UNIVERSITATEA DE ȘTIINȚE AGRONOMICE ȘI MEDICINĂ VETERINARĂ BUCUREȘTI FACULTATEA DE BIOTEHNOLOGII Masterat “Biotehnologii şi siguranța alimentară”, anul I Temă: Tehnici clasice si moderne de detectie in alimente pentru Listeria Disciplină: Metode moderne de detectare a patogenilor și a microorganismelor modificate genetic (OMG) din alimente Coordonator:
This document is posted to help you gain knowledge. Please leave a comment to let me know what you think about it! Share it to your friends and learn new things together.
Transcript
UNIVERSITATEA DE ȘTIINȚE AGRONOMICE ȘI
MEDICINĂ VETERINARĂ BUCUREȘTI
FACULTATEA DE BIOTEHNOLOGII
Masterat “Biotehnologii şi siguranța alimentară”, anul I
Temă: Tehnici clasice si moderne de detectie in alimente
pentru Listeria
Disciplină: Metode moderne de detectare a patogenilor și a microorganismelor
modificate genetic (OMG) din alimente
Coordonator: Student:
Conf. Dr. Florentina Matei Barbu Emilia Nicoleta
-BUCUREȘTI-
2013
Cuprins
Introducere..................................................................................................................................3Genul Listeria-Taxonomie..........................................................................................................4Habitat.........................................................................................................................................6Izolarea si identificarea...............................................................................................................6Metode de izolare, identificare si determinare cantitativa a speciei Listeria monocytogenes in produsele alimentare...................................................................................................................7
Metode bacteriologice........................................................................................................................7
Metodologia de izolare utilizata in tara noastra........................................................................9Detectarea celulelor bacteriene listeria afectate de diferiti factori stresanti la un nivel subletal...................................................................................................................................................11
Metode biochimice...........................................................................................................................13
Metode imunochimice......................................................................................................................14
Metode imunofizice.........................................................................................................................15
Metode imunofizice..................................................................................................................16Flow-citometria................................................................................................................................16
Aceasta metoda permite detectarea unei populatii bacteriene marcate, în mediu lichid.
Dupa o îmbogatire selectiva în bulion LEB, ADN-ul bacterian este colorat cu iodura
de propidium, apoi celulele bacteriene din genul Listeria, sunt marcate cu anticorpi specifici
cuplati cu izotiocianat de fluoresceina. În faza urmatoare, proba este expusa unui fascicul de
raze laser si se realizeaza interpretarea. Celulele bacteriene sunt caracterizate în functie de
morfologie, antigenele de suprafata si continutul în ADN.
Flow-citometria are o sensibilitate intrinseca de 106-107 Listeria monocytogenes/ml,
iar cu o faza de îmbogatire de 24h, contaminarea minima detectabila este de 102 Listeria
monocytogenes/ml. Tehnica este aplicabila si pe probe de consistenta solida, daca examinarea
se executa în bulion de îmbogatire
Imunocaptarea
Imunocaptarea este o metoda originala care permite detectarea si concentrarea
germenilor din genul Listeria existenti într-o proba. Bacteriile sunt captate cu ajutorul
anticorpilor policlonali fixati pe bile magnetice microscopice. Complexele Listeria-imunobile
sunt captate sub actiunea câmpului magnetic, apoi imunobilele sunt spalate, iar complexele
Listeria-anticorpi policlonali sunt evidentiate prin diferite metode. În combinatie cu separarea
imunomagnetica sunt utilizate numeroase sisteme rapide de detectare pentru Listeria: ELISA,
PCR, dot-blot, hibridare etc. Cea mai folosita metoda consta în etalarea imunobilelor pe agar
selectiv, ulterior coloniile caracteristice sunt supuse confirmarii.
Aceasta metoda prezinta avantajul ca permite concentrarea germenilor din genul
Listeria, existenti într-o proba. Datorita utilizarii unui numar mare de imunobile magnetice,
sensibilitatea metodei este foarte mare (1 bacterie/ml.).
