UNIVERSIDAD NACIONAL DE MAR DEL PLATA FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES “Estudio Estructural y Funcional del Inhibidor de Serina – Proteasas tipo Germina presente en plantas de Trigo” Lic. Andrea Yamila Mansilla Director: Dr. Rubén Danilo Conde Instituto de Investigaciones Biológicas Tesis para optar por el título de Doctor en Ciencias Químicas
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UNIVERSIDAD NACIONAL DE MAR DEL PLATA
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES
“Estudio Estructural y Funcional del
Inhibidor de Serina – Proteasas tipo
Germina presente en plantas de Trigo”
Lic. Andrea Yamila Mansilla
Director: Dr. Rubén Danilo Conde
Instituto de Investigaciones Biológicas
Tesis para optar por el título de Doctor en Ciencias Químicas
Esta tesis fue desarrollada mediante Becas de Postgrado I y II otorgadas por el
CONICET. Las mismas fueron dirigidas por el Dr. Rubén D. Conde y codirigidas por la
Dra. Carmen I. Segarra, quienes sumaron sus conocimientos sobre Bioquímica y
Biología Molecular, y Fisiología Vegetal y Fitopatología.
Intentar significa arriesgar,
arriesgar significa probablemente perder,
perder significa aprender,
aprender significa siempre ganar.
(Anónimo)
AGRADECIMIENTOS
Al Dr. Conde, por permitirme realizar esta tesis bajo su dirección y darme lugar
en su laboratorio. Por la libertad con la que me dejo trabajar, siempre contando con su
apoyo, sabiduría y conocimientos (“wikiconde”). Por ser un ejemplo como persona y
científico, por el buen ambiente en el que se trabaja y por priorizar a las personas ante
todo.
A Carmen, mi codirectora... Por estar siempre cuando la necesité, tanto en la
discusión de los experimentos como en las correcciones de esta tesis. Por acompañarme,
aconsejarme, por ser un ejemplo de lucha y por contribuir a que todos tengamos una
facultad y una educación mejor. Por guiar mis primeros pasos en este mundo de la
investigación y verme crecer… desde que me independicé de carpeta en la computadora
hasta la finalización del doctorado.
A Cristina Cordo y a todo su grupo de trabajo del CIDEFI (Facultad de
Agronomía de la Universidad Nacional de La Plata), porque sin ellos no hubiera sido
posible la realización de los ensayos a campo. Por su ayuda, predisposición y
entusiasmo para trabajar.
A Claudia Casalongué por estar siempre predispuesta a discutir nuestros
experimentos, por el aporte de sus ideas para la realización de esta tesis, por
preocuparse en mi futuro, por su alegría y energía.
A la gente linda del laboratorio 3-4, a los que están y a los que se fueron, y que
constantemente me ayudaron con sus consejos y buena onda. En especial a Marce, que
aún estando lejos me brindó su ayuda y sus aportes son siempre un verdadero lujo.
A Diego y Vicky, por alegrarse y compartir los días en que los experimentos
daban bien y por levantarme el ánimo cuando todo salía mal (esos días si que
abundaban!), por las charlas de los pasillos, por los mates, por sus consejos, por todo…
Porque además de ser compañeros son muy buenos amigos y aunque la vida nos lleve
por caminos diferentes sé que estarán siempre conmigo.
A todos los integrantes del IIB por los momentos compartidos, por la ayuda con
algún experimento o con el uso de algún equipo, por su compañerismo.
A Mary, Tere y Vero, por la buena onda que tienen. Tere, gracias especialmente
por responder siempre mis dudas acerca de las finanzas!!!
A mis amigas… Vero, gracias por estar siempre, tanto en los momentos felices
como en los difíciles de mi vida. A Rosy, Yesi, Lau y Ali, porque a pesar de que no nos
veamos tanto como queremos se que están y que puedo contar con ellas. Por muchos
años más de mates, charlas y anécdotas.
A mis padres y a mi hermana, por estar orgullosos y confiar en mí, porque sin su
apoyo nada de esto hubiera sido posible. A mis sobrinitos, porque son dos soles en mi
vida.
A Cristian por estar al lado mío, por su amor incondicional, porque la luchamos
juntos, por aguantarme siempre, por darme fuerza en los momentos complicados, por
admirarme y por tratar de prestar atención cuando quería explicarle algún
experimento… (perdón!)
A la Universidad Nacional de Mar del Plata y al CONICET porque permitieron
la realización de esta tesis.
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ÍNDICE TEMÁTICO
Índice ......................................................................................................................... i
Abreviaturas.............................................................................................................. iv
Anexo: Nomenclatura de los aminoácidos ............................................................... vi
peroxidasas catalizan la descomposición del H2O2 (Chang et al., 1984). Cuando las
plantas son sometidas a condiciones de estrés ambiental como alta intensidad de luz,
temperaturas extremas, sequía, salinidad elevada, tratamiento con herbicida o
deficiencias de minerales, el equilibrio entre la producción de especies reactivas de
oxígeno y la actividad de las enzimas antioxidantes se ve alterado, resultando en un
daño oxidativo (Spychalla and Desborough, 1990; Wise and Naylor, 1987). Se ha
demostrado que las plantas con altos niveles de antioxidantes, ya sean constitutivos o
inducidos, tienen una mayor resistencia al daño oxidativo (Spychalla and Desborough,
1990).
El estudio de cómo las plantas responden a los diferentes estreses a nivel de
genes y proteínas es importante para desarrollar cultivares tolerantes a las condiciones
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desfavorables. En general, la identificación de genes que se expresen diferencialmente
en condiciones de estrés es de mucha utilidad para entender los mecanismos de defensa
de la planta. El desarrollo de técnicas de gran alcance como el análisis por microarrays
proporciona una gran cantidad de información acerca de los genes implicados en las
respuestas al estrés ambiental. Además, dichos enfoques genómicos deben
complementarse con análisis cualitativos y cuantitativos del proteoma de la planta.
Como se ha mencionado anteriormente, las GLPs han sido asociadas a
mecanismos de defensa de las plantas frente a estreses bióticos y abióticos. En el caso
de IPG, se ha demostrado su participación en los mecanismos de defensa frente al
ataque del hongo patógeno Septoria tritici (Segarra et al., 2002) sin embargo no se ha
evaluado su participación en los mecanismos de tolerancia a estrés abiótico. Además,
como se demostró en el capítulo anterior, IPG es una proteína multifuncional, con al
menos tres actividades enzimáticas. Por ello, en la primera parte de este capítulo, se
evaluará la vinculación de IPG con los mecanismos de tolerancia al estrés salino y al
estrés por altas temperaturas desde el punto de vista de su abundancia y de la
modificación de sus actividades enzimáticas.
1.1. Estrés salino
La salinidad del suelo es un problema agrícola importante, sobre todo porque la
mayoría de los cultivos poseen baja tolerancia a la sal. La respuesta de las plantas al
estrés salino es un fenómeno complejo que involucra procesos bioquímicos y
fisiológicos, así como también cambios morfológicos y de desarrollo (Flowers et al.,
1977; Greenway and Munns, 1980). La identificación de genes cuya expresión permita
a las plantas adaptarse al estrés o tolerar la sal, es esencial para los programas de
mejoramiento genético. Una de las estrategias que se siguen para determinar los
mecanismos moleculares implicados en el estrés salino, es identificar genes que
cambien su expresión como resultado del estrés salino. En ese aspecto, se ha
demostrado que el estrés salino provoca cambios en la regulación génica en general y,
en particular, de dos isoformas de GLPs en raíces de cebada (Hurkman and Tanaka,
1996). Sin embargo, poco se sabe sobre el posible papel de estas proteínas en el estrés
salino (Berna and Bernier, 1999; Hurkman et al., 1994; Hurkman and Tanaka, 1996;
Hurkman et al., 1991). Recientemente se ha demostrado que el estrés salino no provoca
cambios en la expresión del gen de una germina (gf 2.8), pero sí ocurre una
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relocalización de la misma (Caliskan, 2009), encontrándose predominantemente en las
células del coleóptilo y disminuyendo en las células de la coleorriza de los embriones.
Sin embargo aún falta dilucidar los mecanismos por los que se altera el sitio de
expresión de dicha germina.
En el presente trabajo de tesis, se evaluó el comportamiento de IPG en las
plántulas de trigo sometidas a estrés salino y se trató de determinar si participa en los
mecanismos de tolerancia a dicho estrés.
