PROTEOMICA PROTEOOM = alle proteïnen die tot expressie worden gebracht door het genoom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof op een bepaald ogenblik Tweedimensionele electroforese (Tweedimensionele chromatografie) Massaspectrometrie Technieken
61
Embed
PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof.
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
PROTEOMICA
PROTEOOM = alle proteïnen die tot expressie worden gebracht door
het genoom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof op een bepaald ogenblik
Tweedimensionele electroforese
(Tweedimensionele chromatografie)
Massaspectrometrie
Technieken
2-D gel electrophoresis
(1) charge
(2)
size
Proteinmixture
Protein separation according to :
HART “mastergel”
German Heart Institute Berlin (2002)
Controle Rat serum
Acute ontsteking(turpentine)
E. Gianazza (2002)
ionenbron
massa analyzer
detector
vacuüm
Massaspectrometer
Iontrap
Electrospray (ESI)
iontrap
ionenbron
iontrap + helium
1- 4 kV
electrospray
mz
Onze strategie
Scheiding van eiwitmengsel dmv 2DE gelspot optimaal slechts 1 eiwit
eiwit in gel trypsine-behandeling specifieke knipplaatsen
[het maximaal aantal eiwitstukjes (= peptiden) is voorspelbaar]
[hoe groter het eiwit, des te meer peptiden ] complex mengsel
Verdere scheiding van peptidenmengsel dmv chromatografie
trypsine
peptiden A B C D E F G
eiwit
Chromatografie
A E B F G C massa-spectrometer
peptiden-mengsel
Stroomrichting over chromatografiekolom
ruwe data
intensiteit
m/z
massaspectrum van de kolomuitstroom is weliswaar minder complex maar blijft toch nog te complex voor de massaspectrometer:
Kan wel alle ionen die op een bepaald ogenblik uit de kolom stromen “wegen”, maar kan er geen verdere “sequentieinformatie” uithalen, behalve uit de drie meest intense ionen (instrumentele beperking er gaat mogelijks veel informatie verloren)
Sequentieinformatie wordt bekomen dmv fragmentatie van het peptide C ion het bekomen massaspectrum noemt men een fragmentatiespectrum
Per full scan spectrum krijgen we maximaal 3 fragmentatiespectra (volledige cycle time: ca 1.5 sec)
Fictief massaspectrum op ogenblik dat peptide Cuit de kolom stroomt
“gewicht” van peptide C
(full scan spectrum)
Peptide sequentiebepaling met MS/MS
NH2 COOH
C-R-I-S-T-A
C-R-I-S-T-A-L
C-R-I-SC-R-I
C-R-I-S-T
C-RC
S-T-A-LI-S-T-A-L
T-A-L A-L
R-I-S-T-A-LC-R-I-S-T-A-L
L
b-ionen y-ionenm/z
763.67
104.01 660.67260.11 504.57
373.20 391.49
460.23 304.45
561.27 202.98
632.31 131.94
MS/MS
Sequentie-ionen
P. Roepstorff & J. Fohlman, Biomed. Mass Spectrom. 11, 601 (1984)
a) Data-acquisitie (software: Xcalibur versie 3.1)
Raw datafile-format (bestaande uit full scan spectra en fragmentaitiespectra)
dta-file format (alleen fragmentatiespectra)
Mascot Sequest
Rapport 1 Rapport 2
(. dat file) (.out file)
search
Van ruwe data tot identificatie van eiwit
Welke ruwe datafile moet er verwerkt worden ?
Ruwe datafile (verzameling van full scan spectra en fragmentatiespectra)
omvormen naar een set bestaande uit enkel fragmentatiefiles = dta-format
( 1 fragmentatiespectrum = 1 dta.file)
search-engine Mascot “publiek”: zonder licentie enkel te bevragenmet maximaal 300 dta.files
Na kopieren van merge programma (afkomstig van Mascot-website) in de juiste folder (hier peptide2975 met 299 dta files)wordt 1 grote tekst-file aangemaakt
Text-file aanbieden in Mascot
invoeren van text-file
Welke databank ?
Hoe specifiek kan/moet de search zijn?
... en na een 1-2 minuten...
Opnieuw dta-fles aanmaken :omdat a) minimizer had enkel de 300 meest intense fragmentatiespectra weerhouden en b) voor slechts een beperkt gebied van het chromatogram
nu verder werken met alle dta-files van het volledige chromatogram
Alles wat hier ingevuld wordt, wordt weggeschreven in een parameter-file in de folderwaar ook de dta-files zich bevinden (vhpeptide2975)
b) Dataverwerking
1 ruwe datafile per analyse (per gel spot)
a) Data-acquisitie (software: Xcalibur versie 3.1)
Raw datafile-format (bestaande uit full scan spectra en fragmentatiespectra)
dta-file format (alleen fragmentatiespectra)
Mascot Sequest
Rapport 1 Rapport 2
(. dat file) (.out file)
search
(Sequest)
AutomatiserenMogelijk ?
In welke mate ?Op welke manier ?
Transparantie ?
Vraagstelling:
.dat file en .out file: twee rapporten-> 1 rapport
DTAselect software bruikbaar om één rapport te maken (HTML file en een text file als output)
? Kunnen we DTAselect rapport makkelijker manipuleerbaar maken (bv. verwijderen van items en de counter aanpassen,... )
? Kunnen we DTAselect rapport publicatie-vriendelijk maken
? Automatiseren van download van databanken en extractie van subdatabanken met automatische logboekregistratie (download datum, versie, aantal items per databank)
? Kan Sequest-search vlotter verlopen (geïndexeerde databanken?)
[Validatie van identificaties (dmv Lutefisk de novo sequentie-software): belangrijk voor identificaties gebaseerd op slechts één peptide]