HPLC Praktikum 1 HPLC Praktikum Skript Assistenten: Tatiana Pimenova (HCI D 330, 3 41 45, [email protected]) (HCI H 322, 2 29 46, [email protected]) 1. Theorie 1.1 Allgemeines Prinzip von Trennmethoden 1.2 Chromatographische Methoden 1.3 Verteilungsisothermen und chromatographisches Verhalten von Komponenten 1.4 Chromatographische Parameter (Retention, Totzeit, Kapazitätsverhältnis, Anzahl theoretischer Trennstufen) 1.5 HPLC 2. HPLC Gerät 2.1 Der verwendete Chromatograph 2.2 Anwendung von Gerät für „Single Run“ Messungen. 3. Aufgaben 3.1 Einfluss der Laufmittelzusammensetzung: Qualitative Interpretation des Chromatogrammes einer homologen Phenon-Reihe 3.2 Konzentrationsbestimmung einer unbekannten Acetophenonlösung mittels internem Standard 3.3 Quantitative Analyse von Coffein in verschiedenen Getränken 4. Grössenausschluss-Chromatographie 4.1 Theorie 4.2 Experimente
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HPLC Praktikum Skript - · PDF fileHPLC Praktikum 3 1.2 Chromatographische Methoden. Chromatographie - physikalische Trennmethode, bei der die zu trennenden Komponenten zwischen einer
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Bei „Time Program“ kann man die Zeit des Experiments einsetzen. Nach dieser Zeit können in
Fällen von kombinierter Analyse die experimentellen Bedingungen gewechselt werden. In
unseren Versuchen ist das die Zeit, nach der das Experiment abgebrochen wird.
5 In Menü „Method“ „PDA Setup“ wählen (Diode Array Detektor).
Bei „General“ definiert man die Randbedingungen des Detektors:
„Start wave length (nm)“, „End wave length (nm)“
Messzeit des Detektors – nach dieser Zeit misst der Detektor nicht mehr.
Eingestellte Parameter speichern : „Save method“.
6 „Single Run“-Knopf drücken und die Parameter einstellen: Beim Wechseln der Methode
müssen die Parameter neu eingestellt werden.
7 Nach dem Ende Messung sollten noch Integration und Analyse durchgeführt werden. Dazu
müssen die Parameter „Width“ und „Threshold“ eingestellt werden.
„Width“ – Breite des schmalsten Signals. Schmalere Peaks werden unterdrückt.
„Threshold“ – Höhe des kleinsten Signals. Kleinere Peaks werden unterdrückt.
Wenn beide Parameter eingestellt sind, im Menü „Method“ „Analyse“-Prozedur wählen. Dann
sieht man die Werte der Retentioszeit tR.
9. Bei „Custom Report“ unter dem „Method“-Menü bekommt man einen Bericht mitChromatogramm und Peaktabelle (Retentionszeit und Peakflächen). Der Bericht sollte für die
statistische Auswertung der Daten ausgedruckt werden.
HPLC Praktikum 10
O
Acetophenon
3.1. Einfluss der Laufmittelzusammensetzung: Qualitative Interpretation des
Chromatogrammes einer homologen Phenon-Reihe
Vorgehen
Eine verdünnte Lösung von Acetophenon, Propiophenon, n-Butyrophenon und n-Valerophenon
steht für den Versuch bereit (je 1-3 Tropfen/100ml Laufmittel, 50% CH3CN, 50% H2O).
Die Zusammensetzung des Laufmittels beträgt :
a) 50% CH3CN und 50% Wasser (METHODE: PHE50.MET)
b) 60% CH3CN und 40% Wasser (METHODE: PHE60.MET)
c) 70% CH3CN und 30% Wasser (METHODE: PHE70.MET)
Bei der Detektionswellenlänge von 250 nm und einer Flussgeschwindigkeit von
1 ml/min sollen je 1 Chromatogramm aufgenommen werden. Beim Wechseln des Laufmittels
sollte jeweils 5-10 Minuten gespült werden.
Fragen
1) Wie verändern sich die Retentionszeiten von a) nach c)? Diskutiere den Einfluss der
Konzentration von Acetonitril bei der RP-Chromatographie.