En primer lugar se determinó el contenido de IPG en el FI de primera y segunda
hoja de plántulas de trigo de 17 días, sometidas a estrés salino durante 12 días. Tal como
se observa en la Figura 31, los niveles de IPG en el FI de la primera hoja permanecieron
constantes (A) y disminuyeron en la segunda (B) cuando se analizaron a través de un
western-blot.
Se ha descripto que en hojas de cebada sometidas tanto a estrés biótico como
abiótico una GLP del FI se insolubiliza o, dicho de otra manera, se relocaliza en pared
celular (Vallelian-Bindschedler et al., 1998). En dicho trabajo, para determinar que tipo
de unión posee la GLP con la pared celular, se realizó una separación de las proteínas
diferenciando a las que están unidas mediante enlaces iónicos, uniones no covalentes o
covalentes. Se determinó que la GLP de cebada se encontraba en la fracción de
proteínas unidas de manera no covalente a la pared celular. Para determinar si algo
similar ocurre con IPG en el FI de la hoja de trigo, se obtuvo el FI de las hojas y
posteriormente se extrajeron las proteínas unidas de manera no covalente a la pared
celular, utilizando un buffer conteniendo SDS, tal como lo describen Vallelian-
Bindschedler et al. (1998). El resultado de dicha extracción se muestra en la Figura 32,
Figura 31. Efecto del estrés salino sobre la abundancia de IPG en el FI. Proteínas del FI de
la primera hoja (A) o de la segunda hoja (B) fueron separadas en SDS-PAGE, transferidas a
una membrana de nitrocelulosa e inmuno-detectadas con el anticuerpo específico de IPG. Calle
1: plantas control, Calle 2: plantas tratadas con 200 mM NaCl. La figura es representativa de
tres experimentos independientes. En cada calle se sembró el FI que corresponde a 100 mg de
peso fresco de hojas
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en la que se observa que los niveles de IPG son mayores en la primer hoja cuando es
sometida a estrés salino (Figura 32 A). En cambio, en la segunda hoja la diferencia entre
control y estrés no fue estadísticamente significativa (Figura 32 B).
Como se ha mencionado anteriormente, IPG es un inhibidor de proteasas con
actividad SOD y dichas actividades enzimáticas han sido vinculadas con la tolerancia al
estrés abiótico. En el caso de inhibidores de proteasas, no son muchos los trabajos que
han demostrado esta relación, pero por ejemplo, se ha descripto un inhibidor de
proteasas de trigo, del tipo Bowman-Birk, que juega un rol importante en la regulación
del crecimiento de las plantas y transporte de Na+ en plantas sometidas a estrés salino
(Shan et al., 2008). También se ha demostrado la acumulación de inhibidores de tripsina
y α-amilasa en hojas de Amaranthus hypochondriacus en respuesta a estrés salino, entre
otros tipos de estreses abióticos (Sanchez-Hernandez et al., 2004). Con respecto a la
actividad SOD, son muchos los trabajos que demuestran su importancia en plantas
sometidas a estrés, debido a su capacidad para eliminar a las especies reactivas de
oxígeno (Esfandiari et al., 2007; Mandhania et al., 2006; Rout and Shaw, 2001). Por
ello, se evaluó si la actividad de inhibidor de proteasas o la actividad SOD de IPG se
modificaban por el estrés salino.
En el primer caso la actividad inhibitoria fue medida in vitro (Udenfriend et al.,
1972) y se detectó que dicha actividad disminuye en el FI y aumenta en la pared, tanto
para primera como para segunda hoja (Figura 33).
Figura 32. Efecto del estrés salino sobre la abundancia de IPG en la pared celular.
Proteínas unidas a la pared celular extraídas de la primera hoja (A) o de la segunda hoja (B)
fueron separadas en SDS-PAGE, transferidas a una membrana de nitrocelulosa e inmuno-
detectadas con el anticuerpo específico de IPG. Calle 1: control, Calle 2: 200 mM NaCl. La
figura es representativa de tres experimentos independientes. En cada calle se sembró el
volumen de extracto que corresponde a 50 mg de peso fresco de hojas.
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La actividad SOD se analizó mediante un zimograma (Beauchamp and
Fridovich, 1971). En el FI de plantas sometidas a estrés salino la actividad SOD
disminuye, tanto para primera como para segunda hoja (Figura 34, FI A y B). Por el
contrario, en la pared celular de primera hoja sometida a estrés salino se observó un leve
aumento con respecto al control (Figura 34, Pared, A).
El peróxido de hidrógeno generado por la dismutación del anión superóxido y
catalizado por SOD en la pared de la primera hoja, podría actuar tanto como molécula
señal en mecanismos de defensa (Kovtun et al., 2000) o catalizando reacciones de
Figura 33. Efecto del estrés salino sobre la actividad inhibitoria de IPG en FI y pared
celular. (A) Primera hoja y (B) segunda hoja. La actividad inhibitoria fue expresada en
porcentaje, considerando el 100% a que aquella que provoca una inhibición total sobre tripsina.
En cada medición se utilizó el volumen de muestra correspondiente a 100 mg de peso fresco de
hoja.
Figura 34. Efecto del estrés salino sobre la actividad SOD de IPG. Las proteínas del FI o
unidas a la pared celular fueron separadas en SDS-PAGE en condiciones no reductoras y
analizadas para su actividad SOD. (A) Primera hoja, (B) Segunda hoja, (1) control, (2) 200
mM NaCl. En cada calle se sembró el volumen de muestra correspondiente a 500 mg de peso
fresco de hoja.
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cross-linking involucradas en la síntesis de lignina y por ende en el fortalecimiento de
la pared celular (Lane et al., 1993).
El estrés salino produce un retraso en el crecimiento de las plantas (Hernández et
al., 1995; Takemura et al., 2000). La respuesta inmediata al estrés, es la reducción en la
velocidad de expansión de la superficie de la hoja, lo que lleva a un detenimiento total
cuando la concentración de sal aumenta (Wang and Nil, 2000). El estrés salino también
provoca una disminución considerable en el peso fresco y seco no sólo de hojas sino de
tallos y raíces (Ali-Dinar et al., 1999; Hernández et al., 1995). En el caso de las
plántulas de trigo evaluadas en el presente trabajo en las condiciones de estrés salino, no
se observaron cambios significativos en la longitud de la primera hoja de trigo pero si
en la segunda hoja (Figura 35, A y B). Además en la primer hoja, la disminución del
peso fresco fue menor que en la segunda (Figura 35 C).
Figura 35. Efecto del estrés salino sobre la longitud y peso fresco de las hojas de trigo.
(A) Plántulas enteras (primera y segunda hoja) de trigo control o sometidas a estrés salino (200
mM NaCl). En las mismas se determinó longitud (B) y peso fresco (C). Los datos son el
promedio de al menos 5 experimentos independientes. Barras con letras distintas son
significativamente diferentes entre sí, con p < 0,05 (test de T). Las barras representan el SD.
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En general, el contenido total de clorofila y carotenoides disminuyen en las hojas
sometidas a estrés salino. (Khavari-Nejad and Chaparzadeh, 1998; Parida et al., 2004)
Las hojas más viejas comienzan a desarrollar clorosis y, si la duración del estrés es
prolongada, directamente se caen (Agastian et al., 2000; Gadallah, 1999; Hernández et
al., 1995; Hernández et al., 1999). Sin embargo, Wang and Nil (2000) han descripto que
el contenido de clorofila aumenta bajo condiciones de estrés salino en Amaranthus.
En las plantas analizadas en la presente tesis se encontró que el contenido de
clorofila en la primera hoja de las plántulas sometidas a estrés es mayor que en las hojas
control. Estas diferencias no se observaron en la segunda hoja (Figura 36 A).
Por otra parte y debido a que la acumulación de prolina es un mecanismo
corriente en las plantas halófitas (Hernández et al., 2000; Lee and Liu, 1999), se
determinó el nivel de este osmolito en hojas control y estresadas.
Como se observa en la Figura 36 B hay un aumento del 200 % en el contenido
de prolina libre de la primera hoja tratada con 200 mM de NaCl, mientras que en la
segunda hoja no hay diferencias significativas. Además los niveles de prolina en la
segunda hoja son más bajos que en la primera. Dado que la acumulación de prolina
otorga una mayor tolerancia al estrés salino (Kuznetsov and Shevyakova, 1997), estos
resultados sugieren que en la primera hoja de plántulas de trigo se han activado algunos
de los mecanismos de tolerancia a dicho estrés que no pudieron mantenerse en la
Figura 36. Efecto del estrés salino sobre el contenido de clorofila (A) y de Prolina libre (B)
de las hojas de trigo. El contenido de clorofila de hojas control y tratadas con 200 mM NaCl
se midió con el minolta-SPAD según lo descripto en Materiales y Métodos. El contenido de
prolina libre se determinó según lo descripto por Bates et al. (1973) Los datos son el promedio
de al menos 3 experimentos independientes. Barras con letras distintas son significativamente
diferentes entre sí, con p < 0,05 (test de T). Las barras representan el SD.
