Prima traducere
2 Drojdie Arhitectura Celulara i Funcie2.1 Caracteristici
generale ale celulei de drojdie
Celulele de drojdie prezint o mare diversitate n ceea ce privete
dimensiunea celulei, forma i culoarea. Chiar i celulele individuale
dintr-o anumit tulpin de drojdie a unei singure specii poate afia
heterogenitate morfologic i de culoare. Acest lucru se datoreaz n
principal modificrilor condiiilor fizice i chimice din mediul
nconjurtor. ntre diferite specii de drojdie, dimensiunea celulei
poate varia foarte mult. n cele ce urmeaz ne vom concentra pe S.
cerevisiae. Informaii mai detaliate i trimiteri la citologia
drojdie pot fi gsite n [Walker, 1998]. Celulele S. cerevisiae sunt
n general de form elipsoidal avand ntre 5 pn la 10 m la diametrul
mare i 1 la 7 m la diametrul mic. Adic volumul de celule este 29
sau 55 microni 3 pentru un haploid sau o celul diploid, respectiv,
dimensiunea celulei crete odat cu vrsta. Constituenii
macromoleculari ai drojdiei cuprind: proteine, glicoproteine,
polizaharide, polifosfai, lipide, i acizi nucleici (Tabelul
2-1).
2.2 Metode citologiceCelulele de drojdie necolorate cu greu pot
fi vizualizate prin microscopie optic. La 1000 de ori mrire, poate
fi posibila vaderea vacuolei drojdie i a corpilor de incluziune a
citosolului. Prin microscopie cu contrast de faz, mpreun cu
tehnicile de colorare adecvate, mai multe structuri celulare pot fi
distinse. Coloranii Fluorochromic pot fi utilizati cu o microscopie
fluorescenta pentru a evidenia caracteristicile interiorului
celulelor, precum i suprafaa celulei [Pringle et al., 1991].Un
instrument foarte convenabil pentru a localiza i chiar pentru a
urmri micarea anumitor proteine in interiorul celulelor de drojdie
este utilizarea de "proteina verde fluorescent (GFP) de la meduze
(Aequorea victoria) ca o molecul de raportor, i mai multi derivai
de GFP cu fluorescen spectrala mutata pe alte lungimi de und.
Fuziunile de gene ce prezinta interes cu gena GFP (N-sau
C-terminal), permite de asemenea, urmrirea destinului i a
exprimarii proteinelor de fuziune urmate de microscopia
fluorescenta [Niedenthal et al, 1996;.A se vedea, de asemenea,
capitolul 4].Gama de funcii celulare vizualizate este cu mult
crescut, atunci cnd anticorpii monospecifici produi impotriva
proteinelor structurale sunt cuplai la colorani fluoresceni, cum ar
fi izotiocianatul de fluorescein (FITC) sau Rodamin B.
Fluxul citometriei are mai multe aplicatii in studiile drojdiei.
De exemplu, sortarea celulelor activate prin fluorescen (FACS)
poate monitoriza progresia ciclului celular de drojdie, atunci cnd
pereii celulari sunt etichetati cu Concanavalina A conjugat cu FITC
i celule proteice cu izotiocianat tetrametil (TRITC). Aceste
etichete permit colectarea de informaii cantitative cu privire la
proprietile de cretere ale celulelor individuale de drojdie, in
timpul progresului prin ciclul lor celular.
Ultrastructura i arhitectura macromoleculara a Organitului pot
fi obinute numai cu ajutorul microscopiei electronica, care, n
procedurile de scanare este utila pentru studierea topologiei de
celule, n timp ce seciunile ultrasubtiri sunt eseniale n
microscopia electronic de transmisie pentru a vizualiza structura
fin intracelular. Microscopia cu for atomic poate fi aplicata la
celulele neacoperite, nefixate de imagistica suprafeelor celulare
ale diferitelor tulpini de drojdii sau de celule n condiii de
cretere diferite.2,3 celulele organite mobile ale drojdiei si
compartimentele eintr-o celula de drojdie idealizata (Figura 2-2),
urmtoarele caracteristici ultrastructurale se pot observa (Figura
2-3): peretele celular, periplasma, membrana plasmatica,
invaginare, cicatricea mugurelui, citosol, nucleu, mitochondrion,
ER, reticul endoplasmatic; aparatul Golgi, vezicule secretorii,
vacuole; peroxizom. n mod evident, celulele de drojdie mprtesc cele
mai multe dintre caracteristicile structurale i funcionale cu
eucariotele mai mari. Spre deosebire de celulele de mamifere,
particularitile celulelor de drojdie sunt c ele sunt nconjurate de
un perete celular rigid i dezvolta cicatrici la natere n timpul
diviziunii celulare; vacuola corespunde lizozomilor n celulele mai
mari. Tabelul 2-3 ofer o list de enzime de marcare care pot fi
utilizate pentru a identifica n mod specific aceste structuri.
Structurile subcelulare din celulele de drojdie pot fi izolate
de protoplaste sau de celulele intacte prin ruperea peretelui
celular, nainte de centrifugarea diferenial.2.3.1 Celula
InvelitoareCelul de drojdie invelitoare este o capsula protectoare,
formata din trei constitueni majori (inauntru si afara): membrana
plasmatica, spaiul periplasmic, si peretele celular. n S.
cerevisiae, celula invelitoare are circa 15% din volumul total de
celule i are un rol major n controlul proprietilelor osmotice i
permeabile ale celulei.
Membrana plasmatica este de o grosime de aproximativ 7 nm, cu
unele invaginari n citosol. Compoziia lipidica cuprinde n principal
fosfatidilcolina i fosfatidiletanolamina, cu proporii mici de
phosphaditylinositol, fosfatidilserina sau phosphadityl-glycerole,
precum i steroli, n principal, ergosterol i zymosterol. Membrana de
proteine a drojdiei include urmtoarele catagorii: (i) ancore
citoschelet; (ii) enzime pentru sinteza peretelui celular;
(iii) proteine pentru transducia semnalului de transmembranare;
(iv) proteine pentru transportul substanei dizolvate (permeases,
canale, ATP); (v) facilitatori de transport, cum ar fi ABC (ATP
caset de legare) proteine implicate ntr-un transport multidrog.
Astfel, funciile principale ale membranei celulelor de drojdie
este de a oferi permeabilitate selectiva, adic de a controla ceea
ce intr i ce iese din citosol. Cel mai important este rolul
proteinelor membranare in reglarea nutritiei drojdiei, cum ar fi
absorbia de carbohidrai, compui cu azot sau ioni, i extrudarea
moleculei periculoase pentru celula. Alte aspecte importante sunt
exo-i endocitoza de molecule de marf, reacii de stres, i
sporulare.
Periplasma drojdiei este (35-45 A), un subire perete celular,
regiune asociat extern membranei plasmatice i intern a peretelui
celular. Aceasta conine n principal proteine secretate
(manoproteine), care sunt n imposibilitatea de a ptrunde n peretele
celular, dar ndeplinesc funcii eseniale n substraturi
hidralizatoare care nu traverseaz membrana plasmatica: invertaza
transform zaharoza n glucoz i fructoz, iar fosfataza acid
catalizeaz eliberarea de fosfat liber de la compuii organici.2.3.2
peretele celular
Peretele unei celule de drojdie este o invelitoare remarcabil de
groasa (100 pn la 200 nm) (Figurile 2-4 i 2-5), care conine
aproximativ 15 pn la 25% din masa uscat a celulei. Majoritatea
Constituenilor structurali ai peretelui celular sunt polizaharidele
(80-90%), n principal glucani i mannan-uri, cu un procent mic de
chitin. Glucanii (att -2, 6 i -glucani 1,3-glucani legati sunt
reprezentati) asigur rezisten peretelui celular, formnd o reea
microfibrilara. Mannan-urile sunt prezentate ca un miez -1,6-legat
cu -1,2 - -1,3 i inlantuiri laterale. Chitina este un polimer de
N-acetil glucozamina reprezentnd doar 2-4% din peretele celular i
localizat n principal n cicatricile mugurilor. Poate fi interesant
de observat c unele cretereri de drojdie filamentoase, cum ar fi
Candida albicans, au un coninut mai ridicat de chitin, n timp ce
chitina este absent din multe alte specii de drojdie. Alte
componente ale peretelui celular sunt cantiti variabile de
proteine, lipide, i fosfat anorganic. Dac celulele de drojdie sunt
tratate cu enzime litice (de exemplu helicaza din sucurile
digestive ale melcului; Zymolase sau Lyticase din surse microbiene)
n prezena stabilizatorilor osmotici, peretele celular este eliminat
ajutand formarea de spheroblasts, care pot fi vizualizati ca
structuri globulare n microscop. Anterior formarea Spheroblast-ilor
era adesea folosita pentru a facilita izolarea componentelor
subcelulare. Remarcabil, spheroblasts menine potenialul de
regenerare a peretelui celular (Figura 2-7).
Flocularea (agregare de celule asexuate) este un fenomen special
de interes n fabricarea berii, deoarece celulele cu tulpini de
drojdie de bere au tendina de a agrega ntr-o msur diferit.
Drojdiile de la fund, utilizate n mod normal pentru fermentaii mai
mari, au un grad mai mare de floculare (adic formarea de flocoane
macroscopice de adeziune celular) dect drojdiile de top, care sunt
utilizate pentru a face tipuri speciale de bere. Cel mai probabil,
flocularea este o consecin a exprimrii difereniate a flocculinei,
care interacioneaz cu receptorii de manoz pe peretele celular al
celulelor nvecinate.2.3.3 Citosol i CytoskeletonCitoplasma drojdiei
este un fluid coloidal acid ( pH = 5,25 ), care conine n principal
ioni i compui organici cu mas molecular mic sau intermediara , i
macromolecule solubile ( de exemplu proteine enzimatice , factori ,
glicogen ) . Enzimele citosolice de drojdie includ: ( i)calea
glicolitica , ( ii)complexul sintazei de acid gras , i ( iii )
unele enzime pentru biosinteza proteinelor . Reeaua cytoskeletal
garanteaza stabilitatea interna a celulei i furnizeaza organizare
structural ce cuprinde microtubuli i microfilamente. Acestea sunt
structuri dinamice care ndeplinesc funcia lor prin asamblare
regulata i des- asamblare de subuniti individuale de proteine .
