Procedimiento de Lab GenoVIH Gisely · 2010. 5. 17. · PROCEDIMIENTO DE LABORATORIO PARA LA PRUEBA DE GENOTIPIFICACIÓN DEL VIH Blga. Gisely Hijar Guerra Coordinación del Laboratorio

PROCEDIMIENTO DE LABORATORIO PARA LA PRUEBA DE GENOTIPIFICACIÓN DEL

VIH

Blga. Gisely Hijar GuerraCoordinación del Laboratorio de Biotecnología y Biología

Molecular.Responsable de los Procesos de la Prueba de

Genotipificación de VIH – Centro Nacional de Salud Publca

¿COMO MONITOREAR RESISTENCIA?GENOTIPO FENOTIPO

CODIGO GENETICO ALTERADODE LA PROTEINA BLANCO DE LADROGA

SUSCEPTIBILIDAD ALTERADAA LA DROGA

HIV DNA DEL PACIENTE

PATIENT HIV

DEFINICIONES• Genotipo : Secuencia de nucleótidos del virus de la

cual se deduce la secuencia de aminoácido de una proteína (En el caso del HIV, la RT y PV)

• Mutaciones : cambios en la secuencia de AA deducida de la secuencia de nucleótidos con respecto a la secuencia de una cepa de referencia (sensible o salvaje) Ejemplo: Met184Val . Mutaciones específicas se identifican como causantes de resistencia genotípica

• Fenotipo : Deriva del genotipo. En el ejemplo, el cambio Met184Val se traduce fenotípicamente como resistencia a 3TC, ddC y Abacavir.

Regiones de PR y RT Evaluadas por test de Resistencia

Genotipificación VIH-INS242

360

320

305

483

PR RT INRNaseHp7NC p1 p6

Gag Cleavage Sites

9

DE LA MUESTRA A LOS RESULTADOS

Pre-Analitica Analitica Post-Analitica

Analítica

Extracción de Ac. Nucleico

Amplificación deAc. Nucleico

SecuenciamientoAutomático

Post-AnalíticaAlineamiento de

Secuencia

Ensamblaje de Secuencia

Edición de Secuencia

Determinación de mutaciones

Reporte de resultados

Pre-AnalíticaColecta de la

muestra Codificación de muestra

Envío y Almacenamiento

MUESTRA : Sangre Total

CONSIDERACIONES DE LA MUESTRA

• PACIENTE : EN AYUNAS

• TIPO DE MUESTRA: SANGRE

• TIPO DE TUBO : TUBO AL VACIO CON EDTA DE 5 – 7 CC.

• TEMP. TRANSPORTE :AMBIENTE

• TIEMPO DESDE QUE SE TOMA LA MUESTRA HASTA QUE SE SEPARA EL PLASMA : 24 HORAS.

SEPARACIÓN DEL PLASMA Y EXTRACCIÓN DEL MATERIAL GENETICO (ARN )

Controles de la PruebaControles Mutantes Controles Silvestres

TRANSCRIPCIÓN REVERSA (RT) YREACCIÓN DE LA CADENA DE LA POLIMERASA

(PCR)

RT-PCR (Reverse Transcription PCR)

RNA Ë c DNA

ELECTROFORESIS

PURIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE PRODUCTOS DE PCR

SEGUNDO PCR

ÁREA SEGUNDA AMPLIFICACIÓN

SECUENCIAMIENTO DE PRODUCTOS DE PCR(Equipo : Analizador Genético)

ANÁLISIS DE SECUENCIAS DE ADN DEL VIH

SOFTWARE Sequencing Analysis

SOFTWARE : SeqScape

La secuencia de ADN del virus obtenido es ingresado en la base de datos de la Universidad de Stanford empleando para ello el Programa HIVdb. Este programa analiza las secuencias y determina si están presentes las mutaciones del virus relacionadas a la resistencia antiretroviral.

INFORMES DE RESISTENCIAS

SEPARACIÓN DEL PLASMA TUBO N° 1

EXTRACCIÓN DE ARN

RT - PCR

ELECTROFORESIS

COLECTA /TOMA DE MUESTRA

FLUJOGRAMA DE LA PRUEBA DE

GENOTIPIFICACIÓN DE VIH

No amplifica

ELECTROFORESIS

PURIFICACION Y CUANTIFICACIÓN DE PRODUCTOS DE PCR

SEGUNDO PCR(Primers alternativos)

No amplifica1a vez

INDETERMINADO

ANÁLISIS DE SECUENCIAS

REPORTE DE RESULTADO

Si amplifica

SECUENCIAMIENTO DE PRODUCTOS DE PCR

Si amplifica

SECUENCIAMIENTO CON PRIMERS ALTERNATIVOS

No amplifica2da vez

No hay secuencia1a vez

Hay secuencia

Hay secuenciaNo hay secuencia2da vez

INFORME DE RESULTADO

RT-PCRMuestra /

Separación de Plasma

Reporte Análisis de Datos

Electroforesis Extracción de ARN

Análisis de Datos

http://hivdb.stanford.edu/pages/algs/HIVdb.html

http://hivdb.stanford.edu/pages/algs/HIVdb.html

Por qué son útiles y necesarios los ensayos de Resistencia

• Asiste al médico en la toma de decisiones terapéuticas en distintos escenarios:– Clarifica los tratamientos disponibles– Selecciona los regímenes mas activos– Mejora el resultado clínico– Clarifica la etiología de los aumentos de carga viral– Reduce el uso de drogas inactivas.

• Provee beneficios a nivel de salud pública– Clarifica la epidemiología de la resistencia al HIV – reduce transmisión de virus resistentes– Permite mejorar las guías de tratamiento

• Asiste en el desarrollo de nuevas drogas terapéuticas

ß Dr Robert Grantß Robert Hanceß Maribel Acuñaß Carlos Yabarß Equipo del laboratorio de VIH y del Laboratorio de Biología

Molecular

AGRADECIMIENTOS