowotworowych. Harmand i wsppracownicy,
badajc indukowanie
apoptozy w komrkach linii HaCat przez kwasu ursolowy, otrzymali
IC50 dla stenia
12.5 M [24]. Inni badacze, analizujc waciwoci cytotoksyczne UA
na komrki linii
B16, otrzymali IC50 przy steniu 10 M [17] za na komrki HepG2
przy 30 M [33].
Z kolei w badaniach dziaania cytotoksycznego kwasu oleanolowego
IC50 wynosio poniej
10 g/ml dla trzech linii komrkowych HO-8910, Hela oraz HL60
[67].
Nie zaobserwowano synergistycznego dziaania kwasu oleanolowego i
kwasu ursolowego
przy zastosowaniu mieszaniny obu kwasw w najniszych steniach,
przy ktrych aden
z nich z osobna nie wykazywa badanych aktywnoci. Oznacza to, e
przy zastosowanych
steniach oba izomery nie wpywaj wzajemnie na swoje dziaanie.
Podsumowanie
Z korzenia Beta vulgaris var. esculenta przy zastosowaniu rnych
warunkw ekstrakcji
i chromatografii wyizolowano mieszanin dziewiciu saponin
triterpenowych, z ktrej
wyodrbniono triglikozyd kwasu oleanolowego. Analiza MS wykazaa
obecno siedmiu
glikozydw kwasu oleanolowego oraz dwch glikozydw kwasu
hydroksy-oleanolowego.
Dominujcy ilociowo w mieszaninie saponin triglikozyd OA zawiera
w swojej czsteczce
dwie heksozy i kwas glukuronowy.
-
ROZDZIA 5. DYSKUSJA 46
Nastpnie zbadano waciwoci cytotoksyczne i proapoptotyczne zwizkw
wyizolowa-
nych z B. vulgaris oraz wolnych kwasw triterpenowych
oleanolowego i ursolowego, a take
3-O-monoglukozydu OA za pomoc dwch metod jednej z zastosowaniem
bkitu try-
panu i drugiej cytometrii przepywowej. Wyniki otrzymane po
analizie cytometrycznej
s znacznie bardziej precyzyjne.
Wykazano zaleno aktywnoci cytotoksycznej i proapoptotycznej od
struktury triter-
penoidu. Wolny kwas oleanolowy nie wykazywa dziaania
cytotoksycznego ani znaczcego
dziaania proapoptotycznego. Zmiana pooenia jednej z dwch grup
metylowych wyst-
pujcych w kwasie oleanolowym przy wglu C-20 w pozycj C-19 w
kwasie ursolowym
powodowaa wzrost waciwoci proapototycznych kwasu ursolowego o
ok. 18% i cytotok-
sycznych o ok. 24%.
W badanych steniach nie stwierdzono synergistycznego dziaania
kwasu oleanolo-
wego i kwasu ursolowego na komrki linii DeTa.
Zdecydowany wpyw na badane waciwoci miao doczenie czsteczki
glukozy do
wolnego kwasu oleanolowego. Przy steniu 100 M 3-O-monoglukozyd
OA praktycz-
nie zabija wszystkie komrki. Z kolei obecno trzech reszt
cukrowych, skadajcych si
z dwch heksoz i kwasu glukuronowego, obniaa aktywno cytotoksyczn
zwizku o po-
ow. Obie pochodne glikozydowe w wikszym stopniu indukoway mier
nekrotyczn ni
apoptotyczn, co nie jest korzystne z punktu widzenia
potencjalnego zastosowania w tera-
pii, w ktrej powinny by stosowane zwizki wybirczo eliminujce
komrki nowotworowe
i nie niszczce zdrowej tkanki.
Mieszanina omiu saponin triterpenowych bez triglikozydu kwasu
oleanolowego nie wy-
kazywaa istotnego wpywu na komrki linii DeTa. By moe aden spord
zwizkw
w mieszaninie nie wykazuje aktywnoci cytotoksycznej i
proapoptotycznej lub te sub-
stancje aktywne mog wystpowa w niewielkich ilociach, a pozostae
saponiny nie wy-
kazywa badanych waciwoci i/lub znosi wzajemnie swoje
dziaanie.
