Prctica No. 5. Filtracin por membrana para la determinacin de
Coliformes totales, coliformes fecales y Estreptococos
fecales.MICROBIOLOGA DE LOS ALIMENTOSEQUIPO No.4
INGENIERA BIOQUMICAPRACTICA #5
PROFESOR:M.C. Miguel ngel Daz Alday.
INTEGRANTES: BIVIANO YEVALES BRAYAN GONZALES CASTRO GABRIEL
REBOLLEDO ALARCON MIGUEL NGEL SANTIAGO RUEDA CELENE VALENTE
RODRIGUEZ JESUS ALBERTO
FECHA DE ENTREGA: 11 DE MARZO DEL 2015
NDICE
PROBLEMA.......3
FUNDAMENTO....3
HIPOTESIS....3
OBJETIVOS...3
INTRODUCCIN..........3
MARCO TERICO........4
MATERIAL Y EQUIPO...12
PROCEDIMIENTO.12
RESULTADOS...13
DISCUSIN DE RESULTADOS.....14
CONCLUSIN...14
GLOSARIO.....15
BIBLIOGRAFA...16
PROBLEMA:La presencia de bacterias patgenas en el agua destinada
al consumo humano es un riesgo siempre presente, que se incrementa
en las reas de mayor densidad de la poblacin. La tcnica de
filtracin por membrana (MF) se basa en hacer pasar la muestra de
agua problema a travs de un filtro de membrana microporosa, en cuya
superficie quedan retenidos los microorganismos. Se utilizan
membranas que tienen un tamao de poro de 0.45 micras ya que la
mayora de los microorganismos tienen un tamao superior (dimetro).La
normativa para abastecimiento y control de calidad de agua potable
de consumo pblico establece como anlisis microbiolgicos a realizar
las determinaciones de: coliformes totales, coliformes fecales,
grmenes totales, estreptococos fecales y clostridios
sulfito-reductores. El nmero de determinaciones se establece para
cada tipo de anlisis, si este es mnimo, normal o
completo.FUNDAMENTO En la tcnica de filtracin por membrana, el
grupo coliformes se define como todas las bacterias aerbicas y
anaerobias facultativas, Gram negativas, no esporuladas que
desarrollan una colonia roja con brillo metlico dentro de 24 horas
de incubacin en un medio tipo Endo conteniendo lactosa. El grupo
coliformes produce aldehdos por la fermentacin de la lactosa. E.
coli bacteria perteneciente al grupo coliformes, que en un medio
adecuado y a una temperatura restrictiva de 44,5 C +/- 0,2C,
fermenta la lactosa produciendo cido, gas, posee actividad
-D-glucoronidasa y actividad triptofanasa. Son negativas a la
actividad oxidasa y ureasa. OBJETIVOS: Este mtodo se utiliza para
medir la calidad sanitaria del agua potable. Se aplica a agua
clorada o agua naturales de muy baja contaminacin y sin turbidez.
Al finalizar, el trabajo prctico, el estudiante estar en capacidad,
mediante la consulta bibliogrfica y la aplicacin de las tcnicas
microbiolgicas, de realizar el control microbiolgico del agua de
proceso, utilizando la tcnica de la Membrana Filtrante.
INTRODUCCION
La presencia de bacterias patgenas en el agua destinada al
consumo humano es un riesgo siempre presente, que se incrementa en
las reas de mayor densidad de la poblacin. La tcnica de filtracin
por membrana (MF) se basa en hacer pasar la muestra de agua
problema a travs de un filtro de membrana microporosa, en cuya
superficie quedan retenidos los microorganismos. Se utilizan
membranas que tienen un tamao de poro de 0.45 micras ya que la
mayora de los microorganismos tienen un tamao superior (dimetro).La
normativa para abastecimiento y control de calidad de agua potable
de consumo pblico establece como anlisis microbiolgicos a realizar
las determinaciones de: coliformes totales, coliformes fecales,
grmenes totales, estreptococos fecales y clostridios
sulfito-reductores. El nmero de determinaciones se establece para
cada tipo de anlisis, si este es mnimo, normal o completoMARCO
TEORICO
La presencia de bacterias patgenas en el agua destinada al
consumo humano es un riesgo siempre presente, que se incrementa en
las reas de mayor densidadde la poblacin. La tcnica de filtracin
por membrana (MF) se basa en hacer pasar la muestra de agua
problema a travs de un filtro de membrana microporosa, en cuya
superficie quedan retenidos los microorganismos. Se utilizan
membranas que tienen un tamao de poro de 0.45 micras ya que la
mayora de los microorganismos tienen un tamao superior (dimetro).La
normativa para abastecimiento y control de calidadde agua potable
de consumo pblico establece como anlisis microbiolgicos a realizar
las determinaciones de: coliformes totales, coliformes fecales,
grmenes totales, estreptococos fecales y clostridios
sulfito-reductores. El nmero de determinaciones se establece para
cada tipo de anlisis, si este es mnimo, normal o completo.