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segunda hoja, y ello puede estar relacionado con el aumento de IPG en la pared celular
(Figura 32A).
Para determinar si el aumento de IPG en la pared celular se debe a una
insolubilización de IPG del FI, es decir una relocalización en la pared, o a una
disminución en la cantidad que se exporta al apoplasto, se realizó un nuevo ensayo
modificando el método de extracción de proteínas. Para ello, previo al tratamiento con
SDS para extraer las proteínas unidas de manera no covalente a la pared, se realizó una
incubación con un buffer fosfato pH 7.5 y así se extrajeron las proteínas solubles
intracelulares. El resultado de dicho experimento se muestra en la Figura 37.
Tanto en las plántulas control como en las sometidas a estrés salino, hay mayor
cantidad de IPG en la fracción de proteínas solubles que en la insoluble unida a pared
celular (Figura 37A). Si se compara sólo la fracción de proteínas de pared, hay mayor
cantidad de IPG en las plántulas tratadas con 200 mM NaCl, que va acompañado de una
disminución en la fracción soluble, tal como lo muestra la densitometría (Figura 37B).
Sin embargo esta disminución no alcanza para explicar el mayor aumento en pared, por
lo que para comprobar las razones de esta relocalización se deberían realizar otros
experimentos para cuantificar la cantidad de IPG con péptido señal de modo de
determinar si se encuentra ubicado intracelularmente o en el apoplasto.
Figura 37. Efecto del estrés salino sobre la abundancia de IPG en pared celular: unida no
covalentemente (P) y en su forma soluble (S). Luego de la obtención del FI de la primera
hoja las proteínas restantes fueron extraídas en buffer fosfato (S) y con SDS (P). (A) Western
blot contra el anticuerpo especifico de IPG; (B) Densitometría de la banda inmuno detectada en
el western blot. Se consideró el 100% a la densitometría de las calles control. En cada calle se
sembró el volumen de FI que corresponde a 50 mg de peso fresco de hoja.
Resultados Capítulo II
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Debido a que la proteína germina fue aislada de embriones maduros de semillas
(Thompson and Lane, 1980), y que uno de los objetivos de la presente tesis es
determinar si IPG se expresa en otros órganos o estadios de la planta, se decidió evaluar
la presencia de IPG en embriones maduros de semilla de trigo. Además, y en relación
con la caracterización del estrés salino, se intentó determinar si su contenido se modifica
frente al estrés salino.
En primer lugar se evaluó el efecto del estrés salino en la germinación de las
semillas de trigo (Figura 38).
Como se puede observar en la Figura 38, el aumento en la concentración salina
retarda la germinación. A las 18 h de incubación en agua (control, 0 mM NaCl) el 90%
de las semillas están germinadas, mientras que en la incubación en 200 mM de NaCl,
sólo el 10% de las semillas germinaron. En tiempos más largos (a partir de las 24 h) y
hasta los 150 mM de NaCl, el estrés salino parece no influenciar significativamente la
germinación. En cambio, una concentración de 200 mM de NaCl, retarda mucho más la
germinación, y 60 h post-imbibición no se llega al valor del control.
Una vez determinado el efecto de la salinidad en la germinación, se planteó
establecer si IPG se encuentra en embriones maduros de semilla de trigo, y de ser así, si
hay modificaciones en su contenido en condiciones de estrés salino. Para ello se extrajo
el embrión a diferentes horas post-imbibición de las semillas. Los tiempos usados
fueron: 0 (secos), 1 h, 5 h, 18 h y 24 h, en los que se imbibieron en agua (control) o en
Figura 38. Efecto del estrés salino sobre la germinación de las semillas de trigo. Se expresó
el % de germinación en función de las horas de incubación en las soluciones de NaCl de 0 a
200 mM.
Resultados Capítulo II
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solución de NaCl 200 mM. Se utilizó esta concentración de cloruro de sodio debido a
que con ella se obtuvo el efecto más marcado de retardo en la germinación (Figura 38).
Las proteínas totales se extrajeron de los embriones según Cuming y Lane (1979) y se
realizó un western blot para determinar si IPG esta presente en dicho extracto (Figura
39).
Se puede observar que el anticuerpo reconoce específicamente una banda de
aproximadamente 50 kDa (Figura 39A). Dicha masa molar, se aproxima más al
oligómero de IPG que al monómero que debería estar presente dado que las muestras
fueron totalmente desnaturalizadas para dicho experimento.
Cabe mencionar que el anticuerpo de IPG es policlonal, por lo que puede
interaccionar con proteínas similares estructuralmente. Entonces, una posible
explicación del resultado anterior es que IPG no se encuentre en el embrión y el
anticuerpo esté reconociendo una proteína semejante. Hay que recordar que en la
superfamilia de las cupinas, a la que germinas y GLPs pertenecen, se encuentran las
proteínas globulinas de reserva, como vicilinas y leguminas, muy similares
estructuralmente a IPG. Otra posibilidad es que en este órgano IPG se encuentre
formando dímeros y no monómeros, y éstos necesiten condiciones diferentes para su
desnaturalización. Eso justificaría el mayor peso molecular obtenido. Para comprobar
alguna de estas hipótesis, se necesitarían otro tipo de ensayos. Se podría realizar
Figura 39. Efecto de la salinidad sobre la abundancia de IPG en embriones de semillas de
trigo. (A) Western-blot y (B) densitometría de la banda inmunodetectada. Semillas de trigo
fueron imbibidas durante 0, 1, 5, 18 y 24 hs en agua (C) o 200 mM NaCl (S) y luego se realizó
la extracción de proteínas del embrión. Las muestras proteícas (20 µgr en cada calle) fueron
hervidas durante 3 minutos en buffer de muestra con 2-mercaptoetanol y separadas en SDS-
PAGE, transferidas a una membrana de nitrocelulosa e inmuno-detectadas con el anticuerpo
específico de IPG.
Resultados Capítulo II
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espectrometría de masas, MALDI-TOF, a la banda inmunodetectada y determinar si el
pico m/z de 2201 kDa, característico de IPG (ver resultados Capítulo I), se encuentra en
dichos espectros. Otro experimento que podría realizarse sería un Northern-blot con la
sonda de ADNc obtenida y se esa manera determinar certeramente si IPG se expresa en
embriones maduros de semilla de trigo.
De todas formas en la banda inmunodetectada, así se trate de IPG o de alguna
proteína de la familia, no se observaron modificaciones significativas entre los
tratamientos control y 200 mM NaCl, en los distintos tiempos de imbibición ensayados.
Sin embargo, sí se pudo determinar que a medida que aumenta el tiempo de imbibición
de la semilla, aumenta la cantidad de la proteína identificada por el anticuerpo con
respecto a las proteínas totales, tal como lo muestra el gráfico de barras de la
densitometría (Figura 39B).
Resultados Capítulo II
85
1.2. Estrés por altas temperaturas
El estrés por altas temperaturas es otro de los estreses abióticos con mayor
impacto sobre el rendimiento y la calidad de los cultivos en muchas partes del mundo
(Neilson et al., 2009). La temperatura media mundial está aumentando con el tiempo y
por lo tanto el estudio de cómo las plantas responden al estrés por alta temperatura a
nivel de genes y proteínas es importante para desarrollar cultivares tolerantes al calor. A
nivel génico, por ejemplo, muchos estudios han demostrado la regulación positiva de las
transcripciones de las proteínas de choque térmico (HSP, Heat Shock Proteins)
(Larkindale and Vierling, 2008; Rizhsky et al., 2002; Simoes-Araujo et al., 2002).
También se han descripto aumentos en las transcripciones de miembros de la familia de
factores de transcripción DREB2, el gen AsEXP1 que codifica para una expansina,
genes que codifican para la sintasa galactinol y enzimas antioxidantes (Busch et al.,
2005; Lim et al., 2006; Rizhsky et al., 2002; Rizhsky et al., 2004; Xu et al., 2007).