-
Bibliografia
[1] BB Aggarwal and S Shishodia. Molecular targets of dietary
agents for prevention and
therapy of cancer. Biochemical Pharmacology, (71):1397 1421,
2006. [cytowanie na str. 4]
[2] B Alberts. Molecular Biology of The Cell. New York, 2002.
[cytowanie na str. 8, 10]
[3] H Assefa, A Nimrod, L Walkerb, and R Sindelara. Synthesis
and evaluation of
potential complement inhibitory semisynthetis analogs of
oleanolic acid. Bioorganic
and Medicinal Chemistry Letters, (9):18891894, 1999. [cytowanie
na str. 11]
[4] H Assefa, A Nimrod, L Walkerb, and R Sindelara. Synthesis
and evaluation of
potential complement inhibitory semisynthetis analogs of
oleanolic acid enantiose-
lective synthesis and complement inhibitory assay of a/b-ring
partial analogues of
oleanolic acid. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters,
(11):16191623, 2001.
[cytowanie na str. 11]
[5] JH Baek, YS Lee, CM Kang, JA Kim, KC Kwon, HC Son, and
KWKim. Intracellular
ca2+ release mediates ursolic acid-induced apoptosis in human
leucemic hl-60 cells.
International Journal of Cancer, (73):725728, 1997. [cytowanie
na str. 11]
[6] W BaerDubkowska. Chemoprewencja - profilaktyka i terapia
wspomagana rakw
gowy i szyji. Postpy w Chirurgii Gowy i Szyi, (2):314, 2003.
[cytowanie na str. 4]
[7] E Bedir, H Krmzpekmez, O Stitcher, and D Cal. Triterpene
saponins from the fruits
of hedera helix. Phytochemistry, (53):905, 2000. [cytowanie na
str. 8]
[8] SA Beresford, KC Johnson, C Ritenbaugh, NL Lasser, LG
Snetselaar, HR Black,
GL Anderson, AR Assaf, T Bassford, D Bowen, RL Brunner, RG
Brzyski, B Caan,
RT Chlebowski, M Gass, RC Harrigan, J Hays, D Heber, G Heiss, SL
Hendrix,
47
-
BIBLIOGRAFIA 48
Howard BV, J Hsia, FA Hubbell, RD Jackson, JM Kotchen, LH
Kuller, AZ LaCroix,
DS Lane, RD Langer, CE Lewis, JE Manson, KL Margolis, Y
Mossavar-Rahmani,
JK Ockene, LM Parker, MG Perri, L Phillips, RL Prentice, J
Robbins, JE Rossouw,
GE Sarto, ML Stefanick, L Van Horn, MZ Vitolins, J
Wactawski-Wende, RBWallace,
and Whitlock E. Low-fat dietary pattern and risk of colorectal
cancer: the womens
health initiative randomized controlled dietary modification
trial. The Journal of the
American Medical Association, 6(295):643654, 2006. [cytowanie na
str. 5]
[9] CY Choi, HJ You, and HG Jeong. Nitric oxide and tumor
necrosis factor- production
by oleanolic acid via nuclear factor-b activation in
macrophages. Biochemical and
Biophysical Research Communications, (288):4955, 2001.
[cytowanie na str. 9]
[10] YH Choi, JH Baek, MA Yoo, HY Chung, ND Kim, and KW Kim.
Induction of
apoptosis by ursolic acid through activation of caspases and
down-regulation of c-iaps
in human prostate epithelial cells. International Journal of
Oncology, (17):565571,
2000. [cytowanie na str. 11]
[11] I Chojnicka and W Janiszowska. Przeciwnowotworowe dziaanie
rolinnych triter-
penoidw: kwasu oleanolowego i kwasu ursolowego oraz ich
pochodnych. Kosmos,
(3-4):335341, 2007. [cytowanie na str. 9, 12]
[12] A Chouj, I Chojnicka, and W Janiszowska. Preliminary glc
and ms analysis of
aglycone moiety of saponins from beetroot (Beta vulgaris var.
esculenta). Lublin,
(71), 2006. [cytowanie na str. 5, 12, 40]
[13] A Chouj and W Janiszowska. Pochodne kwasu oleanolowego i
ich dziaanie farma-
kologiczne. Herba Polonica, (51):6675, 2005. [cytowanie na str.