FILTROS DE MEMBRANA
Los filtros de membrana son filtros de superficie, que muestran
una estructura microporosa precisa. Durante la filtracin las
partculas mayores que los poros de la membrana son retenidas de
forma fiable en la superficie de la misma. Las particulas ms
pequeas pueden pasar el filtro.Filtracin a travs de membrana
El nmero de coliformes totales presentes en el agua se determina
mediante la filtracin de volmenes especficos de la muestra a travs
de filtros de membrana. Por lo general, estn compuestos de steres
de celulosa, tpicamente con poros de 0,45 mm de dimetro que
retienen los coliformes totales y otras clases de bacterias
presentes en la muestra. Despus se incuban las membranas vueltas
hacia arriba en un medio selectivo. En la prctica, la tcnica de
filtracin de membrana ofrece resultados comparables a los que se
obtienen con el mtodo de tubos mltiples. Una de las ventajas del
mtodo de filtracin a travs de membrana es la prontitud con que
pueden obtenerse los resultados y, en consecuencia, se pueden
llevar a cabo rpidamente acciones correctivas y operar en la planta
de agua de nuevo en forma normal. Esta tcnica puede aplicarse en el
anlisis de casi todos los tipos de agua, tambin se utiliza en el
anlisis de leche y otros alimentos lquidos.El anlisis bacteriolgico
del agua es vital en la prevencin de epidemias como resultado de la
contaminacin del agua. El examen bacteriolgico de abastecimientode
agua no implica la bsqueda directa de los grmenes patgenos. El
ensayo se basa en el supuesto de que todas las aguas contaminadas
con desechos humanos o animales son potencialmente peligrosas. Por
consiguiente, el control sanitario del agua se hace con mtodos
bacteriolgicos para determinar la presencia de contaminacin fecal.
Las pruebas para la determinacin de patgenos no se usan
rutinariamente debido a que detectarlos en diluciones altas es muy
difcil y adems se encuentran en nmero muy inferior al de las
bacterias entricas, las cuales tienen una tasa de mortalidad mucho
ms lenta.El examen bacteriolgico del agua usualmente involucra dos
ensayos: la estimacin del nmero de bacterias de acuerdo con el
conteo total en placa y la determinacin, ms significativa, de la
presencia o ausencia de miembros del grupo coliforme.
El grupo coliorme incluye a todas las bacterias en forma de
bastoncillos que son aerobias o anaerobias facultativas, Gram
negativas, no esporogneas, que fermentan la lactosa con produccin
de gas en un medio de cultivo prescrito en un perodo de 48 horas, a
35 C.
El nmero de organismos coliformes en el excremento humano es muy
grande; la excrecin diaria por habitante vara entre 125x109y
400x109nmeros de unidades formadoras de colonias. Su presencia en
el agua es considerada como un indicadorde contaminacin fecal y por
lo tanto,de contaminacin con organismos patgenos. En aguas
residuales la relacin de organismos coliformes con organismos
entricos patgenos es muy grande, del orden de 106/1.