2) Für alle Chromatogramme sollen die folgenden chromatographischen Parameter aus den Daten
ermittelt werden :
Parameter Definition
Die Retentionszeit (tRi) Nach Custom ReportDie Netto-Retentionszeit (tR‘i) tR' = tR − t 0Die Kapazitätverhaltnisse (k‘i)
k' i =tRi − t0t0
Die relativen Retentionen (aij)ai j =
k' jk' i
Die Trennstufenzahlen (Ni)N = 16
tRwb
2
Die Auflösungen (Rij) Ri j =2(tR2 − tR1)
wi + wjAnnahme t0 = 1min bei 1ml/min,
w ist die Peakbreite in min, relative Retentionen und Auflösungen nur zwischen benachbarten
Peaks.
HPLC Praktikum 11
3.2 Konzentrationsbestimmung einer unbekannten Acetophenonlösung mittels internem
Standard
Vorgehen
Die Konzentration einer „unbekannten“ Acetophenonlösung soll mit Propiophenon als internem
Standard ermittelt werden.
Folgende Kalibrierlösungen (jede im 10 ml Kolben) im Laufmittel (50% CH3CN, 50% H2O) mit
gleicher Konzentration von internem Standard von 20 mg/l Propiophenon und verschiedene
4.1 Theoretischer Hintergrund der Größenausschluss-Chromatographie
(Size Exclusion Chromatography, SEC)
Die SEC ist eine spezielle Art der HPLC, bei der die Analyten aufgrund ihrer Grösse und nicht,
wie bei allen anderen flüssigchromatographischen Methoden wegen ihren spezifischen
Wechselwirkungen mit der stationären Phase getrennt werden. Die Analyten diffundieren in die
Poren der Säulenmaterials (typischerweise Teilchen der Grösse 3-10µm mit einer Porengrösse von
50 - 106Å) wobei kleine Verbindungen tiefer in die Poren eindringen können als grössere und somit
eine längere Verweildauer auf der Säule besitzen. Jede Säule ist gepackt mit Teilchen deren Grösse
sich in einem engen Bereich bewegt, so dass sich nur Moleküle innerhalb eines gewissen
Grössenintervalls mit einer bestimmten SEC-Säule auftrennen lassen. Bei der SEC werden grosse
Moleküle zuerst eluiert, kleine Verbindungen dagegen besitzen höhere Retentionszeiten. Eine Säule
kann nur Verbindungen innerhalb eines gewissen Grössenintervalls trennen (abhängig von der
Porengrösse der staationären Phase). Die untere Grenze von keinen Verbindungen wird als
Permeationsgrenze (permeation limit), die entsprechende obere als Ausschlussgrenze (exclusion
limit) bezeichnet
Grosse Verbindungen wandern schnell durch die SEC-Säule
Kleine Verbindungen wandern langsam durch die SEC-Säule
HPLC Praktikum 14 Experimenteller Aufbau
Der experimentelle Aufbau für SEC-Experimente ist identisch mit dem der HPLC bis auf die
Tatsache, dass für die Trennung eine spezielle Säule verwendet wird.
In unseren Experimenten wird eine Waters Ultrahydrogel 120 column (300 mm × 7.8 mm) mit
hydroxyliertem Polymetacrylat als Stationäre Phase verwendet.
Kalibrierung
Die Grössenausschluss-Chromatographie-Säule muss mit Verbindungen bekannter molekularer
Grösse kalibriert werden. Aus Gründen der Übereinstimmung, sollten Verbindungen mit einer
ähnlichen Struktur für die Erstellung einer Kalibrierkurve verwendet werden. Eine SEC-Säule kann
kalibriert werden, indem man das Elutionsvolumen (oder die Retentionszeit) der Signale einer Serie
von Kalibirerstandards gegen die jeweiligen Molekulargewichte der Standards aufträgt (z. B.
Polystyrol 600-30 000 000 Da, Polyethylenglycol 106-20 000 Da).
HPLC Praktikum 15
C
H
2
C
H
3
C
O
O
H
C
H
2
C
H
2
C
O
O
H
C
H
3
n
n
npolymerization
a.
b.