Astfel , tubulinele i polimerizeaz monomeri ca heterodimeri pentru
a da microtubuli , n timp ce monomerii globulari de G Actin
polimerizeaza n microfilamente dublu - catenare ale F - Actin .
Microtubulii i microfilamentele sunt de asemenea importante n mai
multe procese dinamice care au loc n timpul mitozei i meiozei ,
septarii , i mobilitatea organicaCitoplasma drojdie conine mai
multe categorii de microorganisme , care pot fi difereniate de
substructurile organice :
(i) 80S ribozomi suspendati liberi (n contrast cu ER asociate i
60S ribozomi mitocondriali);
(II) particule lipidice, care ndeplinesc funcia de particule de
depozitare sau pot servi in biosinteza membranei de drojdie;
(III) Proteazele, multi-subuniti complexe implicate n proteoliza
proteinelor programate i n alte aspecte ale degradarii proteinelor
sau ale transportului. 2.3.4 Nucleul i Elementele extracromozomiale
Nucleul de drojdie este un organit rotund - lobat, aproximativ 1,5
m n diametru . Nucleoplasma este separata de citosol de o membran
dubl care conine pori ntre 50 pn la 100 nm n diametru . De la
distanta, SPBs-urile sunt conectate la microtubuli citosolici.
Aceste elemente structurale joac un rol important n timpul
diviziunii celulare , cytokinesis i formarea mugurilor . Spre
deosebire de alte eucariote ,membrana nuclear n drojdie nu se
dizolv n timpul mitozei .
n nucleu exist o regiune densa corespunztoare nucleolului care
dispare n timpul mitozei i se reformeaza n timpul interfazei.
Coninutul mare de nucleoplasma este reprezentata de AND-ul genomic
care mpreun cu histone si non- histone este organizat n cromatina.
Cromozomii de drojdie se formeaz i se inmultesc n timpul mitozei
(sau meioz), dar se comport practic invizibil pentry tehnicile
microscopice ( Figura 2-8) . n plus fa de materialul genomic,
nucleele de drojdie conin utilaje pentru replicarea ADN-ului,
repararea ADN-ului, transcriere i prelucrarea ARN mpreun cu
substraturile necesare i factorii reglementori, i
produse(precursoare) rezultate., precum i o parte din protezomii
drojdiei.
Mai mult dect att, multe elemente genetice non-cromozomiale pot
fi prezente n nucleul drojdie [Wickner, 1995].
(i) 2 m ADN este o plasmid ADN meninuta circular stabil, care se
reproduce exact o dat n timpul fazei S. Aceste elemente pot fi
prezente n numr mare de copii, i au fost utile n construcia de
vectori de donare n tehnologia recombinanta a ADN-ului de drojdie.
Nici o funcie nu a fost nc atribuita celor patru gene gsite n
AND-ul 2 m.
(ii) ARN dublu catenar i ADN liniar se gsesc n tulpini de
drojdie ucigae. Ele traiesc in gene pentru toxine, care vor fi
periculoase pentru tulpinile non-ucigase.
(iii) Cele mai interesante elementele extracromozomiale sunt
elementele Ty, singura clas de retrotransposons gsite n
drojdie.
2.3.5 Sistemul de secretor i vacuoleleLa fel de comune pentru
toate eucariotele, celulele de drojdie locuiesc ntr-un sistem de
compartimente nconjurate de o membran, care sunt concepute pentru
traficul de proteine n i n afara celulei. Reticulul endoplasmatic (
ER ) este locul de biosintez i modificare a proteinelor care urmeaz
a fi exportate . Dup sinteza polysom-urilor asociate ER-ului
situate pe suprafaa membranei ER , proteinele precursoare sunt
translocate n lumenul ER. Din ER , proteinele sunt ndreptate de
vezicule spre aparatul Golgi. Ulterior pot avea loc in Golgi
modificari ale proteinelor de catre catenele laterale carbohidrate,
de exemplu mannosylation . Transportul retrograd din Golgi la ER a
fost stabilit ca un control al calitii pentru proteinele
exportate.
Proteinele livrate de la Golgi sunt direcionate ctre diferite
destinaii din interiorul celulei sau la exterior prin diferite
vezicule secretoare. Aceste destinaii includ : ( i)vacuolele , (ii
)regiunea mugurului n timpul mitozei orientate ctre transportul
mediat de actin , (iii ) membrane plasmatica , ( iv )periplasma. n
mod natural , doar cteva proteine sunt exportate n periplasm i la
abunden sczut . Cu toate acestea , secvenele de semnal care sunt
prezente n aceste proteine au fost fuzionate pentru a recombine
proteinele heterologe cu valoare terapeutic , care sunt apoi
secretate cu succes din celulele de drojdie .
Organetul cheie din drojdie implicat n traficul intracelular de
proteine sunt vacuolele. Poate fi privit ca o form de component
integrant a sistemului intramembranous. Rolul principal al acestui
compartiment-Lizozom cum este clivajul proteolitic nespecific
proteinelor, care implic o varietate de enzime litice
intravacuolare: endopeptidaze, aminopeptidases i
carboxipeptidaze.
Alte funcii fiziologice ale vacuolelor drojdiei includ:
depozitarea de aminoacizi bazici, polifosfai i anumii ioni
metalici; homeostaza concentraiilor de ioni citoplasmatici;
osmoregulation.
2.3.6 peroxisomelePeroxisomele efectuiaza o varietate de functii
metabolice in celule eucariote. n drojdie, peroxisomele (Figura
2-10) conin mai multe oxidaze care servesc n utilizarea oxidativa
de surse specifice de carbon i azot. Organitele se dezvolta din
peroxisome mici prezente n celulele glucozei crescute ca rezultat
al sintezei rapide a enzimelor peroxisome, cum ar fi catalaza i
oxidaza alcool-ului. Cele mai multe gene implicate n biogeneza
peroxizomilor (gene PEX) au fost caracterizate pn n prezent in S.
cerevisiae. Cum mitocondriile de drojdie duc lipsa de oxidare -
peroxisomele sunt locul de degradare a acidului gras (Figura
2-11).2.3.7 MitocondriileCelulele de drojdie conin mitocondrii care
seamn structural cu aceste organite gsite n toate eucariotele. Prin
urmare, mitocondriile drojdiei au servit drept modele pentru a
studia intens structura mitocondrial, activitatea i biogeneza
[Glick i Pon, 1995]. Cu toate acestea, mitocondriile drojdiei
prezint o varietate de caracteristici importante, care sunt absente
de la omoloagele lor din organisme mai mari, n special celulele de
mamifere.
Caracteristicile structurale generale ale mitocondriilor (Figura
2-12) includ:
(i) o membran exterioar - care conine enzime implicate n
metabolismul lipidic,
(ii) spaiul intermembranar(iii) o membran interioar - care
conine NADH i dehidrogenaze succinat, componentele lanului
respirator i sintaza ATP, i diferite proteine de transport
membranare integrale,
(iv) matricea mitocondriala - care conine enzime de oxidare a
acizilor grai, ciclul acidului citric, ADN-ul mitocondrial mpreun
cu transcripia mitocondriala i proteinele utilajelor de sinteza
(inclusiv 60S ribozomii mitocondriali i mitocondriale ARNt).
Mitocondriile drojdiei sunt structuri dinamice a cror
dimensiune, form i numr poate varia foarte mult n funcie de tulpina
de specificitate, de faza ciclului celular, i condiiile de cretere,
n care factori importani sunt: presiunea parial a oxigenului,
concentraia de glucoz, prezena substraturilor nefermentabile,
disponibilitatea de steroli i acizi grai , i a anumitor ioni
metalici (Mg + +) n condiii aerobe , mitocondriile drojdiei sunt
implicate n sinteza ATP-ului cuplat la fosforilrile oxidative.
Activitile ciclului acidului citric i lanul respirator vor depinde
n mare msur de speciile de drojdie i expresia efectului Crabtree .
n condiii anaerobe , mitocondriile par a fi dispensabile cel puin
pentru funcia respiratorie . De fapt , aa-numita , mutanti mici,
care nu dispun de mitocondriile funcionale sunt viabile . Cu toate
acestea, mitocondriile pot ndeplini i alte funcii n fiziologia
celulei de drojdie , implicnd c mitocondriile sunt relevante pentru
metabolismul celular intact chiar i n condiii anaerobe :
- Sinteza i desaturarea acizilor grai i lipidelor,
- Biosinteza ergosterolului ,
- Reacii la stres i adaptarea la stres ,
- Enzime pentru sinteza anumitor aminoacizi i acizi
dicarboxilici , pyrimididice i bazele purinice, porfirin i
pteridine ,
- Mobilizarea de glicogen ,
- Producia de arom " a componentelor.
Importana mitocondriilor drojdiei este cel mai bine ilustrat de
faptul c aproximativ 8- 10% din genele de drojdie nucleare sunt
implicate n biogeneza acestor organite i meninerea funciilor lor .
Marea majoritate a acestor proteine sunt sintetizate de ribozomii
din citosol i ajung sa fie importate n mitocondriile drojdie , care
au potenialul de a biosintetiza doar 12 proteine diferite (
subuniti cytocromoxidaze , citocromul b , cele ase subuniti de NADH
dehidrogenaza , factori de splicing ) pe lng mitocondrialul rRNAs (
15S i 26S subuniti ) i complementul ARNt a mitocondrialelor .
Biogeneza mitocondriilor, care implic cooperativitate genetic ntre
genele nucleare i genomul mitocondrial , a fost studiat pe larg n
S. cerevisiae , deoarece mai multe tipuri de mutaii pot fi
utilizate n acest model de organism . 5 genomul de Drojdie
5.1 Proiectul ordonarii genomului de drojdie
n 1989, sa decis initierea unui proiect de secveniere a drojdie
n cadrul programelor de biotehnologie ale UE. Bazat pe o abordare
de reea, iniial, aproximativ 35 de laboratoare europene au devenit
implicate n aceast ntreprindere [Vassarotti & Goffeau, 1992].
Cromozomul III a fost primul cromozom finalizat n 1992 [Oliver et
al.,1992]. n 1994, cromozomii XI i II au fost publicati de
proiectul UE. La scurt timp, o serie de alte laboratoare s-au
alturat proiectului i au fost de accord cu o colaborare
internaional care s permit finalizarea ntreagii secvene a genomului
de drojdie n 1995. n cele din urm, mai mult de 600 de oameni de
stiinta din Europa, America de Nord i Japonia au devenit implicati
n acest efort [Levy, 1994]. Diagrama (Figura 5-1) enumer
laboratoarele implicate n proiectul de colaborare din care a fost
lansata ntreaga secven, n aprilie 1996.