Larkindale y Vierling (2008) también encontraron que la disminución en las
transcripciones de los genes relacionados con la muerte celular programada,
metabolismo básico, y los de respuestas a estrés bióticos son igualmente importantes
para la aclimatación al calor. Sin embargo, debido a que los niveles de abundancia de
ARNm y de las proteínas no siempre se correlacionan, los enfoques genómicos deben
complementarse con análisis cualitativos y cuantitativos del proteoma de la planta. Con
respecto al análisis proteómico de las plantas bajo estrés térmico, se ha demostrado que
la expresión diferencial de las proteínas HSPs es una importante estrategia de
adaptación de las plantas al estrés (Feder and Hofmann, 1999; Howarth, 1991; Vierling,
1991). Las HSPs, con masas moleculares que van desde 10 hasta 200 kDa, están
involucradas en la transducción de señales durante el estrés por calor y tienen la función
de chaperonas, ayudando al correcto pliegue de las proteínas celulares, y a la protección
de los efectos adversos de alta temperatura a sitios funcionales (Vierling, 1991). Las
chaperonas moleculares son proteínas que se unen y estabilizan la conformación de otra
proteína. Además, son responsables del transporte y degradación en los procesos
celulares normales, y también en la estabilización de las proteínas y membranas, y
ayudan al replegado de las mismas en condiciones de estrés.
Las HSPs no son las únicas proteínas importantes en la defensa al estrés por
altas temperaturas. Por ejemplo, se ha encontrado que la expresión de ubiquitina,
proteínas tipo LEA (Late Embryogenesis Abundant) o dehidrinas juegan un papel
importante en la tolerancia al estrés. La principal función de la ubiquitina y la síntesis de
Resultados Capítulo II
86
conjugados de ubiquitina, parece ser la protección de las estructuras celulares y
subcelulares contra el daño oxidativo y la deshidratación (Ortiz and Cardemil, 2001).
Las proteínas LEA pueden prevenir la agregación y se ha demostrado que, por ejemplo,
protegen a la citrato sintasa de la desecación en condiciones de estrés por calor y sequía
(Goyal et al., 2005). En el caso de las dehidrinas, su función está relacionada con las
vías de degradación de las proteínas, reduciendo al mínimo los efectos adversos de la
deshidratación y el estrés oxidativo durante el estrés por calor (Schöffl et al., 1999).
Otras proteínas encargadas de la protección oxidativa inducida por el calor son la
tiorredoxina h, glutatión S-transferasa y dehidroascorbato reductasa (Lee et al., 2007),
Cu / Zn SOD citosólica (Herouart et al., 1994) y Mn-peroxidasa (POD) (Brown et al.,
1993) (Brown et al. 1993), cuyas expresiones son estimuladas por el estrés. En el caso
particular de la actividad SOD, en un estudio sobre Chenopodium murale, se informó
que la proteína de la fracción del estroma era más tolerante al calor que la Cu / Zn-SOD
de los tilacoides, y se determinó que dicha proteína era la responsable de la estabilidad
de los cloroplastos bajo estrés por calor (Khanna-Chopra and Sabarinath, 2004). Sin
embargo, se ha descripto un descenso en la expresión de una Cu / Zn-SOD a causa del
calor en hojas de arroz (Lee et al., 2007). También Sato et al. (2001) reportaron que la
actividad SOD no fue afectada en las plántulas de arroz expuestos al calor (42 ° C).
Estos resultados sugieren que las proteínas SOD podrían responder al estrés térmico en
forma compleja o que, isoformas diferentes podrían ser reguladas diferencialmente.
Por lo tanto, la respuesta al estrés térmico es muy compleja y son muchos los
factores que intervienen para brindar tolerancia a las plantas. Debido a que IPG es un
inhibidor de proteasas que también presenta actividad SOD, se evaluó el
comportamiento de dicha proteína en el estrés por altas temperaturas.
Entonces, para evaluar el efecto de altas temperaturas sobre la actividad
inhibitoria de la proteólisis de IPG, plántulas de trigo de 11d fueron sometidas a
tratamientos de 40º C durante 3 y 4 horas, y luego mantenidas durante 24 horas en las
mismas condiciones de luz y temperatura que las descriptas previamente como normales
(ver materiales y métodos). Debido a que la actividad de IPG regula la actividad
proteolítica presente en el apoplasto FI (Segarra et al., 2002), también se cuantificó esta
actividad enzimática en el FI.
Resultados Capítulo II
87
Luego de las tres horas de tratamiento, la actividad inhibitoria de IPG aumenta
~30 %. Dicho aumento se correlaciona con una disminución de la actividad proteolítica
total del FI (~60%). La actividad de IPG se modifica frente al estrés por altas
temperaturas del mismo modo que el reportado previamente frente a estrés biótico
durante la infección por Septoria tritici de un cultivar susceptible (Segarra et al., 2002).
La inducción de las proteínas de shock térmico es parte de la respuesta del trigo
al estrés por altas temperaturas (McElwain and Spiker, 1992). Debido a que IPG
aumenta su actividad en estas condiciones, podría existir una relación entre ambos
eventos, tendientes a promover la termotolerancia en las plantas de trigo.
Para avanzar en este estudio y determinar si existe una correlación entre dicho
aumento de actividad y el contenido de IPG en el FI, se realizaron ensayos de western
blot. El western blot mostró que los niveles de IPG en el FI no se modificaban con el
tratamiento de 3 horas a 40 °C (Figura 41B). Sin embargo, se determino un leve
aumento en la fracción de proteínas unidas a la pared celular luego del tratamiento a 40
°C (Figura 41A), tal como lo descripto para el estrés salino.
Figura 40. Efecto del estrés por altas temperaturas sobre la actividad proteolítica del FI e
inhibitoria de IPG FI70. 0, 3 y 4 indican las horas de tratamiento a 40 °C a las que fueron
sometidas las plántulas de trigo. La actividad proteolítica e inhibitoria se expresaron como
porcentaje con respecto a las plantas control (100%). Los datos de actividad proteolítica
representan resultados de al menos 3 experimentos independientes. En cada medición se utilizó
el volumen de muestra correspondiente a 100 mg de peso fresco de hoja.
Resultados Capítulo II
88
Figura 41. Efecto del estrés por altas temperaturas sobre la abundancia y localización de IPG.
Proteínas unidas a la pared celular (A) o del FI (B) fueron separadas en SDS-PAGE, transferidas a una
membrana de nitrocelulosa e inmuno-detectadas con el anticuerpo específico de IPG. Calle 1: Control,
Calle 2: tratadas por 3 hr a 40 °C. En cada calle se sembró el volumen de extracto que corresponde a
50 mg de peso fresco de primera hoja.
Resultados Capítulo II
89
2. Estrés biótico: inoculación con el hongo fitopatógeno Septoria tritici y el
hongo biocontrolador Trichoderma spp.
Como se mencionó anteriormente, en nuestro laboratorio se determinó que dos
actividades proteolíticas extracelulares de la hoja de trigo se modifican frente al ataque
del hongo patógeno Septoria tritici, aumentando hasta 400% en el cultivar resistente o
disminuyendo en el cultivar susceptible a dicha enfermedad. Además, dichas
actividades proteolíticas del FI inhiben la germinación de las conidiosporas del hongo y
su actividad esta regulada por IPG. Posteriormente se comprobó que IPG participa en el
control biológico de la septoriosis a través de la previa inoculación de plántulas de trigo
con el hongo biocontrolador Trichoderma spp. Se constató que en las plántulas de trigo
inoculadas con cepas de Trichoderma que lograron disminuir los síntomas de la
enfermedad provocados por el hongo S. tritici, hubo un aumento de la actividad
proteolítica y una disminución de la actividad inhibitoria de IPG respecto de las plantas
control (Cordo et al., 2007). Dichos experimentos fueron realizados en `plántulas de
trigo de un cultivar susceptible, en condiciones controladas de invernadero. Sin
embargo, para que Trichoderma spp. pueda ser utilizado por los productores rurales
como hongo biocontrolador de la septoriosis, hay que demostrar su efectividad en
estadios avanzados del desarrollo de la planta de trigo mediante ensayos a campo.
En la Figura 42 se esquematiza el proceso de crecimiento y desarrollo de la planta
de trigo, en donde se pueden diferenciar 4 etapas principales: (1) macollaje, (2)
encañado, (3) espigazón y floración, y finalmente (4) llenado de granos.
Figura 42. Esquematización del proceso de crecimiento y desarrollo de las plantas de trigo.
