1 ZENTRUM ANGEWANDTE CHEMIE INSTITUT FÜR LEBENSMITTELCHEMIE Prof. Dr. R. G. Berger/PD Dr. Ulrich Krings Callinstr. 5 30167 Hannover ++49-511-762-4583 ++49-511-762-4547 [email protected]Praktikum Bioprozesstechnik (Flüssigchromatographische Trennverfahren HPLC) Zeitraum: 22.08.2013 bis 30.08.2013 Praktikum jeweils geöffnet: 9.00 Uhr bis 17.00 Uhr Empfohlene Literatur Handbücher über Carotinoide Britton, G. (2004) Carotenoids: Handbook. Basel u.a.: Birkhäuser, pp.XI, [ca. 600 S.]. Britton, G., Liaaen-Jensen, S., and Pfander, H. (1995) Carotenoids. Volume 1B: Spectroscopy. Basel u.a.: Birkhäuser, pp.XVI, 360 S. HPLC-Lehrbücher Kromidas, S. (1997) HPLC-Tipps-Band 1. Darmstadt: Hoppenstedt Bonnier Zeitschriften, pp.170 S. Kromidas, S. (2003) HPLC-Tipps-Band 2. Darmstadt: Hoppenstedt Bonnier Zeitschriften, pp.352 S. Lottspeich, F., and Engels, J.W. (2006) Bioanalytik. Heidelberg: Elsevier (Spektrum Akademischer Verlag). Meyer, V.R. (2006) Praxis der Hochleistungs-Flüssigchromatographie. Weinheim: Wiley-VCH, pp.XII, 354 S. Rücker, G., Neugebauer, M., and Willems, G.G. (2008) Instrumentelle Analytik für Pharmazeuten. Stuttgart: Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft. Skoog, D.A., and Leary, J.J. (1996) Instrumentelle Analytik. Berlin, Heidelberg: Springer.
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Praktikum Bioprozesstechnik … · Abb.: Schematischer Aufbau einer HPLC-Anlage Kernstück der HPLC-Apparatur ist die chromatographische Trennsäule. Alle anderen ... Diese Methode
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Der ELSD dient zur Detektion UV-inaktiver Verbindungen (Kohlenhydrate, Lipide,
Steroide). Im Gegensatz zum RI-Detektor sind ELSDs gradientenfähig. Das HPLC-
Eluat wird mit Stickstoff vernebelt und in einem Verdampferrohr in ein Aerosol
umgewandelt. Die Partikelkonzentration wird über eine Streulichtmessung bestimmt.
Kopplungstechniken
Definition: 2 unterschiedliche Geräte, die auch für sich alleine analytische Aufgaben
durchführen können, werden über ein „Interface“ miteinander verbunden. Am
gebräuchlichsten ist die
LC/MS-Kopplung
Die LC/MS-Kopplung ist technisch schwieriger zu realisieren als die GC/MS-
Kopplung, da hohe Massenströme der mobilen Phase bewältigt werden müssen. Ein
Fluss von 1 mL pro min liefert 100 – 1000 mL Dampf (Gas). Für das
Massenspektrometer sind maximal 20 mL Dampf pro min tolerierbar, d.h.,
Hauptaufgabe des Interfaces ist die Abtrennung überschüssigen
Lösungsmitteldampfes. Alternativ kann mit extrem niedrigen Flussraten
chromatographiert werden. Im Direkteinlassverfahren (direct liquid introduction) wird
mit Flussraten von ~ 20 µL min-1 und Säulendurchmessern von 0,5 mm (Mikro-
HPLC) gearbeitet. Bei den Interface-Systemen dominieren aktuell 2 Typen:
Elektrospray-Interface (ESI) Atmospheric Pressure Chemical Ionisation (APCI)
Weitere Kopplungstechniken:
LC/IR: Nur in Kombination mit Fourier-Transformation. Problem: Küvettenmaterial ist
meist nicht beständig; die meisten Lösungsmittel zeigen IR-Banden im analytisch
relevanten Bereich.
LC/NMR: Früher: Problem der deuterierten Lösungsmittel (z.B. D2O) oder
protonenfreier Eluenten (CCl4). Heute ist die automatische Unterdrückung der
Lösungsmittelsignale möglich; man unterscheidet „on-flow“ und „stopped-flow“-
Verfahren.
LC/GC: Anwendung nur in der Normalphasen-LC, da hier wasserfreie
Eluentensysteme Verwendung finden; ungeeignet für ionische oder schwer flüchtige
Analyten.