5.1.1 Clonarea i cartografierea ProceduriiSuccesiunea
cromozomului III a pornit de la o colecie de suprapuneri de plasmid
sau clone fage lambda, care au fost distribuite de ctre
coordonatorul de ADN la laboratoarele de contractare . Cu toate
acestea, curnd a devenit evident c bibliotecile cosmide comandate
au fost mult mai avantajoase pentru a ajuta secventiere la scar
larg. Mai multe dintre aceste libaries au fost construite [de
exemplu Stucka & Feldmann, 1994; Thierry et al, 1995; . .Riles
et al, 1993] i folosite pentru restul cromozomilor de drojdie.
Avantajele evidente ale clonarii segmentelor de ADN n cosmide, care
primesc n mod normal 35-45 kb de ADN , au fost :( i) gene mai mari
ar putea fi obinute pe o singur clon recombinanta, (ii ) mai multe
gene legate pot fi izolate mpreun cu regiunile lor ; intergenice (
iii ) mai puine colonii trebuie s fie meninute i analizate pentru a
izola o clon de interes ; ( iv ) clonele cosmid s-au dovedit a fi
stabile timp de muli ani n condiii de depozitare normale . Nu in
mod surprinzator, izolarea secveniala a clonelor cosmid suprapuse (
exemplul prezentat n figura 5-2 ) a permis legtura fizic i
caracterizarea larg de gene de la diferite organisme .
Pentru a construi o bibliotec cu o acoperire ct mai complet si
cu ct mai puine clone posibil, fragmente ADN clonate trebuie
distribuite aleatoriu pe ADN. n aceste condiii, numrul de clone (N)
dintr-o bibliotec reprezentnd fiecare segment genomic cu o anumit
probabilitate (P) este N = ln (1-P) / ln (1-f) unde f este lungimea
inseriei exprimat ca fracie de mrimea genomului [Clarke &
carbon, 1976].
5.1.2 Strategii de secventiere, secven de asamblare i de control
al calitii
5.1.2.1 Strategii de secveniere
n reeaua european, clonele au fost distribuite la laboratoarele
colaboratoare n conformitate cu un sistem elaborat de ctre
coordonatorii ADN. Fiecare laborator contractat a fost liber sa
aplice strategii de secveniere i propriile tehnici, cu condiia ca
secvenele sa fie determinate n ntregime pe ambele catene i sa fie
obinute citiri clare. Dou abordri principale au fost folosite
pentru prepararea de subclone pentru secveniere: ( i) generarea de
sublibraries prin utilizarea unor serii de enzime de restricie
adecvate sau de deleii ale subfragmentelor corespunztoare,
formulate de exonucleaza III , (ii ) generarea de biblioteci rapide
formate din cosmide ntregi sau fragmente de subclona prin
impartirea aleatoare a ADN-ului . Secvenierea prin tehnica Sanger a
fost facuta fie manual, etichetata cu [ 35S ] dATP fiind metoda
preferata de monitorizare, fie prin dispozitive automate, urmand
diversele protocoale stabilite . Au fost folosite dou tipuri de
dispozitive de detectare on-line cu etichetarea fluorescent:
Applied Biosystems ABI373A i Pharmacia, ALF. Un laborator a folosit
sistemul de exterminare directa a electroforezei de companie GATC (
Konstanz ). Proceduri similare au fost aplicate la succesiunea de
cromozomi din afara reelei europene. Laboratoarele americane s-au
bazat n mare parte pe secventierea la scar larg de catre
mainrii.
5.1.2.2 Secventierea Telomerelor
Cromozomi Telomerii ai drojdie au prezentat o anumit problem.
Datorit substructuri lor repetate i lipsa de locuri restrictive
adecvate au putut fi clonai prin proceduri convenionale, cu doar
cteva excepii. Secvenele au fost apoi determinate de clone de
plasmid specifice obinute prin " capcan clonarii telomerilor", o
strategie elegant dezvoltata de E. Louis la Oxford [Louis, 1994,
Louis & Borts, 1995].
5.1.2.3 Secvena de asamblare i de control al calitii
n cadrul reelei europene, toate secvenele originale au fost
depuse de ctre laboratoarele care colaboreaz la Institutul
Martinsried de Secvente a Proteinelor (MIPS), care a acionat ca un
centru de informatic.
Secvenele au fost inute ntr-o bibliotec de date, asamblate n
succesiuni ce creteau progresiv, i actualizate n timpul desfurrii
proiectului prin aplicarea criteriilor corespunztoare ntr-un numr
de controale de calitate, ncepnd cu cromozomul XI [Vassarotti et
al., 1995]. n colaborare cu coordonatorii ADN-ului secvenele
cromozomiale finale au fost derivate.
5.1.3 Ordonarea Analizei
mpreun cu declaraiile de date oferite de ctre laboratoarele
singure, i n cele din urm atunci cnd secvenele complete au fost
disponibile, datele au fost supuse unei analize prin diveri
algoritmi . Secvenele au fost interpretate utiliznd urmtoarele
principii :
(i) Toate locurile de imbinare ale intronilor ce constau in
modele special definite [ Kalegoropoulos , 1995 ; Kleine &
Feldmann , nepublicat ] au fost listate .
( ii) Orice ORF care conine cel puin 100 de codoni nvecinati ca
sens i care nu sunt cuprinsi n ntregime ntr- un ORF sau in vreo
suvita de ADN a fost enumerat ( aceasta lista include si ORF-uri
parial suprapuse ).
( iii ) Cele dou liste au fost fuzionate i toate perechile cu
locuri de mbinare ale intronilor / puncte ramur ce apar n
interiorul unui ORF dar n orientare opus au fost luate n
considerare.
( iv ) regiunile centromerelor i telomerilor, precum i genele
ARNt i elementele Ty sau rmie ale acestora au fost cercetate n
comparaie cu seturile de date caracterizate anterior de astfel de
elemente [ Kleine & Feldmann , nepublicate ] inclusiv
nregistrrile bazei de date introduse ntr-o biblioteca de gene ARNt
i ARNt actualizat permanent [ Sprinzl et al . , 1996 ] , i prin
aplicarea programului de scanare ARNt [ Fishent & Burke , 1991
] .
5.2 Genomul Drojdie: Viaa cu 6000 de gene
5.2.1 Proteomele Drojdiei: Cadrul citirii deschise i Functia
GenelorTermenul "Proteome" a fost inventat pentru a descrie un set
complet de proteine sintetizate de o via celulara [Wilkins i
colab., 1996]. Odat cu finalizarea succesiunii genomului de
drojdie, pentru prima dat, a devenit posibil s se defineasc
proteomul unei celule eucariote.
Dimensiunile majoritarelor cadre deschise citii ( ORF) din
drojdie variaz ntre 100 i peste 4000 de codoni . Mai puin de 1 %
dintre ORF este estimata a fi mai mic de 100 codoni; cele mai mici
peptide mature care au fost caracterizate sunt cei doi feromoni de
mperechere(respectiv 11 i 13 aminoacizi,).
Este de remarcat faptul c numrul de gene de drojdie pentru care
funciile pot fi atribuite prin comparaii cu intrrile de baze de
date de la mai multe alte organisme , care s-a dezvoltat destul de
exponenial n ultimii ani, nu a crescut substanial . O observaie
similar a fost deja fcut , atunci cnd genomul complet de procariote
mici , cum ar fi Haemophilus influenzae ( 1,8 Mb ) [ Fleischman et
al . , 1995 ] , Mycoplasma genitalium ( 0,6 Mb ) [ Fraser i colab .
, 1995 ] , sau Archeon Methanococcus jannaschii ( 1,7 Mb ) [ . Bult
et al , 1996 ] au fost determinate : o mare parte a genelor au avut
omologii din alte organisme . Prin urmare , probabil c, avem de a
face cu un fenomen general deoarece se pare c multe dintre funciile
noi necesit doar o transcriere tranzitorie sau cu nivel sczut
ntr-un organism, sau sunt n primul rnd - ncrengturi specifice .
mpreun cu raportul ntreagii secvene genomice , o clasificare a
genelor de drojdie a fost stabilit la MIPS i a fost folosita ca baz
pentru clasificarea genelor de la alte organisme . Unul dintre cele
mai utile inventare de proteine de drojdie a fost alcatuit n Baza
de date a Proteinelor de Drojdie ( YPD ) [ Garrels et al . , 1996 ]
i sunt actualizate n mod regulat . (Cu toate acestea , n prezent
aceast informaie este disponibila doar comercial ) . 5.2.2
Suprapunerea ORF , Pseudogene i IntroniCteva cazuri au fost
constatate acolo unde suprapuneri de ORF chiar exist ntr-adevr n
drojdie i sunt exprimate. Intr-un caz special, s-a mai artat c
exprimarea celor doua ORF-uri are loc n diferite etape ale creterii
drojdiei. O ntrebare interesant a fost ct de multe pseudogene ar
putea fi prezente n genomul drojdiei. Din studii anterioare, s-a
anticipat c acest numr n drojdie ar trebui s fie redus n comparaie
cu acela din genomul mamiferelor. n general, aceast ipotez pare s
fie adevrata pentru cea mai mare parte de cromozomi de drojdie, dar
cromozom I s-a dovedit a fi o excepie de la aceast regul [ Bussey
et al . , 1995 ] .
Cromozomul I este cel mai mic cromozom nuclear eucariotic
funcional care se intampla n mod natural caracterizat pn acum.
Centrala 165 kb seamn cu alti cromozomi ai drojdiei att n
densitatea naltimii cat i in distribuia de gene. n contrast,
secvenele rmase flancand acest ADN ( cele dou capete ale
cromozomului ) au o densitate mult mai mica de gene, n mare parte
nu sunt transcrise , nu conin gene eseniale pentru creterea
vegetativ , i conin patru pseudogene aparente i o secven redundant
15 kb .
Aceste regiuni terminale repetitive constau intr-o repetare
telomerica, flancata de AND-ul care este n strns legtur cu FLO1 , o
gen de drojdie implicata n floculare de celule i care codific o
serina. Pseudogenele sunt legate de gene de drojdie cunoscute, dar
aucodoni interni de oprire. Grij extrem a fost luat n astfel de
cazuri pentru a reconfirma secvenele din regiunile amintite de
laboratoarele independente.