Resultados Capítulo II
90
La etapa de macollaje se inicia cuando aparecen brotes secundarios desde el eje
principal, llamados macollos. Dependiendo de las condiciones de cultivo, pueden
originarse varios macollos; éstos, luego de desplegar las primeras hojas, generan su
propio sistema de raíces adventicias. Los macollos, por lo tanto, aunque formando
siempre parte de la planta que los originó, comienzan a independizarse progresivamente
de ésta, hasta llegar a comportarse como una planta individual. El desarrollo de la caña
o etapa de encañado comienza cuando aparece una pequeña protuberancia que
circunda al eje principal en la parte subterránea. Dicha protuberancia corresponde a lo
que en definitiva será el primer nudo aéreo que dará lugar a la formación de la espiga en
su parte apical. La etapa de encañado finaliza cuando el último nudo en la parte alta de
la planta da paso a la espiga a través de la vaina de la hoja bandera, y ahí comienza la
etapa de espigazón. Una vez que la espiga está completamente expresada en el extremo
del tallo, se considera finalizada la etapa de espigazón. Sólo a partir de ese momento y
en forma relativamente rápida, comienza la floración, fase que dura entre 1 y 2 semanas
como promedio. La etapa de floración se considera terminada cuando todos los
estambres de una espiga se hacen visibles asomándose a través de las espiguillas. La
etapa de llenado de granos, se extiende desde que ocurre la fecundación hasta el
momento en que se alcanza la madurez fisiológica, con aproximadamente 35% de
humedad en los granos. Los granos inicialmente presentan un contenido acuoso;
posteriormente, al ir madurando, pasan sucesivamente por los siguientes estados:
lechoso, masa blanda, masa dura (madurez fisiológica), grano duro y madurez de
cosecha. La duración de la etapa de llenado de granos presenta, en general, una
correlación positiva con el rendimiento. Durante toda la etapa de llenado de granos, es
fundamental, que tanto la espiga como las dos hojas superiores, permanezcan
completamente sanas debido a su importancia decisiva en el tamaño de los granos y por
lo tanto en el rendimiento final de las plantas.
Por lo tanto, con el objetivo de analizar el efecto biocontrolador de Trichoderma
spp. a campo, se realizaron experimentos en plantas de trigo provenientes de estadios
más desarrollados, evaluándose la severidad de la enfermedad (porcentaje de necrosis y
cobertura picnidial de la hoja analizado en el trabajo final de grado de Gustavo S.
Walker Esponda de la Facultad de Agronomía de la UNLP) y correlacionándolos con
las actividades proteolíticas del FI y la actividad inhibitoria de IPG. El estudio de dichas
actividades se realizó en el FI de hojas provenientes de plantas en la etapa final de
Resultados Capítulo II
91
macollaje y en la hoja bandera del estadio espigazón. Debido a que hasta el momento
sólo se conoce que IPG está presente en hojas de plántulas de trigo, estos experimentos
permitirán conocer si IPG también se expresa en hojas de macollos y hoja bandera.
2.1. Estudios realizados en la etapa final del macollaje.
Plantas de trigo de un cultivar susceptible a la septoriosis que habían sido pre-
tratadas con dos cepas del hongo biocontrolador Trichordema spp. (Th.cc5 y Th.118),
fueron inoculadas con el hongo fitopatógeno Septoria tritici. Posteriormente, se extrajo
el FI de la primera hoja de cada macollo y se analizó si las actividades proteolíticas
descriptas anteriormente en plántulas están presentes en dicha fracción, al igual que IPG
y su actividad inhibitoria. Además, para relacionar el comportamiento de dichas
actividades enzimáticas con la resistencia a la septoriosis mediada por T. harzianum, se
determinó el porcentaje de necrosis de la hoja provocado por S. tritici y la cobertura
picnidial.
La actividad proteolítica del FI fue analizada por SDS-PAGE copolimerizado
con gelatina (Figura 43). No se observaron modificaciones significativas en ninguno de
los tratamientos, salvo para las plantas pre-tratadas con Th.cc5 en las que la actividad
proteolítica disminuyó levemente con respecto al control (Figura 43, calle 3).
Figura 43. Efecto de S. tritici y Trichoderma spp. sobre la actividad proteolítica del FI examinado mediante SDS-PAGE copolimerizado con gelatina. En cada calle se sembró el FI
correspondiente a 150 mg de peso fresco de primera hoja del macollo. 1, trigo; 2, trigo
inoculado con S. tritici; 3, trigo proveniente de semillas recubiertas con Th.cc5; 4, trigo
proveniente de semillas recubiertas con Th.118; 5, trigo proveniente de semillas recubiertas
con Th.cc5 e inoculado con S. tritici; 6, trigo proveniente de semillas recubiertas con Th.118 e
inoculado con S. tritici.
Resultados Capítulo II
92
Aunque no se obtuvieron diferencias significativas en la actividad proteolítica de
los tratamientos, se realizó un western-blot con el anticuerpo específico de IPG para
determinar si IPG se expresa en la primera hoja de macollos de trigo (Figura 44).
Tal como se observa en el western-blot, IPG se expresa en la primera hoja de
macollos de trigo. Las modificaciones observadas en el contenido de IPG no se
corresponden con los cambios en las actividades proteolíticas analizadas (Figura 43), a
excepción de calle 3, en la cual se observa un aumento en la cantidad de IPG que
correlaciona con la leve disminución en la actividad proteolítica evidenciada en ese
mismo tratamiento en la Figura 43.
Con respecto a la severidad de la septoriosis, no se observaron diferencias
significativas en el porcentaje de necrosis con los tratamientos (Tabla 6). Sin embargo,
el porcentaje de cobertura picnidial en la hoja disminuyó significativamente en las
plántulas cuyas semillas habían sido recubiertas con la cepa de Trichoderma Th.118, lo
que podría ser adjudicado a un efecto de biocontrol de dicha cepa sobre la septoriosis.
Figura 44. Efecto de S. tritici y Trichoderma spp. sobre la abundancia del monómero de
IPG en el FI de primera hoja de macollos. En cada calle se sembró el FI correspondiente a
500 mg de peso fresco, el gel se transfirió a membrana de nitrocelulosa y se incubó con
anticuerpo específico anti-IPG. 1, trigo; 2, trigo inoculado con S. tritici; 3, trigo proveniente de
semillas recubiertas con Th.cc5; 4, trigo proveniente de semillas recubiertas con Th.118; 5,
trigo proveniente de semillas recubiertascon Th.cc5 e inoculado con S. tritici; 6, trigo
proveniente de semillas recubiertas con Th.118 e inoculado con S. tritici.
Tabla 6. Medida de la cobertura necrótica y picnidial causada por S. tritici en plantas de
trigo pretratadas con Trichoderma spp. Los valores fueron expresados en porcentaje y
representan el promedio de tres réplicas independientes. Las promedios seguidos por igual letra
no son diferentes significativamente (P<0.05) según el test de diferencias mínimas
significativas (LSD).
Resultados Capítulo II
93
A diferencia de los resultados obtenidos para plántulas por Segarra et al. (2002)
y Cordo et al. (2007), en las plantas de trigo inoculadas con S. tritici que presentan
síntomas de la enfermedad (Tabla 6), la actividad proteolítica no disminuyo en el FI con
respecto a las plantas control (Figura 43). Además, debido a que en ningún tratamiento
hubo una modificación de dicha actividad enzimática, no se puede correlacionar la
disminución en la severidad de la enfermedad producida por Th.118 con una respuesta
bioquímica de defensa asociada a la proteólisis.
El experimento descripto anteriormente, fue repetido al año siguiente (2010) con
algunas modificaciones. Una de ellas fue que se asperjaron las cepas de Trichoderma
harzianum en macollaje (que hasta el presente se aplicaba solamente por recubrimiento
en semillas). La otra modificación que se introdujo fue agregar tratamientos a los que se
les aplicó fungicida. El objetivo de dicha modificación fue tratar de evitar infecciones
de las plantas de trigo con otros patógenos, que de otra manera no se pueden evitar en
los ensayos a campo. Previamente se verificó que el fungicida utilizado no modificase
ninguna de las actividades enzimáticas evaluadas (dato no mostrado).
El resultado de estos nuevos tratamientos se muestra en la Figura 45.
Como se puede observar en la Figura 45A, la actividad proteolítica presente en
el FI disminuye cuando la planta es inoculada con Septoria tritici (calle 2) con respecto
al control (calle 1). Sin embargo, cuando las plantas son pretratadas con ambas cepas de
Trichoderma y luego inoculadas con S. tritici (calles 4 y 4´), la actividad proteolítica es
semejante a la de las plantas control.