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Chromatogramm/Säulenparameter
Als Maß für die Leistungsfähigkeit einer HPLC-Säule dient die Trennstufenzahl N
(„theoretische Böden“). Sie wird aus der Gleichung
2
16w
tN R berechnet, wobei w1/2 die Breite des Peaks auf halber Höhe
bezeichnet und tR die Retentionszeit der betreffenden Substanz angibt.
Die Peaksymmetrie (bzw. Asymmetrie) AS errechnet sich gemäß A
BAS
bei 10 %
Peakhöhe. Eine wichtige Kenngröße für das chromatographische Verhalten eines
Analyten ist der sogenannte Retentions- oder Kapazitätsfaktor k. Dieser kann direkt
aus der gemessenen chromatographischen Totzeit und der jeweiligen Retentionszeit
bestimmt werden: 0
0
t
ttk R . Ein Maß für die Trennung zweier benachbarter Peaks
ist die Auflösung (Resolution) R. R beschreibt, in wie weit zwei Peaks überlappen.
Nach Ermittlung der Nettoretentionszeiten (tN = tR – t0) und der Halbwertsbreiten
kann die Auflösung R wie folgt berechnet werden:
(1) 1/2(2) 1/2
176,1
ww
tR N
Für eine Auflösung von R = 1 überlappen zwei Peaks um 3 %. Etwa mit dem Wert
R = 1,3 sind zwei Peaks bis zur Grundlinie voneinander getrennt
(„basisliniengetrennt“). Neben der Auflösung kann auch das Verhältnis der
W1/2
A B
Injektion
t0 tR1
tR2
Peak 1 Peak 2
10 % Peakhöhe
10
Kapazitätsfaktoren zweier benachbarter Peaks („Selektivität“ 1
2
k
k) Auskunft über
das erzielte Trennergebnis geben.
2 PRAKTISCHE AUFGABEN
Geräte und Hilfsmittel
Messzylinder
Stoppuhr
2.1 Flusskonstanz (Vorversuch für alle)
Mittels Messzylinder und Stoppuhr wird der Fluss unter den Bedingungen des
jeweiligen Versuches (isokratischer Modus) bei zwei unterschiedlichen Flussraten
(z.B. 0,2 und 1 mL min-1, 10 min) bestimmt.
2.2 Bestimmung von Konservierungsstoffen
Bestimmung von Konservierungsstoffen
Grundlagen
Diese Methode gestattet die Bestimmung der Konservierungsstoffe Benzoesäure,
Sorbinsäure, pHB-Methylester, pHB-Ethylester und pHB-Propylester in fettarmen
Lebensmitteln.
Prinzip der Methode
Die Konservierungsstoffe werden mit einer Extraktionslösung – bestehend aus
Ammoniumacetat-Lösung, Essigsäure und Methanol, - deren pH-Wert so eingestellt
ist, dass eine mögliche Dissoziation zurück-gedrängt wird (warum?), im
Ultraschallbad aus dem Lebensmittel extrahiert. Trübe Extrakte werden geklärt; bei
nicht trüben Extrakten ist eine Membranfiltration anstelle der Klärung ausreichend.
Nach Trennung an einer RP-C18-Phase mit Hilfe der HPLC erfolgt die Bestimmung
mittels UV-Detektion simultan bei 235 nm.
Geräte und Hilfsmittel
Flüssigchromatograph mit UV-Detektor und Auswerteeinheit
Trennsäule: RP-18 monolithische Säule, 5 µm, 100 x 4 mm
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Autosampler
Membranfilter: Porenweite 0,45 µm
Ultraschallbad
Becherglas: 50 mL
Messkolben: 100 mL
Vollpipetten: 1 mL, 5 mL, 10 mL
Faltenfilter
pH-Papier oder pH-Messgerät
Glasstab
Chemikalien (p. a.)
Methanol (HPLC grade)
Essigsäure: 96%ig (Eisessig)
Ammoniumacetat CH3COONH4
Ammoniumacetat/Essigsäure-Pufferlösung:
1000 mL Ammoniumacetat-Lösung (0,01 mol L-1) mit Eisessig pH-Wert von
4,5 - 4,6 einstellen
Extraktionslösung:
60 Volumenanteile Ammoniumacetat/Essigsäure-Pufferlösung mit 40
Volumenteilen Methanol mischen.
Carrez-Reagenz I und II
Carrez-Reagenz I: 1,5 g Kaliumhexacyanferrat (II) in VE Wasser lösen und auf
10 mL auffüllen.
Carrez-Reagenz II: 2,3 g Zinkacetat in VE Wasser lösen und auf 10 mL
auffüllen.