Numai o mic parte a genelor de drojdie, n jur de 4% din total,
sunt prezise (sau deja demonstrate experimental) ca vor fi
ntrerupte de introni. Pn n prezent doar dou cazuri au fost ntlnite
n care doi introni sunt prezenti:, locus-ul MAT pe cromozomul III i
o gena proteica ribozoma, RPL6A, pe cromozomul VII. n acesta din
urm, al doilea intron codific un ARN mic. In general, intronul
dintr-o anumit gen este situat la extrema captului 5 'al fiecarei
gene, uneori chiar precede regiunea de codificare. Populaia
predominant de gene care conin introni este recrutata de cele care
codific proteinele ribozomale. Semnificaia funcional a intronilor
nu este deloc clara, i n ciuda numrului mic de gene de drojdie ce
conin introni, continua sa se dezvolte i sa menina un mecanism
deosebit de sofisticat si complex pentru despicare.
5.2.3 Membrana Proteinelor , Proteine mitocondriale
Algoritmul ALOM [ Klein et al . , 1985 ] poate fi aplicat pentru
a prezice deschiderea membranei putative . O prim estimare pentru
cromozomul III a artat c aproximativ 38% din genele "reale" poate
codifica pentru proteine transmembranare care conin ntre 1 i 14
membrane potenial transversabile[ Goffeau et al . ,1993a ]. O figur
la fel de mare ( 142 ORF din 410 ), a fost gasita pentru
cromozomiul II [ Feldmann i colab. , 1994 ] . Datele ordonate
sistematic, obinute de la alti cromozomi ai drojdiei, sugereaz c
acest lucru pare s se aplice, ca regul general, la drojdie [
Goffeau et al , 1993b ; . . Nelissen et al , 1995 ] . Chiar dac
algoritmul poate da o estimare destul de mare, este posibil ca o
treime din proteinele de drojdie sa trebuiasca s fie considerate ca
fiind asociate cu structuri de membran .
Examinarea ORF pentru apariia secvenelor de semnal int a
mitocondriilor putative este dificil datorit caracterului complex
al acestor semnturi [ Hartl et al . , 1989 ] acest lucru ar putea
fi realizat numai prin inspecie vizuala. Din moment ce nu toate
proteinele care particip la biogeneza mitocondriilor sunt importate
prin anumite secvene semnal , numrul exact de proteine implicate in
mentinerea functiei mitocondriale, in drojdia de bere rmne
necunoscut n prezent . O estimare aproximativ 8-10 % este c unele
proteine de drojdie pot fi implicate n biogeneza mitocondriilor .
5.2.4 Alte entiti genetice
Pe lng genele care codific proteinele, informaii detaliate fost
obinut despre organizarea genele pentru ARNt si alte RNAs mici, de
Retrotranspozoni a drojdiei (elemente Ty denumite) , precum si
secvene telomerice i centromerice . Genele pentru ribozomele RNAs
sunt grupate n aproximativ 100 de copii pe braul drept al
cromozomului al-XII-lea , n timp ce, cele mai multe copii ale
genelor tARN sunt gsite mprtiate n ntreagul genom.
5.2.4.1 Genele Drojdie ribozomal
Genele ribozomale ARN sunt situate n cromozomul XII al drojdiei,
unde formeaz o matrice de aproximativ 100 de uniti de transcripie
aranjate tandem, fiecare cuprinznd secvenele de 28S , 5.8S i 18S
ARNr . Numrul de uniti poate varia uor ntre tulpini ( Figura 5-8 )
.
5.2.4.2.2 Familii tARN , Redundana Genelor tARN , i variante de
Gene tARN
Efectuand analiza de ansamblu a genomului de S. cerevisiae S288C
folosind ajutor computerizat ar putea fi identificate cele 274 de
gene ARNt nucleare intacte, codificate i o gena ARNt de pe
cromozomul suplimentar XIV ntrerupt de un element de Ty1 aproape de
captul 5 '
Dupa mai multe criterii , cele 274 de gene tARN de drojdie pot
fi considerate gene active i grupate n 42 de familii ( Tabelul 5-1
) de specificitate codon distincta. Cele dou isoacceptoare de
metionin sunt atribuite familiilor distincte, in calitate de
iniiator tRNAMeti i de elongator tRNAMet3, se disting n mod clar ,
att prin structura cat i prin funcie. n majoritatea cazurilor,
copiile unice a unei familii impart secvente identice
in partea structural a ARNt-ului. Cu toate acestea, unele
familii, pot s cuprind copii ale genei cu secvene puin variate care
dau natere la perechi alternative de baze din tulpini sau
nucleotide alternative la locurile unice de ARNt . De asemenea ,
variaii ale secvenelor de introni pot fi observate ntre diferiti
membrii a unei familie. n total, variante de secvene ( inclusiv
variantele intron ), exist n 11 familii de gene tARN. Secvenele de
gene tRNASer3 reprezint cazuri speciale : n dou dintre ele , primul
C lipsete n bucla anticodon ( n mod normal, citirea 5'CTGCTAA3 " )
. n cazul n care aceast "pierdere" nu este pur i simplu din cauza
erorilor de secventiere, tARN rezultat ar trebui s fie o variant
real, care are doar ase nucleotide n bucla anticodon . Genele
pentru nonsens sau supresoare tRNAs missense pot fi incluse n
familiile lor "mam", deoarece ele rezulta din mutatii special, din
copii de gene individuale ale acestei familii .
Mai mult dect att, n tulpina S288C nu au fost detectate gene
pentru trei ( variant) tRNAs-uri, structurile primare din care au
fost raportate n literatura de specialitate : tRNAHis1 , tRNASer1 i
tRNAThr1b . Dou explicaii sunt oferite : (i ) aceste ARNt sunt
codificate de genele suplimentare care pot fi prezente n alte
tulpini de drojdie, ( ii ) acestea (i poate altele ) variante de
structuri ARNt sunt generate de editarea ARN . Prima posibilitate
este susinut de faptul c ARN-ul " solubil " din diferitele tulpini
au servit drept materie prim n purificarea ARNt-ului specific
pentru secveniere . Mai mult dect att, au existat numeroase indicii
din profilele tARN-ului n diferite tulpini de drojdie ( inclusiv
tulpinile haploide sau diploide , cu diferite tipuri de imperechere
), c numrul i amplasarea anumitor isoacceptors a fost variabil . A
doua presupunere este dificil de dovedit n prezent. Potrivit
cunostintelor noastre, editarea ARN-ului nuclear a drojdiei de bere
nu a fost raportata pn acum .
5.2.4.2.3 Introni i Procesare de precursori tRNAs
Secvene care intervin n genele eucariote tARN au fost descrise
pentru prima data de tRNATyr-ul drojdiei [ Goodman et colab . ,
1977 ] . Cu disponibilitatea secvenelor suplimentare, reguli pentru
localizarea intronilor n cadrul secvenelor de codificare au fost
stabilite, iar mecanismul de despicare a intronilor n drojdie a
fost elucidat , iar componentele implicate n acest proces au fost
caracterizate .
Surprinzator , intronii sunt gsiti n doar 10 familii nucleare de
gene tARN ( Tabelul 5-1 ), dar oricare membru dintr-o anumit
familie poate purta un intron . In general, intronii pentru o
anumits specie tARN sunt identici sau demonstreza o secven similara
foarte ridicata. Cu toate acestea, in cateva cazuri, intronii au
lungimea variabil ( + / - o nucleotid ), precum i n succesiune
.
Asa cum a fost studiat n anumite supresoare tRNAs , unele
activiti de modificare par s necesite coninuturi de introni tRNAs
in calitate de substraturi . n special, intronii pot fi obligai s
introduc modificri anticodon la prima de baz n timpul prelucrarii a
anumitor pre- tRNAs-uri astfel nct ARNt-urile mature sunt capabile
sa citeasca codoni selectati. Cu toate acestea, aceast cerin a fost
demonstrat c nu este universala, precum i modificrile la alte
poziii n secvena ARNt nu necesit precursoare tRNAs ca substraturi,
dei multe dintre modificri au loc n mod normal la nivelul
precursorilor .
O observaie interesant a fost c intronii pot fi amestecati ntre
genele omoloage ARNt [ Olson i colab . , 1981 ] . Putine informaii
sunt disponibile despre modul n care secvene ce intervin ar putea
afecta nivelul expresiei genice ARNt.
5.2.4.2.4 Multiplicitatea ARNt i Capacitatea Codon n drojdie
Studiile anterioare au aratat ca drojdia de bere , ca i alte
organisme , are isoacceptoare nucleare codate pentru majoritatea
dintre cei 20 de aminoacizi , de preferin, pentru a satisface
degenerarea codului genetic . A devenit evident c " wobbling " n
interaciunile : codon-anticodon permite reducerea numrului de
tRNAs-uri necesare pentru a ine cont de ntreaga capacitate de
decodare a unui organism [ Crick , 1966 ] i c "finetuning-urile ",
interaciunilelor codoni- anticodonilor sunt mediate prin modificri
de baz anticodon foarte precise n special tRNAs-uri . Regulile
wobble particulare pentru poziia a treia a perechii codon -
anticodon propuse pentru S. cerevisiae a dus la predicia a
aproximativ 46 de ARNt-uri diferite [ Guthrie & Abelson , 1982
] .