Los coliformes no solamente provienen del excremento humano
sinotambin pueden encontrarse en los desechos de animales de sangre
caliente, animales de sangre fra y en el suelo. Por lo tanto, la
presencia de coliformes en aguas superficiales indica contaminacin
proveniente de residuos humanos, animales o erosin del suelo
separadamente, o de una combinacin de las tres fuentes. Aunque no
es posible distinguir entre coliformes de origen humano o animal,
existe un ensayo especial para diferenciar entre coliformes fecales
y coliformes del suelo. Para el efecto, se usa unmedio de cultivo
EC para incubacin a 44.5 C durante 24 hr. Este ensayo no reemplaza
la tcnica usual, pero es aplicable en estudios de contaminacin de
ros, fuentes de agua cruda, sistemas de tratamiento de aguas
residuales y aguas para recreacin.Para determinar la presencia de
bacterias del grupo coliforme se aceptan dos mtodos: el mtodo de
los filtros de membrana y el mtodo de los tubos mltiples de
fermentacin.
Tcnica del Filtro de Membrana
Todos los organismos que producen una colonia oscura,
generalmente verde prpura con brillo metlico, despus de incubacin
por 24 horas, en medio de cultivo ENDO son considerados miembros
del grupo coliforme. El brillo metlico puede cubrir la colonia
entera o aparecer solamente en la parte central o en la periferia.
La cantidad ideal de muestra que se ha de filtrar debe ser aquella
que produzcauncrecimiento de mximo 30 colonias de coliformes.
Cuando se filtran porciones de menos de 20 ml, la muestra debe
diluirse y filtrarse un volumen mnimo de 30 ml.Los filtros
preparados se colocan directamente sobre el medio nutriente y se
incuban, normalmente, durante 24 horas, a 37 C 35 C.
El procedimiento consiste en hacer pasar a travs de un filtro de
membrana, aplicando vaco, un volumen medido de muestra de agua. A
continuacinse coloca el filtro en un recipiente estril y se incuba
en contacto con un medio de cultivo, selectivo y diferencial. En
cada punto del filtro en el que durante la filtracinse capta una
bacteria coliforme, se desarrollar una colonia de bacterias
coliformes. Se enumeran las colonias bacterianas, practicndose un
clculo simple para determinar el nmero de colonias de bacterias en
100 ml de muestra.Volumen de agua analizadaEl volumen de muestra a
filtrar es generalmente de 100 ml, excepto para aguas envasadas, en
las que se recomienda analizar muestras de 250 ml. Sin embargo, en
aguas superficiales y en general en aguas naturales sin tratar, el
nmero de bacterias en 100 ml puede variar desde pocas decenas hasta
cientos de millares. La siguiente tabla proporciona unos datos que
pueden servir de orientacin:Tipos de aguaColiformes totales
Potable de consumo pblico100 ml
Envasadas250 ml
Manantiales15; 60; 100 ml
Lagos, depsitos4; 15; 60; 100 ml
Acometidas0,08; 0,15; 0,5; 1,4 ml
De playas0,08; 0,15; 0,5; 1,4 ml
De ros0,003; 0,01; 0,02; 0,08 ml
Residuales cloradas0,003; 0,01; 0,02; 0,08 ml
Residuales sin tratar0,0001; 0,0003; 0,001; 0,003; 0,01 ml
Las muestras comprendidas entre 30 ml y 250 ml se filtran
directamente aadiendolas al embudo de filtracin. Para muestras
entre 1 y 30 ml, se aaden primero al embudo 20-30 ml de solucin
tamponada estril y, encima de ella, se vierte la muestraa a
filtrar.Para todas las muestras inferiores a 1 ml, es preciso
realizar previamente diluciones con solucin tamponada estril.
Preparacin de dilucionesPara realizar una dilucin 1/10 (10-1),
se pipetea aspticamente 1 ml de muestra en un tubo con 9 ml de
solucin tamponada estril y se agita.Muestra1 ml+Diluyente9
ml=Dilucin 1/10 (10-1)
Para realizar una dilucin 1/100 (10-2), se pipetea 1 ml de la
dilucin 1/10 en otro tubo con 9 ml de solucin tamponada estril y se
agita.Dilucin1/10 (10-1)+Diluyente9 ml=Dilucin 1/100 (10-2)
As sucesivamente se van haciendo las diluciones que se
necesiten, dependiendo del grado de contaminacin esperado de la
muestra.
TOMA DE MUESTRALa tcnica de muestreo depende del lugar donde se
realiza dicho muestreo, para conocer los detalles sobre la toma de
muestras de aguas para anlisis microbiolgicos haga clic sobre esta
frase.