Benzoesäure
Sorbinsäure
pHB- Methylester, pHB-Ethylester, pHB-Propylester
Obstsaft
Durchführung
a) Methodenoptimierung
Bereiten Sie jeweils folgende Stammlösungen: Benzoesäure, Sorbinsäure und
p-Hydroxybenzoesäure-Methylester (pHB-Methylester) (jeweils 200 mg L-1 in
40 %igem (v/v) Methanol).
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Bereiten Sie aus den Stammlösungen eine Referenz-Mischung mit c =
50 mg L-1 (pro Konservierungsstoff) und chromatographieren Sie die Mischung
mit den Elutionsgemischen 1-3 (s.u.) und beurteilen Sie die jeweilige
Trennleistung.
Als Eluenten (isokratisch) dienen:
Methanol (HPLC grade)
Ammoniumacetatlösung, wobei der pH-Wert mit Eisessig exakt auf 4,5-4,6
einzustellen ist.
Versuch 0,01 M Ammoniumacetatlösung (VT) Methanol (VT)
1 40 80
2 50 40
3 90 40
VT = Volumenteile
Flussrate: 1,2 mL min-1; Detektionswellenlänge: = 235 und 259 nm
Injektionsvolumen: 20 µL;
b) Qualitative Bestimmung
Bereiten Sie für jeden Konservierungsstoff jeweils eine 50 mg L-1 Lösung vor,
welche zur Bestimmung der Retentionszeit des jeweiligen Analyten dient. Nach
der Probenaufarbeitung bestimmen Sie den Konservierungsstoff in Ihrem
jeweiligen Obstsaft (s.u.).
c) Probenaufarbeitung und quantitative Bestimmung
Bei flüssigen Proben (wie z. B. Obstsäften) werden 10 mL direkt in einen
100 mL-Messkolben pipettiert und mit Extraktionslösung auf ein Volumen von
etwa 80 mL ergänzt. Der Kolbeninhalt wird zur Klärung mit je 1 mL der Carrez-
Reagenzien I und II versetzt, nach jeder Zugabe gut gemischt und mit
Extraktionslösung bis zur Marke aufgefüllt. Nach dem Durchmischen wird die
Lösung durch ein Faltenfilter filtriert (Vorlauf verwerfen!) und – falls erforderlich
nach Membranfiltration – zur HPLC-Analyse eingesetzt.
Bereiten Sie aus den Stammlösungen des unter b) qualifizierten
Konservierungsstoffs in der Saftprobe, jeweils 10 mL Standardlösungen der
folgenden Konzentrationen vor:
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10 mg, 15 mg, 25 mg, 35 mg und 50 mg L-1 in Methanol/Wasser-Gemisch (40
+ 60, v/v). Geben Sie die Ausgleichsgerade und den Regressionskoeffizienten
an.
Überprüfen Sie die Reproduzierbarkeit (besten Eluenten, s.o. verwenden) der
Einzelwerte und der Ausgleichsgeraden anhand von 3 Wiederholmessungen.
Verwenden Sie die gemittelten Einzelwerte zur Erstellung Ihrer
Kalibriergeraden.
Auswertung
Ermitteln Sie anhand Ihrer Kalibriergeraden den Konservierungsstoffgehalt der
Saftprobe!
Beurteilen und diskutieren Sie den Einfluss des Elutionsgemisches auf die
Trennleistung! Was würden Sie tun wenn zwei Substanzen coeluieren?
Geben Sie alle nötigen Parameter zur Beurteilung der Methode und
Trennleistung (A, B, w1/2, t0, tR, N, As, k, R, α) für alle drei verschiedenen
Konservierungsstoffe und die drei Eluenten tabellarisch an.
2.3 Carotinoidbestimmung
Grundlagen
Diese Methode gestattet die Bestimmung von ß,ß-Carotin in Tomaten- oder
Paprikamark und dient zur Untersuchung der Unterschiede vor und nach Verseifung.
Geräte und Hilfsmittel
Flüssigchromatograph mit UV-Detektor und Auswerteeinheit
Trennsäule: RP-18, 5 µm, 250 x 4 mm
Mixer
Küchenmesser
Scheidetrichter (250 mL)
Rotationsverdampfer
Stehrundkolben (250 mL)
250 mL oder 500 mL Rundkolben
Korkring
Messkolben
Faltenfilter
Glaswolle
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Chemikalien (p. a.)
, -Carotin
Dichlormethan (HPLC grade)
Methanol (HPLC grade)
Ethanol
Pentan/Ether
Diethylether
Butylhydroxytoluol (BHT)
Natriumsulfat
30% ige Methanolische Kaliumhydoxidlösung
Natriumchlorid
Tomatenmark, Paprikamark
Bereiten Sie eine , -Carotin-Stammlösung (c = 50 µg mL-1) im
Lösungsmittelgemisch Methanol/Dichlormethan (1/1 v/v) mit 0,1 g L-1 BHT
(tert. Butylhydroxytoluol) vor.