5.2.4.2.6 Redundana genelor ARNt i selecia Codon n drojdie
Studiile la nceputul anilor 1980 au artat deja o corelaie
puternic ntre abundena tRNAs-urilor drojdiei i apariia codoniilor
respectivi n genele proteinelor : gene care au fost cunoscute ca
fiind puternic exprimate s-au dovedit a fi mai mult prtinitoare
dect gene cu un nivel mai sczut de exprimare [ Ikemura , 1982;
Bennetzen i Hall , 1982 ] . Aceste constatri au fost confirmate
intr-un studiu usor de inteles care a investigat corelarea dintre
redundana genei tARN i selecia translationala in drojdie utiliznd
un eantion de 1756 de secvene proteice distinct codificate: o
co-adaptare semnificativ mai puternic ntre alegerea codonului i
numrul de copii a genei tARN a fost observat n gene extrem de
exprimate [ Percudani i colab . , 1997 ] . Cuantificri exacte ale
tuturor componentelor individuale ale populaiei ARNt-urilor nu sunt
disponibile. O estimare a coninutului celular de 21 din 24 serii de
tRNAs-uri, dateaz din 1982 [ Ikemura , 1982 ] i nu include nici
unul dintre ARNt-urile rare . ntr-un studiu recent, Percudani et al
. [ 1997 ] a constatat c numrul de copii de gene pentru speciile
individuale de tARN-uri se coreleaz bine cu coninutul intracelular
msurat anterior a celor 21 de specii ARNt . Aceasta , mpreun cu
constatarea c exist o legtur strns ntre redundana genei ARNt i
compoziia global de aminoacizi a proteinelor drojdiei indic c
nivelurile intracelulare de ARNt n celulele de drojdie ce cresc
normal, sunt determinate n principal de numrul de copii a genei.Cu
toate acestea , variaia coninutului de tARN in drojdia de bere , la
rate de cretere diferite, nu a fost studiat n detaliu cum a fost
fcut , de exemplu , n E. coli [ Dong et al . , 1996 ] . Numai
pentru anumite ARNt-uri de drojdie , cum ar fi isoacceptors serin ,
abundena relativ a fost gsita variind n celule care creteau la
viteze diferite [ Heyman i colab . , 1994 ] . Studiile in vitro au
sugerat c att TFIIIB70 i TFIIIC joac un rol n coordonarea
transcrierii nivelului polimerazei III cu rata de cretere a
celulelor [ Sethy i colab . , 1995 ] .
De asemenea, trebuie remarcat faptul c s-au observat variaii n
numrul de copii de gene majore ARNt n diferite tulpini de drojdie,
dar par a fi tolerate . Aceste constatari sugereaza faptul ca
trebuie sa existe mecanisme mai complicate care permit coninutului
tARN-urilor s fie adaptate prin reglementarea copiilor expresiei
unice a genei tARN. Cu toate acestea, problema cu privire la modul
in care expresia genelor individuale ARNt este reglementat in vivo
este nc o problem datorit redundanei genele ARNt .5.2.4.2.7
Organizarea genomica a genelor ARNt ale drojdiee i aspecte
evolutive
37 din cele 42 de familii de drojdie tARN sunt reprezentate de
mai multe copii ale genei mprtiate de-a lungul genomului.
Aliniamente ale secvenelor genei ARNt-uri isoacceptoare codificate
arat c copiile individuale au o particularitate in comun cu genele
care codific proteinele: n majoritatea cazurilor, puine , dac nu
chiar aproape deloc, omologia nu este vzut n regiunile adiacente
dintre membrii diferii ai unei familii, si de asemenea nu este vzut
nici ntre membrii din diferite familii de gene . Poate doar, unele
de 10 sau cam asa ceva perechi de baze sunt conservate n cadrul
regiunilor imediat urmatoare a diferiilor membrii ai unei familii
de gene ARNt. Exist cteva excepii n care similitudini mai extinse n
regiunile adiacente sunt vzute ( de exemplu , pentru cele dou gene
tRNAIle1 , i pentru dou copii de gene ale tRNAPro1 pe Cromozomii
XII i respectiv XIII), sugernd c dispersia acestor exemplare de
gene care s-au format prin duplicare a avut loc numai recent .
n ceea ce privete bazele transcrierii genei tARN, care este
reglementata de secvene promotorii interne, secvena divergenei n
regiunile adiacente nu este att de surprinztoare .
Cu toate acestea , avnd n vedere faptul c factorul de
transcriere TFIIIB se leaga de secvente care preced partea
structural a genelor tARN , " ajustarea " expresiei genelor tARN ar
trebui s depind de caracterul acestor secvene [ de exemplu ,
Kassavetis i colab . , 1990 ] .
n timp ce ntreinerea multiplicitatii genei tARN este uor de
explicat prin conversia genei interlocus [ Amstutz i colab. , 1985
] , ntrebri cu privire la stabilirea mecanismului ce sta la baza
multiplicitatii genelor tARN rmn n mare parte nerezolvate . Un
proces mediat de transcriere invers pare plauzibil: conservarea de
introni nu nltura aceast ipotez deoarece despicarea este un pas mai
trziu n maturarea tARN i precursorii ARNt pot fi considerati
substraturi pentru retrotranscriptie [ Olson , 1991 ] . Alte
mecanisme de dispersie, cum ar fi evenimentele mediate de
retrotransportori, au fost propuse pentru a fi implicate n
amplificarea genei ARNt [ Warmington et al . , 1987 ] , dar
cunotinele noastre actuale privind organizarea dintre genele ARNt
de drojdie confer aceast posibilitate improbabila .
Compararea ntregilor secvene de cromozomi releva apariia
aa-numitelor regiuni omologii Cluster ( CHRs ), n care genele
omoloage sunt aranjate n aceeai ordine , cu aceeai orientare
transcripional relativ , pe doi sau mai multi cromozomi. Wolfe i
Shields (1997 ) au definit 55 de astfel de blocuri i au sugerat un
model destul de convingtor care explic omologiile extinse vzute n
drojdia de astzi facute de ( allo - sau auto) - tetraploidizarea
dintre dou tulpini vechi de S. cerevisiae , urmate de translocari
reciproce i stergeri de 85 % din genele duplicate .
Este evident ca cele mai mari CHRs-uri mprtesc o serie de "
perechi " de gene tARN, att n aceeai locaie relativ cat i in
orientare . Modelele observate implica faptul c aceste gene
particulare ARNt au fost copiate mpreun cu proteinele ce se ocupau
de codificarea genelor vecine . Presupunnd c genele ARNt sunt o
achiziie veche ce a evoluat, i lund n considerare faptul c
regiunile de flancare ale acestor perechi de gene tARN s-au
despartit complet, constatarile nostra sunt intru-totul de acord cu
ideea ca CHRs-urile au fost generate de suprapunerile genelor
vechi. Cu toate acestea, avnd n vedere faptul c o mare varietate de
exemplare de gene duplicate, codificari de gene precum i gene tARN
, se gsesc mprtiate de-a lungul mai multor locatii in genomul
drojdie, sunt necesare postulari de mecanisme suplimentare de
amplificare a genei i de dispersie . n special pentru genele tARN ,
dintre care majoritatea ( 232/274 ) se afl n afara CHRs-irilor , ar
trebui s invoce dou tipuri diferite de mecanisme prin care sa fie
generate duplicri : ( i) co - evoluia de mari segmente cromozomiale
care conin att codarea proteinelor cat i genele ARNt ; ( ii )
introducerea " duplicarii" copiilor de gene ARNt de la locurile
singulare din alti cromozomi , un proces care ar fi putut deveni
operativ dup speciaie/ specificatie .5.2.4.3 Drojdie Ty
Elemente
Cinci tipuri diferite de elemente Ty care prezint omologie
substanial la retrovirusuri i retrotranspozonii de plante i animale
sunt prezente n genomul de drojdie: Ty1, Ty2, i Ty4 aparin clasei
"COPIA" a retrotransposonilor, n timp ce Ty3 este un membru al
familiei "igan" [revizuire, Sandmeyer, 1992]. S288C conine 32 Ty1 i
13 Ty2 elemente complete, n timp ce Ty4 este prezent la doar trei
locaii i Ty3 are loc n dou exemplare. Ty5, gsit n cromozomul III, a
aprut ca o noua clasa de transpozoni n drojdii.5.2.5 Genomul:
Arhitectur i Organizaia
5.2.5.1 Densitatea Genelor i Amenajarea de gene care codific
proteine
Din numrul de gene i dimensiunea total a genomului drojdiei se
ajunge la o densitate a genei de aproximativ 2 kb pe cadru de
citire deschis. Acesta a stabilit c densitatea genelor n toti
cromozomii drojdiei este destul de asemntoare . Cu excepia
ORF-urilor contribuite de elementele Ty , ORF-urile ocup o medie de
70 % din secvenele . Acest lucru las doar un spaiu limitat pentru
regiunile intergenice care pot fi gndite s poarte elemente de
reglementare majore, implicate n ntreinerea cromozomilor,
replicarea i transcrierea ADN-ul.
Natura compacta a genomului S.cerevisiae se poate observa n
comparaie cu sistemele eucariote mai complex. De exemplu, genomul
elegans C. conine o poteniala gena ce codific proteinele numai la
5-6 kb [ Hodgkin i colab . , 1994 ] . n genomul uman , densitatea
genelor fusese estimata a fi de numai o singur gen n 30 kb [ Olson
, 1993 ] , dup ce proiectul de ordine este disponibil , aceast
figura este o gena in aproximativ 100 kb .
Diferena dintre cele dou gene de drojdie pare a se datora
faptului c , n drojdia de fisiune cca 40 % din gene conin introni ,
n timp ce numai o fraciune mic (mai puin de 5 % )din genele care
codific proteine din S. cerevisiae sunt prezise ( sau deja
demonstrate experimental ) ca vor fi ntrerupte de introni[ Dujon ,
1996 ] .
n ceea ce privete transcrierea genelor care codific proteine, o
varietate de elemente au fost identificate si caracterizate , care
sunt operative n iniierea transcrierii , de reglementare i
terminare . Nu toate genele de drojdie sunt precedate de o caset
TATA canonic , i rmne nc deschis ce tip de secvene AT - bogate sau
alte elemente pot aciona ca niste locuri de iniiere in
transcriptie. In unele cazuri , secvenele terminale au fost
definite , dar nici un consens general secvenele pot fi deduse .,
De asemenea, elemente de reglementare negative ( secvene de
reprimare din amonte ; URS ), s-a dovedit ca controleaza exprimarea
unor gene . Cu toate acestea , n doar cteva cazuri , idei precise
privind interaciunea intima dintre diferitele componente de
reglementare care mediaz expresia genelor au nceput s evolueze
.
Cunoaterea ntreagii secvene a genomului combinata cu puternice
instrumente genetice disponibile pentru
drojdie ar trebui s ncurajeze, acum, cercetarea de-a lungul
acestor linii .n general , ORF-urile par a fi mai degrab
distribuite n mod egal ntre cele dou componente ale cromozomilor
singuri . In unii cromozomi ( ex. I , II , VIII ) , exist un mic
exces de capacitate de codificare pe una dintre catene ,a carei
semnificaie nu este cunoscut .