9, 12]
[14] J Crocker and PG Murray. Molecular Biology in Cellular
Pathology. Chichester,
2003. [cytowanie na str. 10]
[15] M Degowska and G Rydzewska. Chemoprewencja raka jelita
grubego. Przewodnik
Lekarski, (10):4641, 2005. [cytowanie na str. 4, 9, 11]
[16] D Es-saady, A Simon, C Jayat-Vignoles, AJ Chulia, and C
Delage. Mcf-7 cell
cycle arrested at g1 through ursolic acid andincreased reduction
of tetrazolium salts.
Anticancer Research, (16):481486, 1996. [cytowanie na str.
11]
-
BIBLIOGRAFIA 49
[17] D Es-saady, A Simon, M Ollier, JC Maurizis, AJ Chulia, and
C Delage. Inhibitory
effect of ursolic acid on b16 proliferation through cell cycle
arrest. Cancer Letters,
(106):193197, 1996. [cytowanie na str. 11, 40, 45]
[18] J Fernandes, RO Castilho, M Rangel da Costa, K
Wagner-Souza, MA Coelho Kaplan,
and CR Gattass. Pentacyclic triterpenes from chrysobalanaceae
species: cytoto-
xicity on multidrug resistant and sensitive leukemia cell lines.
Cancer Letters,
(190):165169, 2003. [cytowanie na str. 9]
[19] J Fernandesa, RO Castilhob, MR da Costaa, K Wagner-Souzac,
MA Kaplanb, and
CR Gattass. Pentacyclic triterpenes from chrysobalanaceae
species: cytotoxicity on
multidrug resistant and sensitive leukemia cell lines. Cancer
Letters, (190):165169,
2003. [cytowanie na str. 40]
[20] O Guclu-Ustundag and G Mazza. Saponins: Properties,
applications and processing.
Critical Reviews in Food Science and Nutrition, (47):231258,
2007. [cytowanie na str. 12]
[21] RAO AV Gurfinkel, DM and. Soyasaponins: The relationship
between chemical
structure and colon anticarcinogenic activity. Nutrition and
Cancer, (47):2433, 2003.
[cytowanie na str. 44]
[22] R Hakkak, S Korourian, MJ Ronis, JM Johnston, and TM
Badger. Soy protein
isolate consumption protects against azoxymethane-induced colon
tumors in male
rats. Cancer Letters, 1(166):2732, 2001. [cytowanie na str.
5]
[23] PO Harmand, R Duval, C Delage, and A Simon. Ursolic acid
induces apoptosis thro-
ugh mitochondrial intrinsic pathway and caspase-3 activation in
m4beu melanoma
cells. International Journal of Oncology, (10):111, 2005.
[cytowanie na str. 11]
[24] PO Harmand, R Duval, B Liagre, C Jayat-Vignoles, JL
Beneytout, C Delage, and
A Simon. Ursolic acid induces apoptosis through caspase-3
activation and cell
cycle arrest in hacat cells. International Journal of Oncology,
(23):105112, 2003.
[cytowanie na str. 45]
[25] K Hostettmann and A Marston. Saponins. Cambridge University
Press, 1995.
[cytowanie na str. 6]
-
BIBLIOGRAFIA 50
[26] Y Hsu, JJ Yang, and CC Lin. Effects of oleanolic acid and
ursolic acid on inhibiting
tumor growth and enhancing the recovery of hematopoietic system
postirradiation
in mice. Cancer Letters, (111):713, 1997. [cytowanie na str.
9]
[27] Sun HX, YP Ye, and YJ Pan. Cytotoxic oleanane triterpenoids
from the rhizomes
of Astilbe chinensis (maxim.) franch. et savat. Journal of
Ethnopharmacology,
(90):261265, 2004. [cytowanie na str. 11]
[28] M Jakbisiak and W Lasek. Immunologia. Warszawa, 2002.
[cytowanie na str. 8]
[29] Z Kasprzyk and Z Wojciechowski. The structure of
triterpenic glycosides from flowers
of Calendula officinalis l. Phytochemistry, (6):69, 1967.
[cytowanie na str. 8]
[30] Z Kasprzyk, Z Wojciechowski, and W Janiszowska.
Incorporation of 1-14c-acetate
into glycosides of oleanolic acid in Calendula officinalis.