Figura 45. Efecto de S. tritici y Trichoderma spp. sobre la actividad proteolítica del FI (A)
o inhibitoria de IPG (B). Ambas fueron examinadas mediante SDS-PAGE copolimerizado
con gelatina. En cada calle se sembró el FI correspondiente a 150 mg de peso fresco de
primera hoja de macollaje. 1, trigo; 2, trigo inoculado con S. tritici; 3 y 3´, trigo proveniente de
semillas recubiertas y asperjado en macollaje con Th.cc5 y Th.118 respectivamente; 4 y 4´,
trigo proveniente de semillas recubiertas y asperjado en macollaje con Th.cc5 y Th.118 e
inoculado con S. tritici; 5 y 5´, idem 3 y 3´ con fungicida; 6 y 6´, idem 4 y 4´ con fungicida; 7,
trigo con fungicida e inoculado con S. tritici.
Resultados Capítulo II
94
Por otra parte, la disminución de la actividad proteolítica de la calle 2 se
correlacionó con el aumento en la actividad inhibitoria de IPG para ese mismo
tratamiento (Figura 45 B).
En el caso de las plantas a las que se les había aplicado fungicida en plántula y
macollaje (calles 5, 6 y 7 del gel de la Figura 45) los resultados son confusos y las
modificaciones observadas son opuestas a las obtenidas para los tratamientos sin
fungicida.
Con respecto a la severidad de la septoriosis en estos experimentos, en general
se obtuvieron valores muy bajos de necrosis y cobertura picnidial respecto de los
valores habituales para esta enfermedad. A pesar de ello, se observó una disminución
del 50% en la necrosis provocada por S. tritici cuando las plantas provenían de semillas
recubiertas con la cepa Th.cc5 y asperjadas con la misma cepa de Trichoderma (Tabla
7) y una leve disminución (25%) cuando la cepa utilizada fue la Th.118.
Tabla 7. Medida de la cobertura necrótica y picnidial causada por S. tritici en plantas
pretratadas con Trichoderma spp. Los valores fueron expresados en porcentaje y representan
el promedio de tres réplicas independientes.
Resultados Capítulo II
95
Debido a que los tratamientos con ambas cepas de T. harzianum redujeron la necrosis
de las hojas provocada por S. tritici y que, las actividades proteolíticas del FI
aumentaron a valores semejantes al control en dichos tratamientos, se podría decir que
ambas cepas de Trichoderma provocaron una respuesta bioquímica de defensa o de
biocontrol sobre S. tritici. Estos resultados concuerdan con los obtenidos previamente
en plántulas de trigo (Cordo et al., 2007). Por otra parte, en los tratamientos en los
cuales además se aplicó fungicida, es casi imposible establecer una correlación del
efecto biocontrolador de Trichoderma sobre S. tritici con la actividad proteolítica del FI
e inhibitoria de IPG. Es por esto, que si bien la aplicación de fungicida resulta útil a los
efectos de prevenir a campo otras enfermedades distintas a la septoriosis, su uso
representa una variable adicional que, sin dudas, complejiza aún más el análisis de las
respuestas de defensa.
2.2. Estudios realizados en espigazón
La actividad proteolítica del FI fue analizada en la hoja bandera de plantas de
trigo en estadio espigazón. Las semillas habían sido recubiertas y las plantas luego
asperjadas con dos cepas distintas de Trichoderma (Th.cc5 y Th.118) tanto en macollaje
como en espigazón, e inoculadas con Septoria tritici según se indica en la Tabla 8. Estos
ensayos fueron llevados a cabo durante el año 2009.
Tabla 8. Tratamientos realizados a las plantas de trigo analizadas en estadio espigazón.
Resultados Capítulo II
96
Como se observa en la Figura 46, la actividad proteolítica disminuye en casi
todos los tratamientos con respecto a las plantas control (T1), salvo para los
tratamientos T6, T9 y T13 en los que se observó un ligero aumento. Es decir, el
recubrimiento de las semillas con la cepa Th.118 (T6), recubrimiento de las semillas y
posterior asperjado en macollaje con Th.cc5 (T9) y nuevo asperjado con esta misma
cepa en espigazón (T13) hace que los niveles de actividad proteolítica vuelvan a ser
semejantes a los de las plantas control aunque hayan sido infectadas con S. tritici.
De la misma manera que en macollaje, se analizó si IPG se expresa en hoja
bandera de espigazón mediante ensayos de western-blot y de esa manera se analizaron
también las modificaciones en su contenido (Figura 47).
Se pudo determinar que IPG está presente en el FI proveniente de la hoja
bandera y que su contenido varía en los distintos tratamientos. Si bien las muestras que
presentan mayor actividad proteolítica (T6, T9 y T13) son las que poseen menor
cantidad de IPG, para el resto de los tratamientos no se pueden establecer correlaciones
claras entre las variaciones que se observan en el western blot con las actividades
proteolíticas. Por ello, se realizó un gel copolimerizado con gelatina y luego incubado
Figura 47 Efecto de S. tritici y Trichoderma spp. sobre la abundancia del monómero de
IPG en el FI examinado mediante Western blot. En cada calle se sembró el FI
correspondiente a 500 mg de peso fresco de hoja bandera, el gel se transfirió a membrana de
nitrocelulosa y se incubó con anticuerpo específico anti-IPG. T1 a T14 los distintos
tratamientos (ver Tabla 6).
Figura 46: Efecto de S.tritici y Trichoderma spp. sobre la actividad proteolítica del FI
examinado mediante SDS-PAGE copolimerizado con gelatina. En cada calle se sembró el
FI correspondiente a 150 mg de peso fresco de hoja bandera. T1 a T14 los distintos
tratamientos (ver tabla 8).
Resultados Capítulo II
97
con tripsina para detectar directamente la actividad inhibitoria de IPG en los distintos
tratamientos (Figura 48).
La actividad inhibitoria de la proteólisis de IPG fue muy baja en todos los
tratamientos, y en algunos casos no llega a visualizarse. Sin embargo, se pudo
determinar que en el tratamiento T2 hay un aumento de la actividad de IPG con respecto
a T1, que se correlaciona con la disminución de actividad proteolítica observada
anteriormente (Figura 46).
Dados los bajos valores de actividad inhibitoria de IPG obtenidos, se decidió
comparar la abundancia de IPG entre la primera hoja de plántulas y la hoja bandera de
espigazón. Para ello se realizó un SDS-PAGE sembrando el FI correspondiente a igual
cantidad de peso fresco de hoja de ambos estadios y se inmunodetectó la banda
correspondiente a IPG (Figura 49).
Figura 48. Efecto de S.tritici y Trichoderma spp. sobre la actividad inhibitoria de IPG
examinado mediante SDS-PAGE copolimerizado con gelatina e incubado con tripsina. En
cada calle se sembró el FI correspondiente a 2 gr de peso fresco de hoja bandera. T1 a T13 los
distintos tratamientos (ver Tabla 8).
Figura 49. Comparación de la
abundancia de IPG entre primer
hoja de plántula de 12d y hoja
bandera de espigazón de trigo. El FI
de 100 mg de hojas de ambos estadios
fue separado en SDS-PAGE y (A)
teñido con coomassie blue o (B)
transferido a una membrana de
nitrocelulosa e inmuno-detectadas con
el anticuerpo específico de IPG. Calle
1, FI de primera hoja de trigo de 12
días; Calle 2, FI de hoja bandera de
trigo de 130 días.
Resultados Capítulo II
98
IPG es casi indetectable con el anticuerpo específico en el FI de hoja bandera
(Figura 49 2B), mientras que en el FI de plántulas es reconocido fuertemente. Esta
diferencia no se debe a una carga deficiente en proteínas ya que, tal como se observa en
el gel teñido con Coomassie (Figura 49 A), la siembra de proteínas totales es aún mayor
en hoja bandera. Con estos resultados se puede concluir que a pesar de que IPG es una
proteína minoritaria en el FI de hoja bandera de espigazón, su actividad inhibitoria sólo
regula las actividades proteolíticas que se modifican cuando el trigo es infectado con S.
tritici (T2).
Para determinar si las modificaciones en las actividades proteolíticas del FI se
relacionan con los mecanismos de defensa de la planta mediados por T. harzianum,
evidenciados por una disminución de los síntomas de la septoriosis, se evaluó la
cobertura picnidial y necrótica en la hoja bandera (Tabla 9).
