Chapter 8-II 효소반응 메커니즘 8-1. Transition State Theory> 본 이론은 반응속도가 기질의 기저상태와 전이상태 사이의 에너지 차이인 Gibbs free energy 의 차이의 함수로 표시된다는 이론이다. 즉, [X ≠ ] = [X]exp ( -ΔG ≠ / RT ) rxn coordinate E reactants products ES EP 이때 전이상태 물질의 분해되는 frequency 가 깨지는 bond 의 vibrational frequency ν와 같다고 가정하면, 의 관계에서 가 된다. : Boltzmann constant (1.381×10 -23 JK -1 ) : Plank constant (6.626×10 -34 JHz -1 ) 그러면 25℃에서 이 된다. 반응물 의 분해가 1 차 반응일 경우 아래와 같은 식이 된다. - (1) = k 1 [X] 그러므로 이 때의 1 차 반응 속도 상수 - (2) 효소의 반응은 Michaelis-Menten equation 으로 주로 아래와 같이 나타내는데 ΔG ≠ uncat ΔG ≠ cat ΔG 0 X ≠
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products rxn coordinatecontents.kocw.or.kr/document/wcu/2010/11/02/04/11_02_04_byunggee_08.pdf · 1) Michaelis-Menten equation (experimental based mechanism, kcat≪ k-1) Steady state
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Chapter 8-II 효소반응 메커니즘
8-1. Transition State Theory>
본 이론은 반응속도가 기질의 기저상태와 전이상태 사이의 에너지 차이인 Gibbs free energy
의 차이의 함수로 표시된다는 이론이다. 즉, [X≠ ] = [X]exp ( -ΔG≠ / RT )
rxn coordinate
E
reactants
products
ES EP
이때 전이상태 물질의 분해되는 frequency 가 깨지는 bond 의 vibrational frequency ν와
같다고 가정하면,
의 관계에서
가 된다.
: Boltzmann constant (1.381×10-23JK-1)
: Plank constant (6.626×10-34JHz-1)
그러면 25℃에서 이 된다.
반응물 의 분해가 1 차 반응일 경우 아래와 같은 식이 된다.
- (1)
= k1[X]
그러므로 이 때의 1 차 반응 속도 상수
- (2)
효소의 반응은 Michaelis-Menten equation 으로 주로 아래와 같이 나타내는데
ΔG≠uncat
ΔG≠cat
ΔG0
X≠
E + S ES E + P
여기에서 kcat 는 (2)식의 k1 과 매우 유사한 성질을 가짐을 알 수 있다. 그러므로 효소
반응도 유기 화학에서의 촉매 반응과 유사함을 알 수 있으며, homogeneous catalyst 의
촉매 반응과 같이 효소 반응은 아래와 같은 메카니즘에 의해 일어남이 알려져 있다.
○1 specific acid(H+), base(OH-) catalysis
② general acid, base catalysis
③ electrostatic catalysis, metal
ion catalysis
④ covalent catalysis
예) General base catalysis
General acid catalysis
Ks kcat
1) General acid-base catalysis.
Definition: 반응속도가 base의 농도에 비례하여 증가한다(변한다).
kobs= 2nd order rate const.
BrÖnsted Eqn : efficiency of acid-base catalysis
Log k2 = A + β*pKa, log k2 = A-α*pKa
β : BrÖnsted β value
measures the sensitivity of the rxn to the pKa of the
conjugate acid of the base
α : in acid catalysis
usually o < α, β < 1
Note:
0= means no transfer of a proton
1= means complete transfer of a proton
Ex) ester hydrolysis β ≈ 0.3~0.5
“ In general, the stronger the base, the better the general-base
catalysis; the stronger the acid, the better the general-acid
catalysis.”
즉, “ pH와 pKa를 비교하여 catalyst의 (즉 acid 혹은 base의)
ionization state가 반응을 하는데 있어 매우 중요하다.”
2) Electrostatic catalysis
E = e1*e2/(D*r), where, D=dielectric const
- enzymes stabilize polar transition states better than water does,
because the enzyme has dipoles that are kept oriented toward the
charge, whereas water dipoles are randomized by outer solvation
shells interacting with bulk solvent.