4.2 Experimente 4.2.1 Kalibrierung der Säule mit Polymethacrylsäuren
Die Struktur von Polymethacrylsäure ist unten dargestellt, zusammen mit dem entsprechenden
Monomer.
Durchführung der Kalibrierung
1. Man stellt drei Standards von Polymethacrylsäure (PMA) mit MG 1270 Da, 4030 Da und 5880
Da her. Man gibt 10 mg (Spatelspitze) des Polymers in ein Eppendorf-Gefäss (V = 1.5 ml) und
gibt 0.7 ml H2O (Milli Q) zu. Die Lösungen werden vor der SEC-Analyse durch einen PVDF
Filter (0.45 µm Porengrösse, Whatman) filtriert.
2. Die Proben werden in das SEC eingespritzt. Das Experiment wird insgesamt zweimal
durchgeführt.
3. Anschliessend wird eine Kalibirerkurve gezeichnet (X-Achse = Retentionszeit; Y-Achse =
Molekulargewicht des PMA)
4.2.2 Messung eines Huminsäurestandards
Huminsäure sind komplexe, aromatische Macromoleküle deren aromatische Einheiten durch Aminosäuren, Aminozucker, Peptide und aliphatische Verbindungen miteinander verknüpft sind. Die hypothetische Struktur der Huminsäure in der Abbildung enthält freie und gebundene OH-Gruppen, Chinon-Einheiten, Stickstoff und Sauerstoff als verbrückende Atome und Carboxylat-Gruppen welche an die aromatischen Ringe gebunden sind. Huminsäure (humic acid, HA) bildet sich im Boden während des Abbaus von organischem Material
1. Es wird eine Lösung von einem Huminsäure-Standard hergestellt (Acros oder Aldrich).
2. Die Lösung wird durch einen PVDF Filter filtriert (0.45µm Porengrösse, Whatman).
3. Die Probe wird in das SEC-Instrument eingespritzt. Die Messung wird einmal wiederholt.
4. Die Grössenverteilung der Probe wird durch Vergleich mit der Kalibrierkurve ermittelt.
HPLC Praktikum 16
Richtlinien für den Bericht: HPLC
Ihr solltet den Bericht so verfassen, so dass ihr in einem Jahr immer noch wisst, was ihr gemacht habt undden Versuch wiederholen koenntet.
1.Theorie (nicht seitenweise aber die Grundlagen), ca eine Seite
HPLC: was ist das, warum macht man es, was braucht man dazu, wie funktioniert es?
Chromatographische Parameter erläutern, z.B. Totvolumen, Verteilungskoeffizient
2. Ziel des Versuchs + Durchführung
Gerät, Typ, Säule, Laufmittel, Detektor
Angabe aller Messparameter! (Geräteeinstellungen, Laufmittelzusammensetzung, Flussgeschwindigkeit...)
Immer Konzentrationen der verwendeten Lösungen angeben!!!! Dazu die Tabellen im Skript verwenden.
3. Ergebnisse und Diskussion
Angabe von Retentionszeiten und allen Flächen in Tabellen
u.a. Vergleich interner und externer Standard (coffein und Acetophenonversuch, warum gibt es welcheUnterschiede?
Welche Art Spektren wurde aufgenommen?
Angaben der Werte z.B. 5±3 g/L (log. Standard deviation) mit ob. + unt. Vertrauensbereich angeben.
Kalibration+Fehlergeraden aus Matehmatica in den Bericht einfügen (Achsen beschriften).
Diskussion der Ergebnisse (evtl. Vergleich mit Literaturwerten)!
2. + 3. koennt ihr auch zusammenfassen: erst Durchführung und dann gleich Ergebnisse des
jeweiligen Versuchs.
Anhang
Je ein aufgenommenes Spektrum von jedem Versuch
Für Aufgabe 3.1. ist das Ausmessen der Basisbreite nötig entweder direkt nach der Messung ablesen,oder ausdrucken.
Bei Coffein: Contourplot, UV-Diagramm.
Viel Spass
-bei Aufgabe 3.4. für Aufgabe 3.3. hergestellte Lösungen verwenden und entsprechend verdünnen.