Producción de Protea sas y Bacterioci nas por l a Cepa Mexicana Bacillus subtilis No. 21 Contra Hongos y Bacterias Patógenas e n Alimentos María del Rosario Razo Belmán, José Eleazar Barboza Corona, Rubén Salcedo Hernández, Manuel Vázquez Arista, Ma. Guadalupe L. Basurto Cadena. Departamento de Alimentos, Instituto de Ciencias Agrícolas, Universidad de Guanajuato. Km 9 Carretera Irapuato-Silao, Exhacienda El Copal S/N Irapuato, Gto. [email protected]. RESUMEN En estudios previos se comprobó la actividad antagónica, “in Vitro” y en invernadero, que presenta una cepa mexicana de Bacillus subtilisNo. 21, aislada de cultivos de fresa de la región de Irapuato contra los hongos fitopatógenos Fusarium verticillioidesy Rhizoctonia solani. Por tal motivo, se decidió evaluar algunos de los posibles mecanismos de acción de esta bacteria. En este trabajo se detectó la producción de proteasas y bacteriocinas, las cuales pudieran estar involucradas en el mecanismo antagónico de la bacteria B.subtilisNo. 21. AB STRACT Previous studies, “in vitro” and greenhouse, it was proved that the antagonistic activity of a Mexican Bacillus subtilisstrain 21, isolated from strawberry fields in Irapuato, against its pathogenic fungi Fusarium verticillioidesand Rhizoctonia Solani, Hence, it was decided evaluate some possible action mechanisms of this bacteria. In this work proteases and bacteriocinas production were detected, which could be involved in the antagonistic mechanism of Bacillus subtilisstrain 21. INTRODUCCION Uno de los aspectos que más afectan la producción de los cultivos a nivel mundial lo es sin dudas la presencia cada vez más creciente de enfermedades causadas por hongos, bacterias y virus, esto trae como consecuencia la merma mundial de los cultivos. Este aumento en las pérdidas de cultivos y el número de enfermedades presentes en éstos, hace notable la disminución de la efectividad de los productos químicos, lo que con frecuencia da lugar a problemas económicos para los agricultores. Actualmen te se está desarrollan do la base científica de la lucha biológica y como principal componente de esta se encuentra el control biológico el cual abarca desde la represión o control de insectos hasta las enfermedades causadas por hongos bacterias y virus. Para su
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Producción de Proteasas y Bacteriocinas por la Cepa Mexicana Bacillus subtilis No. 21Contra Hongos y Bacterias Patógenas en Alimentos
María del Rosario Razo Belmán, José Eleazar Barboza Corona, Rubén Salcedo Hernández,Manuel Vázquez Arista, Ma. Guadalupe L. Basurto Cadena.
Departamento de Alimentos, Instituto de Ciencias Agrícolas, Universidad de Guanajuato. Km9 Carretera Irapuato-Silao, Exhacienda El Copal S/N Irapuato, Gto.
control se han utilizado microorganismos los cuales ejercen una actividad antagónica contra
dichas enfermedades, entre estos se encuentran hongos como Beauveria, Metarhizium y
Paecilomyces y bacterias como Bacillus thuringiensis y Bacillus subtilis. (Antela, 2004).
Uno de los principales problemas que limita la productividad de los cultivos es el usoconstante de fungicidas, los cuales son nocivos para la salud y el medio ambiente
(EPA,1999).
Estudios realizados en los últimos años sugieren que el método para combatir plagas y
enfermedades en productos hortícola es el control biológico, el cual puede ser incorporado a
un plan de manejo integral con el uso adecuado de rizobacterias antagonistas contra hongos
fitopatógenos (Fernández, 1999), tal es el caso de la cepa de Bacillus subtilis No. 21, aislada
de cultivos de fresa de la región de Irapuato, la cual demostró, a nivel de invernadero, ser
antagónica contra hongos de Fusarium verticillioides y Rhizoctonia solani (Torres - Basurto,2000).
El objetivo de este trabajo fue estudiar dos de los posibles mecanismos por los cuales la
bacteria B. subtilis No.21 ejerce su antagonismo contra los microorganismos probados. Se
observo la presencia de altos niveles de proteasas y una posible actividad (baja) de
bacteriocina.
MATERIALES Y METODOS
Cultivo deBacillus subtilis
No 21. La cepa, conservada en el cepario del Instituto deCiencias Agrícolas se creció como colonias aisladas en Agar Nutitivo estandar (BD Bioxon).
Una colonia se picó en 3 mL de caldo nutrido (BD Bioxon) y se dejó crecer toda la noche, de
este preinóculo se transfirieron 0.5 mL en 100 mL de Caldo nutritivo y se cultivó en los
tiempos indicados (ver resultados). Las células se centrifugaron y el sobrenadante se utilizó
como “medio condicionado”.
Determinación de proteasas. Se añadieron 100 μL de medio condicionado en pozos
horadados en un medio caseolítico, se dejaron 24 h en refrigeración para la difusión de las
proteasas en el medio y se incubaron a 28 ºC por otras 24 h. Posteriormente se midió el áreade hidrólisis en las diferentes muestras usando el halo transparente delimitado por un círculo
blanquecino formado alrededor de los pozos. Una unidad de proteasa (U) fue definida como
el equivalente a 1mm2
de área de hidrólisis.