Compoziia de baz medie a AND-ului de drojdie este de 38,4 % ( G
+ C ) . Cum era de ateptat ,proteina regiunilor de codificare are
un coninut GC mai mare , n medie ( 40,2 % ) dect n regiunile non-
codare ( 35,1 %) . In ferestrele glisante, regiunile de codificare
pot fi discriminate din regiunile intergenice , deoarece "
tranziiile " din coninutul GC sunt destul de agere la frontierele
lor . O distribuie aproape simetric a frecvenelor dinucleotidice se
poate observa peste ntregul cromozom, n timp ce compoziia de baz a
ORF-ului prezint un exces semnificativ de perechi omopurine pe
catena de codificare . n mod normal, regiunile de codificare sunt n
mod egal distribuite ntre cele dou componente . Mrimea medie a
ORF-ului este de 1450 bp . Dimensiunile medii a inter-regiunilor
ORF variaz ntre 630 i 945 pb pentru diferiti cromozomi , sunt 618
pb , n medie, pentru " promotori divergenti " ( 36,2% GC ) i 326 pb
pentru " terminatori convergenti " ( 29,3 % GC ) , n timp ce "
combinaiile promotor - terminator " ( 34,2 % GC) sunt n medie,517
pb n lungime.
5.2.5.2 Compoziia de baz i Densitatea Genelor
Compoziia medie de baz a fost gsita a fi simetrica de-a lungul
ntregului cromozom ( simetria fiind i mai evident in frecvenele
dinucleotidice ) , dar acest lucru reflect doar un numr aproape
egal de ORF-uri codificate pe fiecare fir de ADN a celor mai multi
cromozomi ai drojdie , compoziia de baza a ORF-urilor arata un
exces semnificativ de perechi omopurine pe suvita codificare [
Dujon et al . , 1994 ] .
Variaii regionale a compoziiei de baz cu amplitudini similare
s-au observat mai nti de-a lungul cromozomului III [ Sharp &
Lloyd , 1993 ] , cu vrfuri majore GC - bogate n mijlocul fiecarui
bra . Rezultatele cromozomului XI au confirmat aceast constatare,
dar din cauza dimensiunilor sale mai mari , a dezvaluit o
periodicitate aproape regulata a coninutului GC , cu o succesiune
de segmente GC - GC - bogate i srace . O observaie si mai
interesanta a fost c periodicitatea compoziional coreleaz cu
densitatea genelor locale , ajungnd la mai mult de 85 % n regiunile
bogate n GC , urmate de segmente gene cu densitatea comparabil mai
mic ( 50-55 % ) , n regiunile ATrich [ Dujon et al . , 1994 ] .
5.2.5.3 Elementele funcionale ale cromozomilor de drojdie
5.2.5.3.1 centromeri
Centromerii sunt locurile de formare a kinetoforilor i locul de
ataament cromozomal al axelor mitotice i meiotice [ Lechner i Ortiz
, 1996 ] . Din toate secvenele de ADN centromeric cromozomii
drojdiei mprtesc o structur comun , care se extinde doar peste
aproximativ 200 pb , contrar centromerilor mult mai mari n S. pombe
sau celule de mamifere , n cazul n care se ocup aproximativ 200 kb
.
5.2.5.3.3 Telomeres
Organizarea telomerilor drojdiei a devenit clara din lucrarea
lui E. Louis i a colaboratorilor su n combinatie cu secvenele
cromozomiale .
n schema din figura 5-16 , terminatiile primilor trei cromozomi
ce erau s fie finalizate sunt comparate . Secvene repetitive cu
similitudine ridicata la nivel de nucleotide sunt indicate de ctre
triunghiurile lumplute . ORF-urile sunt reprezentate prin sgei .
Secvenele telomerice consens sunt afiate n negru , infrastructura
lor [ Louis & Borts , 1995 ] este indicat n inserie ( nu trase
la scar ) .
Toti cromozomii drojdiei mprtesc caracteristici telomerice i
structuri subtelomerice.
Comparaiile dintre terminalele cromozomilor a artat c , n plus
fa de repetrile subtelomerice comune, ele au similitudini extinse n
regiunile subtelomerice : redundana genetica este regula de la
capetele de cromozomi ai drojdie . Regiunilor " duplicat " conin
copii ale genelor cu funcii cunoscute sau previzibile , precum i
mai multe produse ORF care prezint asemnare mai mare , dar funciile
lor rmn neclare deoarece nici-un omolog dintr-o funcie cunoscut nu
a fost gsit n bazele de date .
Din cauza structurii lor "deschise " , telomerii trebuie s fie
stabilizati i replicati de ctre un Sistemul telomeric specializat .
Telomerii drojdiei sunt formati din produsele genelor a trei gene
EST ( EST1 , EST2 , EST3 ) , prin care Est2p acioneaz ca subunitate
catalaytica , si o component RNA ( TLC1 ) care este folosita ca o
matrice n sinteza ADN-ului telomeric . In plus , replicarea
telomerilor este dependenta de:
( i)complexul TRF1 , constnd din Ku70 ( HDF1 ) i Ku80 ( HDF2 ),
proteine i interacioneaz cu Cdc13p , care este , de asemenea,
crucial pentru suvitele reparatoare ale AND-ului dublu non- omolog
si protejeaza telomerii fa de nucleaze i recombinaze ,
( ii ) un numr de proteine RAD ( RAD50 , RAD51 , RAD52 ) ,
( iii ) Sgs1p , o helicaz , prevenind din recombinarea de
letirious ntre secvenele telomerice ,
( iv ) i un numr de alte proteine .
n celulele telomere, telomerii progreseaza incet ( n aproximativ
60 de generaii ) si conduc la o scurtare a telomerilor si a
senescentei crescute . Zakian ( 1996) a discutat extrapolarea
informaiilor despre AND-ul telomeric al drojdie la mbtrnirea
celulele umane. Datele de la S.cerevisiae , de asemenea, sugereaza
ca abilitatea de a mentine lungimea telomerilor poate fi critica
pentru starea tumoroasa a celulelor de mamifere . Activitatea
telomerilor este modificat n cele mai multe tipuri de cancer .
5.2.5.4 Repetri complexe i simple
n general, genomul de drojdie este extrem de srac n secvene
repetate. Constelaia unica de secvene repetitive la cele dou capete
ale cromozomului I a fost deja subliniata. Aproximativ 30 kb din
fiecare regiune subtelomerica transporta gene similare ( dar
neeseniale ) i o repetare de 15 kb. Aceste caracteristici sunt n
concordan cu ideea c aceste regiuni terminale reprezint
echivalentul drojdiei cu heterochromatina i apariia acestui tip de
ADN sugereaz c prezena sa d acestui cromozom lungimea critic
necesar pentru stabilitatea i funcionarea corect . Regiunea 30 kb
poate fi ndeprtat din fiecare capt, fr a afecta creterea vegetativ
, dei stabilitatea cromozomului este redusa considerabil . Cel mai
probabil, aceste regiuni repetate care au fost observate ca
contribuie la dimensiunea polimorfisma a cromozomului I [ Bussey i
colab . , 1995]. Pe lng elementele Ty, ADNr-urile de pe cromozomul
XII sunt cele care contribuie cel mai mult la caracterul repetitiv
. Un grup de aproximativ 15 repetiii n tandem ( 2 KB fiecare )
coninnd gena CUP1 i care contribuie la variaia polimorf se gaseste
pe cromozomul VIII [ Johnston et al . , 1994 ] .
Exista intinderi repetate de oligonucleotide scurte. Acestea
includ tractele polilor ( A ) sau polilor (T), alternnd tracturile
polilor ( AT ) sau polilor ( TG ), i repetri lungi directe sau
inversate . Chiar si intinderile scurte a secvenei se repeta simplu
( TG1 - 3 ) n , n mod normal " etanarea " capetelor cromozomiale,
au fost uneori ntlnita in interiorul unor cromozomi . Acest tip de
repetiii interne sunt, probabil, relicve a unor evenimente din
timpul ruperii i vindecarii de cromozomi .
Prin aplicarea programului Pythia [ Milosavljevic & Jurka ,
1993 ] pentru a cuta repet simplu , am detectate cel puin 12 seturi
de trinucleotide repetate n mod regulat de-a lungul cromozomului II
, reprezentnd codoni repetati pentru anumiti aminoacizi, formnd
astfel ntinderi homopeptide . n unele cazuri, au rezultat modele de
aminoacizi chiar mai complexe ( Tabelul 5-3 ) . Un studiu
sistematic privind distribuia i variabilitatea repetarilor
trinucleotidei in genomul drojdiei a fost efectuat [ Richard &
Dujon , 1997 ] .
Repetri perfecte i imperfecte , de la patru la 130 de tripleti
au fost recunoscute i repartizarile unor combinatii triplet
diferite s-a dovedit ca difera ntre ORF i regiunile intergenice .
Examinarea diverselor tulpini de laborator evideniaz o variaie de
mrime polimorfa pentru toate repetri perfecte, comparativ cu o
lipsa de variaie pentru cele imperfecte . Aceste constatari sunt
deosebit de interesante n ceea ce privete faptul c mai multe boli
genetice umane sunt cauzate de expansiune trinucleotidelor.
Sistemul de drojdie poate oferi acum o abordare experimental pentru
a studia mecanismele de expansiune a lor .
5.2.5.5 Comparatie intre hrile fizice i genetice
Harta genetic de S. cerevisiae [ Mortimer i colab . , 1992 ] a
avut o valoare considerabil pentru biologi molecule de drojdie
nainte ca hrile fizice sa devena disponibile . Pe lng extinderea
local sau contracia hrii genetice, i faptul c frecvena global a
recombinarii meiotice creste cu scurtarea dimensiunii cromozomului,
ordinea genelor poziionate pe cromozomii de cartografiere genetic i
fizic sunt extrem de acord. Astfel, compararea hrii fizice i
genetice arat c cele mai multe dintre legturi au fost stabilite
pentru a da ordinea corecta a genelor , dar ca, n multe cazuri,
distanele relative derivate din cartografierea genetica sunt
imprecise .
Evident imprecizia hrilor genetice se poate datora faptului c
diferite tulpini de drojdie au fost utilizate n stabilirea
legturilor. Este chiar posibil ca unele tulpini folosite n
experimentele de cartografiere genetica arat inversiuni sau
transferuri care apoi ar putea contribui la discrepane dintre hrile
fizice i cele genetice. In mod clar, acurateea cartografierii
genetice va depinde de abordrile experimentale utilizate. Cu toate
acestea, un fenomen mai rspndit, care poate duce la imprecizie
hrilor genetice sunt polimorfismele tensometrice cauzate de
secvenele repetitive extinse sau genele subtelomerice duplicate dup
cum sa menionat mai sus, i n special de elementele Ty . n total,
experiena acumulat de la proiectul genomului de drojdie arat c
hrile genetice furnizeaza informaii valoroase , dar ca
cartografierile fizice independente i determinarea secvenelor
complete este necesar pentru a delimita n mod clar toate genele
de-a lungul cromozomilor . n acelai timp, diferenele constatate
ntre diferite tulpini de drojdie demonstreaz necesitatea de a
utiliza o tulpina speciala ca un sistem de referin.