- enzyme plays an important role for substrate solvation
- electrostatic interactions are much stronger in organic solvents than in
water because of lower dielectric const.
3) Metal ion catalysis
- electrophilic catalysis, stabilizing the negative charges
CRO
NHR'
Zn2+
CRO
NHR'RO
Zn2+
RO-
- 104~106 rate enhancement factor
Ex) hydrolysis of glycine ethylester
Co3+ coordinated rxn. 2×106 fold 증가.
- Metal ion becomes a source of OH- ions at neutral pH
Ex) pKa of Cobalt-bound water molecule
(NH3)5Co3++H2O (NH3)5Co2+OH + H+
pKa=6.6
pKa of H2O = 14.7, so that the difference is ca. 8 units.
But, Co-bound OH group is only 40 times less reactive than the
free OH- in catalyzing the hydration of CO2.
∴ becomes Metal-bound H2O is the most effective for nucleophilic
attack.
Ex) carbonic anhydrase
E-Zn2+
OH
C OO E-Zn2+ + HCO3-
즉, combination of i) a metal-bound hydroxyl group and ii) an
intramolecular reaction provides the largest rate enhancement.
4) Covalent catalysis.
- structure-reactivity relationships
- Electrophilic catalysis: Stabilization of an electron(negative charge)
Ex) i) Schiff base formation,
ii) Pyridoxal phosphate,
iii) Thiamine pyrophosphate
- Nucleophile catalysis:
Ex) i) serine hydroxyl
ii) thiol protease, lipase, alkaline phosphatase
iii) imidazole of histidine
A. nucleophilic catalysis
ex) nucleophilic attack at the carbonyl group.
model system: nucleophilic attack on ester synthesis
increases with i) e- withdrawal in the acyl portion
ii) e- withdrawal in the leaving group
iii) increasing basic strength of the nucleophile
반응의 e- withdrawal 및 donation에 대한 민감도를 정량적으로 측
정하기 위해서는 rate const(2차 반응속도상수) term logk2 와
nucleophile 의 pKa를 general-base catalysis처럼 plot할 수 있다.
logk2=A+β pKa :직선관계
이로부터 linear free energy relationship 이 성립함을 알 수 있다.
∵ k2 = fn exp (-∆G≠/RT) = (kT/ h) exp(-∆G≠/RT)
또한, -logKa(=pKa) 는 equilibrium const로 ∆G≠ 와 비례관계가 있
음을 알 수 있다.
∴ logk2=A+βpKa는
① Gibbs energy of activation of bond formation with carbonyl
carbon
② Gibbs energy of transfer of a proton to the nucleophile
의 비례관계라고 볼 수 있다. : relationship b/w the nucleophilicity
of a nucleophile and its basic strength
B. Hammett eqn : alternative way of plotting data for aromatic
-easy to use and rapidly calculating the ratio of the rxn rate
2) Specificity for competing substrates kB EB
B E kA EA d[A] /dt = vA = (kcat/Km)A [E][A] d[B] /dt = vB = (kcat/Km)B [E][B] (vA / vB ) = {( kcat/Km )A[A]}/ {( kcat/Km )B[B]}
Specificity is determined by the ratio of kcat/Km, and not by Km alone. Since kcat/ KM is not affected by (1) non-productive binding, nor by (2) accumulation of intermediates, these phenomena do not affect specificity.
A
8-7. Enzyme Inhibitions
1). Competitive inhibition
- inhibitor 와 기질이 active site 에 대해 경쟁적임.
-Binding to active site
Vo =Vmax [S] / (αKm + [S]),
where α =( 1 + [I] / KI ), KI = [E] [I] / [EI]
Increase in apparent Km by α
No change in Vmax
2) Uncompetitive inhibition
- inhibitor 가 ES complex 를 이룰 경우에만 반응하며 효소자체(E)일 경우는 결합하지 않음.
-Binding only to ES complex at a site distinct from the active site
Vo =Vmax [S] / (Km + α’ [S])
α’ = (1 + [I] / K’I ), K’I = ([ES] [I] / [ESI])
Decrease in Vmax : Vmax / α’, Decrease in apparent Km
3) Noncompetitive inhibition( or Mixed inhibition)
- inhibitor 와 기질이 동시에 active site 에 결합함.