AGAR ENDO
Endo describi el desarrollo de un medio de cultivo para
diferenciar entre microorganismos fermentantes y no fermentantes de
la lactosa. Durante aos el agar Endo ha sido un importante medio
para el examen microbiolgico del agua potable y residual, los
productos lcteos y los alimentos; no obstante, el compendio actual
de mtodos estndar para analizar estos elementos recomienda las
formulaciones de otros medios.El medio se utiliza an en
microbiologa clnica y en otros sectores para elaislamiento y la
diferenciacin de la familia
Enterobacteriaceae.
La selectividad del agar Endo se debe a la combinacin del
sulfito de sodio con fucsina bsica, lo cual ocasiona la supresin
parcialde los microorganismos gram-positivos. Los coliformes
fermentan la lactosa, produciendo colonias color rosa oscuro a
rojizo con un brillo metlico verdoso iridiscente y una coloracin
similar en el medio. Las colonias de microorganismos que no
fermentan la lactosa son incoloras o de color rosa plido en
contraste con el fondo rosa claro del medio.
El agar Endo es un medio de cultivo diferencial y ligeramente
selectivo utilizado para la deteccin de coliformes y otros
microorganismos entricos.
Colonias tpicas
Los coliformes fermentadores de lactosa producen colonias
rosadas a rojas, mientras que las colonias de los microorganismos
que no pueden fermentar este carbohidrato son incoloras o rosado
plido. Las colonias tpicas de E. colien el Agar Endo son rosadas
con un brillo verde metlico caracterstico, debido a la elevada
produccin de cidos y aldehdos como producto de la fermentacin de la
lactosa.
ENTEROCOCCS AGAREs un medio selectivo para el aislamiento y el
recuento de estreptococos fecales (grupo D) a partir de muestras
clnicas. El medio es una frmula estndar para el aislamiento de
enterococos
Dos peptonas proporcionan los nutrientes. Los estreptococos del
grupo D (incluidos los enterococos) hidrolizan la esculina para
formaresculetina y glucosa. La esculetina reacciona con una sal
frrica para formar un complejo marrn oscuro o negro. Se incluye el
citrato frrico como indicador, que reacciona con la esculetina para
producir un complejo de marrn a negro. Se utiliza bilis de buey
para inhibir las bacteriasgram positivas diferentes de los
enterococos. La azida sdica inhibe losmicroorganismosgram
negativos.
MATERIALES:
cajas de petrimillipord Membranas filtrantes de 0,45 m de tamao
de poro Soporte del filtro con embudo Sistema de vaco Pipetas
estriles de 10 y 1 ml. Pinzas estriles papel filtro muestra de
playa la angostaPROCEDIMIENTOColocar un filtro de membrana estril
sobre el soporte de filtracin.
Adaptar el embudo y conectar el matraz a una bomba elctrica de
vaco. Filtrar 100 ml de muestra si se trata de agua potable, y 0,1
y 1 ml si se trata de aguas no potables, previamente
homogeneizadas.
Lavar con unos 30 ml de agua destilada. Retirar el embudo.
Mediante las pinzas esterilizadas, transferir la membrana filtrante
sobre losmedio de cultivo contenido en dos cajas millipor, de modo
que la superficie de filtracin quede hacia arriba. Cerrar y esperar
a que el filtro se adiera bien al medio, despus invertir ambas
placas e incuba una a 44C (+/-1C ) durante 24h y la otra a 35 +/-
2C.
Se filtran 100 ml del agua a analizar previamente
homogeneizada.
Se coloca el filtro de membrana sobre el medio KF se cierra la
placa y se espera a que el filtro membrana ase adiera bien al
medio. Se invierte la placa y se incuban a 37C durante 24 h.
Se utiliza para la determinacin del nmero de estafhylococcus
faecalis mediante filtracin de un volumen determinado del agua a
analizar a travs de filtros de membrana e incubacin de los mismos
sobre medios de cultivo a temperaturas adecuadas.
Hoja de campoMuestraAgua de playa
Lugar de recoleccinPlaya l a angosta, Acapulco, Gro.
fecha
ReceptorSantiago Rueda Celene.