Din punct de vedere comercial imunobilele VICAM (Watertown SUA) sunt distribuite
sub forma a doua chituri:
Lister Screen
17
Lister TestTM .
Lister Screen este o metoda calitativa, combinând imunocaptarea cu
etalarea pe agar selectiv PALCAM, totodata este o metoda foarte sensibila (0,5-1UFC/ml.) si
specifica, prezentând avantajul ca permite decelarea bacteriilor stresate din alimente.
Lister TestTM permite o analiza cantitativa a germenilor din genul
Listeria dintr-un produs alimentar sau o proba de mediu. Dupa etapa de imunocaptare
imunobilele sunt etalate pe agar selectiv cu ceftazidima si acid nalidixic. Coloniile
caracteristice sunt supuse confirmarii prin tehnica dot-blot, cu anticorpi monoclonali.
Complexele imune sunt apoi puse în evidenta printr-o reactie enzimatica.
Metoda MIPA (Magnetic Immuno PCR Assay) combina imunocaptarea cu detectarea
prin PCR (poymerase chain reaction). Prin imunocaptare, pe lânga concentrarea germenilor se
asigura si eliminarea unor inhibitori ai polimerizarii, prezenti în unele produse alimentare.
Timpul necesar obtinerii rezultatelor este de 55h.
Metode fizice
Impedansmetria
Aceasta metoda se bazeaza pe determinarea variatiilor electrice dintr-un mediu de
cultura, datorate metabolismului microbian. În cultura obtinuta în bulion se aplica 2 electrozi
care vor înregistra variatia impedantei în urma dezvoltarii culturii. Tehnica poate fi utilizata si
pentru determinarea numarului de germeni si prezinta o serie de avantaje: rapiditatea de
detectare (24h), automatizare, economie de medii si manopera. Totusi, detectarea este dificila
atunci când probele sunt puternic contaminate si impune utilizarea unor medii înalt selective.
Metode de biologie moleculara
18
Tehnicile de biologie moleculara permit detectarea secifica a germenilor din genul
Listeria, sau chiar a speciei Listeria monocytogenes cu ajutorul unor sonde nucleare a caror
tinte sunt localizate pe ADN sau ARN. Totodata sunt metode deosebit de specifice care
asigura detectarea inclusiv a tulpinilor atipice. Dupa utilizarea sondelor nucleare constituite
spre exemplu dintr-un fragment a genei care codifica listeriolizina O, [58], au fost sintetizate
oligonucleotide pentru detectarea bacteriei fie prin hibridare cu o sonda, fie prin tehnica PCR
cu ,,amorse".
Hibridarea cu sonde nucleare
Tehnicile de hibridare a acizilor nucleici se bazeaza pe capacitatea catenelor
complementare de ADN sau ARN de legare specifica si de a forma complexe stabile dublu
catenare. Pentru detectarea speciei Listeria monocytogenes prin hibridare nucleara, se
utilizeaza 2 sonde specifice de ARN ribozomal 16S (Metoda Gene Track sau AccuProbe).
Aceste metode necesita o faza de îmbogatire prealabila indiferent de sonda utilizata (Tabel 3).
TABEL 3
Metode de hibridare cu sonde comerciale pentru detectare Listeria
METODA GENE-TRACK ACCUPROBE TM
Specificitate Listeria spp. sau L.m. L. monocytogenes
Îmbogatire 24h 24-48h*
Sensibilitate
(UFC/ml)
5x104 106
Rapiditate 30 min. 2h 30min
Sistem de evidentiere Colorimetrie (Reactie
imuno-enzimatica)
Luminiscenta
(ester de acridinium)
19
*În caz de rezultat negativ se aplica o îmbogatire secundara.
Kit-ul Accuprobe TM(Gen-Probe sau Diego, USA) permite detectarea specifica a
speciei Listeria monocytogenes dupa îmbogatire si etalare pe geloza. Apoi celulele bacteriene
sunt lizate pentru a elibera ARN-ul ribozomal, iar hibridarea se realizeaza cu o sonda de ADN
monocatenar marcata cu ester de acridinium. Hibrizii sunt detectati prin luminiscenta
(cantitatea de lumina este direct proportionala cu cantitatea de ARN ribozomal).