5.2.5.6 Organizarea Genomumui i Aspecte evolutive
5.2.5.6.1 Redundana genetic n drojdie
ntruct o estimare a similaritatii secvenei ( att la nivel de
aminoacizi i nucleotide ) este acum posibil , ea rmne inca dificil
de corelat fizic complet la redundana funcional , deoarece chiar i
funciile genei de drojdie au fost definite cu precizie ntr-o msur
limitat . nelegerea adevratei naturi a redundantei va ajuta la
elucidarea rolului biologic a fiecarei gena de drojdie.
In multe cazuri, secvenele duplicate sunt limitate la aproape
ntreaga regiune de codificare a acestor gene i nu se extind n
regiunile intergenice . Astfel, produsele genei corespunztoare
mprtesc similaritatea ridicat n termeni de secven de aminoacizi sau
, uneori sunt chiar identice i , prin urmare , pot fi funcionali
excesivi . Cu toate acestea, dup cum indic diferenele de secven din
cadrul regiunile promotor , expresia genelor ar trebui s varieze n
funcie de natura elementelor de reglementare sau alte constrngeri (
de reglementare ) . Acest lucru a fost demonstrat experimental n
numeroase exemple ( Tabelul 5-4 ) .
Se poate foarte bine ca o copie a genei sa fie foarte exprimata
in timp ce o alta este exprimata umil. Deschiderea sau oprirea
expresiei a unei copii special din cadrul unei familii de gene
poate depinde de starea difereniat celulei ( cum ar fi tipul de
mperechere , spori, etc ) . Studiile biochimice , de asemenea, au
relevat faptul c , n cazuri speciale proteinele " redundante " se
pot substitui reciproc , astfel fiind lamurit faptul c o mare parte
din perturbrile genelor singure din drojdia de bere nu afecteaz
creterea sau provoca fenotipuri " anormale " . Acest lucru nu
implic, totui , c aceste gene redundante erau dispensabile
prioritar . Mai degrab au aprut prin necesitatea de a ajuta celule
de drojdie sa se adapteze la anumite condiii de mediu . Aceste
noiuni sunt de importan practic in efectuarea i interpretarea
experimentelor de ntrerupere a genei .
5.2.5.6.1.1 Genele dublate n regiunile subtelomerice
Exemple clasice de gene redundante n regiunile subtelomerice
sunt drojdiile MEL , Suc , MGL i Genele MAL , care au fost
menionate anterior . De fapt, tulpinile de drojdie difer de prezena
sau absena seturilor speciale ale acestor gene . De exemplu , trei
gene mapate pe cromozomul II, tulpinile de tip slbatic , MEL1 ,
SUC3 , i MGL2 , sunt absente de la tulpina S288C . O comparaie la
nivel molecular a S288C cu tulpina de drojdie de bere C836 a artat
n mod clar c genele SUC sunt prezente pe cromozomul II din ultima
tulpinia . n ceea ce privete genele implicate n metabolismul
carbohidrailor, prezena multiplelor copii ale genei pot fi
atribuite presiunii selective indus de domesticire uman , aa cum se
pare c acestea sunt n mare parte dispensabile n tulpinile de
laborator ( cum ar fi S288C ) care nu mai sunt utilizate n
procesele de fermentaie . Procesele de recombinare non- omoloage
pot fi responsabile pentru dublarea acestora i a altor gene care
locuiesc n regiunile subtelomerice [ de exemplu, Michels i colab .
, 1992 ] , care reflect structura dinamic a telomeriilor drojdiei n
general [ Dershowitz & Newlon , 1993 ] . Am menionat deja
faptul c regiunile subtelomerice a multor cromozomi ai drojdiei
impart segmente foarte conservate, n unele cazuri pn la 30 kb ,
care transporta genele duplicate ale cror funcii sunt n mare msur
necunoscute .
5.2.5.6.1.2 Genele de dublare interne ctre Cromozomii
In plus , exist o mare varietate de gene interne cromozomilor
care par s fi aprut din dublari , aa cum e sugerat de analizele
cromozomilor individuali. nainte ca secvenele complete a
cromozomilor sa devina disponibile , o mare varietate de gene au
fost cunoscute s apar n dou sau mai multe copii identice sau
aproape identice localizate la diferiti cromozomi , cum ar fi
genele histone , genele ribozomale de proteine , genele pentru
transportatorii ATP / ADP , pentru enzimele caii glycolytic ,
pentru zahr i transportori de aminoacizi , i pentru multe alte
proteine . Numeroase exemple pot fi acum adugate , atunci cnd
cromozomii finalizate sunt cutati pentru similitudini la nucleotide
, precum i la nivelul proteinelor . Acestea includ familiile
dispersate cu gene nrudite , dar non- identice mprtiate individual
peste muli cromozomi . Cea mai mare astfel de familie cuprinde 23
de gene PAU care specific aa-numitele seripauperine [ Viswanathan
et al. , 1994 ] , un set de proteine serin- saraci aproape identice
cu funcie necunoscut . Genele PAU locuiesc n regiunile sub-
telomerice . Familii de gene cluster sunt mai puin frecvente , dar
o mare familie de acest tip se produce pe cromozomul I unde ase
gene nrudite codifica un set de proteine membranare cu funcie
necunoscut [ Viswanathan et al . , 1994 ] . Alti 10 membrii ai
aceastei familii au loc pe cinci cromozomi suplimentari , uneii
sunt grupati , altii sunt mprtiati individual , nc altii sunt
situati n regiunile sub- telomerice .
5.2.5.6.1.3 Genele dublate n Clustere
Remarcabil , gene duplicate au fost , de asemenea, gsite n
clustere . Exist cel puin trei exemple de acest gen n cromozomul II
[ Feldmann i colab. , 1994 ] . Un alt caz este un grup de trei gene
hexoz transportate pe cromozomul VIII [ Johnston et al . , 1994 ] ,
care par a fi rezultatul unei duplicari de gen mai recenta. Mai
degrab cazuri unice ale dublri de gene sunt reprezentate de o mare
familie de gene grupate ( tandem ) de proteinele cu membrana pe
cromozomul I , i un grup mare de pe cromozomul VIII lng CUP1 . Gena
de codificare, metalotioneina de cupru CUP1, este coninut ntr-o
repetare de 2 kb, care include , de asemenea, un ORF cu functie
necunoscuta . Regiunea repetat a fost estimat sa se deschida la un
interval de 30 kb de tulpina S288C , care ar putea cuprinde 15
repetari , dar numrul de repetri variaz printre tulpinile de
drojdie .
5.2.5.6.1.4 Regiunile omoloage Cluster ( CHRs )
Un fenomen cu att mai surprinztor a devenit evident , atunci cnd
secvenele de cromozomi completi au fost comparate ntre ele ,
dezvluind c exist mari segmente cromozomiale n care genele omoloage
sunt aranjate n aceeai ordine , cu aceeai orientri transcripionale
relative , pe doi sau mai multi cromozomi . Apariia unor astfel de
regiuni omoloage Cluster ( CHRs ) este acum manifestata intr-o mare
parte a genomului de drojdie i ar putea reprezenta pentru unele
30-40 % din redundana total [ Goffeau et al , 1995; . Heumann &
Mewes , 1996 ] . Pentru a analiza msura i modelul redundanei
genomului de drojdie , o structur de date puternica ,HPT , a fost
dezvoltata la MIPS , permitand o comparaie toate - contra - toate a
blocurilor de dimensiuni fixe ale nuclotidelor rezultate care pot
fi vizualizate prin o interfa grafic care arat similariti att la
nucleotide cat i la nivelul de proteine . Figura 5-18 prezint un
exemplu din aceast analiz.
Cromozomi II i IV mprtesc cel mai lung CHR , care cuprinde o
pereche de regiuni pericentrice de 170 i respectiv , 120 kb , care
mprtesc 18 perechi de gene omoloage . Genomul a continuat s
evolueze de cand aceast dublare veche a avut loc : a avut loc
introducerea sau eliminarea de gene , elemente Ty i intronii au
fost pierdute i acumulate ntre cele dou seturi de secvene . In
total, cel puin 10 CHR-uri ( comune cu cromozomi II , V , VIII ,
XII , XIII i ) pot fi recunoscute pe cromozomul IV .
Remarcabil , ntreagul cromozom XIV poate fi mprit n mai multe
segmente care sunt gsite duplicate pe alti cromozomi .
O examinare mai atent a celor mai mari apte CHR-uri a artat c
acestea sunt compuse din "uniti " (scurte) fiecare coninand una sau
dou gene omoloage de codificare de proteine adiacente unei gena
ARNt . Acest lucru ar putea sugera c astfel de uniti au fost
asamblate nainte duplicarii ntregilor blocuri. S-ar putea chiar sa
se aibe n vedere posibilitatea ca astfel de uniti sa fi contribuit
la suprapuneri de-a lungul evoluiei . Mai izbitor, este faptul ca
exist un astfel de exemplu de susinere a unui astfel de regim.
Cromozomul XIV poarta doua copii ale genei tRNAIle2 n legtur cu dou
gene care codific proteina extrem de conservate , cu domiciliul n
dou segmente inversate de 4.2 kb, segmente separate cu24 kb de
secvena non- repetitive . In termeni de evolutie , acesta dublare ,
trebuie s fi avut loc recent , deoarece aceste segmente impart o
secven identical de 99 %. Din moment ce o mare parte din al XIV-lea
cromozom , inclusiv una dintre copiile genei tRNAIle2 este
duplicata pe cromozomul IX [ Philippsen et al . , 1997 ] , am
verificat dac regiunea adiacenta acestei gene ARNt pe cromozomul IX
a fost asemntoare regiunii de 4,3 kb de pe cromozomul XIV . Acest
lucru nu a fost sugerat, ca aceasta copie a genei tRNAIle2 a fost
amplificata n mod independent.