Kontrollieren Sie den -Carotin-Gehalt Ihrer Stammlösung anhand einer
photometrischen Messung in einem geeigneten Lösungsmittel (Einführung
durch den Assistenten)! Für die Berechnung verwenden Sie das Lambert-
Beersche Gesetz. Der molare Extinktionskoeffizient für -Carotin beträgt
140.400 L mol-1 cm-1 (Ethanol, 450 nm).
Bereiten Sie aus der Stammlösung Standardlösungen mit jeweils 1, 5, 10, 15
und 20 µg mL-1 im Lösungsmittelgemisch Methanol/Dichlormethan/BHT
1/1/0,1 (v/v/w). Geben Sie die Ausgleichsgerade und den Regressions-
koeffizienten an.
HPLC-Analyse (Nucleodur 100-5 ec C18-Phase, 5 µm, 250 x 4mm)
Die Elution des -Carotins erfolgt mit folgenden Eluentengemischen:
(v/v) Methanol Dichlormethan n-Hexan
Eluent A 95 2,5 2,5
Eluent B 55 22,5 22,5
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im Gradientenmodus:
Zeit [min] % A % B
0 100 0
5 100 0
40 0 100
45 100 0
Injektionsvolumen: 20 µL, = 450 nm, Flussrate: 1,0 mL min-1.
Diskutieren Sie ihre Kalibrierung hinsichtlich Linearität und Aussagekraft (für
diese Analytik) und statistische Signifikanz. Können Sie aus der ermittelten
Kalibrierfunktion die Nachweisgrenze für -Carotin abschätzen?
Extraktion eines Obst/Gemüse-Mixes
Je 2 g Tomaten- oder Paprikamark mit ca. 20 mL H2O gelöst. Das Gemisch wird in
einem Scheidetrichter zweimal mit je 100 mL Pentan/Ether (1:1,12) ausgeschüttelt.
Die vereinigten Extrakte werden über Glaswolle filtriert, über Natriumsulfat getrocknet
und durch ein Faltenfilter in einen Rundkolben filtriert. Nach weitgehender Entfernung
des Lösungsmittels am Rotationsverdampfer (Einführung durch Assistenten) werden
letzte Reste mit Stickstoff abgeblasen. Der ölige Rückstand wird in 2 mL Ethanol abs.
gelöst, mit Stickstoff erneut bis fast zur Trockene eingeengt und schließlich in 20 mL
Diethylether aufgenommen.
a) Verseifung
10 mL der etherischen Carotinoidlösung werden in einem Stehrundkolben mit
Diethylether auf 100 mL aufgefüllt und mit 10 mL methanolischer KOH-Lösung
(30 %ig w/w) versetzt. Man lässt über Nacht stehen und wäscht anschließend in
einem Scheidetrichter 3 mal mit je 100 mL H2O (beim ersten mal nur vorsichtig
schwenken, zur Phasentrennung ggf. Ethanol oder Kochsalz zugeben). Der Extrakt
wird über Na2SO4 getrocknet, filtriert und am Rotationsverdampfer fast bis zur
Trockene eingeengt. Reste des Lösungsmittels werden im Stickstoffstrom entfernt
und der Rückstand in 2 mL Methanol/Dichlormethan/BHT 1/1/0,1 (v/v/w)
aufgenommen.
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b)
Die 10 mL der etherischen Carotinoidlösung, die nicht zur Verseifung eingesetzt
wurden, werden zur Trockene eingeengt. Reste des Lösungsmittels werden im
Stickstoffstrom entfernt und der Rückstand in 2 mL Methanol/Dichlormethan/BHT
1/1/0,1 (v/v/w) aufgenommen.
Auswertung
Führen Sie die HPLC-UV-Analyse des verseiften und unverseiften Carotinoid-
Extraktes unter o.g. Bedingungen durch. Analysieren Sie anschließend interessante
Peaks anhand der parallel aufgenommenen DAD-Spektren und identifizieren Sie
diese mit Hilfe der Literatur (Britton).
Schätzen Sie die jeweiligen Gehalte anhand der für β,β-Carotin ermittelten
Kalibrierfunktion ab und beurteilen Sie die „Richtigkeit“ dieses Verfahrens über
Vergleiche mit erwarteten Carotingehalten.
2.4 Tocopherolbestimmung
Grundlagen
Diese Methode dient zur Beurteilung der -Tocopherol Konzentration in zwei
verschiedenen Speiseölen mittels Standardaddition.