Phytochemistry, (19):561,
1960. [cytowanie na str. 8]
[31] Z Kasprzyk, Z Wojciechowski, and A Kuczewska-Jankowska. The
glycosides of
triterpenic acid from Helianthus annus l. flowers. Bulletin
LAcademie Polonaise
des Science, (14):747, 1966. [cytowanie na str. 8]
[32] K Kawabata, T Tanaka, T Murakami, T Okada, H Murai, T
Yamamoto, A Hara,
M Shimizu, Y Yamada, K Matsunaga, T Kuno, N Yoshimi, S Sugie,
and H Mori.
Dietary prevention of azoxymethane-induced colon carcinogenesis
with rice-germ in
f344 rats. Carcinogenesis, 11(20):21092115, 1999. [cytowanie na
str. 5]
[33] DK Kim, JH Baek, CM Kang, MA Yoo, JW Sung, HY Chung, ND
Kim, YH Choi,
SH Lee, and KW Kim. Apoptotic activity of ursolic acid may
correlate with
the inhibition of initiation of dna replication. International
Journal of Cancer,
(87):629636, 2000. [cytowanie na str. 9, 41, 45]
[34] S Kohlmunzer. Farmakognozja. Number 277. Wydawnictwo
Lekarskie PZWL,
Warszawa, 1998. [cytowanie na str. 6, 7]
[35] J Kotynia and E Maecka-Panas. Uwarunkowania rodowiskowe i
chemoprewencja
raka jelita grubego. Gastroenterologia Polska, (10):7583, 2003.
[cytowanie na str. 9]
[36] D Kritchevsky and DM Klurfeld. Interaction of fiber and
energy registration in
experimental colon carcinogens. Cancer Letters, 1(114):5152,
1997. [cytowanie na str. 5]
-
BIBLIOGRAFIA 51
[37] F Lauthier, L Taillet, P Trouillas, C Delage, and A Simon.
Ursolic acid triggers
calcium-dependent apoptosis in human daudi cells. Anticancer
Drugs, (11):737745,
2000. [cytowanie na str. 11]
[38] J Liu. Oleanolic acid and ursolic acid: Research
perspectives. Journal of Ethnophar-
macology, (100):9294, 2005. [cytowanie na str. 12]
[39] H Lodish, A Berk, P Matsudaira, CA Kaiser, P Krieger, MP
Scott, L Zipur-
sky, and J Darnell. Molecular Cell Biology.
www.whfreeman.com/lodish, 2003.
[cytowanie na str. 10]
[40] JS Mandel. Colorectal cancer screening. Cancer and
Metastasis Reviews,
(16):263279, 1997. [cytowanie na str. 4]
[41] S Marquina, N Maldonado, ML Garduno-Ramirez, E Aranda, ML
Villarreal, Navarro
V, R Bye, G Delgado, and L Alvarez. Bioactive oleanolic acid
saponinc and other
constituents from the roots of Viguiera decurrens.
Phytochemistry, (56):9397, 2001.
[cytowanie na str. 11]
[42] GH McIntosh, GO Regester, RK Le Leu, PJ Royle, and GW
Smithers. Dairy proteins
protect against dimethylhydrazine-induced intestinal cancers in
rats. The Journal of
Nutrition, 4(125):809816, 1995. [cytowanie na str. 5]
[43] Y Mimakia, M Fukushimaa, A Yokosukaa, SashidaaY, S Furuyab,
and H Sakagamib.
Triterpene glycosides from the roots of Sanguisorba officinalis.
Phytochemistry,
(57):773779, 2001. [cytowanie na str. 11]
[44] Y Mizushina, A Ikuta, K Endoh, M Oshige, N Kasai, K Kamiya,
T Satake, H Taka-
zawa, H Morita, H Tomiyasu, H Yoshida, SugawaraF, and K
Sakaguchi. Inhibition
of dna polymerases and dna topoisomerase ii by triterpenes
produced by plant cal-
lus. Biochemical and Biophysical Research Communications,
(305):365373, 2003.
[cytowanie na str. 11]
[45] RGMontoya and MJWargovich. Chemoprevention of
gastrointestinal cancer. Cancer
and Metastasis Reviews, (16):405419, 1997. [cytowanie na str.