Dup cum sa menionat deja , Wolfe i Shields [ 1997 ] au definit
55 de blocuri de suprapunerile gene de cluster i au sugerat un
model destul de convingtor care explic omologiile extinse vzute n
drojdia de astzi prin( allo sau auto ) - tetraploidizare ntre dou
tulpini vechi de S. cerevisiae , urmate de translocatii reciproce i
stergeri de gene duplicate in proportii de 85 %. Acest punct de
vedere a fost confirmat prin compararea genomului Ashbya gossypii a
genei S. cerevisiae [ Dietrich et al . , 2004 ] i a unei analize
noi a duplicarilor din S. cerevisiae [ Woodfit & Wolfe , 2005 ]
.
5.2.5.6.1.5 Redundana i Organizaia Genelor
Cu toate acestea, ne putem imagina dou moduri in care se poate
sa fi aprut suprapunerile. n primul rnd , unele dintre genele
duplicate ar putea reprezenta genele prelucrate care au fost
inserate n genomul relativ recent , o vedere care este n concordan
cu conservarea secvenei numai n regiunile de codificare . Cu toate
acestea, toate aceste cazuri par s fi creat prin integrarea
intregului AND complementar , pentru c nici unul nu pare s fie
pseudo gene , iar acest lucru este neateptat n acest model . In
plus , o parte din perechile de gene omoloage includ introni n
ambele gene , ceea ce sugereaz c cel puin aceste gene nu au fost
dublate de acest mecanism .
n al doilea rnd , gruparea de gene duplicate i apariia de zone
similitudine extinse ne oblig s luam n considerare ideea c
regiunile genomice ntregi au fost dublate . Mai multe dintre
acestea evenimente duplicatoare par a fi vechi [ Wolfe &
Shields , 1997 ] , pentru c secvena de AND a deviat n mod clar n
afara regiunilor de codificare , n plus , astfel de grupuri par sa
imparta chiar i un numr de genele ARNt, ambele n acelai loc i
orientare . Cu toate acestea , suprapunerile pot aprea n orice
moment in timpul evoluiei [ Richard i Dujon , 1998 ] .
Oricare ar fi termenele i mecanismele de suprapunere relativ ,
aceste evenimente urmate de mutaii care afecteaz proprietile
funcionale da o ans de a duce la mbuntirea sanatatii mediului . Pe
de alt parte ,densitatea mare de gene in drojdie indic o tendin
puternic de a menine un genom compact , Prin urmare, mecanismele de
compensare trebuie s existe pentru a elimina copiile genelor
nefuncionale sau de prisos .
O problem interesant strns legata de evoluie este originea
modelului de organizare a genelor care s-a manifestat pn n prezent.
Am putea , de exemplu , gsi orice criteriu , fie structural sau
funcional n natura , care sa guverneze aranjamentul regional al
unor gene speciale ? Cu alte cuvinte , este acolo de-a lungul
cromozomilor drojdie o " grupare ordonata " de gene sau ne-a rmas o
succesiune aleatorie din majoritatea genelor ? n prezent , nu avem
multe indicii pentru a rspunde la aceste ntrebri . Cu toate acestea
, in ceea ce privete unele gene, avem indicii supra unei anumite
locaii sau grup de gene , i cteva exemple au fost deja menionate
mai sus . n mai multe cazuri, gene extrem de exprimate sunt gsite
asociate cu Elementele ARS , astfel nct s-ar putea specula c
replicarea i transcrierea eficient sunt strns cuplate . n
cromozomul XI , se pare c genele foarte exprimate apar n " clustere
" n regiuni preferate [ Dujon , pers . Commun . ] . In mod clar
,MAL i loci SUC , si locusul GAL reprezint exemple , n care genele
legate funcional implicate ntr-o anumit cale metabolic sunt strns
asociate ntre ele .
5.2.5.6.1.6 Variaia Sequence Printre tulpini de drojdie
ntrebarea: n ce msur tulpinile de drojdie difer n ceea ce
privete coninutul lor genetic implicit a fost deja atinsa. Am
discutat o serie de caracteristici care contribuie la formarea
polimorfismelor n diferite tulpini de drojdie : ( i) numr variabil
de copii de gene de la familii de gene repetate ; ( ii ) modele
individuale cauzate de prezena sau absena anumitor elemente Ty ; (
iii ) plasticitate cromozomului se termina . n toate aceste cazuri,
polimorfismul de asemenea, devine manifestat prin lungimi diferite
intre cromozomii corespunztri. n plus, excizii sau inversiuni
speciale ale regiunilor genei au fost observate pentru a da natere
la polimorfisme . Ruperea cromozomului a fost gsita n drojdia de
bere , care rezult n karyotipul ce se abat de la imaginea de
"normal" . Cu toate acestea, variaiile secvenei n regiunile de
codare de gene individuale par a fi rare , n msura n care putem
spune in urma comparaiilor secvenelor omoloage obinute din diferite
tulpini .
5.2.6 Familiile Genelor Drojdiei
5.2.7 Compararea genomului de drojdie cu alti genomi
Disponibilitatea secventei completa a genomului de drojdie nu
numai c a permis introspecia n organizarea i evoluia genomul n
drojdiea de bere , dar se extinde catalogul de gene noi detectate n
acest organism [ Stucka , 1992 ] . Multe dintre acestea pot avea o
valoare deosebit numai pentru biologii molecule de drojdie , dar de
interes general pot fi acelea care sunt omoloage cu genele care
ndeplinesc funcii difereniate n organisme multicelulare sau care ar
putea fi relevante pentru malignitate . Dei rolul acestor gene
trebuie nc s fie clarificat , drojdia , n unele cazuri, a servit ca
un sistem experimental util in identificarea funciei lor . Pe de
alt parte, bogia de informaii care urmeaz s fie ateptata cere n mod
clar ca noile rute sa fie explorate pentru a investiga functiile
genelor noi .
5.2.7.1 Conexiunea om- drojdie
Prin compararea catalogului de secvene umane disponibile n
bazele de date cu ORF-uri asupra cromozomilor drojdiei realizate la
nivelul aminoacizilor se estimeaz c peste 30 % din genele de
drojdie de bere au omologi printre genele umane . Cum era de
ateptat , cele mai multe dintre genele cu funcia cunoscut,
clasificata n acest fel reprezint funcii de baz n ambele organisme.
Mai multe asemnri devin evidente , cnd EST-uri sunt incluse n
analiz . Fr ndoial, protagonistele cele mai convingtoare printre
aceste omoloage sunt genele drojdiei care poart similitudini
substaniale cu " genele bolii " umane .
Studii comparative de-a lungul acestor linii au fost publicate [
Basset et al . , 1996 ] i sunt actualizate n mod regulat .
5.2.7.2 Alte organisme model
nainte de a elibera secvena complet a genomului de drojdie , dou
genomuri bacteriene complete au fost publicate , cele de H.
influencae i M. genitalium [ Fleischman et al , 1995; . . Fraser et
al , 1995 ]; un alt genomului procariot , cea Methanococcus
jannaschii , a fost lansat n acelai an [ Bult et colab . , 1996 ] .
Intre timp , secvenele unor multitudine de genoame bacteriene i
genoame archeal , precum si genoamele mai multor eucariote inclusiv
Schizosaccharomyces pombe , Caenorhabditis elegans , Drosophila
melanogaster , Arabidopsis thaliana , i Homo sapiens sunt
disponibile .
Fr ndoial, informaiile acumulate de la aceste proiecte ofer o
baz important pentru afla mai multe despre msura n care diferite
procese sunt conservate ntre organisme n diferite linii [ Miklos i
Rubin , 1996] .
O caracteristic remarcabil printre genele de specii diferite a
devenit evidenta destul de devreme n timpul diferitelor proiecte de
secventiere . Cnd gene intregi au fost supuse la cutri similaritate
asistate computerizate ntre cadrele de citire deschise , s-a
constatat c toate mprtesc un procent ridicat de gene orthologous (
Figura 5-19 ) i c redundanta genetica intraspecifica a fost de
aproximativ 30 % la minim , dar ar putea deveni la fel de mare ca
60 % , de exemplu, n C. elegans ( Figura 5-20 ) .
5.3 genomul Drojdie mitocondriale
De la descoperirea lui Ephrussi n 1949 a citoplasmaticelor
ereditare a mutanilor Petite ", cu deficit respirator,
Saccharomyces cerevisiae au fost n centrul geneticii mitocondriale.
Genele mitocondriale i structura lor mozaic intronic au fost
identificate pentru prima dat n S. cerevisiae i primele gene
mitocondriale esalonate au fost de la acest organism .
Genomul mitocondrial copiat multiplu de la S. cerevisiae este
caracterizat de o densitate sczut a genei i coninut ridicat de A +
T . Compoziia sa de baz este foarte eterogen , n timp ce coninutul
de G+ C al genelor este aproximativ 30 % , distanierele intergenice
sunt compuse din cvasi - pure ntinderi A + T ale mai multor sute de
perechi de baza , ntrerupte de peste 150 ( G+ C) clustere bogate ,
variind de 10-80 pb n lungime . Aceste trsturi explic de ce oamenii
de stiinta au structurat genele i neglijat regiunea intergenic.
Secvena complet a genomului mitocondrial de drojdie a fost
determinat de Foury i colab. [1998]. Genomul ( figura 5-21 ) conine
genele pentru subunitile citocrom c al oxidazei I , II i III ( cox1
, COX2 i cox3 ) , ATP subunitile sintaz 6 , 8 i 9 ( atp6 , atp8 i
atp9 ) , apocytochrome b ( cytb ) , o proteina ribozomala ( var1 )
i mai multe cadre de citire deschise legate de intronul ( ORF) .
COX1 i genele cytb conin mai multi introni , dintre care unele sunt
traduse , independent sau n cadru cu exoni lor n amonte, n plus ,
genomul mitocondrial conine originele replicilor ( ORI) elemente de
replicare i codificare 21S i 15S ARN ribozomal , 24 tRNAs care pot
recunoaste toti codonii , i ARN-ul 9S componenta de RNaz P. Toate
genele sunt transcrise din aceeai catena , cu excepia tRNAthr1 .
Aproximativ 10 000 de nucleotide sunt secvene noi , compuse n esen
de + lungi T ntrerupte de mai multe grupuri de G+ C genele atp6 ,
atp9 , COX2 , cox3 i tARN apar ca mici insule G+ C - mbogite n
mijloc de regiuni cluster bogat in A + T i P C. Celelalte vrfuri de
densitate mare G + C corespunde Clusterelor G+ C , limea lor fiind
n funcie de numrul acestora situate aproape una de alta .