Bibliografie1. CRAWFORD R.G., BELIVEAU C.M., PEELER J.T., DONNELY C. W. and
BUNNING V.K. (1989). Comparative recovery of uninjured and heat-injured Listeria monocytogenes cells from bovine milk. Appl. Environ. Microbiol. 55, 1490-1494.
2. DESTRO M.T., J.M. FARBER (1996) Use of molecular typing methodes to trace the dissemination of Listeria monocytogenesin a shrimp processing plant., Appl. Envir. Microb., 62, 2, 705-711.
3. DONNELY C.W. and BAIGENT G.J. (1986). Method for flow cytometric detection of Listeria monocytogenes in milk. Appl. Environ. Microbiol. 52:689-695.
20
4. BUDO-AMOAKO E., TOORA S., ABLETT R. and SMITH J. (1992). Evaluation of the ability of primary selective enrichment to resuscitate heat-injured and freeze injured Listeria monocytogenes cells. Appl. Environ. Mi-crobiol. 58, 3177-3179.
5. DOYLE M.P., L.M. MESKE and E.H. MARTH. (1985) Survival of Listeria monocytogenes during manufacture and storage of nonfat dry milk. J. Food Prot. 48, 740-742.
6. EL-KEST S.E. and MARTH E.H. (1992). Freezing of L.monocytogenes and other microorganism: A review. J. Food Prot. 55, 579-582
7. GOLDEN D.A. BEUCHAT L.R. and BRACKETT R.E. (1988). Inactivation and injury Listeria monocytogenes as affected by heating and freezing. Food Microbiol. 5, 17-23.
8. HUI Y.H., RICHARD GORHAM J., MURRELL K.D. and DEAN O. CLIVER. (1994). Foodborne Disease Handbook , Marcel Dekker, N.Y.
9. MEYER D.H. and DONNELLY C.W. (1992) - Effect of incubation temperature on repair of heat-injured Listeria in milk, J. Food Prot., 55, 579-582.
10.PALUMBO S.A. and WILLIAMS A.C. (1991). Resistance of Listeria monocytogenes to freezing in foods. Food Microbiol. 8, 63-68.
11.Mc CARTHY S.A. (1991). Pathogenicity of nonstressed , heat-stressed and resuscitatea Listeria monocytogenes 1A1 cells. Appl. Environ. Microbiol. 57, 2389-2391.
12.THOMAS L.V. and J.W.T. WIMPENNY (1996) Investigation of the effect of combined variations in temperature, pH and NaCl concentration on nisin inhibition of Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus., Appl. Envir.Microb., 62, 2, 2006-2012.
13.WALKER S.J., ARCHER P. and BANKS J.G. (1990). Growth of Listeria monocytogenes of refrigeration temperatures. J. Appl. Bacteriol. 68, 157-162.
14.BEUMER R.R. (1996)-Listeria spp. in domestic environments., Epidem. and Inf., 117, 3, 429- 437.
15. BAYLES D.O., B. A. ANNES and B.J. WILLKINSON (1996), Appl. Eviron Microb., 62, 3, 1116-1119.
16.Alexandru T.Bogdan, Iulian Țogoe, Gheorghe Câmpeanu ș.a, Microbiologia alimentelor-volumul I- Patogeni alimentari, Editura Ascelepius, Bucuresti, 2011.
17. Bărzoi D., Apostu S. – Microbiologia produselor alimentare, Ed. Risoprint, ClujNapoca, 2002, p. 150-155.
18. Bourgeois CM., Mescle J.F., Zucca J. - Microbiologie alimentaire, Aspect microbiologique de la sécurité et de la qualité des aliments, Tec et Doc Lavoisier, Paris, 1996.
19. Bradshaw J.G., Peeler J.T., Twedt R.M. - Thermal resistance of Listeria sp.in milk, I. Food Prot., 54, 1991, p. 12-14.