5]
[46] RK Murray, DK Granner, PA Mayes, and Rodwell VW. Biochemia
Harpera. War-
szawa, 2006. [cytowanie na str. 8, 9]
-
BIBLIOGRAFIA 52
[47] A Najid, A Simon, J Cook, EL Chable-Rabinovitch, C Delageb,
AJ Chulia, and
M Rigaud. Characterization of ursolic acid as a lipoxygenase and
cyclooxygenase
inhibitor using macrophages, platelets and differentiated hl60
leukemic cells. FEBS
Letters, (299):213217, 1992. [cytowanie na str. 9, 40]
[48] T Narisawa, Y Fukaura, M Hasebe, S Nomura, S Oshima, and T
Inakuma. Pre-
vention of n-methylnitrosourea-induced colon carcinogenesis in
rats by oxygenated
carotenoid capsanthin and capsanthin-rich paprika juice.
Proceedings of the Society
for Experimental Biology and Medicine, 2(224):116122, 2000.
[cytowanie na str. 5]
[49] T Narisawa, Y Fukaura, M Hasebe, S Nomura, S Oshima, H
Sakamoto, T Inakuma,
Y Ishiguro, J Takayasu, and H Nishino. Prevention of
n-methylnitrosourea induced
colon carcinogenesis in f344 rats by lycopene and tomato juice
rich in lycopene.
Japanese journal of cancer research, 10(89):10031008, 1998.
[cytowanie na str. 5]
[50] T Oguro, J Liu, CD Klaassen, and T Yoshida. Inhibitory
effect of oleanolic acid on
12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate-induced gene expression in
mouse skin. Toxi-
cological Sciences, (45):88 93, 1998. [cytowanie na str. 9,
40]
[51] W Oleszek, K Gowniak, and B Leszczyski. Biologiczne
oddziaywania rodowiskowe.
Number 13. Akademia Medyczna Lublin, 2001. [cytowanie na str. 6,
7]
[52] MJ ONeil, A Smith, and PE Heckelman. The Merck Index - An
Encyclopedia of
Chemicals, Drugs and Biologicals. Number 753. New York, 2001.
[cytowanie na str. 7, 8]
[53] J Ostrowski, Z Szczepirkowski, L Trzeciak, M Rochowska, K
Skurzak, and E Butruk.
Induction of ornithine decarboxylase in normal and protein
kinase c-depleted human
colon carcinoma cells. Journal of Physiology and Pharmacology,
(43):373382, 1992.
[cytowanie na str. 13]
[54] MA Pereira, CJ Grubbs, LH Barnes, H Li, GR Olson, I Eto, M
Juliana,
LM Whitaker, GJ Kelloff, Steele VE, and RA Lubet. Effects of the
phyto-
chemicals, curcumin and quercetin, upon azoxymethane-induced
colon cancer and
7,12-dimethylbenz--anthracene-induced mammary cancer in rats.
Carcinogenesis,
6(17):13051311, 1996. [cytowanie na str. 5]
-
BIBLIOGRAFIA 53
[55] D Ruszkowski, A Szakiel, and W Janiszowska. Metabolism of
[3-3h]oleanolic acid in
Calendula officinalis roots. Anatomy, Physiology and
Pharmacology, (25):311, 2003.
[cytowanie na str. 8]
[56] A Schatzkin, E Lanza, D Corle, P Lance, F Iber, B Caan, M
Shike, J Weissfeld,
R Burt, MR Cooper, JW Kikendall, and J Cahill. Lack of effect of
a low-fat, high-fiber
diet on the recurrence of colorectal adenomas. polyp prevention
trial study group.
The New England Journal of Medicine, 16(342):1149 1155, 2000.
[cytowanie na str. 5]
[57] WA Schulz. Molecular Biology of Human Cancers. Dordrecht,
2005. [cytowanie na str. 10]
[58] Shimada, 2007.
http://www.shimadadesigns.com/gallery/v/beet.html.
[cytowanie na str. 6, 57]
[59] A Simon, A Najid, AJ Chulia, C Delage, and M Rigaud.
Inhibition of lipooxy-
genase activity and hl60 leukemic cell proliferation by ursolic
acid isolated from
heater flowers (Calluna vulgaris). Biochimica et Biophysica
Acta, (1125):6872, 1992.
[cytowanie na str. 9]
[60] A Simon, A Najid, AJ Chulia, C Delage, and M Rigaud.