Como se observa en la Tabla 9, se registran diferencias en los distintos
tratamientos, aunque en esta oportunidad el trigo inoculado con S. tritici (T2) manifestó
valores muy bajos de severidad (porcentaje de necrosis: 6,67% y de cobertura picnidial:
0,83%). Cabe destacar que en este ensayo hubo una infección adicional observada al
principio del estadio espigazón provocada por el hongo patógeno Blumeria graminis
f.sp. tritici (dato no mostrado). Dicha infección podría haber actuado como una
preinoculación del cultivo, lo que suprimiría los síntomas posteriores de la enfermedad
provocados por S. tritici, tal como se ha reportado para otros sistemas experimentales
Tabla 9. Determinación de la cobertura necrótica y picnidial causada por S. tritici en
plantas pretratadas con Trichoderma spp. Los valores fueron expresados en porcentaje y
representan el promedio de tres réplicas independientes. Las promedios seguidos por igual letra
no son diferentes significativamente (P<0.05) según el test de diferencias mínimas
significativas (LSD).
Resultados Capítulo II
99
(Jorgensen et al., 1996; Loughman et al., 1993). A pesar de ello, se puede comparar la
efectividad en el biocontrol de la septoriosis de las dos cepas de Trichoderma utilizadas.
En los tratamientos en los que además del recubrimiento de la semilla se realizó
aplicación aérea de Th.cc5 (T9 y T13), la necrosis y la cobertura picnidial es mucho
menor que en los casos donde se aplicó la cepa Th.118 (T10 y T14), por lo que se
podría afirmar que la cepa Th.cc5 es más efectiva en el control de la enfermedad.
Además, cabe recordar que para los tratamientos T9 y T13 se había determinado un
aumento en las actividades proteolíticas del FI, por lo que tal como lo reportado para
plántulas (Cordo et al., 2007), se puede afirmar que existe una relación entre el
biocontrol ejercido por la cepa Th.cc5 y el aumento de la proteólisis.
Discusión
Discusión Capítulo II
100
Muchas de las proteínas de la familia de las GLPs han sido vinculadas con la
resistencia de las plantas a situaciones de estrés biótico y abiótico. Debido a ello, en esta
segunda parte de la tesis se analizó el comportamiento de IPG frente a dichas
situaciones de estrés. Uno de los trabajos más relacionado con IPG y el estrés, es el de
Vallelian-Bindschedler et al. (1998) en el que caracterizan a una GLP de hoja de cebada
HvGER2a (que resultó idéntica a IPG) frente a estrés por altas temperaturas,
tratamiento con H2O2 e infección con el hongo patógeno Erysiphe graminis f. sp.
hordei. En las tres situaciones estudiadas, se determinó que HvGER2a desaparece del FI
luego del estrés y se relocaliza en pared celular, pero la abundancia del ARNm difiere
según el tratamiento. En el caso del estrés térmico hay un aumento en la expresión del
ARNm, con el tratamiento con H2O2 no hay modificaciones y con la infección fúngica
se detecta una disminución. Este ejemplo ilustra la complejidad de los mecanismos de
tolerancia a distintos tipos de estrés lo que hace difícil descifrar la participación de esta
proteína a partir del mero análisis de los niveles del mensajero y su correspondiente
producto.
Para IPG, el inhibidor de proteasas tipo germina del FI de hoja de trigo, se ha
demostrado su participación en los mecanismos de defensa frente a septoriosis (Segarra
et al., 2002). Para avanzar en su caracterización y determinar si participa en respuestas a
otros tipos de estrés, se analizó su comportamiento en condiciones de estrés salino en
primera y segunda hoja de plántulas de trigo. En la primera hoja se encontró que IPG
desaparece del FI y aumenta en la fracción de proteínas unida a la pared celular, tal
como en el ejemplo de la GLP de cebada HvGER2a mencionado anteriormente
(Vallelian-Bindschedler et al., 1998). Más allá del rol de IPG en la pared, su
insolubilización, podría ser indicador de estrés en las hojas de trigo. Con respecto a sus
actividades enzimáticas, la actividad inhibitoria de la proteólisis de IPG disminuyó en el
FI de ambas hojas y aumentó en la pared, mientras que la actividad SOD sólo aumentó
en la fracción de proteínas unida a la pared celular de la primera hoja. Ha sido
demostrado que el estrés salino produce un desbalance iónico que provoca toxicidad,
estrés osmótico y oxidativo debido a la generación de especies reactivas de oxígeno
(Alscher et al., 1997; Cheeseman, 1988; Noctor and Foyer, 1998). Estos efectos,
dañinos para las plantas, son contrarrestados por las enzimas antioxidantes: SOD,
peroxidasas, glutatión reductasa y catalasa entre otras. La actividad SOD protege a las
células de los efectos tóxicos del anión superóxido producido en el estrés oxidativo, ya
Discusión Capítulo II
101
que cataliza la reacción de dismutación en peróxido de hidrógeno y oxígeno. En
plántulas de trigo de cultivares sensibles o tolerantes al estrés salino, se ha demostrado
que la actividad SOD disminuye o aumenta respectivamente en cada caso (Mandhania
et al., 2006), por lo que los autores proponen su participación en la tolerancia de las
plántulas al estrés salino. De acuerdo a los resultados obtenidos en la presente tesis, se
podría afirmar que en las condiciones de estrés salino estudiadas, el aumento en la
actividad SOD observado también estaría involucrado en la tolerancia a dicho estrés.
Por otra parte, el peróxido de hidrogeno generado podría estar catalizando reacciones de
cross-linking involucradas en la síntesis de lignina y por ende en el fortalecimiento de
la pared celular (Lane et al., 1993).
Previamente en nuestro laboratorio, se analizó la naturaleza de las señales
involucradas en la regulación de las actividades proteolíticas e inhibitorias de la
proteólisis de IPG. Se observó que el ácido jasmónico (JA) provoca el mismo tipo de
respuesta que la generada por S. tritici sobre cultivares resistentes o susceptibles en
relación a la actividad de IPG (Segarra et al., 2003), por lo que se podría afirmar que
dicha hormona mimetiza el efecto del patógeno (Casalongué et al., 2003). Por otra
parte, se ha descripto que cuando las plantas son sometidas a estrés salino se acumulan
proteínas de respuesta a JA (Moons et al., 1997). Entonces, la acumulación de IPG en la
pared durante la respuesta al estrés salino podría ser un proceso dependiente de JA. De
esa manera esta hormona podría ser el punto de conexión entre el estrés abiótico y
biótico en la regulación de IPG.
Además, en el cultivar de trigo estudiado se evaluaron cambios bioquímicos y
morfológicos que evidencien tolerancia al estrés salino. Se encontró que la longitud de
la primera hoja no se modifica con este estrés pero que aumenta el contenido de
clorofila y prolina. En cambio, en la segunda hoja de trigo se determinó que tanto la
longitud como contenido de prolina y clorofila disminuyen. Se ha descripto que bajo
condiciones de estrés salino el contenido de clorofila de las hojas generalmente
disminuye (Parida and Das, 2005). Sin embargo para el mismo tipo de estrés, Wang y
Nil (2000) han reportado un aumento de la clorofila en las hojas de Amaranthus, que en
este caso interpretan como signo de tolerancia. También se ha señalado la importancia
de la prolina en la respuesta de las plantas al estrés salino (Khedr et al., 2003). Werner y
Finkelstein (1995) han descripto que mutantes de Arabidopsis deficientes en la síntesis
de prolina, si bien son capaces de germinar en medio salino no pueden continuar con su
desarrollo normal. Okuma et al. (2000) encontraron que la aplicación exógena de
Discusión Capítulo II
102
prolina mejora el crecimiento de cultivos de células de tabaco estresadas y adjudicaron
dicho efecto al rol de la prolina como osmo-protector de enzimas y membranas. Estos
resultados junto con la observación de la relocalización de IPG en pared celular y el
aumento de sus actividades enzimáticas en este compartimento, ponen de manifiesto la
participación de esta proteína multifuncional en la respuesta de tolerancia observada
frente al estrés salino.