Geräte und Hilfsmittel
Flüssigchromatograph mit Floureszenzdetektor und Auswerteeinheit
Trennsäule: Nucleosil 100-5 (Machery-Nagel), 5 µm, 250 x 4 mm
Messkolben (10 mL)
Chemikalien (p. a.)
-Tocopherol
Methanol/Ameisensäure (99,5 %/0,5 %) (v/v))
Diethylether
Speiseöl
Durchführung
40 mg -Tocopherol werden in einem 10 mL Messkolben in
Methanol/Ameisensäure (99,5 %/0,5 %) (v/v) gelöst und bis zur Marke
aufgefüllt (Stammlösung). Aus der Stammlösung werden verschiedene
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Kalibrierpunkte (1,0; 2,0; 4,0; 6,0; 8,0 mg/mL) in Methanol/Ameisensäure
(99,5 %/0,5 %) (v/v) Referenzlösung hergestellt:
Die HPLC-Analyse erfolgt an einer Kieselgelphase mit
Methanol/Ameisensäure (99,5 %/0,5 %) (v/v) als Fließmittel (isokratisch);
Injektionsvolumen: 20 µL; Fluss: 1,0 mL min-1, em = 289 nm, ex = 331 nm,
25 °C. Zwischen den Messungen wird erst mit Methanol/Ameisensäure (99,5
%/0,5 %) (v/v) 5 min lang gespült und im Anschluss die Säule 15 min lang
mit Methanol/Ameisensäure (99,5 %/0,5 %) (v/v) equilibriert.
Zur Bestimmung des -Tocopherolgehaltes in zwei verschiedenen Speiseölen
werden jeweils ~ 1 g des zu untersuchenden Öls genau in einen 10 mL
Messkolben eingewogen und mit n-Hexan bis zur Marke aufgefüllt. Diese
Lösung wird direkt zur HPLC-Bestimmung unter o.g. Bedingungen verwendet.
Zur Identifizierung des -Tocopherolpeaks werden dem 500 µl des Öls mit je
500 µl Referenzlösung (a) 4,0 mg/mL und b) 8,0 mg/mL) vermischt und mittels
HPLC analysiert.
Es sollen Dreifachbestimmungen durchgeführt werden.
Auswertung
Die Quantifizierung erfolgt über ein Standard-Additionsverfahren. Hierbei
werden unterschiedliche Mengen von einer Tocopherol-Standardlösung zu
einer konstant gehaltenen Menge Öl-Lösung zudosiert.
Welche alternative Quantifizierung könnte man verwenden? Wie ließe sich die
Sicherheit der Identifizierung von -Tocopherol erhöhen?
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Allgemeine Angaben zu Versuchsprotokollen – Institut für Lebensmittelchemie Prinzip
In 2-3 Sätzen darstellen, worum es bei dem Versuch geht und was das Versuchsziel ist Durchführung
Die Durchführung des Versuches ist bereits im Skript angegeben. Stellen Sie hier nur wesentliche Abweichungen dar. Die Abweichungen sollten nachvollziehbar sein und begründet werden. Rohdaten
Hier sind sämtlich experimentellen Daten wie Einwaagen, Verbrauch an Maßlösung, Verdünnungen, Chromatogramme, Spektren etc. anzugeben bzw. darauf zu verweisen (Chromatogramme können auch in einen Anhang gegeben werden) Auswertung und Berechnung
Hier muss schlüssig aus den Rohdaten das Ergebnis abgeleitet werden (ggf. mit Strukturformeln und Reaktionsgleichungen). Insbesondere sind sämtliche Berechnungen, die zum Ergebnis geführt haben, nachvollziehbar darzustellen! Ergebnis/Schlussfolgerung/Diskussion
Was ist das Versuchsergebnis und wie ist diese zu Bewerten? Fallen beim Vergleich mit literaturbekannten Werten Unterschiede auf? Wie kommen die Unterschiede zustande? Literatur
Angabe der verwendeten Literatur. Bitte verwenden Sie vertrauenswürdige Quellen; ausschließliches ‚googlen‘, bzw. kopieren von ‚Wikipiedia‘ Artikeln wird nicht akzeptiert! Verwenden Sie die im Praktikumsskript angegebene Literatur, bzw. Literatur aus der TIB! Anhang
Hier kommen evtl. Chromatogramme, Spektren o. ä. rein Anmerkung
Quellen müssen korrekt zitiert werden! Achten Sie beim Protokoll auf eine kurze und prägnante Darstellung von Sachverhalten (keine ‚Ich‘-form, keine seitenlangen Diskussionen)