Inhibition of lipooxy-
genase activity and hl60 leukemic cell proliferation by ursolic
acid isolated from
heater flowers Calluna vulgaris. Biochmica et Biophysica Acta,
(1125):6872, 1992.
[cytowanie na str. 9]
[61] American Cancer Society. Cancer facts and figures 2007,
2007.
http://www.cancer.org/downloads/STT/CAFF2007PWSecured.pdf.
[cytowanie na str. 3]
[62] LO Somova, A Nadar, P Rammanan, and FO Shode.
Cardiovascular, antihy-
perlipidemic and antioxidant effects of oleanolic and ursolic
acids in experimental
hypertension. Phytomedicine, (10):115121, 2003. [cytowanie na
str. 9]
[63] SG Sprag, ME Light, and J van Staden. Biological activities
and distribution of plant
saponins. Journal of Ethnopharmacology, (94):219 243, 2004.
[cytowanie na str. 9, 11]
[64] H Strzelecka and J Kowalski. Encyklopedia zielarstwa i
zioolecznictwa. Warszawa,
2006. [cytowanie na str. 5]
-
BIBLIOGRAFIA 54
[65] K Subbaramaiah, P Michaluart, MB Sporn, and AJ Dannenberg.
Ursolic acid inhibits
cyklooxygenase-2 transcription in human mammary epithelial
cells. Cancer Research,
(60):23992404, 2000. [cytowanie na str. 9, 11]
[66] MK Sung and RAO AV Kendall, CWC and. Effect of soybean
saponins and
gypsophila saponin on morphology of colon carcinoma cells in
culture. Food and
Chemical Toxicology, (33):357366, 1995. [cytowanie na str.
40]
[67] SunHX, YP Ye, and YJ Pan. Cytotoxic oleanane triterpenoids
from the rhizomes
of Astilbe chinensis (maxim.) franch. et savat. Journal of
Ethnopharmacology,
(90):261265, 2004. [cytowanie na str. 45]
[68] JP Vincken, L Heng, A Groot, and H Gruppen. Saponins,
classification and occur-
rence in the plant kingdom. Phytochemistry, (68):275297, 2007.
[cytowanie na str. 8]
[69] MP Wasilewicz and D Bielicki. The role of cyclooxygenase
and lipoxygenase in
pathogenesis of colorectal neoplasmatic tumors - review of
current knowledge. Ga-
stroenterologia Polska, (12):133136, 2005. [cytowanie na str.
9]
[70] P Wgleski. Genetyka molekularna. Warszawa, 2002. [cytowanie
na str. 8]
[71] G Wulf. Neuere Entwicklungen auf dem Saponingebiet. Number
108. Deutsche
Apotheker Zeitung, 1968. [cytowanie na str. 7]
[72] HJ You, CY Choi, JY Kim, SJ Park, KS Hahm, and HG Jeong.
Ursolic
acid enhances nitric oxide and tumor necrosis factor-alpha
production via nuclear
factor-kappab activation in the resting macrophages. FEBS
Letters, (509):156160,
2001. [cytowanie na str. 40]
-
Spis symboli i skrtw
Skrt Opis Strona
COX cyklooksygenaza 4
FAP rodzinna polipowato gruczolakowata 4
HNPCC zesp Lyncha (dziedziczny rak jelita grubego niezwi-
zany z polipowatoci
4
OA kwas oleanolowy 7
UA kwas ursolowy 7
LOX lipooksygenaza 8
GPx peroksydaza glutationowa 9
SOD dysmutaza ponadtlenkowa 9
PKC kinaza biakowa C 9
PMA 12-octan-13-mirystynianoforbolu ??