- Binding to either E or ES at a site distinct from the active site
Vo =Vmax [S] / (α Km + α’ [S])
α = α’ , affects Vmax but not Km
v/[S]
v
v/[S]
v
v/[S]
v
1/[S]
1/v
1/[S]
1/v
1/[S]
1/v
(a) (b)
Competitive
Uncompetitive
Noncompetitive
8-8. Multisubstrate system
Ref.) Irwin H. Segel, Enzyme Kinetics(1975), John Wiley and Sons
A. 예)
① ping-pong bi-bi mechanism
E EE-AX E-XA
AX A B BX
EX E-XB E-BX
이 경우는 효소의 한 개의 결합부위에서 반응이 일어나는 경우임.
② random-order mechanism
보통 ternary complex 를 형성하고 두 개의 다른 결합부위를 가지고 있는 경우.
E + AX E-AX
E-AX-B
EBE + B
+B
+AX
EA-BX
EA-BX
-A E-BX
E + A
E + BX
③ ordered mechanism (예: ordered Bi-Bi)
보통 ternary complex 를 형성하는 경우임.
E EEA
A PB Q
EAB-EPQ EQ
B. Steady state kinetics
multisubstrate 의 경우도 한 개의 기질농도를 일정하게 유지하고 나머지 다른 기질에 대해
M-M equation 을 따르는 식으로 변환할수 있음을 알 수 있다.
<random bi-bi>인 경우를 예를 들어 보면
E+A+B
EA + B
EB+A EAB EPQ
EP + Q
P+EQ
P+E + Q
KA
KB
αKA
αKB
kp
k-p
βKQ
Kp
βKp
KQ
만약, 속도결정단계가 EAB 가 EPQ 로 변하는 step 이라면 P,Q 가 아직
생기지 않았다고 가정할 때, 초기 반응속도는 라고 생각할 수 있다. 이때,
이며 이때,
이므로
두 개의 기질중 를 고정하고 를 변화시킬 때,
상기한 속도식을 정리하면 M-M 식과 같이 쓸수 있다.
이때,
이 식에서 볼 때, 의 농도가 saturation 되었을 때, 이고 임을 알 수 있으며 의 농도를
고정하고 의 농도를 변화시키면 L-B plot 을 그릴 수 있다. (그림 2 참조)
이와 같이 ordered Bi-Bi 및 ping-pong Bi-Bi 식을 구하면 아래와 같다.
ordered Bi-Bi:
ping-pong Bi-Bi:
<Extra Advanced>
3) Intermediates occurring after ES : KM < KS
Ks K K’ k4
E+S ES ES’ ES’’ E+P
Slow
[ES’] = K[ES] and [ES”] = K’[ES’]
Km= Ks
1+ K +KK’
kcat = k4KK’
1+ K +KK’
ex) chymotrypsin – catalyzed hydrolysis of esters and amides
Ks k2 k3
E+S ES EAc E
P1
EAc: acyl enzyme
υ= [E]o[S] k2k3/(k2+k3) Ksk3/(k2+k3) +[S]
Km = Ks k3 kcat = k2k3 k2+k3 , k2+k3
if k3<<k2 , kcat = k3
① leaving group activation
A. Electrophilic catalysis
(i.e. Stabilization of an electron(negative charge))
i) Schiff base formation
ii) Pyridoxal phosphate
iii) Thiamine pyrophosphate
B. Nucleophile catalysis ~ ① serine hydroxyl or
② thiol protease, lipase, alkaline
phosphatase
③ imidazole of histidine
i) shiff base
예) i) acetoacetate decarboxylase
acetoacetate acetone + CO2
ii) Aldolase and trand aldolase
ii) PLP. ~ coenzyme phridoxal phosphate
- pyridine ring in the schiff base acts as an electron sink stabilize a
negative charge.
a. removal of α-hydrogen
cause
i)racemization
ii)transamination shiff base of an α-ketoacid
iii)β-decarboxylation amino acid가 aspartate일 경우
iv)interconversion of side chains
b. α-decarboxylation
iii) Thiamine pyrophosphate
- positive charge on the nitrogen promotes the ionization of the C-2