NotaSe tom la muestra de la playa ,
RESULTADOS:
En la determinacin de estafhylococcus fecalis obtuvimos
resultados abundantes de colonias que se desarrollaron en el tipo
de agar KF por lo cual fue considerada incontables para nosotros
debido a que esta bacteria se encontraba en abundancia en la
muestra.
Para la determinacin de coliformes totales y fecales donde se
utilizo el medio agar EMB los resultados fueron negativos debido a
que no se desarrollo ninguna colonia tanto para coliformes totales
y fecales.
DISCUSIN DE RESULTADOS:
La muestra analizada fue extrada de la playa la angosta
Acapulco, guerrero la cual fue trasladada en frascos estriles para
su anlisis. Posteriormente se llevaron a cabo tres filtraciones de
100 ml de muestra, una en la caja con agar KF donde se
desarrollaran estafhylococcus fecalis, los resultados fueron
colonias masivas con un color amarillo crema y de buen tamao de
formacin y en abundancia, debido a esto se consideraron incontables
por haber obtenido un crecimiento masivo y esparcido en el filtro
membrana, asiendo de esta manera imposible contar las colonias en
el estereomicroscipio. En las siguientes filtraciones realizadas
donde se utilizo el medio de agar EMB para coliformes totales y
fecales, los resultados fueron negativos debido a que no obtuvimos
ninguna colonia tanto para coliformes totales como para
fecales.
CONCLUSIONESSe determins Streptococcus fecalis en la muestra de
agua de playa la angosta Acapulco Gro; lo cual es es indicativo de
que existe una contaminacin constante y abundante en esta playa
debido a que cualquier microorganismo que es capaz de soportar
altas concentraciones de sal como lo es dicha bacteria, solo puede
habitar en ella alrededor de 20 minutos para despus pasar a la fase
de muerte, es por eso que llegamos a la conclusin de que la fuente
de contaminacin que conlleva a esta playa es a menudo constante. En
la determinacin de coliformes totales y fecales los resultados
fueron negativos para ambos coliformes ,pensando en el tipo de
estacin en que nos encontramos (invierno) , las temperaturas podran
no ser las adecuadas para el desarrollo de este tipo de bacterias
indicadoras de fuentes de contaminacin.
GLOSARIOColiforme:La denominacin genrica coliformes designa a un
grupo de especies bacterianas que tienen ciertas caractersticas
bioqumicas en comn e importancia relevante como indicadores de
contaminacin del agua y los alimentos.Clostridios:Bacilos mviles,
grampositivos y anaerobios. Crecen en el suelo, las cloacas,
sedimentos marinos, vegetacin en descomposicin, productos de
animales y vegetales, el tracto gastrointestinal del hombre, otros
vertebrados e insectos. La mayora de las especies que viven en el
hombre son comensales inofensivos que pueden convertirse en
patgenos oportunistas.Esculina:Es un glucsido txico que se
encuentra en el fruto del castao de Indias (Aesculushippocastanum)
y en el Falso castao de California (Aesculuscalifornica). Los
efectos que produce su ingesta son: espasmos, dolor de estmago,
diarrea, desorientacin e incluso la muerteEsporognesis, Dentro del
ciclo de vida haplo-diplonte, es la parte en la que se producen las
microsporas y megasporas. Son producidas por el esporfito,
diploide, que por meiosis produce una ttrade de esporas
haploides.Fermentacin lctica:Es una ruta metablicaanaerbica que
ocurre en el citosol de la clula, en la cual se oxida parcialmente
la glucosa para obtener energa y donde el producto de desecho es el
cido lctico.Organismos entricosLas bacterias del grupo entrico
forman un conjunto de microorganismos muy heterogneo (el contenido
de G+C del grupo vara del 40 al 60%) cuya caracterstica comn ms
relevante es ser anaerobios facultativos: desarrollan un
metabolismo respiratorio en condiciones aerobias y un metabolismo
fermentativo en anaerobias. Slo algunos miembros del grupo son
capaces de respirar NO3- aunque esta no es una caracterstica
general del grupo.
BIBLIOGRAFIALevin, M., yH. W.Schoenlein. 1930Una compilacin
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Marshall,R. T.(ed.). 1992Los mtodos estndar paraelexamen de los
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