IAP inhibitory apoptozy 10
AIF czynnik indukujcy apoptoz 10
DeTa linia ludzkich komrek nowotworowych jelita grubego 12
FCS podowa surowica cielca 14
HEPES kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowy 14
SPE ekstrakcja do fazy staej 15
TLC chromatografia cienkowarstwowa 17
CC chromatografia kolumnowa 17
MS spektrometria mas 18
55
-
SPIS SYMBOLI I SKRTW 56
Skrt Opis Strona
EtOH alkohol etylowy 24
HepG2 linia komrkowa ludzkiego wtrobiaka zarodkowego 40
B16 linia komrkowa mysich melanoma 45
HaCat linia komrkowa ludzkich keratynocytw 45
Hela linia komrkowa 45
HO-8910 linia komrkowa 45
HL60 linia komrkowa 45
HT-29 linia komrkowa ludzkiego raka jelita grubego 44
IC50 wspczynnik, przy ktrym miertelno wynosi 50% 45
-
Spis rysunkw
1 Burak wikowy [58] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . 6
2 Kwas oleanolowy i kwas ursolowy . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . 7
3 Korzenie buraka wikowego . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . 13
4 Schemat aparatury uytej do SPE . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . 16
5 Schemat izolowania saponin triterpenowych z korzenia buraka
wikowego . . . 20
6 Wstpna analiza TLC frakcji po ekstrakcji SPE . . . . . . . . .
. . . . . . . . 21
7 Widmo MS mieszaniny saponin . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . 22
8 Widmo MS oczyszczonego triglikozydu kwasu oleanolowego . . . .
. . . . . . . 23
9 Zawarto procentowa ywych komrek hodowanych z kwasem
oleanolowym . 24
10 Zawarto procentowa ywych komrek hodowanych z
3-O-monoglukozydem
kwasu oleanolowego . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . 25
11 Zawarto procentowa ywych komrek hodowanych z triglikozydem
kwasu
oleanolowego . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . 26
12 Schemat analizy cytometrycznej . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . 27
13 Analiza cytometryczna komrek hodowanych z kwasem oleanolowym
. . . . . 28
14 Zawarto procentowa komrek apoptotycznych i nekrotycznych po
analizie
cytometrycznej hodowanych z kwasem oleanolowym . . . . . . . . .
. . . . . 28
15 Analiza cytometryczna komrek hodowanych z kwasem ursolowym .
. . . . . 30
16 Zawarto procentowa komrek apoptotycznych i nekrotycznych po
analizie
cytometrycznej hodowanych z kwasem uroslowym . . . . . . . . . .
. . . . . . 30
57
-
SPIS RYSUNKW 58
17 Analiza cytometryczna komrek hodowanych z kwasem ursolowym i
oleanolo-
wym . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . 32
18 Zawarto procentowa komrek apoptotycznych i nekrotycznych po
analizie
cytometrycznej hodowanych z kwasem uroslowym i oleanolowym . . .
. . . . 32
19 Analiza cytometryczna komrek hodowanych z monoglukozydem
kwasu ole-
anolowego . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . 34
20 Zawarto procentowa komrek apoptotycznych i nekrotycznych po
analizie
cytometrycznej hodowanych z monoglukozydem kwasu oleanolowego .
. . . . 35
21 Analiza cytometryczna komrek hodowanych z triglikozydem kwasu
oleanolo-
wego . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . 36
22 Zawarto procentowa komrek apoptotycznych i nekrotycznych po
analizie
cytometrycznej hodowanych z triglikozydem kwasu oleanolowego . .
. . . . . 36
23 Analiza cytometryczna komrek hodowanych z mieszanin saponin .
. . . . . 38
24 Zawarto procentowa komrek apoptotycznych i nekrotycznych po
analizie
cytometrycznej hodowanych z mieszanin saponin . . . . . . . . .
. . . . . . . 38
25 Porwnanie analiz cytometrycznych prb kontrolnych . . . . . .
. . . . . . . . 42
26 Porwnanie analiz cytometrycznych prb kontrolnych z etanolem
100 M . . . 42
-
Spis tabel
1 Zwizki podawane komrkom . . . . . . . . . . . . . . 19
2 Zawarto procentowa ywych komrek hodowanych z kwasem
oleanolowym . 24
3 Zawarto procentowa ywych komrek hodowanych z
3-O-monoglukozydem
kwasu oleanolowego . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . 25
4 Zawarto procentowa ywych komrek hodowanych z triglikozydem
kwasu
oleanolowego . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . 25
5 Analiza cytometryczna komrek hodowanych z kwasem oleanolowym
27
6 Analiza cytometryczna komrek hodowanych z kwasem ursolowym
29
7 Analiza cytometryczna komrek hodowanych z kwasem ursolowym i
oleanolowym 31
8 Analiza cytometryczna komrek hodowanych z monoglukozy