En el caso del estrés por altas temperaturas, también se observó la relocalización
de IPG en pared celular. A diferencia del estrés salino, en el estrés térmico se determinó
un aumento en la actividad inhibitoria de IPG en el FI. No son muchos los trabajos que
vinculan a los inhibidores de proteasas con al tolerancia al estrés abiótico. Sin embargo
se ha descripto que el gen del inhibidor de cisteína proteasas de castaño, denominado
CsC, es inducido fuertemente en las raíces y hojas de plántulas sometidas a estrés salino
y bajas temperaturas, así como también en las raíces luego del estrés por calor (Pernas et
al., 2000). Dichos autores sugieren que CsC probablemente estaría involucrado en el
mecanismo de respuesta a dichos estreses y su regulación mediada por ácido abscísico o
jasmónico dependiendo del tipo de estrés. Por otra parte, se ha descripto la inducción
de un inhibidor de proteasas de Brassica napus, bajo condiciones de estrés por sequía y
calor. Dicho inhibidor contiene en su secuencia aminoacídica un motivo característico
de los inhibidores tipo Kunitz (Satoh et al., 2001). Dado que sólo se cuantificó la
actividad inhibitoria en el FI, la misma se debería medir también en pared celular ya que
se observó la relocalización de IPG en este compartimento. También se debería analizar
si sus otras actividades enzimáticas se modifican en estrés por calor. Hasta el momento
los resultados obtenidos sólo indicarían una concordancia con aquellos reportados por
Vallelian-Bindschedler et al. (1998) para la GLP HvGER2a de cebada, la cual bajo el
mismo estrés se relocaliza en la pared celular. En ese caso, se proponía dicho evento
como un marcador de estrés térmico.
Con respecto a la caracterización de IPG en estrés biótico, previamente en
nuestro laboratorio se había determinado que actividades proteolíticas extracelulares de
la hoja de trigo se modificaban frente al ataque del hongo patógeno Septoria tritici,
inhibían la germinación de las conidiosporas del hongo y eran reguladas por el inhibidor
IPG (Segarra et al., 2002; Segarra et al., 2003). Por ello se postuló su participación en
los mecanismos de defensa frente a este hongo patógeno. La “mancha de la hoja” o
septoriosis del trigo, provocada por S. tritici, es una de las enfermedades de mayor
distribución en la región triguera de América del Sur. Esta enfermedad es por
Discusión Capítulo II
103
naturaleza endémica y, según las condiciones climáticas, su aparición es cíclica (Cunfer,
1999). Cuando el ataque foliar es intenso se reduce la superficie fotosintética, se
producen granos de tamaño reducido y por lo tanto se afecta la calidad del cultivo de
trigo (Cordo and Marechal, 1990). Para controlar la enfermedad se ha recurrido
habitualmente al uso de fungicidas (Cook et al., 1999). Sin embargo debido a la alta
contaminación que producen los agroquímicos, se están buscando alternativas
ecológicas para el control de las enfermedades, como por ejemplo el control biológico.
En relación a estas estrategias alternativas de manejo de la septoriosis, Cordo et al.
(2007) demostraron que las plántulas de trigo pretratadas con Trichoderma harzianum
mostraban menos síntomas luego de la infección con S. tritici, y esto se correlacionaba
con una disminución en la actividad inhibitoria de IPG y un aumento de la actividad
proteolítica del FI, cuya actividad antifúngica ya había sido demostrada (Segarra et al.,
2002). En el presente trabajo de tesis se evaluó en ensayos a campo la eficiencia y
mecanismo de acción de Trichoderma spp para controlar la mancha de la hoja de trigo.
Desde el punto de vista experimental, este tipo de ensayos presentan el inconveniente de
la aparición de variables difíciles de controlar (temperatura, humedad ambiente,
disponibilidad de agua) y presencia de patógenos naturales diferentes al estudiado.
Además, para tener las replicas necesarias de los experimentos, se necesita
mínimamente de tres años. A pesar de estos inconvenientes, se pudo determinar tanto en
macollaje como en espigazón que la actividad proteolítica del FI disminuye respecto del
control en el cultivar de trigo susceptible cuando las plantas son infectadas con S. tritici,
resultados semejantes a los obtenidos previamente (Segarra et al., 2002). Dichos valores
de actividad proteolítica vuelven a ser semejantes al control cuando las semillas fueron
recubiertas, y las plantas asperjadas en macollaje y luego en espigazón con Trichoderma
spp. Además, en algunos tratamientos, se demostró que las modificaciones de la
actividad proteolítica se debían a su regulación por la actividad inhibitoria de IPG, tal
como se había observado previamente en plántulas (Cordo et al., 2007). A diferencia de
los ensayos en plántulas, en los cuales IPG es la proteína mayoritaria de la primera hoja
de trigo, en espigazón esta proteína es casi indetectable en el FI de la hoja bandera. A
pesar de ello, su actividad inhibitoria sigue siendo fundamental en la regulación de las
proteasas. Estos resultados sugieren que, tal como se ha descripto en otros sistemas
experimentales (Hanson and Howell, 2004; Koike et al., 2001), T. harzianum determina
en plantas de trigo inoculadas con S. tritici una respuesta bioquímica de defensa. Estos
resultados permiten afirmar que el control biológico mediado por T. harzianum a través
Discusión Capítulo II
104
de la regulación de las actividades proteolíticas del FI constituye una herramienta
potencial de gran importancia en relación al manejo de la septoriosis.
Con respecto a la localización de IPG en distintos órganos y estadios de
desarrollo del cultivo de trigo, se confirmó su presencia en hojas de plántulas, de
macollos y en la hoja bandera del estadio espigazón. Además, se comprobó que en este
último estadio, la abundancia de IPG es mucho menor que en los anteriores. También se
trató de determinar, a través de ensayos de western-blot, si IPG estaba presente en
embriones maduros de semilla de trigo, tal como se describió para las primeras
germinas halladas (Thompson and Lane, 1980). En este caso, el resultado no fue
concluyente, dado que el anticuerpo reconoció específicamente una proteína de masa
molecular diferente a la del monómero de IPG. Para confirmar si se trata de una
isoforma de IPG debería realizarse un Northern-blot con la sonda de ADNc de IPG, y
así determinar fehacientemente si el mensajero se expresa en dicho órgano.
En conclusión, los resultados presentados sugieren la participación de IPG tanto
en los mecanismos de defensa de las plantas de trigo frente a la septoriosis como
también en la tolerancia a distintos tipos de estrés abiótico. Sin embargo para confirmar
este rol, se deberían analizar plantas transformadas genéticamente en las cuales el gen
de IPG se encuentre silenciado o sobreexpresado, y así evaluar su aporte e importancia
en las respuestas a distintas condiciones de estrés. Los resultados que se obtuviesen de
estos experimentos, no sólo determinarían un notable avance en el conocimiento de las
proteínas tipo germinas, sino que también constituirían un aporte fundamental para el
mejoramiento del cultivo de trigo en relación a las demandas agronómicas.
Conclusiones
Conclusiones
105
Se obtuvo la secuencia aminoacídica de IPG, lo que permitió identificarla como
una GLP con actividad pirofosfatasa/fosfodiesterasa. Pese a que su actividad
como inhibidor de proteasas resultó novel en las GLPs, no se trata de una nueva
proteína dentro de esta familia.
IPG es una proteína multifuncional con al menos tres actividades enzimáticas:
inhibidor de proteasas, superóxido dismutasa y pirofosfatasa/fosfodiesterasa.
La Arg69 de IPG es necesaria para conservar la actividad de inhibidor de serina
proteasas, y dicho aminoácido es periférico en la estructura tridimensional
predicha mediante herramientas bioinformáticas. Este hallazgo permitiría
relacionar a IPG con los inhibidores de proteasas del tipo Kunitz ya que
presentan el mismo aminoácido expuesto en la estructura del sitio activo.
Se analizó la presencia de IPG en distintos estadios del desarrollo del trigo y
mediante ensayos de western-blot se comprobó su presencia en primera y
segunda hoja de plántulas y en hojas provenientes de plantas en macollaje y
espigazón.
En los dos estreses abióticos estudiados, salinidad y calor, se observó una
relocalización de IPG en la pared celular de las hojas de trigo y un aumento de
sus actividades enzimáticas en dicho compartimento. Además, en el caso del
estrés salino, se pudo establecer una correlación entre la relocalización de IPG y
la tolerancia de las plántulas de trigo evidenciada por la modificación de los
parámetros fenotípicos y bioquímicos estudiados.
Conclusiones
106
Se constató, mediante ensayos a campo, que en las plantas de trigo susceptibles a
la septoriosis hubo una disminución de la actividad inhibitoria de IPG cuando
las mismas fueron pretratradas con el hongo biocontrolador Trichoderma
harzianum. Se observó asimismo un concomitante aumento de la actividad
proteolítica del FI, cuya capacidad antifúngica fue previamente demostrada.
Estos resultados correlacionaron con la disminución de los síntomas de la
enfermedad, lo que permite asignar a IPG un rol en el control biológico de la
septoriosis mediado por T. harzianum.
Bibliografía
Bibliografía
107
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Photosynthesis and Biochemical Characteristics in Mulberry Genotypes.
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