Cuantificación de proteasas por el método de Kunitz. Se preparó una mezcla de 0.5 mL
de enzima + 1 mL de sustrato de caseína en regulador con glicina, se incubó a 37 °C durante
30 min. Una vez terminada la incubación se agregaron 3.5 mL de ácido tricloroacético 4%
para detener la reacción, se agitó durante unos segundos para mezclar y se tomó una
muestra de 1 mL la cual se depositó en un microtubo y posteriormente se centrifugo durante
10 min a 10,000 rpm. Una vez terminada la centrifugación se recuperó el sobrenadante paramedir la absorbencia a 280 nm una unidad fue definida como
A280nm*Dilución*160.566/volumen/30 min. (Rojas I., 1994).
Método de difusión de pozos para la determinación de bacteriocinas. Para la evaluación
de bacteriocinas se inocularon previamente las cepas de diferentes bacterias patógenas y
Bacillus cereus en 15 mL de Caldo de Soya Tripticaseína (CST), se incubaran a 37 °C y 28
°C respectivamente con una agitación de 200 rpm durante 24 h. Después de la incubación se
ajusto la concentración de células a una absorbencia a 2.0 nm y posteriormente se
mezclaron 105 µL de B. cereus + 15 ml de agar para pozos. Se realizó la misma mezcla paracada una de las 12 especies patógenas que se utilizaron, la mezcla se vació en cajas de
Petri y se dejó solidificar, una vez solidificado el medio se hicieron pozos de 8 mm y se
dejaron secar a 37 °C durante 2 h. Después se agregaron 100 µL de la bacteriocina (medio
condicionado) y se incubaron a 4 °C durante 24 horas para la absorción de la bacteriocina,
luego se incubó a B. cereus a 28°C y las cepas patógenas a 37°C durante 24 h. Si la prueba
es positiva se observaran halos de inhibición y se medirá el diámetro del halo para
determinar así la actividad de bacteriocinas.
Método de fluorescencia para determinación de bacteriocinas. Se preparó un preinoculóde B. cereus , el cual constó de 10 mL de Caldo de Soya Tripticaseína (CST)+ 2 asadas de la
colonia y se incubara a 28 °C durante 24 h. Después se efectuó una siembra de 5 µL de
preinoculó +45 mL de CST y se incubara a 28 °C a 200 rpm durante 2 h, posteriormente se
tomarán 35 mL de la muestra y se centrifugaron a 0 °C durante 5 – 10 min a 4000 rpm. El
sobrenadante se tiró y se resuspendió la pastilla en buffer de fosfatos hasta ajustar las
células a una absorbencia de 0.887 nm. Se preparó un blanco agregando 50 µL buffer de
fosfatos + 20 µL células normales + 930 µL (Berberina + buffer de fosfatos) y un control
agregando 45 µL buffer de fosfatos + 5 µL muestra +20 µL células normales + 930 µL(Berberina + buffer de fosfatos). La preparación de las muestras se realizaron agregando 50
µL muestra + 20 µL células normales + 930 µL (Berberina + buffer de fosfatos), se agitaron
unos segundos en el vortex y se realizó la medición en el fluorómetro Hoefer DynA Quant
200 a una longitud de onda de 360 nm de excitación y 460 de emisión (Fuente –Salcido,
Determinación de proteasas. Los resultados obtenidos mostraron la presencia de
proteasas. En la Tabla 1, se muestran los resultados del diámetro que presentaron los halos
de hidrólisis al colocar la cepa de Bacillu s subtilis No. 21, en dos diferentes medios. LasFiguras 2 y 3 muestran el ensayo de proteasas a 24, 48 y 72 h en medio de caldo nutritivo.
Las Figuras 4 y 5 muestran el ensayo de proteasas a las 24, 48 y 72 h en medio de quitina
coloidal. En estas figuras se puede observar que las muestras colocadas en caldo nutritivo
tuvieron mayor actividad de proteasas que las muestras colocadas en quitina coloidal.
Tiempo
Medio de Cultivo
Caldo
Nutritivo
Quitina
Coloidal
24 1.3823 0.3534
48 2.8589 0.7461
72 2.7568 1.1545
Tabla 1. Determinación de proteasas (U) producidas por B. subtilis No. 21 al cultivarlos en diferentes medios de cultivo
Fig. 1. Ensayo de proteasas Fig. 2. Ensayo de proteasas
a las 24, y 48 h en caldo nutritivo a las 72 h en caldo nutritivo
BIBLIOGRAFIAAntela- Arrastía., O., 2004. Control biológico como estrategia en el manejo integrado de
plagas.
EPA., 1999 Environmental Protection Agency and pesticides.
Fernández, G.J., 1999. Agroecología Americana. En Enciclopedia Práctica de la Agricultura y
Ganadería: 11-18. Grupo Editorial Océano. Barcelona, España.
Fuente Salcido N., Salcedo Hernandez R., Alanís Guzmán M., K. Bideshi D., Barboza
Corona J., 2007. A new rapid fluorogenic method for measuring bacteriocin actiity.,
Journal of Microbiological Methods.
Torres G.L.I., Basurto C.M.G. 2000. Control Biológico De Hongos Fitopatógenos De La Raíz
y Corona De Fresa Con Cepas Antagónicas De Bacillus subtilis . Tesis de Licenciatura.
ICA. U. de Guanajuato. Irapuato, Gto. México.
Rojas I. 1994. Producción de proteasas por Bacillus thuringensis crecido en medios a base
de materiales protein-quitinosos. Posible uso de estas enzimas en la obtención de hidrolizados de carne y harinas de pescado. Tesis de Maestría. Instituto Tecnológico